Method Article

זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת של DNA של נגיף הפטיטיס B

DOI:

10.3791/66249

⸱

December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) של DNA של נגיף הפטיטיס B (HBV) היא שיטה רגישה ומדויקת לאבחון וניטור זיהום HBV. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי DNA HBV ומדידת עומס נגיפי של דגימה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא גורם משמעותי למחלות כבד ברחבי העולם. זה יכול להוביל לזיהומים חריפים או כרוניים, מה שהופך אנשים רגישים מאוד שחמת קטלנית וסרטן הכבד. זיהוי וכימות מדויקים של DNA HBV בדם חיוניים לאבחון וניטור זיהום HBV. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי DNA HBV היא PCR בזמן אמת, אשר ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הנגיף ולהעריך את העומס הנגיפי כדי לפקח על התגובה לטיפול אנטי ויראלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או פלזמה באמצעות ערכה מבוססת PCR בזמן אמת המסומנת IVD. הערכה משתמשת בפריימרים ובבדיקות המכוונים לאזור הליבה השמור ביותר של גנום HBV ויכולים לכמת במדויק את כל הגנוטיפים של HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I ו-J). הערכה כוללת גם בקרה פנימית אנדוגנית לניטור עיכוב PCR אפשרי. בדיקה זו נמשכת 40 מחזורים, והחיתוך שלה הוא 38 Ct. לכימות DNA HBV בדגימות קליניות, מסופקת ערכה של 5 תקני כימות עם הערכה. התקנים מכילים ריכוזים ידועים של DNA ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). התקנים משמשים לאימות הפונקציונליות של הגברה ספציפית ל- HBV DNA וליצירת עקומה סטנדרטית, המאפשרת לכמת DNA HBV בדגימה. DNA HBV נמוך של 2.5IU/mL זוהה באמצעות ערכת PCR. הרגישות הגבוהה ויכולת השחזור של הערכה הופכות אותה לכלי רב עוצמה במעבדות קליניות, ומסייעת לאנשי מקצוע בתחום הבריאות באבחון וניהול יעיל של זיהומי HBV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא נגיף DNA דו-גדילי חלקית מהסוג Orthohepadnavirus וממשפחת Hepadnaviridae 1. זה יכול לעורר זיהום כרוני שנמשך לאורך כל החיים, מה שעלול להוביל שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular 2,3,4. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), אוכלוסייה מוערכת של 296 מיליון אנשים חיו עם זיהום כרוני הפטיטיס B בשנת 2019, ו -1.5 מיליון אנשים נדבקו חדשים מדי שנה5.

זיהוי ומדידה של DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה משמשים כשיטה רבת ערך לאיתור אנשים עם זיהום מתמשך בהפטיטיס B, הערכת יעילות הטיפול האנטי-ויראלי וחיזוי ההסתברות להצלחת הטיפול 6,7,8,9,10,11. עומס נגיפי גבוה קשור לסיכון מוגבר להתקדמות מחלות כבד, כולל שחמת הכבד וסרטן הכבד12,13. לפיכך, מדידה מדויקת של עומס נגיפי היא חיונית למעקב אחר התקדמות זיהום HBV ולקבלת החלטות לגבי הטיפול.

לבדיקות PCR כמותיות בזמן אמת יש רגישות גבוהה יותר, טווח דינמי רחב יותר וכימות מדויק יותר של DNA HBV מאשר טכניקות PCR קונבנציונליות 14,15,16,17. מספר ערכות אבחון מולקולריות מסחריות בזמן אמת מבוססות PCR לכימות DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה זמינות בשוק. במאמר זה אנו מתארים תהליך עבודה מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או בפלזמה באמצעות ערכה מסחרית זמינה מסחרית המבוססת על PCR בזמן אמת. הערכה נמצאת בשימוש נרחב18,19, בעלות נמוכה אך רגישה מאוד, ומאפייני הביצועים שלה דומים לערכות אחרות הזמינות מסחרית עם סימון CE18. מלבד הגברה של אזור היעד HBV, גן בקרה פנימית אנדוגני כלול גם בערכה כדי לאמת את איכות הדגימות, איכות ה- DNA שחולץ, הגברת PCR ועיכוב PCR אפשרי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים או דגימות קליניות. החומר הביולוגי היחיד ששימש היה התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). תקן זה הוא חומר עזר הזמין לציבור ואינו מכיל מידע אישי או נתונים הניתנים לזיהוי. כיוון שכך, לא נדרש אישור אתי למחקר זה.

1. מיצוי DNA

  1. חלצו את הדנ"א הנגיפי מסרום אנושי או מדגימת פלזמה. אחסן את ה- DNA שחולץ ב -20 ° C עד לשימוש נוסף ב- PCR.
    הערה: הנפח המומלץ של סרום או פלזמה למיצוי DNA הוא 500 μL, ונפח elution הוא 50 μL. במחקר זה, הדנ"א הנגיפי הופק באמצעות ערכה למיצוי חומצות גרעין נגיפיות (Table of Materials).

