בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

תאי מולר (MCs) הם תאי הגליה העיקריים והנפוצים ביותר הנמצאים ברקמת הרשתית. הם שחקני המפתח במתן שלמות מבנית ותפקודים מטבוליים בתוך הרשתית¹. המבנה האסטרטגי של MCs מתפרש על פני כל עובי הרשתית, ובכך מספק תמיכה לרשתית. בנוסף לתכונות דמויות הפיגומים שלהם, יש להם פונקציות מטבוליות עבור נוירונים ברשתית, המספקים להם מצעי אנרגיה, כולל גלוקוז ולקטט. תפקודים אלה חיוניים על מנת לשמור על תפקוד עצבי בריא. דווח כי MCs לקויים תורמים למחלות רשתית שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטינופתיה סוכרתית וגלאוקומה ^2,3. MCs יכולים להיות מקורות תאיים אנדוגניים לטיפול רגנרטיבי ברשתית¹. הם גם מהווים חלק משמעותי מהרשתית, וראיות חזקות מצביעות על כך שבכמה מינים, תאים אלה יכולים להיות מעוררים להחליף נוירונים חסרים². הם משתפים פעולה באופן מועיל עם נוירונים, וכפות הרגליים הסופיות של תאי מולר המסתעפים בחרוט פותחות בצפיפות את כלי הדם ומחברות את המרכיבים העצביים של הרשתית. על מנת לשמור על התפתחות עצבית ופלסטיות עצבית, תאי מולר משמשים כמצע רך לנוירונים, ומגינים עליהם מפני טראומה מכנית³. בנוסף, בנסיבות פתולוגיות, תאי מולר עשויים להתמיין לאבות עצביים או תאי גזע המשכפלים או מחדשים את הפוטורצפטורים והנוירונים^{שאבדו 2,3,4}. תאי מולר שומרים על המאפיינים של תאי גזע ברשתית, כולל רמות שונות של פוטנציאל להתחדשות עצמית והתמיינות ^5,6. לתא הגליה של מולר יש שושלת רשתית משמעותית המייצרת גורמים נוירוטרופיים, סופגת וממחזרת מוליכים עצביים, חוצצת יונים מרחבית ושומרת על מחסום הדם-רשתית על מנת לשמור על הרשתית בהומאוסטזיס ^7,8,9. זה מדגיש את הפוטנציאל של תאי מולר ככלי מבטיח בטיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות הקשורות לניוון הרשתית. תאי מולר הם תאי הגליה העיקריים המפוזרים ברחבי הרשתית, ומתחברים הן לנוירונים והן לכלי הדם. הם ממלאים תפקיד הגנה חיוני, ומספקים תמיכה מבנית ומטבולית חיונית לשמירה על הכדאיות והיציבות של תאי הרשתית. למרבה הצער, מעט מאוד פרוטוקולים נמצאים בספרות לבידוד תאי מולר ראשוניים מהרשתית^10,11.

אנו מציגים גישה משופרת לבידוד וטיפוח אמינים של תאי מולר ראשוניים של עכברים. פרוטוקול זה שימש בקבוצה שלנו כדי לבודד תאי מולר מעכברי בר מסוג C57BL/6 ועכברים טרנסגניים^12,13. עכברים בגילאי 5 עד 11 ימים, ללא העדפת מין, משמשים לפרוטוקול זה. תאים עברו עד 4 פעמים; עם זאת, ב P4 הם מפסיקים לדבוק צלוחיות, וזה הופך להיות קשה לגדל תרבות בריאה. התרבית מזוהמת לעתים קרובות בתאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE), ולכן יש להעביר את התאים לפחות פעם אחת לפני ביצוע ניסויים נוספים בקו התא. המעבר מאפשר בידוד נוסף ממזהמים. לכן, הפרוטוקול שהוצג מציע דרך מהירה ויעילה לבודד תאי מולר עכבר, אשר לאחר מכן יכול לשמש פלטפורמה אמינה לחקר מטרות טיפוליות והערכת טיפולים פוטנציאליים למחלות רשתית¹⁴.

