אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

Summary

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

Abstract

הובלה אקסונלית היא תנאי מוקדם להעברת חלבונים אקסונליים מאתר הסינתזה שלהם בגוף התא העצבי ליעדם באקסון. כתוצאה מכך, אובדן הובלה אקסונלית פוגע בגדילה ובתפקוד העצביים. חקר התחבורה האקסונלית משפר אפוא את הבנתנו את הביולוגיה של התא העצבי. עם השיפורים האחרונים בעריכת הגנום של CRISPR Cas9, תיוג אנדוגני של מטענים אקסונליים הפך לנגיש, ומאפשר להתקדם מעבר להדמיה מבוססת ביטוי חוץ רחמי של תחבורה. עם זאת, תיוג אנדוגני מגיע לעתים קרובות במחיר של עוצמת אות נמוכה ומחייב אסטרטגיות אופטימיזציה כדי להשיג נתונים חזקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לייעל את ההדמיה של תחבורה אקסונלית על ידי דיון בפרמטרים של רכישה וגישה הלבנה כדי לשפר את האות של מטען מסומן אנדוגני על רקע ציטופלזמי מפוזר. אנו מיישמים את הפרוטוקול שלנו כדי למטב את ההדמיה של מבשרי שלפוחית סינפטית (SVPs) המסומנים על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג RAB-3 כדי להדגיש כיצד כוונון עדין של פרמטרי רכישה יכול לשפר את הניתוח של מטען אקסונלי מסומן אנדוגנית ב- Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

במהלך החיים, תאי עצב מסתמכים על הובלה אקסונלית כדי להעביר חלבונים, שומנים ומולקולות אחרות מגוף התא ליעדם הסופי באקסון. כתוצאה מכך, פגיעה בתחבורה אקסונלית קשורה לאובדן תפקוד עצבי ולעתים קרובות מעורבת בפתולוגיה של הפרעות נוירודגנרטיביות ^1,2. לפיכך, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס ההובלה האקסונלית היא בעלת עניין רב.

כמה עשורים של מחקר על הובלה אקסונלית חשפו תובנות חשובות רבות על המנגנון המולקולרי המתווך תחבורה זו, הרכבם כמו גם מנגנוני הבקרה. העברה אקסונלית ארוכת טווח מתרחשת על שלד הציטובול של המיקרוטובול, המורכב מפולימרים מיקרוטובולים חופפים חלקית שבדרך כלל מכוונים עם קצה הפלוס שלהם החוצה באקסונים³. כתוצאה מכך, ההובלה האנטרוגרדית מתווכת על ידי חלבונים מוטוריים ההולכים לקצה הפלוס של מיקרוטובולים, קינזינים, בעוד שההובלה המדרדרית תלויה במנוע הדינאין המכוון לקצה המינוס. למרות שהיבטים רבים של הובלה נחשפו, עבור חלבונים אקסונליים רבים עדיין לא ברור, כיצד הם נטענים לתוך מכונות ההובלה, כיצד חבילות הובלה בודדות מאורגנות, וכיצד הובלה זו מוסדרת³.

הובלה אקסונלית נחקרה לראשונה בניסויי תיוג רדיו, שבהם הוזרקו חומצות אמינו רדיואקטיביות לתא הסומטי, שם הן שולבו בחלבונים אנדוגניים מתהווים וניתן היה לעקוב אחריהן לאורך זמן בתא האקסונלי על ידי אוטורדיוגרפיה⁴. למרות שניסויי תיוג רדיו אפשרו מחקר של הובלה אקסונלית של חלבונים אנדוגניים in vivo, הם אינם מאפשרים מעקב ישיר אחר התנהגותם של מטענים בודדים כדי לקבל תובנות מכניסטיות⁴. מגבלה זו התגברה עם השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, לעתים קרובות העברה אקסונלית אינה מומחשת על חלבונים אנדוגניים אלא על ידי ביטוי של עותק פלואורסצנטי מסומן. במיוחד עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך, ביטוי יתר מספק עוצמות אות גבוהות יותר אשר מאפשרות ויזואליזציה, רצוי ברזולוציה של נוירון יחיד. יתר על כן, ביטוי חוץ רחמי של החלבון המתויג הפלואורסצנטי עוקף את הצורך והאתגרים של עריכת גנום. לעומת זאת, נטען כי התנהגותו של מטען מבוטא אקטופית עשויה להיות שונה מהתנהגות המטען האנדוגני⁵.

שיפורים אחרונים בעריכת הגנום הפכו את אסטרטגיות התיוג האנדוגניות לנגישות יותר. לפיכך, עוצמת אות נמוכה יותר הפכה למגבלה העיקרית לחקר הובלה אקסונלית של מטען על ידי ביטוי חוץ רחמי במקום תיוג אנדוגני. שיקולים זהירים באסטרטגיית הסימון האנדוגנית בשילוב עם אופטימיזציה של תנאי הרכישה יכולים להתגבר על אתגר זה.

