מאמר שיטה

איסוף במקביל של מוח וסרום מורין עוברי להערכת ההשפעות של תזונה אימהית על תזונה והתפתחות עצבית בנוירופיברומטוזיס סוג 1

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66226

⸱

17 במאי 2024

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis

במאמר זה

סיכום

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לאיסוף סימולטני של רקמת מוח עוברית וכן נסיוב איכותי ללא המוליזה מאותו עובר עכבר. השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור כיצד חשיפה תזונתית אימהית משפיעה על פרופילי אבות המזון העיקריים ועל התפתחות עצבית עוברית בעכברים הטרוזיגוטיים עבור Nf1 (נוירופיברומטוזיס סוג 1).

תקציר

הוכח כי השמנת יתר הנגרמת על ידי תזונה אימהית משנה את ההתפתחות העצבית אצל צאצאים, מה שעלול להוביל לירידה ביכולת הקוגניטיבית, היפראקטיביות וליקויים בהתנהגות חברתית. חולים עם הפרעה גנטית הטרוגנית קלינית נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1) עשויים להופיע עם ליקויים דומים, אך כרגע לא ברור אם גורמים סביבתיים כגון תזונה אימהית משפיעים על התפתחות פנוטיפים אלה, ואם כן, המנגנון שבו השפעה כזו תתרחש. כדי לאפשר הערכה של האופן שבו חשיפה אימהית לתזונה אובסוגנית משפיעה על גורמים מערכתיים הרלוונטיים להתפתחות עצבית ב-NF1, פיתחנו שיטה לאיסוף סימולטני של סרום ללא המוליזה ומוחות שלמים או אזוריים מנותחים במיקרו מצאצאים עובריים של סכרים מורינים שניזונו מדיאטת ביקורת לעומת תזונה עתירת שומן וסוכרוז. מוחות עובדו להקפאה או להקפאת פלאש לשימוש לבידוד RNA או חלבונים לאחר מכן; איכות הרקמה שנאספה אומתה על ידי immunostaining. איכות הסרום אומתה על ידי ניתוח פרופילים של אבות מזון עיקריים. באמצעות טכניקה זו, זיהינו כי תזונה אובסוגנית אימהית מעלה את רמת הכולסטרול בסרום העובר באופן דומה בין WT לבין גורים הטרוזיגוטיים Nf1.

מבוא

נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1) נחשבת לראסופתיה, קבוצה של הפרעות המאופיינות במוטציות גנטיות של קו הנבט וכתוצאה מכך בהפעלת מסלול האיתות RAS/MAPK (נגיף RAt Sarcoma / חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן). חולים עם ראסופתיה NF1 נמצאים בסיכון לפתח ביטויים רבים ושונים, כולל גידולים שפירים וממאירים של מערכת העצבים המרכזית (גליומה במסלול האופטי 1,2, גליומה בדרגה גבוהה 3,4) וההיקפית (נוירופיברומה פלקסיפורמת 5,6, גידול ממאיר במעטפת העצבים ההיקפית 7,8) וכן דיספלסיות גרמיות9 והפרעות פיגמנטריות בעור10 (נמשים בבית השחי, קפה-או-לייט מקולס). ההשפעה של הפרעה זו על קוגניציה והתפתחות עצבית מוכרת יותר ויותר, כאשר חולי NF1 מציגים שכיחות מוגברת של ליקויי למידה, היפראקטיביות והפרעת ספקטרום האוטיזם 11,12,13. עם זאת, קיימת הטרוגניות משמעותית בהתפתחות פנוטיפים אלה בין חולים 13,14,15,16,17, ולא ברור מדוע חלק מהחולים מציגים ליקויים קוגניטיביים משמעותיים בעוד שאחרים אינם מושפעים. השמנת יתר הנגרמת על ידי תזונה אימהית הוכחה כמשפיעה באופן דומה על למידה והתנהגות באוכלוסייה הכללית 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 דבר המצביע על כך שחשיפות תזונתיות דיפרנציאליות אימהיות ב-NF1 יכולות להיות מקור אחד להטרוגניות קלינית זו., בפרט, ילדים לאימהות שמנות מציגים סיכון מוגבר לפתח היפראקטיביות 18,19,20,23,25,26, אוטיזם 19,24,27, ליקויים בתפקוד הניהולי21,23, ויש להם ציוני IQ מלאים נמוכים יותר22,28. עם זאת, חולים עם NF1 שינו פנוטיפים מטבוליים בהשוואה לאוכלוסייה הכללית, כולל ירידה בשכיחות של השמנת יתר וסוכרת 29,30,31, כך שלא ברור אם הם יגיבו באופן דומה לגירויים תזונתיים.

