מאמר שיטה

כימות מהיר של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון באמצעות אורתו-פתאלדהיד בתאי יונקים בתרבית במבחנה

DOI:

10.3791/66267

⸱

28 ביוני 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Health and Life Sciences, Teesside University, 2Institute of Biochemical Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון (GSSG ו-GSH, בהתאמה) הושג באמצעות שימוש באורתו-פתאלדהיד (OPA). OPA הופך להיות פלואורסצנטי מאוד ברגע שהוא מצומד ל-GSH אך אינו מסוגל להצמיד GSSG עד שהוא מופחת. כאן, אנו מתארים בדיקה רב-פרמטרית לכימות שניהם באמצעות כימות חלבונים לנורמליזציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלוטתיון נחשב זה זמן רב לסמן ביולוגי מרכזי לקביעת התגובה נוגדת החמצון של התא. לפיכך, זהו סמן עיקרי למחקרים על מיני חמצן תגובתי. השיטה משתמשת באורתו-פתאלדהיד (OPA) כדי לכמת את הריכוז התאי של גלוטתיון. OPA מצומד עם גלוטתיון מופחת (GSH) באמצעות קשירת סולפידריל ליצירת איזואינדול לאחר מכן, והתוצאה היא צימוד פלואורסצנטי מאוד. כדי להגיע לתוצאה מדויקת הן של גלוטתיון מחומצן (GSSG) והן של GSH, נדרש שילוב של חומרי מיסוך וחומרים מחזרים, אשר יושמו בפרוטוקול זה. טיפולים עשויים גם להשפיע על הכדאיות התאית. לפיכך, נורמליזציה באמצעות בדיקת חלבון מוצגת בבדיקה רב-פרמטרית זו. הבדיקה מדגימה טווח זיהוי פסאודו-ליניארי של 0.234 - 30μM (R2=0.9932±0.007 (N=12)) ספציפי ל-GSH. הבדיקה המוצעת מאפשרת גם קביעה של גלוטתיון מחומצן עם תוספת של חומר המיסוך N-ethylmaleimide כדי לקשור גלוטתיון מופחת, ואת החומר המחזר tris(2-carboxyethyl) פוספין הוא הציג כדי לנתק את הקשר disulfide ב GSSG כדי לייצר שתי מולקולות של GSH. הבדיקה משמשת בשילוב עם בדיקת חומצה ביקינכונית מאומתת לכימות חלבונים ובדיקת אדנילט קינאז להערכת ציטוטוקסיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם הגורם העיקרי לעקה חמצונית; עקה חמצונית הוכחה היטב ביצירת מוטציות DNA, הזדקנות / מוות תאי, סוגי סרטן שונים, סוכרת, מחלות נוירולוגיות (כגון פרקינסון ואלצהיימר), ועוד מספר מצבים מתישים חיים 1,2,3,4,5. הגנה מרכזית נגד ROS הם נוגדי חמצון תיאוליים, לא אנזימטיים, אשר מסוגלים להפחית מחמצנים או רדיקלים על ידי פעולה כתורמי פרוטונים 6,7. גלוטתיון (GSH) וציסטאין הם שני התיולים הנפוצים ביותר הנמצאים ביונקים8, בעוד שקיימים מספר תיול אחרים בעלי משקל מולקולרי נמוך (כגון ארגותיונין), GSH וציסטאין הם נוגדי החמצון הלא-אנזימטיים הנפוצים ביותר שנמדדו בספרות 9,10,11 והם בעלי הרלוונטיות הרבה ביותר למאבק ב-ROS 8,12,13,14.

כאשר GSH מנוצל כנוגד חמצון, שתי מולקולות של GSH מקושרות באופן קוולנטי יחד באמצעות קשר דיסולפיד כדי ליצור גלוטתיון דיסולפיד (GSSG). דלדול של GSH משמש לעתים קרובות כאינדיקטור של מתח חמצוני15,16. הערכה זו יכולה להיות משולבת גם עם זיהוי של GSSG, אם כי עלייה ב- GSSG בתאים מוגבלת לעתים קרובות על ידי תהליכי ייצוא פעילים, שכן GSSG יכול להיות תגובתי יחסית בתאים, מה שמוביל להיווצרות קשר דיסולפיד עם תיולים חלבונים אחרים16.

שיטות מסורתיות למדידת GSH ו- GSSG אינן תהליכים פשוטים ודורשות שלבים רבים, כולל מיצוי תאי באמצעות ריאגנטים ליטיים17,18. הפרוטוקול המתואר כאן מפשט שיטות אלה ומאפשר מדידה מדויקת של תיולים לא אנזימטיים ונורמליזציה באמצעות תכולת החלבון התאית או שחרור אדנילט קינאז. בנוסף, ניתן למדוד את הכדאיות התאית לפני מיצוי GSH/GSSG. מספר שיטות ניסו בעבר לכמת ולכמת תיולים לא אנזימטיים מופחתים ומחומצנים ביעילות; שיטות הכוללות שימוש ב-HPLC 19,20,21, בדיקת לוחות (ביוכימית)22,23,24,25, והמשתמשות בריאגנטים נפוצים לצמידות תיול, כגון 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB/ Ellman's reagent)19, Monochlorobimane (mBCI)26,27,28. מספר חברות הכינו גם ערכות קנייניות לזיהוי גלוטתיון; עם זאת, הם אינם מפרסמים חוסר תאימות ריאגנטים, אשר מציג בעיות התלויות בטיפולים המשמשים29.