נמטודות מספקות מודל מחקר מצוין לחקר הובלה אקסונלית in vivo בשל שקיפותן וקלות המניפולציות הגנטיות שלהן. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיית מחקר כדי לדמיין הובלה אקסונלית של חלבונים אנדוגניים עם רזולוציה של נוירון יחיד ב- Caenorhabditis elegans חיים. אנו מדמיינים את ההובלה האקסונלית של מבשרי שלפוחית סינפטית באמצעות זן שנוצר על ידי מעבדת יורגנסן⁶, שבה השלפוחית המשויכת ל- RAB GTPase, RAB3, מסומנת אנדוגנית עם GFP, בנוירון המוטורי DA9. על ידי השאלה כיצד התאמות קטנות בפרמטרים שונים של רכישה והלבנה יכולות לשפר את ההדמיה של אירועי הובלה בודדים, הפרוטוקול מספק רעיונות כיצד לייעל את תנאי ההדמיה.

Protocol

לקבלת פרוטוקול מפורט כיצד לשמור ולהכין נמטודות לדימות תאים חיים, עיין בעבודתו של S.Niwa ⁷.

1. יצירת זן תולעים

בנוסף לייצור זני נמטודות, המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)⁸ מכיל אוסף גדל והולך של זני נמטודות עם חלבונים מתויגים פלואורסצנטית אנדוגנית שניתן להשיג ישירות מדף האינטרנט שלהם.

1. בחירת אסטרטגיית התיוג הפלואורסצנטי
   1. השתמש בזן הנמטודה MTS1161, המכיל את אלל RAB-3(ox699)⁶, כדי לדמיין GFP אנדוגני המסומן RAB-3 בנוירון המוטורי DA9 (הזן יופקד ב- CGC). כדי להמחיש חלבונים אקסונליים אחרים, צור זן נמטודה עם חלבון מתויג אנדוגני באמצעות פרוטוקול העריכה CRISPR Cas9 ממעבדת Mello^{Lab 9}.
      הערה: MTS1161 משתמש בגישת רקומבינציה לתא ספציפי לתייג RAB-3 באופן אנדוגני עם תג GFP⁶. גישה חלופית נפוצה מבוססת על הרכבה מחדש של חלבון פלואורסצנטי מפוצל, המומלץ לחלבונים בעלי ביטוי נמוך במיוחד מכיוון שהוא משפר את מספר העותקים הפלואורסצנטיים לכל חלבון אנדוגני על ידי שימוש במספר עותקים פלואורסצנטיים מפוצלים¹⁰. בתחילה ניתן להעריך את מספר העותק בהתבסס על ערכות נתונים של תמלול מדף האינטרנט CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. בחירה של נוירון כדי לדמיין תחבורה אקסונלית
   1. בזן MTS1161, דמיינו את RAB-3 בתא העצב המוטורי DA9 (ראו איור 1). עבור מטענים אקסונליים אחרים, במיוחד חלבונים בעלי ביטוי נמוך, זהה נוירון שבו רמות הביטוי של החלבון המנותח הן הגבוהות ביותר באמצעות דף האינטרנט CenGen.
      הערה: פרויקט CenGen (cengen.org) מספק משאב מקוון נהדר להערכת רמות ביטוי עבור חלבון בעל עניין בתאי עצב רבים בנמטודה בהתבסס על מערך נתונים תעתיק גדול המכסה את כל 302 תאי העצב של מערכת העצבים C. elegans ^12,13.