כדי לענות על שאלות אלה, ביקשנו לקבוע אם שינויים הנגרמים על ידי תזונה אובסוגנית בפרופיל macronutrient בצאצאים עובריים עם Nf1 תרמו לשינויים נוירו-התפתחותיים. אספנו בעבר רקמות שלמות ואזוריות באיכות גבוהה המתאימות ליישומים נוירו-התפתחותיים ממוח העובר32. עם זאת, איסוף הדם העוברי מאתגר בשל גודל הגוף הקטן ונפח הדם הנמוך33. איסוף הדם באמצעות ניקוז בעזרת כוח הכבידה לאחר עריפת ראשים הוביל לנפחי איסוף נמוכים ולהמוליזה משמעותית בדגימות שלנו, מה שיכול להשפיע על פענוח היישום במורד הזרם. איסוף באמצעות שאיפה מלב העובר או מכלי בית החזה, כפי שדווח בעבר33, היה מאתגר מבחינה טכנית והביא גם להמוליזה תכופה. לכן פיתחנו שיטה לאיסוף נסיוב עוברי, המשתמשת בצינורות נימים מיוחדים כדי לאפשר איסוף נפח גבוה יותר ללא לחץ גזירה משמעותי.

כאן, אנו מציגים את השיטה הזו כדי לאסוף בו-זמנית מוחות עובריים וסרום עוברי מגורים הטרוזיגוטיים מסוג Nf1 שנחשפו לתזונה עתירת שומן וסוכר לעומת דיאטת ביקורת ברחם (איור 1 וטבלה משלימה S1). מוחות הוטמעו בהקפאה לצורך ניתוח עוקב על ידי אימונופלואורסנציה או נותחו במיקרו אזורי והוקפאו באמצעות הבזק לשימוש מאוחר יותר ביישומי ביולוגיה מולקולרית. התקבל סרום באיכות גבוהה, המתאים ליישומים במורד הזרם כגון פרופיל macronutrient. באמצעות שיטה זו, זיהינו כי חשיפה תזונתית אימהית עתירת שומן וסוכרוז מובילה לעלייה ברמות הכולסטרול בסרום הן אצל WT והן אצל גורים הטרוזיגוטיים מסוג Nf1.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה פעלו בהתאם להנחיות NIH ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. בעלי חיים שוכנו עם אור סטנדרטי של 12 שעות: רכיבה על אופניים חשוכים וגישה חופשית למזון ומים.

1. דיאטה אימהית

  1. הניחו נקבות עכברים על צ'או ביקורת (CD) או דיאטה אובסוגנית (Ob) בגיל 4 שבועות.
  2. בגיל 8-12 שבועות, קבעו הזדווגות מתוזמנת על ידי ניטור פקק הריר של הסכר בשעות הבוקר המוקדמות כדי לקבוע את גיל האיסוף הנכון. כדי לאמת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה, לשקול נקבות בעת הזדווגות.
    הערה: טווח של 8-12 שבועות שימש למערך ההזדווגות הראשוני כדי להבטיח שהנקבות הניזונות מתזונה אובסוגנית סבלו מעודף משקל בהשוואה למקבילותיהן, שלא תמיד התרחשו עד גיל 8 שבועות. יום התקע נחשב ליום עוברי 1 (E1), וכל בעלי החיים ששימשו במחקר זה נאספו ב-E19. נקודת הזמן העוברית המאוחרת נבחרה עקב שינויים נוירו-התפתחותיים שנצפו בעבר בתקופה זו בבעלי חיים שנחשפו לתזונה אובסוגנית (הנתונים לא מוצגים).

2. הוצאת עובר מהסכר

  1. ראשית, יש לוודא שהסכר נראה גרביד (צורת בטן ומלאות, מישוש בטן או תנועת עובר). אם יש ספק, לשקול את הנקבה שוב כדי למדוד עלייה במשקל.
    הערה: עכברות בהריון מאוחר צריכות להציג לפחות 3-4 גרם של עלייה במשקל. כדי להגדיל את הסבירות להתעברות במסגרת הזמן הרצויה, ניתן להוסיף לכלוב הנקבה נסורת מלוכלכת (המכילה שתן ופרומון) מכלוב הזכר מדי יום במשך 3 ימים לפני ההזדווגות כדי לגרום לייחום34.
  2. הרדימו את הסכר על ידי הכנסתו לתא עם מגבת נייר המכילה 3 מ"ל איזופלורן, תוך הקפדה להימנע ממגע ישיר בין הסכר למגבת הנייר ספוגה בהרדמה. לאחר שהחיה מורדמת, הניחו אותה על מגבת נייר, החזיקו אותה בזנב, הניחו מספריים לדיסקציה על הצוואר, ואז דחפו את המספריים כלפי מעלה לכיוון הראש כדי לבצע נקע צוואר הרחם. לחלופין, בצע עריפת ראש לאחר טשטוש איזופלורן.
    הערה: ניתן לאסוף סרום מהסכר בשלב זה, באמצעות מתודולוגיה דומה כמתואר להלן אך עם צינורות נימים גדולים יותר. אם רוצים בכך, יש לבצע עריפת ראש ולא פריקת צוואר הרחם. יש להקפיד על מנת להבטיח כי הפנוטיפ של עניין לא ישתנה על ידי הממשל של isoflurane מיד לפני המתת חסד.
  3. מניחים את צד הגחון של הסכר כלפי מעלה בצלחת של 100 מ"מ. צובטים את העור המכסה את הבטן ומבצעים חתך בקו האמצע עם מספריים לנתיחה. בצע חתכים נוספים בניצב לחתך קו האמצע כדי ליצור דשי עור כדי לחשוף את הרחם המכיל את העוברים.
  4. משוך את הרחם מחלל הבטן. בעזרת מספריים, לנתק את הרחם מן הסכר. מניחים את השק העוברי השלם ("פנינים על חוט") המכיל את העוברים לתוך צלחת עם מלח קר סטרילי 1x פוספט חוצץ (PBS). מניחים את צלחת העוברים על קרח.
    הערה: מכיוון שכל המלטה מכילה בדרך כלל 6-10 גורים שייקצרו הן עבור המוח והן עבור הסרום, עוברים נשמרים על קרח כדי למנוע השפלת רקמות. הנחת גורים על קרח מבטיחה בנוסף המתת חסד נאותה של גורים, שכן המתת חסד אימהית לבדה לא תמיד מספיקה. אם רוצים רק איסוף סרום, ייתכן שעדיף איסוף בטמפרטורת החדר.