פרוטוקול זה מתאר בדיקה רב-פרמטרית המזהה תיולים מופחתים (כגון GSH) באמצעות צימוד אורתו-פתאלדהיד (OPA) כדי לייצר אות פלואורסצנטי הניתן לזיהוי ב-340/450 Ex/Em, בהתאמה. בדיקה זו מאפשרת זיהוי של GSH ו- GSSG בו זמנית (בצלחת), באמצעות שימוש בסוכני מיסוך (N-ethylmaleimide) וחומרים מחזרים GSSG (tris(2-carboxyethyl) פוספין). פרוטוקול רב-סמנים ביולוגיים זה מספק גם הזדמנות בשלב השכיבה התאית לכמת חלבונים באמצעות בדיקת חומצה ביכוניסית לנורמליזציה של דגימות עם השלמת המדידה הסופית או באמצעות בדיקת אדנילט קינאז מהמדיה התאית. בדיקה זו יכולה להתבצע באמצעות מספר ריאגנטים הזמינים ברוב המעבדות ורק כמה כימיקלים נדירים נוספים לביצוע. התהליך פשוט, נגיש וניתן לבצע אותו ללא שלבים מייגעים בפחות משעתיים.

בפרוטוקול זה נבחרו ננו-חומרים שונים שהוכחו בעבר כגורמים ל-ROS או שנחשדו כגורמים לעקה חמצונית30,31. טווח ריכוזים נבדק כדי לראות את ההשפעות של חשיפה של ננו-חומרים אלה על קווי תאים שונים ואת היעילות של הבדיקה בכימות תיולים נוגדי חמצון.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול הבא תוכנן עם היכולת להיות מנוצל בשילוב עם בדיקת חלבון חומצה ביקינכונית (BCA) ובדיקת אדנילט קינאז (AK) כדי לנרמל דגימות לטיפולים. ודא שהמפעיל לובש לבוש מתאים וציוד בטיחות נחוץ, כגון מעיל מעבדה של Howie, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות Class I, במהלך ההכנה והשימוש בחומרים. הפרוטוקול מחולק למספר שלבים.

1. הכנות למלאי ופתרונות עבודה

  1. הכינו תמיסות מלאי של תקן 100 mM GSH ב-1 mM HCl (מוכן מ-37% HCl במים מזוקקים כפול (ddH2O)).
    הערה: אם מדללים מחומצה מרוכזת מאוד, כגון 37% HCl, יש לוודא את התהליך הנכון של הוספת חומצה למים במכסה אדים מסוג I.
  2. הכינו מלאי של 22.35 mM OPA באתנול מוחלט. בצע שלב זה בכיתה I אדים מכסה מנוע. הכן 25 mM N-ethylmaleimide (NEM) ב- ddH2O. בצע שלב זה במכסה אדים בכיתה I.
    הערה: ניתן לאחסן את שלושת הפתרונות הללו בטמפרטורה של -20°C למשך עד 3 חודשים.
  3. הכן 0.01 M Tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) לנפח כולל של 500 μL, הדרוש עבור 100 בארות. הכן 100 μL של תקן 1 mM GSH, מדולל ממלאי 100 mM באמצעות ddH2O.
  4. השתמש במאגר ליזה של משקעים חיסוניים (IP) או בנוסחה הבאה: 394 מ"ג Tris-HCl (ריכוז סופי 25 mM), 877 מ"ג NaCl (ריכוז סופי 150 mM), 29 מ"ג EDTA (ריכוז סופי 1 mM), 1 מ"ל של 100% NP-40 או IGEPAL CA-630 (ריכוז סופי של 1% V/V), 5 מ"ל גליצרול (ריכוז סופי 5% V/V), 84 מ"ל של ddH2O. יש לערבב רכיבים באמצעות ערבוב עדין ולהתאים את רמת החומציות ל-7.4. דקנט לתוך בקבוק נפח 100 מ"ל ולהוסיף את הנפח הנותר של ddH2O כדי להגיע נפח סופי של 100 מ"ל. יש לסנן סטרילי דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים.
    הערה: תמיסות שקר אכן פועלות כמזהם/מתערב בבדיקה זו; לפיכך, הניסוחים לעיל מפורטים.
  5. הכינו 1 ליטר של מי מלח חוצצי פוספט 0.1M בתוספת חומצה טטראצטית אתילאנדיאמין (PBS-EDTA) ב-3 ערכי pH שונים, במיוחד 7.2, 8.5 ו-9.0. יש להשתמש במאגר PBS מסחרי של 0.1 M בתוספת 1 mM EDTA (292.24 מ"ג/ליטר) או בנוסחה הבאה של 10x (1 L): 80 גרם NaCl, 2.0 גרם KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4, 800 מ"ל של ddH2O. להוסיף ולערבב; ממלאים עד 1 ליטר Autoclave את הפתרון לסטריליות ולאחסן אותו במשך 12 חודשים בטמפרטורת החדר. מתוך פתרון מלאי 10x, לעשות פתרון עבודה של PBS ולהשלים אותו עם EDTA (ריכוז כאמור לעיל).
    הערה: pH הוא בעל חשיבות קריטית; ודא שה- pH מדויק לפני תחילת הפרוטוקול.
  6. בצע דילול טורי 1:2 של 1 mM GSH באמצעות ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62.5 μM, 31.25 μM, 15.625 μM ו- 7.8125 μM). הוסף 10 μL מכל ריכוז לבארות סטנדרטיות (מבוצע בכפול). הדגימות ידוללו עוד יותר במאגר הליזיס; לפיכך, הריכוזים יהיו 1/5 מהריכוז המקורי שלהם לאחר מכן (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 מיקרומטר).
    הערה: הריכוזים הסופיים לכיול יהיו 30 מיקרומטר, 15 מיקרומטר, 7.5 מיקרומטר, 3.75 מיקרומטר, 1.875 מיקרומטר, 937.5 ננומטר, 468.8 ננומטר ו-234.4 ננומטר.