2. טיפול בתולעים והכנה להדמיה

1. שמור נמטודות על מדשאה של חיידקים (זן: OP50) שנזרעו על לוחות בינוניים לגידול נמטודות ב -20 מעלות צלזיוס וגדלו עד גיל של יום אחד לתוך הבגרות לצורך הדמיה.
   הערה: מדידת הובלה אקסונלית בשלב גיל מוגדר חשובה מכיוון ששיעורי ההובלה יורדים עם ההזדקנות באופן עקבי על פני מטענים אקסונליים שונים, קבוצות נוירונים ואורגניזמים 14,15,16,17,18-נמטודות בשלב הזחל L4 או יום אחד לתוך הבגרות שימשו ברוב המאמרים ולכן מציעים את מערכי הנתונים הגדולים ביותר להשוואות.
2. הכנת נמטודות לדימות תאים חיים: בצע את כל השלבים הבאים עם מיקרוסקופ סטריאו כדי להמחיש את התולעים ולטפל בהן.
   1. מעבירים נמטודות לטיפה של 0.5 mM Levamisole באמצעות פיק חוט פלטינה ודוגרים על הנמטודות במשך 20 דקות בטיפת.
   2. הרכיבו בזהירות 10-20 נמטודות מטיפת הלבמיסול לתוך טיפה של 12 μL של מדיום M9 על מדבקה של 10% אגרוז (מומס בתווך M9) על מגלשת זכוכית באמצעות פיק שיער. לקבלת הליך מפורט על איך לעשות תיקון agarose 10%, עיין בפרוטוקול של S.Niwa⁷.
      הערה: הרכבה של מספר נמוך של נמטודות מספיקה מכיוון שרק בעלי חיים מעטים יצולמו בכל שקופית לפני שהחיות יתחילו לסבול מהיפוקסיה.
   3. הניחו את החלקת הכיסוי על גבי הטיפה (22 מ"מ x 22 מ"מ או 18 מ"מ x 18 מ"מ). להעברת הדמיה באקסון DA9, מקם את האקסון קרוב להחלקת הכיסוי. כדי לעשות זאת, סובבו את החלקת הכיסוי ב-45° לאחר הנחתה על גבי חלקת האגר, כדי לגלגל את החיות על גבן.
   4. אטמו את הרווח בין החלקת הכיסוי למגלשת הזכוכית בג'ל צמיגי כמו פטרולאטום. זה ימנע את התייבשות מדבקת האגרוז, מה שעלול לגרום לנמטודות להיסחף אל מחוץ לשדה ההדמיה.
      הערה: חשוב להתייחס לבעלי החיים בעדינות ככל האפשר. ריכוזים גבוהים מדי של לבמיזול או נזק פיזי לתולעת עלולים לפגוע בהובלה האקסונלית. עוויתות קלות של הזנב במהלך ההדמיה הן סימן טוב לכך שהחיה נשארת במצב בריא. בעלי חיים נשארים בריאים ואף יכולים להתאושש ממדבקת האגרוז לאחר ההדמיה.

3. מיקרוסקופ תאים חיים

הערה: ערכי פרמטרי רכישה מדויקים עשויים להיות שונים בין מיקרוסקופים. עם זאת, מגמות עבור כל פרמטר רכישה צריך להיות עצמאי המיקרוסקופ בשימוש. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי מסתובב שצויד בקו לייזר נפרד להלבנה (ראו טבלת חומרים לפרטים על המיקרוסקופ). פלואורסצנטיות ירוקה הורגשה על ידי לייזר 488 ננומטר והפליטה סוננה על ידי מסנן פליטה ET525/36. ההלבנה בוצעה באמצעות קו לייזר 488 ננומטר.

1. ודא כי הטמפרטורה של החדר, או אם שלב מבוקר טמפרטורה זמין, מוגדר לטמפרטורה קבועה. עבור נמטודות, הגדר את הטמפרטורה ל 20 °C (75 °F).
2. הרכיבו את המגלשה והשתמשו בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של 4x-20x כדי לאתר את הנמטודות בשקופית ולשנן מיקומים. עבור לעדשת הגדלה של 63x לרכישת תמונה.
3. צלם תמונה אחת כדי לבדוק פרמטרים ראשוניים של רכישה. עקוב אחר עוצמות האות בשדה הראייה באמצעות היסטוגרמת העוצמה של תוכנת הרכישה. ערכי עוצמה צריכים לכסות את השליש התחתון של האות המרבי שהמצלמה יכולה לזהות. הימנע מרוויה של פיקסלים. שפר את עוצמת לייזר העירור אם עוצמת האות נמוכה מדי.
   הערה: אין להשתמש בעוצמות לייזר עירור גבוהות מדי מכיוון שהוא מלבין את החלבון הפלואורסצנטי במהלך חלוף זמן.
4. שנה את פרמטר הרכישה ואת השלבים כאן כדי למטב את זיהוי האות הפלואורסצנטי.
   1. יישום שלב הלבנה: אקונומיקה של אזור האקסון שעומד להיות מנותח באמצעות קו לייזר 488 ננומטר (הספק: 15 mW) עבור שלב ההלבנה. יש לשאוף ליעילות הלבנה של 90% לפחות. קבע את יעילות ההלבנה על ידי השוואת עוצמת האות של האזור לפני ואחרי שלב ההלבנה.
      הערה: הלבנה משפרת את האות של חלקיקים נעים על ידי הורדת האות הנובע מחלקיקים נייחים, כמו גם מהאות הנובע מהחלק הציטופלזמי של החלבון ברקע. למטען ממברנטי, כמו RAB-3 על מבשרי שלפוחית סינפטית, יש מקטע ציטופלזמי נמוך, כך ששלב ההלבנה משפר רק במעט את האות של חבילת ההובלה על הרקע הציטופלזמי (איור 2A,D). אולם הלבנה משפרת מעקב אחר אירועי הובלה בודדים על פני מרחקים ארוכים יותר ומאפשרת לכמת זמני השהיה (איור 2A).
   2. Binning: השתמש באיגוד 2 x 2 כדי לשפר את עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים. Binning משלב מערכי פיקסלים לפיקסל אחד גדול יותר. זה יפחית את הרזולוציה המרחבית אבל ישפר את עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים, וזה מועיל במיוחד עבור חלקיקים עמומים (איור 2B,D).
   3. זמן חשיפה: שפר את זמן החשיפה כדי לשפר את עוצמת האות. שיפור זמן החשיפה משפר את עוצמת האות של הדגימה לעלות של קבלת רזולוציית זמן נמוכה יותר עבור אירועי ההובלה. לצורך הניסוי כאן, השתמש ברזולוציה זמנית של 300 מילישניות עד 700 מילישניות בין נקודות זמן רצופות (זמן חשיפה של 100-500 מילישניות) כדי לעקוב אחר אירועי הובלה בודדים של RAB-3. (איור 2C,D)
5. הקלטת קיטועי זמן: קח קיטוע זמן של לפחות 1-3 דקות בהתאם לעוצמת האות של החלבון, כמו גם לתדירות של אירועי הובלה בודדים. לאחר שנרשם פרק זמן עברו לחיה הבאה. אין לצלם בעלי חיים בשקופית במשך יותר מ-30 דקות כדי להבטיח שבעלי החיים המתועדים נמצאים במצב בריא.
   הערה: עוויתות קלות של זנב החיות במהלך ההקלטה הן אינדיקטור לכך שהחיה עדיין חיה.