כל הניסויים בבעלי חיים תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ונעשו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שלנו שאושר על ידי ועדת המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ומדיניות אוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מספר 2022-1160)

1. הכנת מדיה ופתרונות

1. הכן את תמיסת העיניים של תאי Müller על ידי השלמת Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, פרטים בטבלת החומרים) עם פניצילין/סטרפטומיצין בדילול של 1:1000. לדוגמה, עבור 10 מ"ל של DMEM, להוסיף 10 μL של פניצילין/סטרפטומיצין.
   הערה: זוהי מדיה פשוטה ללא סרום שהוכנה. כמו כן, חממו את המדיה המלאה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה לעבודות תרבית תאים.
2. הכינו מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא על ידי תוספת DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS, מומת חום), ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדוגמה (500 מ"ל של מדיה DMEM + 50 מ"ל של FBS + 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין).
3. הכינו תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% עם Collagenase IV בריכוז של 200 U/mL (טריפסין-EDTA משמש להמסת הכמות המחושבת של אבקת Collagenase IV כדי להגיע לריכוז הדרוש).

2. חינוך

1. המתת חסד אתית של העכבר באמצעות שאיפת CO₂ בהתאם להנחיות IACUC.
   1. בקצרה, הניחו את בעלי החיים בתא CO₂ כדי להחדיר 100% CO₂ בקצב מילוי של 30-70% מהנפח של התא עם CO₂ כדי להשיג את המטרה של חוסר הכרה מהיר תוך 2-3 דקות עם מצוקה מינימלית לעכברים.
   2. מכיוון שהעכברים נמצאים בגיל צעיר (~10 ימים), בצעו פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית כדי להבטיח המתת חסד נאותה.
2. לאחר עיקור אזור העבודה עם 70% אתנול, הניחו את העכבר על כרית תחתונה סטרילית.
3. חלץ את העיניים על ידי הנחת זרועות הפינצטה בחלק האחורי של העין, משיכה עדינה מאזור המסלול, והפעלת העיניים על ידי הפעלת לחץ עם פינצטה בסגנון 5/45 לאזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזיס.
   הערה: יש לעקר את כלי הדיסקציה עם 70% אתנול ולאחר מכן מלח חיץ פוספט לפני הנתיחה.
4. ודא כי עצב הראייה עדיין מחובר לעין על ידי enucleating העין לאט. הקפד למשוך את עצב הראייה (מזוהה חזותית כחוט לבן) מאחורי העין.
   הערה: שלב זה אינו חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ, וניתן לבצע אותו על ספסל מעוקר.

3. טיפול בעיניים הלומדות

1. כסו צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ברדיד אלומיניום ומלאו את הצינור ב-10 מ"ל של תמיסת העיניים של תא מולר.
2. הניחו את העיניים המנותחות בצינור של 15 מ"ל המכיל תמיסת עיניים של תאי מולר ואפשרו להן לשבת למשך הלילה, או כ-18 שעות, בטמפרטורת החדר.
3. לאחר 18 שעות, לרוקן את תמיסת העיניים ולשטוף בקצרה את העיניים עם 2-3 מ"ל של מחומם (37 ° C) פוספט חוצץ מלוחים (PBS).
4. דקרו את PBS והזיזו את העיניים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין. (הוכן בשלב 1.3).
   הערה: טריפסין משמש על כל העין enucleated, מתנהג כסוכן דיסוציאטיבי כדי להקל על הפרדת תאים משכבות הרשתית במהלך דיסקציה. ברשתית המנותחת יש תאים רבים, כולל תאי RPE, שהם דביקים ובעלי הסבירות הגבוהה ביותר לזהם את תרבית תאי מולר¹⁴. בדיקה מיקרוסקופית הראתה בבירור כי לאחר 5 ימי בידוד (במהלך שינוי המדיה הראשון), תאי RPE התנתקו מהצלחת ומתו¹³. המדיה המשמשת לבידוד RPE היא DMEM/F-12, בעלת הרכב שונה מ-DMEM (המשמש לבידוד תאי מולר), המכילה נתרן פירובט וגלוקוז נמוך.
5. מניחים את המנה באינקובטור ודגרים במשך 1.5 עד 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
6. לאחר הדגירה, מעבירים את העיניים לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה כ-5 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.

4. דיסקציה

הערה: הליך זה חייב להתבצע בתוך הסביבה הסטרילית של מכסה המנוע. לפיכך, חיוני לעקר ביסודיות את משטחי מכסה המנוע עם 70% אלכוהול, יחד עם כל הכלים ומיקרוסקופ הדיסקציה. ראוי לציין כי הסרטון הוקלט מחוץ למכסה המנוע לצורך ראות טובה יותר ומטרות הדגמה ברורות יותר.