2. הכנת הבדיקה

הערה: פרוטוקול זה משתמש בקווי תאים אנושיים HepG2, A549 ו- J774, שנרכשו באופן מסחרי מ- ATCC. קווי תאים אלה נוצלו על פי ההנחיות המאושרות שהותוו על ידי חוקי תרביות בעלי חיים ורקמות של האוניברסיטה.

  1. 24 שעות לפני תחילת הבדיקה, תאי זרע בריכוזים המוצגים בטבלה 1; עם זאת, בהתאם לקו התא / סוג והטיפול בו נעשה שימוש, התאם את הצפיפות לפי הצורך. לגדל תאים במדיום גדילה מלא (Eagles modified essentials medium (EMEM) עם 10% סרום עגל עוברי מומת בחום (HIFS), 1% Penstrep (10,000U / מ"ל פניצילין / 10mg / mL סטרפטומיצין), ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות.
  2. תאי זרע בשיטות זריעת תאים קונבנציונליות32. תאי זרע בלוחות שחורים לחלוטין אם לא באמצעות מיקרוסקופ לאחר הבדיקה. יש להעריך תאים למפגש ובריאות כללית בבקבוק T75 לפני השימוש באמצעות מיקרוסקופיה.
  3. בארון בטיחות ביולוגי נקי, סטרילי, סוג II ובעקבות טכניקה אספטית קפדנית, יש להשליך את המדיה התאית, לשטוף בעדינות תאים עם ~15 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר (RT) ולהשליך.
  4. לצלוחית התא, הוסף 5 מ"ל של טריפסין סטרילי 1x, התנדנד בעדינות כדי להבטיח כיסוי של חד-שכבת התא, והכנס לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות כדי להקל על ניתוק התא.
  5. להפסיק טריפסיניזציה על ידי הוספת מדיום גדילה המכיל סרום עגל עוברי מומת בחום (10%), כ -10 מ"ל.
  6. מעבירים תאים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל וגלולה במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות. מחק את המדיה והחלף אותה ב- 5 מ"ל של אותה מדיה. יש להשהות תאים בצינור עד שהם הומוגניים ולא ניתן להבחין בגושים.
  7. יש להסיר 20 μL של תרחיף תאים ולהניח בהמוציטומטר לספירה. לאחר חישוב מספר התאים הדרוש, בצע דילול כדי ליצור פתרון עם צפיפות התאים הנכונה.
  8. מדיית פיפטה המכילה תאים בצלחות 96 בארות (קיבולת 350 μL), עם נפח מרבי של 200 μL לכל באר. מקם תאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 24 שעות כדי להיצמד למשטח הצלחת.
  9. כדי להעריך הן את סך הגלוטתיון והן את GSSG, יש לטפל בדגימות עבור שני המצבים. זרעו וטפלו ב-6 בארות כדי לספק 2 סטים של GSH ו-GSSG כל אחד עם 3 חזרות טכניות (איור 1 מדגים פריסה).
  10. לוודא שכל הריאגנטים מוכנים כראוי לפני תחילת הבדיקה; יש לוודא שכל רכיבי החיץ והריאגנטים נמצאים ב-RT לפני תחילת בניית המאגרים או השימוש בהם בבדיקה, למעט pH 7.4 PBS (ללא EDTA), שיש לשמור על קרח / בקירור עד לשימוש.
    הערה: יש חשיבות קריטית לכך שהיווצרות הבועות תוגבל למינימום כדי לאפשר לתגובות הרצויות להתרחש בתוך הבדיקה ולאפשר כימות מדויק באמצעות קורא הלוחות.

קו תאצפיפות זריעה (צלחת 96 בארות)
HepG210,000 תאים / באר
A5495,000 תאים / באר
J77410,000 תאים / באר

טבלה 1: צפיפויות זריעה מוצעות עבור קווי תאים שנבחרו. מודגמות צפיפויות זריעה שונות עבור שלושה קווי תאים שונים המשמשים בנתונים המיוצגים, במיוחד A549, J774 ו- HepG2.

figure-protocol-1
איור 1: פריסה מוצעת לזריעה של 96 צלחות באר לקביעה סימולטנית של סך כל גלוטתיון וגלוטתיון דיסולפיד. כמו כן מודגמות בארות לכיול ובקרות. בארות שאינן מנוצלות מיוצגות באמצעות צלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. טיפול ננו-חומרי

  1. שקלו ננו-חומרים (במיוחד ZnO, TiO2, CuO ו-Ag) בסולם משקל בעל יכולת מיקרוגרם. בצע חישוב להשגת ריכוז התחלתי של 1 מ"ג/מ"ל לננו-חומר.
  2. העבר תמיסות ננו-חומרים לסוניקטור וסוניקט במשך 16 דקות באמצעות אמבט סוניקציה (38 W) כדי לייצר תמיסה הומוגנית. בצע סדרה של דילולים עבור כל ננו-חומר ב 125, 62.5, 31.25, 15.625 מיקרוגרם / מ"ל.
  3. הסר תאים מן האינקובטור ולשטוף קלות עם RT PBS. לאחר שווידאתם שכל PBS הוסרו, הוסיפו 100 מיקרוליטר טיפולים לצלחת, עם בקרות (מדיה תרבותית ללא HIFS). לאחר יישום הטיפול בתאים, יש לדגור עם הננו-חומרים באינקובטור של 37°C (5% CO2) למשך 4 שעות; לאחר מכן, השתמש בפרוטוקול הבא כדי לכמת GSH: GSSG, ריכוז חלבונים ושחרור AK.