4. ניתוח נתוני תעבורה אקסונליים

הערה: השתמש ב- ImageJ/Fiji¹⁹ לשלבי ניתוח התמונה הבאים. פיג'י מסוגלת לקרוא נתונים לפי כל חבילות התוכנה הנפוצות למיקרוסקופיה.

1. יצירת קימוגרף
   1. ייבוא נתונים: יבא את קובץ הנתונים עם קיטועי הזמן לפיג'י. במקרה שהוא לא יכול לייבא את הנתונים לפיג'י, ייצא את הקלטת הזמן כקובץ tiff מחבילת התוכנה וטען אותו לאחר מכן לפיג'י.
   2. תיקון סחף: בדוק אם מקטע החיה/אקסון זז או נסחף מעט במהלך רכישת התמונה. נכון לתנועת בעלי חיים או היסחפות על ידי הפעלת התוסף StackReg²⁰. בעת הפעלת התוסף, בחר את טרנספורמציית הגוף הנוקשה .
   3. יצירה ידנית של קימוגרף: הליך מפורט שלב אחר שלב מוצג באיור 3. השתמש בסרט תיקון הסחף כדי ליצור את הקימוגרף. השתמש בכלי קו מקוטע והתאם את רוחב הקו כך שיתאים לקוטר האקסון על-ידי לחיצה כפולה עם לחצן העכבר השמאלי על סמל הקו המקוטע כדי לצייר קו לאורך מקטע האקסון שינותח. הפעל את תוסף ImageJ/Fiji Kymoreslicewide כדי ליצור את הקימוגרף ולנצל את ערך העוצמה המרבית לרוחב הקו בהגדרות הפרמטרים שלו.
      הערה: שמירה על עקביות בכיוון ציור הקו (למשל, תמיד קרוב לאקסון דיסטלי או הפוך) מפשטת את כיוון התנועה לאחור בקימוגרפים.
2. ניתוח פרמטר התחבורה
   1. חשב את פרמטר התחבורה: מספר אירוע, מהירות, אורך ריצה ומשך השהיה מהקימוגרף על ידי ביצוע השלבים הבאים.
      1. עקוב אחר אירועי תעבורה בקימוגרף: השתמש בכלי קו ישר כדי לעקוב אחר אירועי תעבורה בודדים בקימוגרף. שמור כל שורה למנהל החזר ההשקעה ועקוב אחר כל אירועי התחבורה בקימוגרף. בחרו בפרמטרי המדידה הבאים ב- ImageJ/Fiji: שטח, מלבן תוחם, ערך אפור ממוצע, קוטר Feret.
      2. חישוב פרמטר תעבורה: הדבק את טבלת התוצאות בגיליון אלקטרוני והשתמש בעמודות הבאות של מקטעי התוצאות כדי לחשב:
         אורך הפעלה: הכפל את הרוחב (בפיקסל) ברזולוציה של המצלמה (לדוגמה, x μm/pxl) כדי לקבוע את אורך ההפעלה במיקרומטר.
         מהירות: אורך הריצה/משך הריצה. כדי לקבוע את משך הזמן של אירוע תנועה בשניות, הכפל גובה (בפיקסל) בזמן הרכישה בין נקודות זמן עוקבות (לדוגמה, x s/pixel).
         זמן השהיה: משך הריצה בין שתי תנועות רצופות שבהן המהירות היא 0.
         מספר אירוע: ניתן לנרמל את סך האירועים לאורך הכולל של הקימוגרף כדי לקבוע את מספר האירוע לדקה ואת מקטע אורך האקסון (axon length). ניתן לסווג אירועים נוספים לאירועי תחבורה אנטרוגרדיים ונסוגים. כדי לקבוע את הכיווניות של כל אירוע תנועתי, השתמש בכלי זווית Feret. בקימוגרפים שנוצרו בתחילה על ידי שרטוט הקו המקוטע מפרוקסימלי לדיסטלי ואירועי ההובלה האנטרוגרדית בקימוגרף מצביעים מימין לשמאל, זווית פרט < 90° תצביע על אנטרוגרד ו->90° אירוע נסוג, אחרת זה יהיה הפוך.