1. הניחו חתיכה קטנה של רקמה מעוקרת ברמת מעבדה בצלחת כדי לסייע בייצוב העיניים במהלך הנתיחה. הניחו את העיניים מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להתחיל את הדיסקציה.
   הערה: השימוש ברקמה ברמת מעבדה מאפשר תמרון של העיניים בכלי מלא נוזל (מדיה שלמה), ומבטיח דיסקציה מדויקת.
2. השתמשו במספריים של Vannas ובפינצטה בסגנון M5S כדי להסיר את רקמת החיבור, השרירים החוץ-עיניים ועצב הראייה.
   1. תפסו את העין בפינצטה בסגנון M5S ובצעו חתך באזור האורה-סראטה בעזרת מספריים של Vannas או מחט של מזרק.
      הערה: קיים קו מעגלי בצבע תכלת בין החלק הקדמי והאחורי של העין הנקרא אורה סראטה (ora serrata), אשר יכול לשמש כנקודת ציון לכיווני מדויק במהלך הדיסקציה.
   2. אחזו את החתך בפינצטה בסגנון M5S ומשכו או קרעו את הקרנית מהחלק האחורי של העין. משכו פנימה במרווחים קטנים כדי להבטיח ששלמות הרשתית תישאר שלמה.
      הערה: שלבים אלה הם להסיר את החלק הקדמי של העין (קרנית, קשתית ועדשה) מהחלק האחורי של העין (רשתית עצבית ופיגמנטית).
   3. כדי לשמור על שלמות שכבות הרשתית, משוך בעדינות והסר את אפיתל פיגמנט הרשתית מהרשתית העצבית. הרשתית העצבית צריכה להיות נקייה מכל כתמים שחורים כדי להבטיח את טוהר הבידוד ככל האפשר, שכן שכבת RPE היא בדרך כלל דביקה ומחוברת לרשתית העצבית.
   4. חתכו את הרשתית העצבית המנותחת לחתיכות קטנות לפני שתאספו אותה בצלחת כדי להבטיח התפשטות הומוגנית של התאים בצלחת.
3. לוחית את הרשתית העצבית בבקבוק T25 המכיל 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.
4. לבסוף, מניחים את הבקבוק באינקובטור ודגרים ב 37 ° C ו 5% CO₂.

5. גידול תאי גליה ראשוניים

1. אין להזיז את הבקבוק במשך 3-5 ימים כדי לקדם את צמיחת התאים.
2. שנה את המדיה לאחר היום החמישי וכל יומיים לאחר מכן עד שהתאים יהיו 90% נפגשים.

6. מעבר תאי גליה ראשוניים של מולר

1. שאפו את מדיית תרבית התאים של מולר, ואחריה 2 מ"ל שטיפה ב-PBS, ושאפו החוצה את PBS. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (1x), או מספיק כדי לכסות את הצלחת.
2. דוגרים במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. ודא שהתאים מנותקים מהצלחת מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, אספו את תרחיף התא והוסיפו 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא שחומם מראש (37°C) (מוכן בשלב 1.2) לצינור האיסוף.
4. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 300 x גרם. לאחר שאיפת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא. מכיוון שמספר התא יכול להשתנות בהתאם למספר העיניים המנותחות, לכן, עדיף לספור את התאים לפני הזריעה והדגירה. צפיפות הזריעה המומלצת היא 3.0 x 10⁶ תאים בצלוחית T75.
   הערה: ניתן להעביר תאים עד 4-5 פעמים. עם זאת, תוצאות הניסוי העקביות ביותר נמצאות לאחר 1-2 מעברים.

7. Immunofluorescence

הערה: השתמש בפרוטוקול immunofluorescence כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של תאי Müller. להלן סקירה קצרה של פרוטוקול immunofluorescent. שלב זה מבוצע לאחר הקטע הראשון¹².