3. איסוף סרום עוברי

  1. הסר את העובר מהשק העוברי על ידי ניתוח בזהירות עם #5 מלקחיים. מעבירים את העובר לצלחת באמצעות מלקחיים מעוקלים עם טרי קר סטרילי 1x PBS.
  2. כתם בעדינות את בעל החיים על מגבת נייר כדי להסיר שאריות מי שפיר ו- PBS מהדגימה.
  3. החזיקו את החיה בבטן. ערפו חלקית את ראשו של בעל החיים עם מספריים מיקרו על ידי ביצוע חתך בצוואר הגחון. יש לוודא שכלי הדם חתוכים, אך העור השומר על הראש עדיין מחובר.
    הערה: הראש חייב להישאר מחובר כך שניתן יהיה לאסוף דם מהגוף ומהראש בו זמנית.
  4. החזק את הגוף בזווית של 45° כשהחתך פונה כלפי מטה. החזק את 50 μL minivette (צינור נימים) במקביל לאתר החתך של הסכר שבו הדם יוצר טיפה. בזהירות לאפשר את צינור נימי 50 μL למלא בדם.
    הערה: צינור נימי x2 או 100 μL צינור נימי ניתן להשתמש כדי לאסוף עד ~ 75 μL של דם.
  5. מניחים את הראש בכלי טרי בקוטר 60 מ"מ המכיל 1x PBS קר וסטרילי לאיסוף רקמות נוסף (סעיף 4).
  6. לאחר הדם הוא בתוך צינור נימים, לחץ על הבוכנה במהירות לתוך צינור 1.5 מ"ל. החלק את הצינור או סובב אותו במהירות כדי לוודא שהדם נמצא בתחתית הצינור.
  7. חזור על הפעולה למשך שארית ההמלטה.
    הערה: שמירה על הגורים על קרח ומעבר מהיר ביניהם חיונית כדי להפחית את הסיכון לקרישה לאחר המוות שתגביל את נפח האיסוף.
  8. קריש את הדם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  9. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 4 ° C, 16,000 × גרם במשך 20 דקות.
  10. מעבירים את הסרום לצינורות טריים של 500 μL עם פיפטה של 200 μL, מבלי להפריע לכדור תאי הדם בתחתית הצינור.
    הערה: הסרום צריך להיות בצבע קש ללא לכלוך אדום. כל עובר צריך להניב 15-30 μL של סרום.
  11. יש לאחסן את הסרום שנאסף בטמפרטורה של -80°C.