Results

סקירה כללית של מערכת המודל והליך המדידה
כדי להמחיש הובלה אקסונלית של מבשרי שלפוחית סינפטית, עקבנו אחר GFP אנדוגני שכותרתו RAB-3. כאן אנו עושים שימוש בזן GFP שנוצר לאחרונה::Flip-on::RAB-3 זן⁶, שבו ביטוי של רקומבינאז פליפאז תחת מקדם ספציפי לתא (glr-4p) מתייג RAB-3 אנדוגני בנוירון המוטורי DA9. DA9 הוא תא עצב מוטורי דו-קוטבי, שגוף התא שלו ממוקם בחלק האחורי של החיה בצד הגחוני, קרוב לפי הטבעת (איור 1A). הוא מכיל דנדריט קצר העובר קדמית לאורך חוט העצב הגחוני ואקסון ארוך העובר אחורי, יוצר קומיסורה ולאחר מכן רץ קדמי לאורך חוט העצב הגבי, שם הוא יוצר סינפסות עוברות המעצבבות את השריר הגבי ואת נוירון VD 22,23,24. אנו מדמיינים תחבורה אקסונלית באזור האסינפטי; את רוב אירועי התחבורה ניתן לצלם באמצעות מישור מוקד יחיד (איור 1A). שלב ראשוני של הלבנת תמונות מיושם כדי להפחית את הרקע של שלפוחיות נייחות באזור הזה, שלעתים קרובות נוטות לעצור באזור הזה (איור 1B). סרטוני קיטועי זמן מוקלטים במשך 3 דקות, והאות RAB-3 לאורך האזור האסינפטי משורטט לתוך קימוגרף כדי לחלץ אירועי הובלה בודדים (איור 1C).

התאמת פרמטר הרכישה כדי למטב את התצוגה החזותית של תעבורה אקסונלית
כדי להתגבר על עוצמת האות הנמוכה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים אנדוגניים, יש לייעל את פרמטרי הרכישה של המיקרוסקופ. לכימות חזק של אירועי תחבורה, עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים צריכה להיות בהירה ככל האפשר על רקע ציטופלזמי או מטען נייח מושהה. מבשרי שלפוחית סינפטית עוצרים לעתים קרובות באזור האסינפטי בבריכות שלפוחית נפרדות, מה שמפריע לזיהוי שלפוחיות נכנסות חדשות ומקשה על מעקב אחר עקבות ההובלה שלהן⁷.

שלב הלבנה פלואורסצנטי ראשוני יחיד יכול להפחית באופן משמעותי את האות הפלואורסצנטי הנובע מבריכות השלפוחיות כדי לשפר את זיהוי התנועה של שלפוחיות נכנסות חדשות (איור 2A). שלב ההלבנה שיפר רק במעט את האות של העברת בועיות RAB-3 מעל עוצמת הרקע הציטופלזמית, ככל הנראה מאחר שהחלק הציטופלזמי של RAB-3 נמוך מאוד (איור 2D).

השימוש בבינינג מספק שכבה נוספת לשיפור האות על רקע אירועי תעבורה בודדים על ידי שילוב מערך פיקסלים לפיקסל יחיד. בינינג של 2 x 2 יפחית בחצי את הרזולוציה המרחבית (כאן מ-108.33 ננומטר לפיקסל ל-216.7 ננומטר לפיקסל), וזה עדיין מספיק כדי לעקוב אחר חלקיקי הובלה בודדים של RAB-3 (איור 2B), אבל משפר מאוד את עוצמת האות של שלפוחיות בודדות (איור 2D). אלא אם כן נדרשת רזולוציה מרחבית גבוהה מאוד, ניתן להחיל כריכה גם כדי להמחיש מטענים אקסונליים רבים אחרים.