1. זרעו את התאים בשקופית תא תרבית תאים (30,000 תאים לבאר עבור שקופית של 8 בארות).
2. תרבית את התאים המבודדים במשך 24-48 שעות בתווך תרבית תאי מולר שלם (מוכן בשלב 1.2) ב 37 ° C ו 5% CO₂.
3. שאפו החוצה את המדיה ושטפו את שקופית התא עם 250-300 μL של 1x PBS על כל באר כאשר התאים הם 80-90% במפגש.
4. תקן את המגלשה למשך 10 עד 15 דקות ב 250-300 μL של 4% paraformaldehyde על כל באר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS / TX-100 (5 דקות כל אחד / 3x).
5. הוסף מאגר חוסם למשך שעה אחת ב- 37°C (ראה טבלת חומרים).
6. יש לשאוף את התמיסה החוסמת, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים הראשוניים הספציפיים לתאי מולר כדי לאשר את טוהר התאים המבודדים באמצעות גלוטמין סינטטאז ווימנטין ^5,12. דגירה במשך 3 שעות ב-37°C (באמצעות ריכוז נוגדנים של 1:100-1:200 בחיץ חוסם בנפח של 150-200 μL/slide). שטפו את המגלשה בשטיפות PBS/TX-100 (5 ו-10 דקות כל אחת).
   הערה: נוגדנים אלה נבחרו מכיוון שהם סימני היכר לזיהוי תאי מולר ולהבטחת ההצלחה והטוהר של תרבית תאי מולר.
7. מוסיפים את הנוגדן המשני (עם ריכוז נוגדנים שנע בין 1:1000 בחיץ חוסם ב-150-200 מיקרוליטר/שקופית) ודגרים במשך שעה אחת ב-37°C. לאחר מכן, שטפו עם PBS/Triton X-100, שלוש פעמים (5-10 דקות כל אחת).
8. החל טיפה של אמצעי הרכבה DAPI כדי לתייג את הגרעינים לפני כיסוי השקופית בכיסוי. הימנעו מבועות אוויר בעת הנחת הכיסוי.
9. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את השקופית וללכוד תמונות (ראה טבלת חומרים).
   הערה: תאים ממוקמים עם DAPI ב- ex/em 359/461 בהגדלה של 10x כדי לאתר תאים; הגדלה גבוהה יותר יכולה ללכוד תאים. אורכי גל אחרים יהיו תלויים בצבע הנבחר. צבע ירוק (GFP)- ex/em 488/510. צבע אדום (Cy3)- ex/em 555/569.

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום של תאי מולר מבודדים
כדי לאשר את הכדאיות, המורפולוגיה והתכונות הייחודיות של תאי מולר המבודדים, התאים נבדקו תחת מיקרוסקופ אור. תועדו תמונות P0 ו-P1 (איור 1A). כדי לבדוק את הזיהום של תאי מולר מבודדים בתאי RPE ולאשר את טוהרו, בוצעה צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) באמצעות נוגדנים ספציפיים לסמן תאי RPE, RPE65. תאי פיגמנט ברשתית האנושית (ARPE -19) שימשו כבקרה חיובית. תאי RPE מוכתמים RPE65 (אדום וכחול עבור צביעה גרעינית) מוצגים באיור 1B (פאנל תחתון). נוגדנים ספציפיים ל-RPE65 לא הכתימו את תאי מולר המבודדים (איור 1B, פאנל עליון). העובדה שה-RPE65 הכתים את תאי ARPE-19 (אדום) ולא הכתים את התאים המבודדים, מצביעה על כך שהתאים המבודדים אינם תאי RPE. נוכחות של פירובט גלוקוז נמוך בתקשורת קובע תנאים שליליים לצמיחה של תאי RPE. כתוצאה מכך, גם במקרה של זיהום תאי RPE, הם בסופו של דבר להתנתק מן הצלוחית.

יתר על כן, כדי לאשר את זהותם של תאים מבודדים, נעשה שימוש בצביעת אימונופלואורסצנטיות של תאי מולר עבור סמנים ספציפיים של תאי מולר כדי לאשר את הבידוד המוצלח של תאי מולר. חלבון נימה ביניים cytoskeleton שנקרא vimentin שימש12,13. נוסף על כך,נעשה שימוש גם בגלוטמין סינטטאז (GS), המזרז את התגובה של עיבוי גלוטמט ואמוניה ליצירת גלוטמין, כפונקציה מרכזית של תאי גליה מולר ברשתית.

באופן קולקטיבי, תאים מבודדים מוכתמים כשליליים עבור RPE65 (אדום, איור 1B), חיוביים עבור וימנטין (ירוק, איור 1C) ו-GS (ירוק, איור 1D). צביעת IF מאשרת בידוד מוצלח (טוהר וספציפיות) של תאי מולר המבודדים. איור 1E הוא בקרה שלילית עבור וימנטין (פאנל עליון) ו-GS (פאנל תחתון), מה שמאשר את הספציפיות של הנוגדנים.

איור 1: אימות בידוד תאי מולר (טוהר וספציפיות). (A) תמונה במיקרוסקופ אור למעברים:מעבר אפס(P0) ו(P1)מורפולוגיה. (B) RPE65 immunostaining בשילוב עם צביעה גרעינית DAPI. (C) צביעה חיסונית של וימנטין עם צביעה גרעינית DAPI בהגדלה גבוהה. (D) GS immunostaining באותה הגדלה גבוהה. (E) בקרות שליליות כדי לאשר את הספציפיות של צביעת נוגדנים vimentin ו- GS. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר כי הם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.