4. אוסף מוח עוברי

  1. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ המנתחת, החזיקו את החוטם באמצעות מלקחיים מעוקלים והשתמשו במלקחיים #5 כדי לקלף בזהירות את העור מכובע הגולגולת, תוך שמירה עליו מחובר לחוטם כדי להקל על האחיזה. זווית #5 מלקחיים עד 45° ביחס לגולגולת, נקבו בזהירות את הקרום השקוף שהוא הגולגולת המתפתחת, העבירו את המלקחיים במקביל לגולגולת, הכניסו אותה מתחת לכובע הגולגולת, ואז צבטו וקילפו לצד אחד. לאחר הסרת צד אחד, תפסו את הצד הנותר עם #5 מלקחיים וקילפו לצד השני.
  2. גרפו בעדינות את המוח מהגולגולת בעזרת כף מיקרו והעבירו את המוח לצלחת טרייה בקוטר 60 מ"מ המכילה PBS 1x קר.
    הערה: בשלב זה, מוחות שלמים יכולים להיות קבועים ומוטבעים עבור immunostaining. ראה מתודולוגיה32 שפורסמה בעבר.
  3. אם יש צורך להקפיא רקמות בהצמדה עבור יישומים מולקולריים אחרים, נתחו את תחום העניין. בידוד הרקמה הפריחדרית סביב החדר הצידי, השלישי והרביעי מתואר להלן.
    1. בעזרת המלקחיים המעוקלים, החזיקו את המוח בצומת של המוח האחורי והמוח הקדמי עם היד הלא דומיננטית. עם היד הדומיננטית, להחזיק את האזמל עם הלהב במקביל לפני השטח של המוח. לחצו בחוזקה כלפי מטה באזור קליפת המוח האמצעית (איור 1).
    2. עדיין מחזיקים את המוח האחורי, בצעו חתך שני לפני המוח האחורי כדי להפריד אותו מהמוח הקדמי (איור 1). בחלק הקדמי ביותר, חפשו שני חללים חצי עגולים קטנים הממוקמים בתוך המישור האופקי, שהם החדרים הרוחביים. השתמש במלקחיים המעוקלות הממוקמות במרכז כל חדר כדי להחזיק את המוח במקום, לנתח בזהירות את הרירית באמצעות מלקחיים #5, ולהסיר לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי טרי 1.5 מ"ל.
    3. בחלק האמצעי, לחפש חלל ליניארי קטן על פני הגחון, שהוא החדר השלישי. באמצעות #5 מלקחיים, בזהירות לצבוט את בטנה משני הצדדים של פני החדר, ולאחר מכן להסיר צינור microcentrifuge נקי טרי 1.5 מ"ל.
    4. בחלק האחורי ביותר, חפשו חלל ליניארי קטן במרכז המוח האחורי, שהוא החדר הרביעי. נתחו את הבטנה משני הצדדים באמצעות מלקחיים #5, ואז הסירו לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ונקי של 1.5 מ"ל.
      הערה: אם חיתוך המוח האחורי אינו חתך נקי, רקמת החדר הרביעי עלולה להיות מוסתרת ו / או נהרסת.
    5. עבור שלבים 4.3.2-4.3.4, מיד לאחר שהרקמה הוכנסה לצינורות מיקרוצנטריפוגה, הכנס את הצינורות במהירות למיכל בטוח להקפאה המכיל חנקן נוזלי.
      הערה: ניתן לשמור את הצינורות בחנקן נוזלי עד לניתוח הדגימות הנותרות. אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קור חמורות. אין להכניס ידיים ישירות לחנקן נוזלי ולהימנע מהתזות.
    6. מניחים צינוריות קפואות על קרח יבש ומעבירים רקמות קפואות למקפיא בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

תוצאות

כדי להמחיש את איכות רקמת המוח המתקבלת באמצעות טכניקה זו, אנו מראים דגימה של מוחות עובריים מעכברי Nestin-CFPnuc35, שהוכתמו חיסון עבור GFAP לפי טכניקה32 שדווחה בעבר. תאי Nestin+ נראים מצפים את החדר הצידי (איור 2A), עם חוטי GFAP+ המשתרעים מפני השטח. לא ראינו הבדלים בין ביטוי נסטין או GFAP בחדר הצידי של CD לעומת עכברים שנחשפו לאוב בזני WT או Nf1-heterozygous (איור 2A,B). לאחר מכן הערכנו את איכות הרקמה המנותחת. תחילה ביצענו כתם מערבי36 עבור חלבון משק הבית β-אקטין על הרקמה המיקרודיסקרטית שבודדה מהחדרים הצדיים של עכברים שנחשפו ל-CD לעומת עכברים שנחשפו לאוב. כל הדגימות הציגו ביטוי חזק של β-אקטין (איור 2C), כצפוי. לאחר מכן בודדנו רנ"א מרקמת המיקרודיסקציה לפי מתודולוגיית32 שדווחה קודם לכן. רנ"א מבודד הציג גם טוהר גבוה (260/280 ≥ 2) וגם שלמות (ערכי RIN ≥ 9), מה שמעיד על רנ"א בעל טוהר גבוה ולא מפורק (איור 2D).

לאחר מכן השווינו בין השיטות השונות לבידוד בסרום. באמצעות שיטת המיניווט שלנו, אספנו באופן שגרתי נפחים גדולים יותר של סרום שאינו המוליזה, בעוד שניקוז כוח הכבידה וניקור בית החזה הביאו לאיסוף נפח משתנה מאוד ולהמוליזה בדגימות רבות (איור 3A,B). כדי להמחיש את איכות הסרום המתקבלת באמצעות טכניקה זו, מדדנו את רמות הכולסטרול הכולל בסרום באמצעות מגיב הכולסטרול הכולל בהתאם להוראות היצרן. רמות כולסטרול עוברי היו בטווח הצפוי עבור גורי הריון מאוחרים בהתבסס על מחקרים קודמים בעוברים אנושיים37. הרמות היו גבוהות יותר בעכברים שנחשפו ל-Ob בהשוואה לגורי CD שנחשפו גם לגורי בר (איור 3C, משמאל) וגם לגורי Nf1-heterozygous (איור 3C, מימין). שימו לב שהפאנל הימני מתאר נתונים משולבים משני זנים שונים של Nf1-heterozygous עם מוטציות בקו הנבט שזוהו על ידי המטופל (R681X, C383X)32,38,39 כפי שנצפו פרופילים דומים בשני הזנים.