לאחר מכן, שאלנו כיצד שינויים בזמן החשיפה יכולים לשפר את עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים. כללנו במיוחד זמן חשיפה בניתוח כדי להראות גם שזמן חשיפה של עד 500 מילישניות עם 700 מילישניות בין נקודות זמן הדמיה עוקבות עדיין מספק רזולוציה טמפורלית שבה ניתן לעקוב אחר מבשרי שלפוחית סינפטית (איור 2C,D).

יצירה וניתוח קימוגרפים עם פיג'י
כדי ליצור קימוגרף ולנתח אירועי הובלה בודדים לפי השלבים באיור 3.

איור 1: סקירה כללית של מערכת המודל כדי להמחיש הובלה אקסונלית של RAB-3 פלואורסצנטי אנדוגני. (A) פאנל עליון: סקירה כללית של הנמטודה עם ציר אחורי-קדמי וגחוני-גבי מסומן. תא העצב המוטורי DA9 מסומן בכחול. לוח אמצע: הגדלת התצוגה של האזור הארוז המוצג בלוח העליון עם מידור DA9 מצוין. סינפסות En passant מודגשות בירוק, * מציין את פי הטבעת. שימו לב שהאקסון ממשיך בחוט העצב הגבי עד שהוא עובר את הפות. התיבה האדומה מציינת את אזור האזור האסינפטי. פאנל תחתון: תמונת מיקרוסקופ קונפוקלי של GFP אנדוגני המסומן RAB-3 באקסון הפרוקסימלי במישור מוקד יחיד. שימו לב שישנם כיורי שלפוחית של RAB-3 משהה ארוך יותר באזור האסינפטי, אם כי רוב צבירי האותות של RAB-3 באזור הסינפטי. האזור האסינפטי מסומן באדום. קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של הקלטה בהילוך מהיר כדי להמחיש העברה אקסונלית. כדי לשפר את העקיבות של חלקיקי הובלה בודדים על פני חלקיקים נייחים, האזור האסינפטי מלבין בתחילה. לוחות תחתונים באזור הקופסה הסגולה מציגים דוגמה לאירוע תנועה של אנטרוגרד (ראש חץ כתום) ונסיגה (ראש חץ כחול). חלוניות מלמעלה למטה מייצגות נקודות זמן רצופות. (C) רישום קיטועי זמן ב-(B) שורטט כקימוגרף (ייצוג דו-ממדי של זמן על מיקום). קווים אלכסוניים מייצגים אירועי תנועה שבהם השיפוע מציין את המהירות. קווים אנכיים מציגים אירועים נייחים. תיבה סגולה היא התקרבות של הקימוגרף כדי להדגיש את אירועי ההובלה המוצגים גם ב- (B) ולעקוב אחר אירועי התחבורה האנטרוגרדיים (כתום) והנסיגה. קווים אנכיים מקווקווים מציינים את אירועי ההשהיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אופטימיזציה של שלבי רכישה ופרמטרים לשיפור ההדמיה של מטען אקסונלי אנדוגני. GFP אנדוגני::RAB-3 הודגמו באזור האסינפטי של אקסון DA9 וצילמו תמונות של מישור מוקד יחיד במיקרוסקופ דיסק מסתובב קונפוקלי. קימוגרפים נרכשו כדי להמחיש אירועי הובלה בודדים בכיוון אנטרוגרד (מימין לשמאל) ובכיוון נסיגה (משמאל לימין) (A-C). (A) קימוגרפים מראים אירועי הובלה של RAB3 ללא (קימוגרפים שמאליים) או עם שלב הלבנה משולב. שים לב ששלב ההלבנה משפר את התצוגה החזותית של אירועי השהיה (מסומנים על-ידי ראשי חצים צהובים) בין אירועי העברה עוקבים (ראשי חץ כתומים). (B) יישום כריכה של 2 x 2 מסייע לשפר את עוצמת האות של אירועי הובלה חלשה של RAB3. התמונות נרכשו בזמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה, ועם (C) עלייה מצטברת של זמן החשיפה (מ-100 מילישניות בקצה השמאלי ל-500 מילישניות בקצה הימני) מסייעת לשפר את עוצמת האות של אירועי תעבורה בודדים. התמונות נרכשו ב 2 x 2 binning ובאמצעות שלב photobleaching ראשוני. כל הקימוגרפים מציגים משך כולל של 3 דקות והם מצוירים באותו קנה מידה, כך שקימוגרפים עם פחות נקודות זמן רכישה עקב חלוף זמן ארוך יותר בין נקודות