4. פרוטוקול Assay

  1. לאחר חשיפה לטיפול (איור 2A), הערך את הכדאיות באמצעות פעילות אדנילט קינאז (AK) (אופציונלי). השתמש בערכה מסחרית לבדיקה זו בהתאם להוראות היצרן.
  2. סובבו לוחות בצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם במשך 5 דקות לטיפול קל בכדוריות ובפסולת תאים (איור 2B).
  3. הסר 20 μL של חומר הדפסה בעדינות מכל דגימה ובקר היטב (כפי שצוין לעיל) ופיפטה ללוח לבן סמוך בן 96 בארות באותה תבנית פריסה (איור 2C).
  4. הוסף 100 μL של פתרון עבודה מערכת AK לכל באר, להגן על הצלחת מפני אור, ולהשאיר לפתח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הקלט עוצמת אור באמצעות קורא לוחות במהירות של 1000 ספירות לשנייה.
  5. עבור תקני GSH, הוסיפו 40 מיקרוליטר של חיץ גלוטתיון כולל לכל באר (איור 2D; אופציונלי, נדרש לצורך כימות).
  6. שאפו את שאריות המדיה מהצלחת ושטפו 3x עם PBS קר כקרח 0.1 M, pH 7.2, תוך השלכת כל כביסה (איור 2E) למעט התקנים. השאירו את השטיפה הסופית בצלחת עד להעמסת כיול GSH לצלחת.
  7. הוסף 10 μL מכל ריכוז גלוטתיון וריק (ddH2O) לבארות משולשות.
  8. הסר את שטיפת PBS הסופית והוסף את התערובות לכל באר לפי טבלה 2 לכימות היעד הרצוי (איור 2E). חשב את אמצעי האחסון הדרושים לפני תחילת שלב זה עקב אובדן פעילות תלוי זמן עם מאגרים מלאים. ודא כי תערובות ריאגנטים אלה מיוצרות לפני תחילת תהליך הבדיקה, אך אל תאפשר להם לשבת יותר מ -30 דקות לפני השימוש.
  9. הניחו על שייקר צלחת מסלולית ואפשרו לצלחת לרעוד במהירות של 300 סל"ד במשך 2 דקות (איור 2F).
  10. הסר מהשייקר והוסף 5 μL של תמיסת TCEP 0.01M לכל באר, למעט באר בקרת NEM. החזירו את הצלחת לשייקר ודגרו במשך 10 דקות (איור 2F).
  11. מעבירים צלחת לצנטריפוגה ומסתובבים ב 200 x גרם במשך 5 דקות. מעבירים 25 μL מכל באר דגימה לצלחת אחרת של 96 בארות (שקופה); זה ינוצל לריכוז חלבון (ראה שלב 4.15; איור 2G). אל תעביר תקנים או בקרות בדיקה.
  12. ודא שהנפח הסופי עבור כל באר הוא 30 μL; הסר אמצעי אחסון מהפקדים ומהתקנים כדי לעמוד בדרישה זו (איור 2H).
  13. הוסיפו 170 מיקרוליטר של תמיסת OPA עובדת לכל באר, הגנו על הצלחת מפני אור והניחו על שייקר למשך 15 דקות (איור 2I).
  14. קרא פלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות ב- Ex340/Em450 (איור 2J). ודא שאין בועות בשלב המדידה; תהיה להם השפעה מזיקה הן על התגובה והן על הכימות באמצעות קורא לוחות.
  15. כדי לכמת את תכולת החלבון של תאי ליזד, השתמש בערכת בדיקת BCA מסחרית. העבירו דגימות שנלקחו משלב 4.12 לצלחת חדשה בת 96 בארות (שקופה) ב-25 מיקרוליטר לבאר.
  16. השתמשו באלבומין בסרום בקר (BSA) המדולל במאגר ליזה IP והוסיפו לצלחת בטריפליקט ב-25 מיקרוליטר לבאר. הריכוזים המדויקים מוגדרים בפרוטוקול ערכת BCA.
  17. הכינו פתרון עבודה המורכב מיחס של 50:1 ריאגנטים A ו-B מערכת BCA והוסיפו 200 μL לכל באר המכילה דגימה, תקן ובקרה. הגנו על לוחות מאור ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות (איור 2K).
  18. הסר דגימות מהאינקובטור, אפשר להן לאזן בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן קרא את הספיגה באמצעות קורא לוחות במהירות של 562 ננומטר (איור 2L).
ריכוז גלוטתיון כולל תערובת מגיב ליזה
רכיבנפח
חיץ ליזיס50μL
נפח כולל / באר50μL
ריכוז גלוטתיון מחומצן ליזה תערובת מגיב
רכיבנפח
חיץ ליזיס49.5μL
NEM (25 מיליון)0.5μL
נפח כולל / באר50μL
השתמש בשני הפתרונות תוך 30 דקות מהרכב התערובת
רכיב פתרון זיהוי OPAנפח
OPA 3 מ"ג/מ"ל5μL
PBS (pH 9.0)165μL
נפח כולל / באר170μL

טבלה 2: נפחים נחוצים של ריאגנטים לביצוע הפרוטוקול. נפחים הדרושים לכל באר לקביעת סך גלוטתיון, גלוטתיון דיסולפיד וריאגנט עבודה נדרשים. ודא שאמצעי האחסון הדרושים מחושבים, והשתתפות עצמית כלולה כדי לקחת בחשבון אובדן נפח באמצעות העברה.