figure-results-1
איור 1: תקציר גרפי של זרימת עבודה. הגורים מבודדים תחילה מסכרים בהריון. לאחר מכן נקצר הסרום מהגורים. לבסוף, מוחות שלמים מבודדים מגורים, ואם רוצים, מנותחים במיקרו עבור אזורים מעניינים. גרפיקה שנוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תוצאות להמחשה, רקמת המוח. (A) מוחות קריוסקציה מעכברי Nestin-CFPnuc , המבטאים חלבון פלואורסצנטי ציאן מקומי גרעיני תחת שליטתו של מקדם נסטין, נקצרו בשיטה זו והוכתמו חיסון עבור GFAP (אדום) לפי מתודולוגיה שדווחה בעבר32. תאים חיוביים לנסטין מוצגים באמצעות ביטוי אנדוגני של Nestin-CFPnuc (ירוק). גרעינים היו מוכתמים בביס-בנזימיד (כחול). לא היו הבדלים משמעותיים בין מוחות WT שנחשפו ל-CD ו-Ob. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) Nestin-CFPnuc; גוריNf1 mut/+ הוערכו באופן דומה. התפלגות GFAP ונסטין-CFP נראתה דומה ל-WT ולא השתנתה בהתאם לתנאים התזונתיים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) חלבון בודד מרקמה מיקרודיסקרטית מה-LV. הקרישה המערבית בוצעה לפי מתודולוגיה36 שדווחה בעבר עם 20 מיקרוגרם חלבון טעון בכל נתיב. ביטוי חזק של β אקטין היה ניתן לזיהוי בכל הדגימות. (D) RNA בודד מרקמה מיקרודיסקרטית לפי מתודולוגיה32 שדווחה בעבר. איכות הרנ"א הוערכה באמצעות יחסי 260/280 וערכי RIN. כל הדגימות הציגו יחסים מצוינים של 260/280 (≥2) וערכי RIN (≥9), מה שמצביע על בידוד טוב של RNA לא מפורק. קיצורים: CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי; WT = סוג פראי; LV = חדר לרוחב; RIN = מספר שלמות RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות להמחשה וסרום. (A) סרום נאסף מכל אחת מהשיטות המתוארות. הקולקציה עם המיניווט אפשרה איסוף שגרתי של סרום ללא המוליזה בהשוואה לניקוז בעזרת כוח הכבידה וניקוב בית החזה. (B) מוצגים נפחי איסוף אופייניים של סרום. קולקציית Minivette אפשרה אוסף ניתן לשחזור יותר של כמויות גדולות יותר של סרום. מובהקות סטטיסטית נקבעת על ידי ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות. סרגלי שגיאה: SEM. (C) הכולסטרול הכולל בסרום נמדד מ-CD לעומת WT שנחשף ל-Ob-exposure (משמאל) ומ-Nf1-heterozygous (מימין) בסרום עוברי מאוגם; בעלי חיים שנחשפו לאוב הציגו כולסטרול גבוה יותר בסרום בשני הגנוטיפים. מובהקות סטטיסטית נקבעת על ידי מבחן t. קווי שגיאה: SEM. קיצורים: WT = סוג פראי; CD = דיאטת בקרה; Ob = דיאטה אובסוגנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: הרכבים תזונתיים. הרכב הבקרה והדיאטות האובסוגניות המשמשות בכתב יד זה מוצגים. הערה: עבור דיאטה דלת שומן ונטולת סוכרוז השולטת טוב יותר עבור רכיבי התזונה הבודדים ב- D12331, ניתן להעדיף את דיאטת D12328 (researchdiets.com). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

שיטות מסורתיות לאיסוף דם מעכברים כוללות retrobulbar, וריד זנב, וריד saphenous, וריד הפנים, ודימום ורידים jugular 40,41,42. למרבה הצער, שיטות אלה אינן אידיאליות לאיסוף דם עוברי בשל גודל החיה וכלי דם קטנים ועדינים. איסוף הדם באמצעות ניקוז בעזרת כוח הכבידה לאחר עריפת ראשים הוביל הן לנפחי איסוף נמוכים והן להמוליזה משמעותית בדגימות שלנו. פרוטוקולים קודמים דיווחו על שיפור בנפחים על ידי שימוש במחט 20 G שונה כדי לנקז דם מכלי דם בבית החזה33; עם זאת, מצאנו טכניקה זו מאתגרת מבחינה טכנית וראינו שיעורים גבוהים של המוליזה, מה שהופך אותה ללא מתאימה ליישומים רבים במורד הזרם. לשיטה שלנו יש את היתרון של איסוף באמצעות זרימת דם פסיבית, המפחיתה את הסיכון להמוליזה כתוצאה מלחץ מוחלט הנגרם על ידי שאיפה. הבוכנה על צינור הנימים מספקת גם דרך מהירה ויעילה להזרמת דם לצינור האיסוף, ממזערת את החשיפה לאוויר ומגבילה את פיצול קרישי הדם. חשוב לציין, רקמת מוח שלמה או אזורית יכולה להיאסף לאחר מכן מאותה חיה, ובכך להפחית את סך הצרכים של בעלי חיים ניסיוניים.

