מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

קיימות שיטות כמותיות ואיכותיות לאיתור התיישבות ריזוספרה על ידי זן חיידק יחיד. בשיטה האיכותית יש להשתמש בזן המבטא פלואורסצנטיות באופן מכונן ולבחון את התפלגות הפלואורסצנטיות ועוצמתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מכשירי לייזר קונפוקליים ^1,2. אסטרטגיות אלה יכולות בהחלט לשקף התיישבות חיידקים באתרו³, אך הן אינן מדויקות כמו שיטות ספירת לוחות מסורתיות בכימות. חוץ מזה, בגלל המגבלה של הצגת אזורי שורש חלקיים בלבד מתחת למיקרוסקופ, לפעמים זה יכול להיות מושפע מהטיה סובייקטיבית.

במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית, הכוללת איסוף תאי החיידק המאוכלסים וספירת ה-CFUs החיידקיים על צלחת. שיטה זו מבוססת על דילול וציפוי שבאמצעותם ניתן לספור את הזנים המושבלים שהופשטו משורשי הצמח, ולחשב את מספר החיידקים המיושבים הכולל על השורש ^4,5.

ראשית, A. thaliana תורבית בתנאים הידרופוניים, ולאחר מכן תאי חיידקים חוסנו בריזוספרה בריכוז סופי של 0.01 OD₆₀₀. רקמות השורש הנגועות נקצרו יומיים לאחר החיסון ונשטפו במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. יתר על כן, תאי חיידקים שהתיישבו על השורש נאספו, נמהלו במאגר מלח חוצץ פוספט (PBS), וצופו על מדיום אגר לוריא-ברטאני (LB). לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, נספרו ונורמלו מושבות בודדות על לוחות LB כדי לקבוע את תאי החיידקים המאוכלסים על השורשים.

שיטה זו ישימה מאוד, בעלת יכולת חזרה טובה, והיא מתאימה יותר לקביעת התיישבות חיידקית מדויקת בריזוספרה.

1. הידרופוני סטרילי א. גידול תאליאנה

1. הכינו שתילי A. thaliana .
   1. הכינו תרבית שתילי A. thaliana בינוני, המורכב מ 1/2 MS בינוני (Murashige ו Skoog) עם 2% (wt / vol) סוכרוז ו 0.9% (wt / vol) אגר.
   2. יוצקים את אמצעי העיקור המוכן לכלי פטרי מרובעים סטריליים (13X13 ס"מ) לפני המיצוק. יש להימנע מייבוש באוויר כדי לשמור על לחות.
   3. לטבול זרעי A. thaliana בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל מלא 1 מ"ל של מים סטריליים ב 4 ° C במשך יותר מ 12 שעות, ולאחר מכן לעקר את הזרעים עם 1 מ"ל של 2% (vol / vol) NaClO במשך 2 דקות.
   4. שטפו היטב את הזרעים במים סטריליים שש פעמים כדי להסיר את תמיסת NaClO. זורעים את הזרעים על צלחות פטרי עם מדיום אגר MS עם קצה סטרילי של 1 מ"ל.
   5. אטמו את צלחות הפטרי בסרט רפואי נושם והניחו אותן במאונך באינקובטור קל לגידול במשך שבוע. הגדר את יחס היום/לילה של אינקובטור האור ל -16 שעות / 8 שעות, שמור על הטמפרטורה על 23 ° C והלחות על 40%-60%.
2. השתלה א. תליאנה.
   1. חותכים חורים בקוטר 5 מ"מ על מכתים בגודל נקבוביות בגודל 40 מיקרומטר ומעקרים אותם.
   2. השתילו שלושה צמחי A. thaliana בני 7 ימים דרך חורים של מסננת תאים והכניסו אותם לצלחת 6 בארות המכילה 3 מ"ל של נוזל סטרילי 1/2 MS בינוני עם 0.5% סוכרוז.
   3. הניחו את לוחות 6 הקידוחים באינקובטור אור (איור 1A) ודגרו במשך 10 ימים.