הדמיה עוקבות הם בעלי אורך כולל קצר יותר של הקימוגרף. (D) כימות עוצמת האות לאירוע תעבורה לאחר חיסור פלואורסצנטיות רקע מקימוגרפים ב-(A-C). שימו לב שהכריכה ושלב האקונומיקה נרכשו בזמן חשיפה של 300 מילישניות. השוואה סטטיסטית באמצעות n אירועים עבור 100 מילישניות (n_{אירועים} = 27_{בn בעלי חיים} = 2), 200 מילישניות (n_{אירועים} = 30 ב- n_{בעלי חיים} = 2), 300 מילישניות (n_{אירועים} = 88 ב- n_{בעלי חיים} = 6), 500 מילישניות (n_{אירועים} = 12 ב- n_{בעלי חיים} = 1), 300 מילישניות ללא (w.o.) בינינג (n_{אירועים} = 31 ב_{- n בעלי חיים} = 3), 300 מילישניות עם (w) בינינג (n_{אירועים} = 88 ב- n_{בעלי חיים} = 6) ו- 300 מילישניות , 2 x 2 כריכה עם הלבנה (n_{אירועים} = 88_{בn בעלי חיים} = 6) וללא הלבנה. כל נקודת נתונים מייצגת את עוצמת האות של אירוע תעבורה בודד של RAB-3 לאחר חיסור רקע (ציטופלסמה של האקסון) בנקודת זמן אחת לאורך העקבה שנבחרה באופן אקראי. זמן החשיפה הושווה באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס ואחריו ההשוואה המרובה של דאן, בינינג והלבנת תמונות הושוו באמצעות מבחן מאן-ויטני זוגי. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צעד אחר צעד כדי ליצור קימוגרף ולמדוד אירועי הובלה בודדים. (A) לאחר טעינת הקלטת הווידאו לפיג'י, כלי הקו המקוטע משמש למעקב אחר קו לאורך המקטע האקסונלי שעומד להיות מנותח. (B) קימוגרף (פאנל ימני) נוצר באמצעות תוסף Kymoreslicewide עם הפרמטרים המתוארים בחלונית השמאלית. (C) אירועי הובלה בודדים מאותרים באמצעות כלי הקו הליניארי ומאוחסנים אצל מנהל החזר ההשקעה. החלונית הימנית מציגה את קביעות המדידה המשמשות ליצירת טבלת התוצאות. (D) התוצאות בטבלה משמשות לחישוב פרמטר התעבורה. תיבות מציינות פרמטרים חשובים המתוארים בסעיף שיטות של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מגבלות השיטה והשיטות החלופיות
בפרוטוקול זה, ביצענו אופטימיזציה של פרמטרי רכישה כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של RAB-3 המתויג אנדוגנית, המשויכת למבשרי שלפוחית סינפטית. כדי להמחיש את RAB-3, השתמשנו ב-FLIP-on::GFP::RAB-3 זן⁶ שפורסם לאחרונה וביטאנו את הרקומבינאז Flippase תחת מקדם ספציפי לתא (glr-4p)²⁵. אסטרטגיה זו מאפשרת לנו לתייג את RAB-3 עם פלואורופור GFP יחיד. RAB-3 קל יחסית לדמיין מכיוון שהוא מבוטא מאוד ומועשר מאוד על מבשרי שלפוחית סינפטית, כך שלאירועי הובלה בודדים יש עוצמת אות בהירה על פני אות נמוך הנובע מהרקע הציטופלזמי. חלבונים אקסונליים אחרים עשויים לדרוש אסטרטגיות אופטימיזציה נוספות מחוץ להגדרות המיקרוסקופ כדי לאפשר הדמיה של אירועי תחבורה. במיוחד עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך, מערכת split-GFP מספקת חלופה מצוינת. במערכת זו, GFP₁₁ מוכנס למוקד האנדוגני של החלבון המעניין ו- GFP_1-10 מבוטא ממקדם ספציפי לתא. יתרון גדול של מערכת זו הוא הגודל הקטן של תבנית תיקון הדנ"א (כ -70 נוקלאוטידים) שיש להחדיר גנומית, מה שהופך את הרקומבינציה ההומולוגית ליעילה יותר בהשוואה להחדרת ORF של תג הפלואורסצנטי כולו^26,27. בגלל גודלו הקטן, ניתן להחדיר מקטעי GFP₁₁ מרובים לחלבון האנדוגני, מה שמגביר את מספר פלואורופורי GFP משוחזרים לכל חלבון ובכך משפר את האות הפלואורסצנטי של החלבון האנדוגני ובכך של חבילת ההובלה²⁸.