פרוטוקול זה אינו חף מהתאמות לייעול איכות ויעילות הגבייה. עבור איסוף בסרום, חיוני להסיר בעדינות נוזל עוברי ו- PBS נוסף מהחיה לפני איסוף הדם, שכן עודף נוזלים עלול להפוך את בעל החיים לחלקלק ולהגדיל את הסבירות למיקום לקוי או לא יציב המשפיע לרעה על איכות איסוף הדם. בנוסף, מיקום האצבע בזמן החזקת העובר הוא קריטי, שכן הדם יידבק לאצבע בכפפה במהלך האיסוף אם האצבע צמודה לצינור הנימים. חשוב גם להחזיק את פתח צינור הנימים בסמוך, ולא שקוע, בדם הזורם; אוסף הנימים יופרע אם הצינור שקוע. לבסוף, יש לשקול בזהירות את המריחה במורד הזרם כדי לייעל את איסוף הסרום. לדוגמה, גלוקוז מתפרק עם הזמן בצינורות לא מטופלים בטמפרטורת החדר, כך שאיסוף לתוך נתרן פלואוריד או צינורות המכילים EDTA עשוי להיות נחוץ כדי לכמת במדויק את רמות הגלוקוז43,44.

לאיסוף רקמת המוח, הסרה זהירה של העור והגולגולת השקופה משני צידי הראש היא קריטית למיצוי נקי. אם רק צד אחד מנותח, המוח עלול להידבק לגולגולת עם ניסיון הסרה, וכתוצאה מכך קריעה ועיוות של הרקמה. עבור חתך המוח, חשוב ליצור פרוסות בודדות ונקיות כדי להפריד את החלק הקדמי מקליפת המוח האמצעית ואת קליפת המוח האמצעית מהמוח האחורי. חתכים מרובים יכולים לשבש את השלמות המבנית של הרקמה או לטשטש את נקודת הייחוס שלך עבור microdissection הבאים. לבסוף, שמירת דגימות על קרח עד קיבוע או הקפאת בזק היא חיונית כדי למנוע התפרקות דגימה.

אמנם אנו מעדיפים שיטה זו בשל איסוף שגרתי של סרום נפח גבוה יותר, ללא המוליזה, זה לא בלי חסרונות. למרות המוליזה מופחת לעומת טכניקות אחרות, שיטה זו אינה מבטלת את הסיכון. צינור הנימים יכול גם להיות סתום עם קריש דם ברגע הדם מפסיק לזרום, ולכן חשוב לעבוד במהירות לאחר עריפת ראש כדי להפחית את הסיכון של איסוף כושל עקב קרישה. שמירת דגימות על קרח, הנעשית כדי לשמור על שלמות הדגימה בפרוטוקול זה, עלולה גם להשפיע לרעה על פנוטיפים מסוימים ועשויה שלא להתאים לכל היישומים.

לסיכום, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לבודד בו זמנית מוחות בסרום כמו גם במוחות שלמים או אזוריים מאותו עובר. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לטפל באופן שבו גורמים מערכתיים, כגון שינוי בפרופיל אבות המזון העיקריים הנגרם על ידי תזונה אימהית, עשויים להשפיע על התפתחות עצבית ב- NF1 או הפרעות אחרות.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

N Brossier נתמך על ידי תוכנית המלגות של פרנסיס ס. קולינס במחקר קליני ותרגומי של נוירופיברומטוזיס הממומנת על ידי תוכנית ההאצה הטיפולית של נוירופיברומטוזיס (NTAP, Grant # 210112). פרסום זה נתמך בחלקו על ידי מימון של NTAP בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. תוכנו הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. תמיכה נוספת של בית החולים לילדים בסנט לואיס (FDN-2022-1082 עד NMB) ואוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ליבת מחקר סוכרת (NIH P30 DK020579). מיקרוסקופיה בוצעה באמצעות המרכז לדימות תאי של אוניברסיטת וושינגטון (WUCCI), בתמיכת בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, המכון לגילוי ילדים של אוניברסיטת וושינגטון, ובית החולים לילדים בסנט לואיס (CDI-CORE-2015-505 ו- CDI-CORE-2019-813) והקרן לבית החולים היהודי בארנס (3770 ו- 4642). עכברי Nestin-CFPnuc35 סופקו בנדיבות על ידי גריגורי אניקולופוב (בית הספר לרפואה של הרנסאנס, אוניברסיטת סטוני ברוק, ניו יורק), ועכברי Nf1 הטרוזיגוטים עבור מוטציית נבט R681X או C383X 32,38,39 סופקו בנדיבות על ידי דייוויד גוטמן (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס, מיזורי). איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#5/45 מלקחייםדומונט 11251-35צורת קצה: זווית 45°
4200 TapestationAgilentG2991BAלאמת את תקינות ואיכות ה-RNA, מדידת ערכי RIN
במיכל חנקן נוזלי ספסלThermo Fisher2122או מיכל אחר בטוח לקריו
בקרת ChowPicoLab5053דיאטות מחקר D12328 (דל שומן, דל סוכר).
מלקחיים מעוקליםקול פארמרUX-10818-25צורת קצה: מעוקל 90°
חיתוך ידית להבCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, #10 עד #15 להבים
EMS SuperCut Dissection מספרייםמיקרוסקופ אלקטרונים מדעי72996-015½ " (139.7 מ"מ),
נוגדן GFAPAbcamab7260מדולל 1:350. בלוק עם 10% סרום המכיל 0.3 M גליצין.
להבים כירורגיים מפלדת פחמן Glassvan, גודל 11MYCO רפואי2001T-11# 11 להבים מאפשרים כף מעבדה מיקרו ישרה, חתך שטוח
Az ScilabA2Z-VL001נירוסטה, מספריים מיקרו ניתנים לחיטוי
Rubis78180-1C3דגם 1C300
Minivette  POCT ניטרליSarstedt17.2111.050נפח נומינלי: 50 ומיקרו; L, ללא הכנה
NanoropThermo Fisher13-400-519למדוד ריכוז RNA, 260/280 יחסים
דיאטה השמנהResearchdiets.comD12331כולל עשיר בשומן וסוכרוז
תרמופישרTR13421זיהוי קולורימטרי
ובטא;-נוגדן אקטיןאיתות תאים8457לדלל 1:1,000.
ניתן להשתמש גם ישר מגיב כולסטרול