2. טיפוח חיידקים וחיסון

1. הכינו תרחיף חיידקי לחיסון.
   1. עבור Bacillus velezensis, לחסן תאי חיידקים לתוך LB סטרילי בינוני לדגור ב 37 ° C עם רעד ב 170 סל"ד עד שהוא מגיע OD₆₀₀ של 0.8-1.2.
   2. לאסוף את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 6000 x גרם במשך 2 דקות ולהשהות מחדש את התאים במאגר PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2.6 mM KCl). חזור על שלבי הצנטריפוגה וההשהיה מחדש 3 פעמים כדי להסיר את מדיום LB ואת המטבוליטים החיידקיים.
   3. להשהות את תאי החיידק בתווך טרי של 1/2 MS בריכוז סופי של OD₆₀₀ 0.01. לחסן את תרחיפים חיידקים על צלחות 6 באר לגדל שתילי A. thaliana , מניחים את צלחות 6 באר באינקובטור אור, ולטפח אותם במשך 2 ימים.

3. מדידת חיידקים המתיישבים על שורשים

1. קוצרים את רקמת השורש ולוחצים את התאים המיושבים.
   הערה: כל השלבים צריכים להתבצע במצב גנוטוביוטי
   1. שקלו את צינורות 2 מ"ל ורשמו את המשקל כ-W₀.
   2. קצרו את רקמות שורש A. thaliana בתרבית משותפת ושטפו אותן במים סטריליים 3 פעמים. הניחו את השורש על נייר סינון כדי להסיר את עודפי המים.
   3. הכניסו את השורש לצינור המיקרוצנטריפוגה השקולה, שקלו את השורשים יחד עם הצינור ורשמו אותו כ-W₁.
   4. הוסף 1 מ"ל PBS לכל צינור ומערבל את הצינורות במשך 8 דקות במהירות המרבית.
   5. מדללים את התרחיפים עם תאי החיידקים שנאספו ממושבות שורש ל 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (בהתאם ליכולת התיישבות החיידקים). מורחים את התרחיפים החיידקיים המדוללים על צלחות המכילות מדיום אגר LB ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 10 שעות.
2. לספור את המושבות ולנרמל את הנתונים.
   1. ספרו את מושבות החיידקים על לוחות LB.
   2. חישוב CFUs על פי דילול המתאים לנרמל את הנתונים עם משקל טרי שורש (W_{1-W 0}). התוצאות הסופיות מצביעות על ספירת תאי חיידקים שהתיישבו לגרם של שורש יומיים לאחר החיסון (איור 1B).

כדי לבדוק את הדיוק של יכולת התיישבות החיידקים שזוהתה בשיטה זו בריזוספרה A. thaliana חיסנו את Bacillus velezensis SQR9 WT ומוטציה נגזרת Δ8mcp לתוך A . thaliana rhizosphere בנפרד. Δ8mcp היא מוטציה שחסרה את כל הגנים המקודדים לכימורצפטור, ויש לה ירידה משמעותית בנשאות6. מדדנו את הנשאות שלהם יומיים לאחר החיסון על ידי בדיקת נשאות השורש הנוכחית. התוצאות הראו ירידה משמעותית בהתיישבות השורשים של Δ8mcp, מה שמצביע על כך שהמצב והשיטה האלה מודדים ביעילות את התיישבות החיידקים (איור 1C).

איור 1: גידול A. thaliana והתיישבות השורש של Bacillus velezensis SQR9 ו-Δ8mcp. (A) מבט מלמעלה על A. thaliana בן 7 ימים הגדל בצלחות 6 בארות עם מכתים תאים במצב הידרופוני. (B) מבט מהצד של א. תליאנה בת 7 ימים הגדלה בצלחות בנות 6 בארות, שכל באר מכילה 3 שתילים. (C) נשאות של B. velezensis wild-type SQR9 ו-Δ8mcp שנמדדו באמצעות הבדיקה המוצגת. שישה עותקים משוכפלים נכללו, והנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם תוכן מאמר זה.