figure-protocol-2
איור 2: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. (A) זריעה, דגירה וטיפול ראשוניים בתאים. (B) צנטריפוגה להפרדת מדיה ממוצקים מרחפים. (C) העברת מדיה עבור בדיקת Adenylate kinase. (D) הוספת ריכוזי גלוטתיון לטווח כיול. (ה) שלבי שטיפה והוספת ריאגנטים שוכבים. (F) תוספת חיץ ותוספת פוספין tris(2-carboxyethyl) עם שלב ניעור. (G) צנטריפוגה של תאי ליזד לסילוק מדיה לצורך ניתוח חלבונים. (H) הסרת מדיה כדי להשוות את עוצמת הקול על פני הלוח. (I) תוספת של תמיסת עבודה אורתו-פתאלדהיד עם דגירה מטלטלת. (J) מדידה של פלואורסצנטיות אורתו-פתאלדהיד באמצעות קורא לוחות. (K) שלבי דגירה לבדיקת חומצה ביצינכונינית לקביעת חלבון. (L) מדידת ריכוז החלבון, המאפשרת נורמליזציה של גלוטתיון: ערכי גלוטתיון דיסולפיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות פרוטוקול זה, קווי תאים A549 ו-J774 נזרעו בצפיפות של 5,000 תאים/באר ו-10,000 תאים/באר, בהתאמה, וגודלו בתרבית ב-37°C ב-5%CO2 למשך 48 שעות. ניתוח AK לאחר טיפול בננו-חומרים מוצג בטבלה משלימה 1, וריכוז החלבון מוצג בטבלה משלימה 2.

גרף כיול
באיור 3 מוצגים שלושה כיולים המשתמשים בטווח הריכוזים המצוין (ריכוז סופי של 0.234 - 30 מיקרומטר) משלושה לוחות נפרדים משלושה סוגי תאים שונים (אם כי לא אמורים להשפיע על הכיול) בשלושה ימים שונים, לא רצופים. בעוד 3 דגימות מוצגות, N של 12 נצפתה, והדגים רגרסיות ליניאריות דומות עם ערך R2 ממוצע של 0.9932 ± 0.007.

figure-results-1
איור 3: גרפים של כיול גלוטתיון לבדיקה. שלושה גרפי כיול מטווחי כיול גלוטתיון נפרדים בתוך לוחית, כל אחד מהם מבוצע בהפרש של שבוע; קווי שגיאה ± SD (n = 3, N = 12) n = משכפלים טכניים, N = משכפלים ביולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות לדוגמה
תאי HepG2, A549 ו-J774 שימשו להערכת ננו-חומרים שונים החשודים כגורמים לשינויים במנגנונים תאיים באמצעות עקה חמצונית. נעשה שימוש בפרוטוקול האיתור והכימות המתואר.

הנתונים שהתקבלו משלוש המדידות (AK, BCA ו- GSH/GSSG) טופלו כדלקמן. בדיקת AK ו- BCA יושמה לצורך נורמליזציה; בדיקת AK, באמצעות הערכה המומלצת, תיתן את הנתונים המהירים והפשוטים ביותר עבור כמות AK המשתחררת למדיה הסלולרית. עלייה בערכי AK צפויה להגדלת מוות תאי. לפיכך, נדרש פקד -ve (חי) ו- +ve (מת). זה יאפשר נורמליזציה על בסיס אחוזים.

בדיקת BCA היא תהליך ארוך יותר, אך תאפשר להשיג תוצאות ניתנות לכימות באמצעות כימות חלבונים (מ"ג/מ"ל). זה לא דורש בקרת -ve או +ve כמו ב- AK אבל עדיין ידרוש בקרת -ve כללית (תאים לא מטופלים) כדי לאפשר נורמליזציה של ערכים להיות מושגת.

בסעיף תוצאות מייצגות זה, נמצא כי לטיפול (ננו-חומרים) היה פוטנציאל לגרום להפרעה בבדיקת AK. לפיכך, כל הנורמליזציה בוצעה באמצעות נתוני BCA. לכן, המידע מוצג כריכוז המינים שזוהו (GSH או GSH+GSSG (עם זאת, חיסור של ריכוז GSH מהריכוז הכולל של GSH+GSSG מבוצע כדי לקבל ריכוז GSSG) לכל מ"ג/מ"ל חלבון (באמצעות בדיקת BCA). אם תרצה, ניתן להמיר זאת ליחס כדי להעריך את השינוי ב- GSH: GSSG מהטיפול הרצוי.

באיור 4 מוצגים נתוני יחס GSH: GSSG משלושה קווי תאים שונים (A549, J774 ו-HepG2) שנרכשו באמצעות פרוטוקול OPA ונורמלו לביטוי חלבונים באמצעות BCA (מק"ג/מ"ל), נתונים נוספים המפרטים ערכי GSH ו-GSSG נוספים ניתן למצוא באיור משלים 1.

figure-results-2
איור 4: גלוטתיון: יחס גלוטתיון דיסולפיד מביצוע הבדיקה. מוצגים יחסי גלוטתיון: גלוטתיון דיסולפיד של 3 שורות תאים, כלומר (A) A549, (B) J774 ו-(C) HepG2. התאים הודגרו עם טיפולים (ננו-חומרים שונים במדיה נטולת סרום) במשך 4 שעות. התאים עובדו באמצעות פרוטוקול זה כדי לכמת שינויים בגלוטתיון ובגלוטתיון דיסולפיד ונורמלו באמצעות כימות חלבונים, קווי שגיאה ± SE (n = 3, N = 3) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הצלחת מכילה גם סדרה של פקדים כדי להבטיח שהבדיקה פעלה כראוי. NEM מתווסף כרכיב בודד כדי להדגים חוסר אינטראקציה עם מדיית זיהוי OPA. תקן הכיול מדגים עלייה ליניארית עם ריכוז GSH, אשר מדגים את היכולת היעילה של מגיב זיהוי OPA להיקשר ביעילות לריכוזים הולכים וגדלים של GSH.

יש לציין כי בדיקה זו מכוונת באופן ספציפי לקבוצות סולפידריל חופשיות הנמצאות בדרך כלל בתיולים (כגון GSH, הנחשבים בדרך כלל לנוגדי חמצון). אינטראקציה אפשרית אחת היא קשירה של OPA לחלבון תיול, מה שיגרום לאיסוף נתונים לא מדויק. לפיכך, בדיקת BCA היא שלב מכריע כדי לנרמל נתונים לחלבון ולאפשר השתקפות מדויקת של GSH חופשי.