2. PCR בזמן אמת

  1. הפשירו את כל הריאגנטים (טבלה 1) של ערכת ה-PCR בזמן אמת בטמפרטורת החדר (RT; 15-25°C) לפני תחילת בדיקת ה-PCR. לאחר ההפשרה, ערבבו את הרכיבים על ידי מערבולות פולס במשך 10 שניות במהירות בינונית וצנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 שניות ב- RT. שמרו את כל הרכיבים המופשרים על בלוק קירור.
  2. הכנת תגובה
    1. הכינו תערובת PCR לפי טבלה 2. חשב את נפח הריאגנטים שיש להוסיף בהתבסס על מספר הדגימות, התקנים וללא בקרת תבנית.
      הערה: בעת הכנת תערובת PCR, יש להוסיף לפחות 10% נפח נוסף של כל מגיב (למשל, אם נדרשות 10 תגובות, חשב עבור 11 תגובות).
    2. Pipet 15 μL של תערובת PCR שהוכן לעיל לתוך כל צינור PCR. לאחר מכן, הוסף 15 μL של DNA הדגימה שחולץ. הוסף 15 μL של לפחות אחד התקנים עבור HBV (תקן HBV 1-5) כבקרה חיובית (PC) לגילוי DNA HBV ו- 15 μL של מים נטולי נוקלאז ברמת PCR כבקרה שלילית (NC). כדי ליצור עקומה סטנדרטית הנדרשת לכימות הדנ"א של HBV, השתמש בכל 5 תקני הכימות שסופקו עם הערכה (תקן HBV 1-5) עבור כל ריצת PCR.
    3. סגור את הצינורות, מערבב את הרכיבים על ידי מערבולת פולס במשך 10 שניות במהירות בינונית, וצנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 שניות ב- RT לפני שתמשיך למחזור התרמי. ודא שאין בועות בתמהיל התגובה, מכיוון שהוא עלול להפריע לזיהוי פלואורסצנטי.
  3. הגדרת התוכנית
    1. תכנת את המחזור התרמי לפי תנאי הרכיבה כמומלץ בטבלה 3.
  4. בחירת ערוץ/פלואורופור
    1. בחר את הצבעים הפלואורסצנטיים עבור פלטפורמות PCR נפוצות בזמן אמת, כפי שמוזכר בטבלה 4.
  5. ניתוח נתונים
    1. לאחר השלמת הריצה, נתח את תרשים ההגברה בקנה מידה ליניארי.
    2. הגדרת סף
      1. הגדר את הסף בתוך השלב המעריכי של תגובת PCR. ערכי סף מומלצים עבור הערכה מוזכרים בטבלה 5. היו עקביים עם הגדרת הסף. לאחר קביעת הסף האופטימלי לבדיקה, השתמש בו באופן עקבי עבור כל הדגימות עבור מכשיר PCR מסוים. זה יעזור להבטיח כי התוצאות מדויקות לשחזור.
        הערה: אם הסף מוגדר נמוך מדי, ייתכן שהאות נמוך מרמת הרעש וערך ה- Ct לא יהיה אמין. אם הסף מוגדר גבוה מדי, האות עשוי להיות בשלב המישור של התגובה, שבו ההגברה אינה יעילה, וערך ה- Ct עשוי להיות לא מדויק.
    3. חיתוך
      1. הפעל את הערכה במשך 40 מחזורי הגברה. אין להתייחס לשום הגברה מעבר ל-38 מחזורים לכל פרשנות.
    4. ניתוח תוצאות איכותי
      1. השתמש בערכה לזיהוי איכותי של DNA HBV. השתמש בתקן 2 כמחשב עם ערכי Ct צפויים של 20 ± 2 עבור HBV ו- 24 ± 3 עבור IC.
      2. ודא שאף פקד תבנית (NTC) אינו מציג הגברה הן עבור HBV והן עבור מטרות בקרה פנימית (IC). אם מתרחשת תגובת הגברה בתגובת NTC, ייתכן שהתרחש זיהום דגימה.
      3. מכיוון שסף הבדיקה הוא 38, שקול כל הגברה לפני 38 Ct עבור יעד HBV כמדגם חיובי ל- HBV. כאשר כל הבקרות עומדות בדרישות שצוינו לעיל, שקול דגימה בהתאם לפרשנויות המוזכרות בטבלה 6.
    5. ניתוח תוצאות כמותי
      1. השתמש בקבוצה של 5 תקני כימות של ריכוזים ידועים עבור דנ"א ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומי הרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA עבור טכניקות הגברה של חומצות גרעין (NAT)20 (טבלה 7).
      2. השתמש בתקנים אלה כדי ליצור עקומת תקן. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לכמת את הדנ"א HBV של דגימה לא ידועה.
        הערה: תוכנת ה-PCR בזמן אמת תיצור עקומה סטנדרטית באמצעות ערכי Ct המתקבלים עבור יעדי HBV של כל 5 התקנים והריכוזים המתאימים להם ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL).
      3. לפרש את הערכים עבור דגימות לא ידועות רק אם שיפוע התקנים נופל בין -3.1 ל -3.6, ערך R2 הוא בין 0.99 ל -1.0, יעילות PCR היא בין 90%-110% (0.9-1.1), ואין הגברה בבקרה השלילית.
      4. התוכנה תחשב את הריכוז של כל דגימה חיובית HBV ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL). כדי לחשב את העומס הנגיפי (המרה של IU/μL ליחידות בינלאומיות למיליליטר [IU/mL]), השתמש במשוואה הבאה:
        תוצאה (IU/mL) = (תוצאה [IU/μL] x נפח Elution [μL])/ נפח דגימה (mL)