מקורות

  1. Listernick, R., Darling, C., Greenwald, M., Strauss, L., Charrow, J. Optic pathway tumors in children: the effect of neurofibromatosis type 1 on clinical manifestations and natural history. J Pediatr. 127 (5), 718-722 (1995).
  2. Fisher, M. J., et al. Integrated molecular and clinical analysis of low-grade gliomas in children with neurofibromatosis type 1 (NF1). Acta Neuropathol. 141 (4), 605-617 (2021).
  3. Cimino, P. J., et al. Expanded analysis of high-grade astrocytoma with piloid features identifies an epigenetically and clinically distinct subtype associated with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 145 (1), 71-82 (2023).
  4. Lucas, C. -H. G., et al. Multiplatform molecular analyses refine classification of gliomas arising in patients with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 144 (4), 747-765 (2022).
  5. Fisher, M. J., et al. Management of neurofibromatosis type 1-associated plexiform neurofibromas. Neuro-Oncol. 24 (11), 1827-1844 (2022).
  6. Packer, R. J., et al. Plexiform neurofibromas in NF1. Neurology. 58 (10), 1461-1470 (2002).
  7. Evans, D. G. R., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet. 39 (5), 311(2002).
  8. Prudner, B. C., Ball, T., Rathore, R., Hirbe, A. C. Diagnosis and management of malignant peripheral nerve sheath tumors: Current practice and future perspectives. Neurooncol Adv. 2, Suppl 1 i40-i49 (2020).
  9. Ma, Y., et al. A molecular basis for neurofibroma-associated skeletal manifestations in NF1. Genet Med. 22 (11), 1786-1793 (2020).
  10. Ozarslan, B., Russo, T., Argenziano, G., Santoro, C., Piccolo, V. Cutaneous findings in neurofibromatosis Type 1. Cancers. 13 (3), 463(2021).
  11. Hyman, S. L., Shores, A., North, K. N. The nature and frequency of cognitive deficits in children with neurofibromatosis type 1. Neurology. 65 (7), 1037-1044 (2005).
  12. Morris, S. M., et al. Disease burden and symptom structure of autism in neurofibromatosis type 1: a study of the International NF1-ASD Consortium Team (INFACT). JAMA Psychiatry. 73 (12), 1276-1284 (2016).
  13. Geoffray, M. -M., et al. Predictors of cognitive, behavioural and academic difficulties in NF1. J Psychiatr Res. 140, 545-550 (2021).
  14. Monroe, C. L., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Dissecting clinical heterogeneity in neurofibromatosis type 1. Ann Rev Pathol. 12 (1), 53-74 (2017).
  15. Kehrer-Sawatzki, H., Mautner, V. -F., Cooper, D. N. Emerging genotype-phenotype relationships in patients with large NF1 deletions. Hum Genet. 136 (4), 349-376 (2017).
  16. Hou, Y., et al. Predictors of cognitive development in children with neurofibromatosis type 1 and plexiform neurofibromas. Dev Med Child Neurol. 62 (8), 977-984 (2020).
  17. Biotteau, M., et al. Sporadic and familial variants in NF1: an explanation of the wide variability in neurocognitive phenotype. Front Neurol. 11, 368(2020).
  18. Rodriguez, A., et al. Maternal adiposity prior to pregnancy is associated with ADHD symptoms in offspring: evidence from three prospective pregnancy cohorts. Int J Obes (Lond). 32 (3), 550-557 (2008).
  19. Andersen, C. H., Thomsen, P. H., Nohr, E. A., Lemcke, S. Maternal body mass index before pregnancy as a risk factor for ADHD and autism in children). Eur Child Adolesc Psychiatry. 27 (2), 139-148 (2018).
  20. Pugh, S. J., et al. Gestational weight gain, prepregnancy body mass index and offspring attention-deficit hyperactivity disorder symptoms and behaviour at age 10. Bjog. 123 (13), 2094-2103 (2016).
  21. Mina, T. H., et al. Prenatal exposure to maternal very severe obesity is associated with impaired neurodevelopment and executive functioning in children. Pediatr Res. 82 (1), 47-54 (2017).
  22. Oken, E., et al. Analysis of maternal prenatal weight and offspring cognition and behavior: Results from the Promotion of Breastfeeding Intervention Trial (PROBIT) Cohort. JAMA Netw Open. 4 (8), e2121429-e2121429 (2021).