תרשים משלים 1: איורים המדגימים גלוטתיון, גלוטתיון דיסולפיד וגלוטתיון: יחס גלוטתיון דיסולפיד מ-3 שורות תאים, כלומר (A) A549, (B) J774 ו-(C) HepG2. התאים הודגרו עם טיפולים (ננו-חומרים שונים במדיה נטולת סרום) במשך 4 שעות. התאים עובדו באמצעות פרוטוקול זה כדי לכמת שינויים בגלוטתיון ובגלוטתיון דיסולפיד ונורמלו באמצעות כימות חלבונים, פסי שגיאה ± SE (n = 3, N = 3) אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: מטה-נתונים של ערכי אדנילט קינאז עבור תאי A549 ו-J774. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: מטא-נתונים של ערכי חומצה ביצינכונינית עם כיול עבור תאי A549, J774 ו- HepG2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאמור, הצורך להבין חמצון-חיזור תאי, לעקוב אחר מצבי עקה חמצונית והתגובה נוגדת החמצון תמיד היה חיוני להבנה ומניעה של מספר עצום של מחלות, כגון סרטן וניוון עצבי33,34. הדגמה כאן היא אמצעי לשיפור הנוף התרגומי על ידי הגברת הנגישות של זיהוי GSH מדויק: GSSG עם הכנה מהירה ומינימלית.

פרוטוקול זה מדגים רצף רב-פרמטרי של בדיקות לקביעת מיני גלוטתיון/תיול תוך-תאיים (מופחתים ומחומצנים), עם 2 אמצעי נורמליזציה באמצעות בדיקת חלבון BCA ו/או בדיקת AK. ניתן גם לשנות בדיקה זו כדי לזהות סמנים שונים אחרים באמצעות שלב המיצוי המתווך הראשוני וניתן לפשט אותה באופן שפשוט ייתן יחס תיול מחומצן/מופחת עם אי הכללת טווח הכיול.

כאשר בוחנים את הערכת האנליטים, הן mBCI והן OPA נחקרו והושוו לשימוש. בעוד mBCl הוכיח בתחילה פוטנציאל אות טוב, התגלו מגבלות משמעותיות בשימוש. בעיקר, השימוש בתאים חיים מדגים את השימוש הטוב ביותר של mBCl; עם זאת, לאחר ליזה סלולרית, האות נמצא מרווה, והוא בדרך כלל מופחת בפורמט multiwell לעומת OPA35. נושא נוסף הוא מדידת GSSG באמצעות mBCl, הספרות דלילה לגבי זה, ובאמצעות אופטימיזציה / חקר פרוטוקולים, זיהוי מדויק של GSSG באמצעות mBCl לא הושג.

הוכחנו כי בדיקת OPA מציגה טווחי כיול אמינים באופן משמעותי, עם ממוצע R2 של 0.9932 ± 0.007 (N=12) בטווח ריכוז GSH של 0.234 - 30 מיקרומטר. טווח זה נבחר בשל טווחי ייחוס קודמים שנמצאו בספרות35. תיאורטית ניתן לאתר גלוטתיון מחוץ לטווחים אלה, אך הדבר ידרוש שינוי בריכוז הריאגנטים, בזמן הדגירה ואולי גם בציוד המשמש לאיתור. יש לציין כי כל צלחת דורשת טווח סטנדרטי משלה לכימות; השונות הקלה ביותר בזמן בין לוחות המבוצעת בימים שונים יכולה להשפיע באופן משמעותי על הערכים המתקבלים במהלך המדידה.

השגת נתונים מדויקים ואמינים מפרוטוקול זה תלויה במספר צעדים מכריעים שיש להקפיד עליהם. בעת בניית המאגרים השונים הנדרשים בפרוטוקול, חשוב מאוד שה- pH יהיה מדויק. לפיכך, מאגרים הדורשים pH של 9 לא צריכים להיות סטייה מעבר ± 0.1 של ערך זה. זאת בשל הפוטנציאל של רכיבי חיץ לזרז מתוך הפתרון ב- pH הלא נכון; ביצוע פרוטוקול זה בדיוק ימנע בעיה זו.

הסרה מלאה של הטיפול ושטיפה מדויקת לפני שכיבה הם גם קריטיים כדי למנוע ממצאים וקבלת נתונים לא מדויקים בשלב קריאת הלוחות. לאחר לידינג התאים (שלב 4.8), הסרת הטיפול אינה אפשרית, והצלחת לא תהיה ניתנת להצלה. בשל נפחי המאגרים / ריאגנטים המתווספים לאורך הפרוטוקול המשתנים בין דגימות ותקנים, קריטי שהמשתמש יהיה מודע לנפחים המגוונים, בשלב 4.12 ו- 4.13. מפעיל הבדיקה מודע גם לנפחים מגוונים אלה ומונחה לוודא שכל הכרכים זהים כדי לאפשר מדידה מדויקת. מכיוון שהנפחים בין הדגימות לתקנים אינם משמעותיים באופן ניכר, זו יכולה להיות טעות קלה לעשות לגבי הימצאות תמיסה עודפת במדגם.

ישנן מגבלות לפרוטוקול זה הנשענות על שלבים מכריעים, שהם קריטיים להשגת נתונים מדויקים ומהימנים. המשתמשים המבצעים בדיקה זו צריכים להיות בעלי רמה סבירה של כישורי מעבדה כדי למנוע בעיות בלתי רצויות, כגון היווצרות בועות. להיווצרות בועות יש השפעה דרסטית הן על יכולת התגובות להתרחש בתוך המיקרו-צלחת והן על מדידת הפלואורסצנטיות. חומר הליסינג המשמש בפרוטוקול זה מכיל חומר ניקוי, המציג קושי לחוקר מתחיל שעלול להיאבק במניעת היווצרות בועות. צנטריפוגה מיידית עשויה להציל שגיאה זו. הפרוטוקול מוגבל גם לגבי סוג התא; קווי התאים A549, J774 ו- HepG2 שימשו הן לאופטימיזציה והן להפקת נתונים עבור פרוטוקול זה. קווי תאים אחרים עשויים לדרוש צפיפויות זריעה שונות ואופטימיזציה של הפרוטוקול כדי לקבל נתונים מדויקים.

פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים על פני מספר בדיקות קיימות. בעוד שזיהוי תיולים באמצעות פתאלדהיד אינו רעיון חדש, שימוש בפורמט בדיקה משולב כגון זה, במיקרו-לוחית, עם חומרים וציוד נדרשים מוגבלים, מציע פוטנציאל גדול לכל המעבדות לגשת לפרוטוקול זה. רוב ערכות Thiol/GSH מספקים מסחריים אינן חושפות את הרכב הריאגנטים שלהן. לפיכך, זה יכול להיות קשה לחזות את הפוטנציאל של חוסר תאימות / הפרעות. כאן, אנו מציגים כל מרכיב של כל הריאגנטים המנוצלים כדי להגביל את הפוטנציאל הזה.

פרוטוקול זה מבוצע גם די מהר עם סיום תקופת הטיפול הראשונית. אם ניקח בחשבון את עיבוד המשתמש בין שלבי הדגירה, היבט כימות התיול של פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך פחות משעה אחת. הדגימות עוברות ליזה בו זמנית וקשורות כדי למנוע חמצון אוטומטי של דגימות, שהוא אופטימלי עבור מיני תגובה אלה. למרות שלא צוין בפרוטוקול, דגימות יכולות טכנית להיות מונחות בצלחת ואטומות, מה שמאפשר להקפיא אותן לניתוח עתידי. עם זאת, שינוי זה בפרוטוקול לא נבדק.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי הפרויקטים האירופיים GRACIOUS (GA760840) ו- SUNSHINE (GA952924). המחברים רוצים גם להכיר במאמצים של כל אלה אשר, בדרך כלשהי, סייעו בפיתוח פרוטוקול זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; מסנן m (אופציונלי-למאגר ליזה)Fisher scientific12561259
בקבוק נפחי 100 מ"לFisher Scientific15290866
1L בקבוק נפחי פישר סיינטיפיק15230876
250 מ"ל (אופציונלי-למאגר ליזה)פישר סיינטיפיק15409083
מיקרופיפטה 8 ערוצים (20-200&מיקרו; L)SLSFA10011D2
מיקרופיפטה 8 ערוצים (2-20 ומיקרו; L)SLSB2B06492
צלחות 96 בארות - שחור עם תחתית שקופה, טיפול TCפישר מדעי10000631צלחת מועדפת לזריעה ופלואורסנס, השתמש ב- TC שטופל שקוף אם אינו זמין
96 צלחות באר - שקופות (מטופלות TC ולא מטופלות)פישר מדעי10141161אם אין צלחות שחורות עם תחתית שקופה / שימוש מתאים TC מטופל שקופות
96 צלחות באר - לבן, לא מטופל TCפישר מדעי11457009
A549 (קרצינומה ריאתית) קו תאיםATCCCCL-185
אתנול מוחלטMerck (Sigma-Aldrich)1.08543
רדיד אלומיניוםפישר מדעי11779408להגנה על צלחות מפני ערכת
בדיקת BCAThermo23225
צנטריפוגה ספסלית ( עם רוטור 96 צלחות)Eppendorf5804
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884
גלוטתיון (GSH)Merck (Sigma-Aldrich)G6013
גלוטתיון דיסולפיד (GSSG)Merck (Sigma-Aldrich)G4501
גליצרולMerck (Sigma-Aldrich)G5516
HCl, 37% Merck (Sigma-Aldrich)258148דילול ל-1 מ"מ עבור מלאי GSH, התאמת pH גם
קו תאים HepG2 (Hepatocarcinoma)ATCCHB-8065
IGEPAL  CA-630 Merck (Sigma-Aldrich)18896השתמש ב-IGEPAL CA-630 או NP-40 לפתרון, לא בשניהם
מאגר ליזה IP 11825135מדעי פישר
J774 (מונוציטים, מקרופאגים)ATCCTIB-67
KClMerck (Sigma-Aldrich)P3911
KH2PO4 Merck (Sigma-Aldrich)P0662
מיקרופיפטה (20-200&מיקרו; L)SLSB2B06482
מיקרופיפטה (2-20 ומיקרו; L)SLSB2B06478
שייקר מיקרופלייטVWR444-0041
Na2HPO4Merck (Sigma-Aldrich)S9763
NaClMerck (Sigma-Aldrich)S9888
NaOH, 10MMerck (Sigma-Aldrich)72068להתאמת pH רק
N-Ethylmaleimide (NEM)& נ.ב.פ;Merck (Sigma-Aldrich)E3876
NP-40Merck (Sigma-Aldrich)492016השתמש ב-IGEPAL CA-630 או NP-40 לפתרון, לא בשניהם. חלופה מוצעת NP-40
אורתו-פתלדיאלדהיד (OPA)Merck (Sigma-Aldrich)P1378
PBS 0.1MMerck (Sigma-Aldrich)P2272PBS ניתן לרכוש מראש או מיוצר בבית, ראה הערות
קורא צלחות (עם קיבולת פלואורסנס)TecanSPARK
מוט ערבוב (אופציונלי-למאגר ליזה)פישר מדעי16265731
ערכת בדיקה ביולוגית של Toxilight (בדיקת AK)LonzaLT17-217
Tris(2-carboxyethyl)פוספין הידרוכלוריד (TCEP) 0.5M  ב-H2OAlfa AesarH51864ניתן לרכוש גם
TRIS-HClMerck (Sigma-Aldrich)93363
X100 קוקטייל פוספטאז ופרוטאז פישר סיינטיפיק10025743
קלה קו תאים קוקטייל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnham, K. J., Masters, C. L., Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov. 3 (3), 205-214 (2004).
  2. Arfin, S., et al. Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants. 10 (5), 642(2021).
  3. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  4. Ghezzi, P., Jaquet, V., Marcucci, F., Schmidt, H. H. H. W. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 174 (12), 1784-1796 (2017).
  5. Bhattacharyya, A., Chattopadhyay, R., Mitra, S., Crowe, S. E. Oxidative stress: An essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiol Rev. 94 (2), 329-354 (2014).
  6. Yin, F., Sancheti, H., Cadenas, E. Mitochondrial thiols in the regulation of cell death pathways. Antioxi Redox Sig. 17 (12), 1714-1727 (2012).
  7. Balcerczyk, A., Bartosz, G. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Rad Res. 37 (5), 537-541 (2003).
  8. McBean, G. J. Cysteine, glutathione, and thiol redox balance in astrocytes. Antioxidants. 6 (3), 62(2017).
  9. Nimse, S. B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 5 (35), 27986-28006 (2015).