בנוסף לתיוג החלבון בגישת split-GFP או GFP, ניתן להשתמש בפלואורופורים מקודדים גנטית אחרים שיש להם יתרונות וחסרונות ייחודיים לגבי תכונותיהם הפוטוכימיות, אשר הושוו לאחרונה²⁹. יתר על כן, ניתן להשתמש בפלואורופורים כימיים עם תכונות פוטוגרפיות נוספות על ידי תיוג אנדוגני של החלבון המעניין עם תג HALO או SNAP³⁰.

במיוחד עבור חלבונים ציטופלזמיים הנמצאים בשפע לאורך האקסון כולו, ייתכן שיהיה צורך בגישת תיוג מותנה. לאחרונה דמיינו מטען כזה, ספקטרין אנדוגני, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשתמש בתיוג מבוקר זמנית כדי להמחיש רק חלבוני ספקטרין מסונתזים חדשים. עבור תיוג מותנה ברזולוציית נוירון יחיד, שילבנו ביטוי מונע הלם חום של רקומבינאז עם מערכת GFP מפוצלת³¹.

אם מטרת המחקר היא להבין את ההובלה של אברונים, ביטוי של תחום חלבוני המשויך לאברון יכול לספק חלופה לביטוי אקטופי של החלבון באורך מלא.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
הכנה זהירה כדי לייעל את ההדמיה של החלבון בהתבסס על רמות ביטוי צפויות, כמו גם לבחור את אסטרטגיית התיוג האופטימלית הם קריטיים במיוחד עבור הדמיה מוצלחת של חלבונים מסומנים אנדוגניים. ניתן להעריך את רמות הביטוי של רוב החלבונים בתאי עצב רבים בהתבסס על מערך הנתונים התעתיק של Cengen¹³. ניתן לשפר את עוצמת האות הנמוכה הצפויה של אירועי הובלה עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך או ציטופלזמי על ידי חיבור עותקים מרובים של הפלואורופור. שים לב, עם זאת, כי בכל ניסוי תיוג, יש להקפיד לא לשבש את תפקוד החלבון המתויג. במקרה שיש פנוטיפ ידוע למוטציה המתאימה, חשוב לוודא שהתיוג אינו יוצר פנוטיפ זה. במקרים בהם אין פנוטיפ ידוע, נדרשות גישות חלופיות אשר ישתנו בכל מקרה לגופו.

שלב קריטי בהדמיה של אירועי הובלה אקסונליים הוא המצב הבריאותי של החיה. יש להתייחס לבעלי החיים בעדינות רבה ככל האפשר להכנת התמונה וכן במהלך ההדמיה (למשל, שימוש בפירמת שיער במקום בחוט מתכת להעברת בעלי חיים משותקים, מזעור זמן הדגירה בחומר המשתק, צמצום זמן ההדמיה כדי למנוע פוטוטוקסיות).

שינויים ופתרון בעיות
בעוד שאנו מתכוונים לייעל את הדמיית ההובלה האקסונלית של חלבונים אנדוגניים, אסטרטגיות האופטימיזציה עבור פרמטרים של רכישה חלות גם על חלבונים מבוטא חוץ רחמי. במיוחד אם רמות הביטוי האנדוגניות נמוכות מכדי לדמיין אירועי תחבורה, ביטוי חוץ רחמי של החלבון יכול לספק חלופה.

במקרה שלא ניתן לרשום אירועי הובלה למרות עוצמת אות חזקה של החלבון המסומן אנדוגני, בעלי החיים עשויים להיות במצב לא בריא. ניתן לפתור זאת על ידי הכנת בעלי חיים למיקרוסקופ תחת הליכי הכנה עדינים יותר (למשל, קיצור זמן הדגירה בחומר המשתק). לחלופין, אירועי תחבורה עשויים להיות נדירים, והקלטת וידאו של 3 דקות עשויה שלא להספיק כדי ללכוד אירועים. ניתן לייעל לכידת אירועי הובלה נדירים על ידי שיפור משך הקלטת הווידאו, על ידי הגדלת מספר בעלי החיים המצולמים, או על ידי הדמיה של בעלי החיים בשלב התפתחותי אחר שבו אירועי הובלה עשויים להיות תכופים יותר.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
(22 מ"מ x 22 מ"מ, No1); זכוכית כיסוי חותם זהב	תומאס סיינטיפיק	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
מיקרוסקופ: מיקרוסקופ הפוך Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, מצלמת Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA מטרת טבילת שמן, סורק פוטוסטימולציה של ניקון ב-488 ננומטר עם מסנן פליטה ET525/36	מיקרוסקופ
NIS-elements AR	תוכנת Nikon		עבור Nikon Ti2
שקופיות מיקרוסקופיה רגילות מנוקות מראש	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strainIdentifier		Source rab-3
(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	יופקד ב- CGC (https://cgc.umn.edu/)