  23. Buss, C., et al. Impaired executive function mediates the association between maternal pre-pregnancy body mass index and child ADHD symptoms. PLOS ONE. 7 (6), e37758(2012).
  24. Li, Y. -M., et al. Association between maternal obesity and autism spectrum disorder in offspring: a meta-analysis. J Autism Dev Disord. 46 (1), 95-102 (2016).
  25. Dow, C., Galera, C., Charles, M. -A., Heude, B. Maternal pre-pregnancy BMI and offspring hyperactivity-inattention trajectories from 3 to 8 years in the EDEN birth cohort study. Eur Child Adolesc Psychiatry. 32 (10), 2057-2065 (2023).
  26. Fast, K., et al. Prevalence of attention-deficit/hyperactivity disorder and autism in 12-year-old children: A population-based cohort. Devl Med Child Neurol. 66 (4), 493-500 (2023).
  27. Carter, S. A., et al. Maternal obesity and diabetes during pregnancy and early autism screening score at well-child visits in standard clinical practice. Autism. 28 (4), 975-984 (2023).
  28. West, Z., et al. Relationships between maternal body mass index and child cognitive outcomes at 3 years of age are buffered by specific early environments in a prospective Canadian birth cohort. J Dev Orig Health Dis. 14 (1), 42-52 (2023).
  29. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3, 17004(2017).
  30. Martins, A. S., et al. Lower fasting blood glucose in neurofibromatosis type 1. Endocr Connect. 5 (1), 28-33 (2016).
  31. Martins, A. S., et al. Increased insulin sensitivity in individuals with neurofibromatosis type 1. Arch Endocrinol Metab. 62 (1), 41-46 (2018).
  32. Brossier, N. M., Thondapu, S., Cobb, O. M., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Temporal, spatial, and genetic constraints contribute to the patterning and penetrance of murine Neurofibromatosis-1 optic glioma. Neuro Oncol. 23 (4), 625-637 (2020).
  33. de Lurdes Pinto, M., et al. Technical Report: Mouse fetal blood collection taking the best out of the old needle-syringe method. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science. 35 (1), 5(2008).
  34. Musillo, C., et al. Bdnf-Nrf-2 crosstalk and emotional behavior are disrupted in a sex-dependent fashion in adolescent mice exposed to maternal stress or maternal obesity. Transl Psychiatry. 13 (1), 399(2023).
  35. Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8233-8238 (2006).
  36. Anastasaki, C., et al. Human induced pluripotent stem cell engineering establishes a humanized mouse platform for pediatric low-grade glioma modeling. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 120(2022).
  37. Cai, H. -J., Xie, C. -L., Chen, Q., Chen, X. -Y., Chen, Y. -H. The relationship between hepatic low-density lipoprotein receptor activity and serum cholesterol level in the human fetus. Hepatology. 13 (5), 852-857 (1991).
  38. Toonen, J. A., et al. NF1 germline mutation differentially dictates optic glioma formation and growth in neurofibromatosis-1. Hum Mol Genet. 25 (9), 1703-1713 (2016).
  39. Guo, X., Pan, Y., Gutmann, D. H. Genetic and genomic alterations differentially dictate low-grade glioma growth through cancer stem cell-specific chemokine recruitment of T cells and microglia. Neuro Oncol. 21 (10), 1250-1262 (2019).
  40. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  41. Meyer, N., et al. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLOS ONE. 15 (9), e0238895(2020).
  42. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  43. Jung, J., Garnett, E., Rector, K., Jariwala, P., Devaraj, S. Effect of collection tube type on glucose stability in whole blood. Ann Clin Lab Sci. 50 (4), 557-559 (2020).
  44. Bonetti, G., et al. Which sample tube should be used for routine glucose determination. Prim Care Diabetes. 10 (3), 227-232 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

איסוף מוח עובריאיסוף סרוםמודל עכבריתזונה אובסוגניתדיסקציה של המוחניתוח מאקרו-נוטריאנטיםגליומה של המסלול האופטי
איסוף במקביל של מוח וסרום מורין עוברי להערכת ההשפעות של תזונה אימהית על תזונה והתפתחות עצבית בנוירופיברומטוזיס סוג 1
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.