  10. Nordberg, J., Arnér, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system1. Free Rad Biol Med. 31 (11), 1287-1312 (2001).
  11. Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci. 4 (2), 89(2008).
  12. Harris, I. S., DeNicola, G. M. The complex interplay between antioxidants and ROS in cancer. Trend Cell Biol. 30 (6), 440-451 (2020).
  13. Traverso, N., et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013, 972913(2013).
  14. Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione. Dose-Resp. 3 (3), 425-442 (2005).
  15. Aquilano, K., Baldelli, S., Ciriolo, M. R. Glutathione: new roles in redox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. 5, 196(2014).
  16. Zitka, O., et al. Redox status expressed as GSH: GSSG ratio as a marker for oxidative stress in paediatric tumour patients. Onco Lett. 4 (6), 1247-1253 (2012).
  17. Childs, S., Haroune, N., Williams, L., Gronow, M. Determination of cellular glutathione: glutathione disulfide ratio in prostate cancer cells by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chrom A. 1437, 67-73 (2016).
  18. Giustarini, D., et al. glutathione disulfide, and S-glutathionylated proteins in cell cultures. Free Rad Biol Med. 89, 972-981 (2015).
  19. Özyürek, M., et al. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  20. Zhang, L., Lu, B., Lu, C., Lin, J. Determination of cysteine, homocysteine, cystine, and homocystine in biological fluids by HPLC using fluorosurfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn colorimetric reagents. J Sep Sci. 37 (1-2), 30-36 (2014).
  21. Tsiasioti, A., Georgiadou, E., Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Development and validation of a direct HPLC method for the determination of salivary glutathione disulphide using a core shell column and post column derivatization with o-phthalaldehyde. J Chromat B. 1197, 123216(2022).
  22. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agri Food Chem. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  23. Berker, K. I., Güçlü, K., Tor, İ, Demirata, B., Apak, R. Total antioxidant capacity assay using optimized ferricyanide/prussian blue method. Food Anal Meth. 3 (3), 154-168 (2010).
  24. Rahman, I., Kode, A., Biswas, S. K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Prot. 1 (6), 3159-3165 (2007).
  25. Kampa, M., et al. A new automated method for the determination of the Total Antioxidant Capacity (TAC) of human plasma, based on the crocin bleaching assay. BMC Clin Pathol. 2 (1), 3(2002).
  26. Fernández-Checa, J. C., Kaplowitz, N. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis. Anal Biochem. 190 (2), 212-219 (1990).
  27. Nauen, R., Stumpf, N. Fluorometric microplate assay to measure glutathione S-transferase activity in insects and mites using monochlorobimane. Anal Biochem. 303 (2), 194-198 (2002).
  28. Stevenson, D., Wokosin, D., Girkin, J., Grant, M. H. Measurement of the intracellular distribution of reduced glutathione in cultured rat hepatocytes using monochlorobimane and confocal laser scanning microscopy. Toxicol in vitro. 16 (5), 609-619 (2002).
  29. McBeth, C., Stott-Marshall, R. J. Interference of reversible redox compounds in enzyme catalysed assays–Electrochemical limitations. Anal Biochem. 662, 114972(2023).
  30. Yu, Z., et al. Reactive oxygen species-related nanoparticle toxicity in the biomedical field. Nanoscale Res Lett. 15 (1), 115(2020).
  31. Boyles, M., et al. Development of a standard operating procedure for the DCFH2-DA acellular assessment of reactive oxygen species produced by nanomaterials. Toxicol Mech Meth. 32 (6), 439-452 (2022).
  32. Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Sci Meth Clin Res. , 151-172 (2017).
  33. Ma, Q. Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 53, 401-426 (2013).
  34. Calabrese, V., Cornelius, C., Dinkova-Kostova, A. T., Calabrese, E. J., Mattson, M. P. Cellular stress responses, the hormesis paradigm, and vitagenes: novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative disorders. Antioxid redox Signal. 13 (11), 1763-1811 (2010).
  35. Ishkaeva, R. A., Zoughaib, M., Laikov, A. V., Angelova, P. R., Abdullin, T. I. Probing cell redox state and glutathione-modulating factors using a monochlorobimane-based microplate assay. Antioxidants. 11 (2), 391(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Glutathione QuantificationOxidized GlutathioneReduced GlutathioneOrtho Phthalaldehyde AssayReactive Oxygen SpeciesProtein NormalizationFluorescence DetectionMammalian Cell CultureBicinchoninic Acid AssayCytotoxicity Assessment

מאמרים קשורים