        הערה: התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA, NIBSC code 10/266, הופק לטיהור DNA נגיפי מפלזמה של 0.5 מ"ל, דילל את ה- DNA הנגיפי המטוהר ל- 50 μL של מאגר אלוציה ושימש עם ערכת ה- PCR כדגימת ייחוס יחד עם 5 תקני HBV ו- NTC. העומס הנגיפי HBV של דגימת הייחוס (קוד NIBSC 10/266) חושב כ- (6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 מ"ל = 6,65,900 IU/mL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאגרמה סכמטית של תהליך העבודה לזיהוי וכימות דנ"א HBV מפלזמה/סרום אנושי מוצגת באיור 1. תרשים הגברה של תקן 2 (המשמש כמחשב) ו-NTC עבור HBV ו-IC מוצג באיור 2. איור 3 מראה את עקומות ההגברה עבור דגימה חיובית ל-HBV, דגימה שלילית ל-HBV ודגימה עם עיכוב PCR. עקומת ההגברה, ערך Ct עבור HBV, וריכוז HBV המתקבל ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL) עבור קוד NIBSC 10/266 מוצגים באיור 4. עקומות הגברה עבור יעד HBV של כל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוד NIBSC 10/266 הוקצה ליחידה של 9,55,000 IU/mL כאשר הוא מורכב מחדש ב- 0.5 מ"ל של מים ללא Nuclease בהתאם למידע הספק21. זה יכול להיחשב מדגם חיובי HBV עומס גבוה. העומס הנגיפי של HBV שנקבע על-ידי ערכת העומס הנגיפי ששימשה במחקר זה היה 6,65,900 IU/mL (איור 4). מכיוון שיעילות מיצוי הדנ"א של כל ערכת מיצוי דנ"א אינה 100%, חלק מהדנ"א אובד לעתים קרובות במהלך תהליך הטיהור. למרות שהעומס הנגיפי שנקבע על ידי הערכה נמוך מעט מהערך שהוקצה לספק מגיב (קוד NIBSC 10/266), עדיין הנתונים מש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים קשורים לחברת Kilpest India Limited, יצרנית ערכת העומס הנגיפי HBV ששימשה במחקר זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לפראבין, קוסום, צ'נדאן, אישה, רשמי, בבלי, שיבני, אנקיטה ושייקה על עזרתם הטכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th תקן בינלאומי של ארגון הבריאות העולמי לנגיף הפטיטיס B DNANIBSCNIBSC קוד: 10/266התקן הבינלאומי הרביעי של ארגון הבריאות העולמי לנגיף הפטיטיס B (HBV) DNA, קוד NIBSC 10/266, מיועד לשמש לכיול ריאגנטים משניים המשמשים בטכניקות הגברה של חומצות גרעין HBV (NAT).
מכונות PCR בזמן אמת של ABI ThermoFisher ScientificABI 7500; QuantStudio 5זוהי מכונת PCR בזמן אמת 
HBV, HCV ו- HIV Multiplex 14/198NIBSCקוד NIBSC: 14/198זהו מגיב טריפלקס חיובי נמוך מאוד לבדיקות NAT המכילות הפטיטיס B (HBV), הפטיטיס C (HCV) ונגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1)
מכונת PCR בזמן אמתQiagenRotor-Gene Qזוהי מכונת PCR בזמן אמת 
ערכת TRUPCR HBV Viral Load Kilpest India Limited3B294זוהי ערכה מבוססת PCR בזמן אמת המשמשת במחקר זה לזיהוי HBV DNA וקביעת עומס נגיפי
TRUPCR ערכת מיצוי חומצות גרעין נגיפיותKilpest India Limited3B214זוהי ערכת מיצוי DNA המשמשת למיצוי DNA נגיפי HBV מ-NIBSC:10/266 ו-NIBSC:14/198

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  3. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  4. Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643(2011).
  5. World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
  6. Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143(2023).
  7. Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
  8. Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
  9. Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
  10. Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
  11. Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
  12. Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231(2016).
  13. Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
  14. Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
  15. Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
  16. Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
  17. Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
  18. Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
  19. Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795(2022).
  20. NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
  21. Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
  22. Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189(2020).
  23. Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
  24. Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

Related Articles