הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.

תקציר

הארכיאון Sulfolobus acidocaldarius התגלה כמערכת מודל תרמופילית מבטיחה. חקירת האופן שבו תרמופילים מסתגלים לטמפרטורות משתנות היא דרישת מפתח, לא רק להבנת תהליכים אבולוציוניים בסיסיים אלא גם לפיתוח S. acidocaldarius כמארז לביו-הנדסה. מכשול עיקרי אחד לביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים הוא הוצאות תחזוקת ציוד ושימוש באנרגיה של אינקובטורים מסורתיים לגידול בטמפרטורה גבוהה. כדי להתמודד עם אתגר זה, מוצג פרוטוקול ניסויי מקיף לביצוע אבולוציה ניסיונית ב- S. acidocaldarius , תוך שימוש בתרמומיקסרים בעלי עלות נמוכה וחסכוניים באנרגיה. הפרוטוקול כולל טכניקת תרבית אצווה עם נפחים קטנים יחסית (1.5 מ"ל), המאפשרת מעקב אחר הסתגלות במספר שושלות עצמאיות. שיטה זו ניתנת להרחבה בקלות באמצעות שימוש בתרמומיקסרים נוספים. גישה כזו מגדילה את הנגישות של S. acidocaldarius כמערכת מודל על ידי הפחתת ההשקעה הראשונית והעלויות המתמשכות הקשורות לחקירות ניסיוניות. יתר על כן, הטכניקה ניתנת להעברה למערכות מיקרוביאליות אחרות לחקר הסתגלות לתנאי סביבה מגוונים.

מבוא

ייתכן שהחיים המוקדמים על פני כדור הארץ מקורם בסביבות קיצוניות, כגון נביעות הידרותרמיות, המאופיינות בטמפרטורות וחומציות גבוהות במיוחד¹. מיקרובים ממשיכים לאכלס סביבות קיצוניות, כולל מעיינות חמים וסולפטארה וולקנית. אפיון הדינמיקה האבולוציונית המתרחשת בתנאים קיצוניים אלה עשוי לשפוך אור על התהליכים הפיזיולוגיים המיוחדים המאפשרים הישרדות בתנאים אלה. עשויות להיות לכך השלכות נרחבות, החל מהבנתנו את מקורות המגוון הביולוגי ועד לפיתוח אנזימים חדשים בטמפרטורה גבוהה עם יישומים ביוטכנולוגיים.

ההבנה של דינמיקה אבולוציונית מיקרוביאלית בסביבות קיצוניות נותרה מוגבלת למרות חשיבותה הקריטית. לעומת זאת, גוף ידע משמעותי על אבולוציה בסביבות מזופיליות נרכש באמצעות יישום טכניקה המכונה אבולוציה ניסיונית. אבולוציה ניסויית כוללת התבוננות בשינויים אבולוציוניים בתנאי מעבדה 2,3,4,5. לעתים קרובות, מדובר בסביבת שינוי מוגדרת (למשל, טמפרטורה, מליחות, הכנסת רעלן או אורגניזם מתחרה)^7,8,9. בשילוב עם ריצוף גנום שלם, האבולוציה הניסויית אפשרה לנו לבחון היבטים מרכזיים של תהליכים אבולוציוניים, כולל תקבולת, חזרתיות והבסיס הגנומי להסתגלות. עם זאת, עד כה, רוב האבולוציה הניסויית בוצעה עם מיקרובים מזופיליים (כולל חיידקים, פטריות ווירוסים 2,3,4,5, אך במידה רבה לא כולל ארכאה). שיטה לאבולוציה ניסיונית הישימה למיקרובים תרמופיליים תאפשר לנו להבין טוב יותר כיצד הם מתפתחים ותתרום להבנה מקיפה יותר של האבולוציה. יש לכך השלכות פוטנציאליות נרחבות, החל מפענוח מקורות החיים התרמופיליים על פני כדור הארץ וכלה ביישומים ביוטכנולוגיים הכוללים "אקסטרמוזימים" המשמשים בתהליכים ביולוגיים בטמפרטורה גבוהה¹⁰ ובמחקר אסטרוביולוגי¹¹.

הארכאון Sulfolobus acidocaldarius הוא מועמד אידיאלי כאורגניזם מודל לפיתוח טכניקות אבולוציה ניסיוניות עבור תרמופילים. S. acidocaldarius מתרבה באופן אירובי, עם טמפרטורת גידול אופטימלית ב 75 ° C (טווח 55 ° C עד 85 ° C) וחומציות גבוהה (pH 2-3) 4,6,12,13,14. למרבה הפלא, למרות תנאי הגידול הקיצוניים שלו, S. acidocaldarius שומר על צפיפות אוכלוסייה ושיעורי מוטציות דומים למזופילים 7,15,16,17,18. בנוסף, הוא בעל גנום קטן יחסית, מבואר היטב (זן DSM639: 2.2 Mb, 36.7% GC, 2,347 גנים)¹²; S. acidocaldarius נהנה גם מכלים חזקים להנדסת גנום, המאפשרים הערכה ישירה של התהליך האבולוציוני באמצעות נוקאאוטים גנטיים ממוקדים¹⁹. דוגמה בולטת לכך היא זמינותם של זנים מהונדסים גנטית של S. acidocaldarius, כגון זנים auxotrophic uracil של MW001¹⁹ ו- SK-1²⁰, אשר יכולים לשמש סמנים לבחירה.

ישנם אתגרים משמעותיים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. דגירה ממושכת בטמפרטורות גבוהות הנדרשות למחקרים אלה כופה אידוי ניכר הן בטכניקות גידול נוזליות והן בטכניקות גידול מוצקות. פעולה ממושכת בטמפרטורות גבוהות עלולה לפגוע גם באינקובטורים המסורתיים המשמשים בדרך כלל באבולוציה ניסיונית במדיה נוזלית. חקר טמפרטורות מרובות מחייב השקעה כספית משמעותית לרכישה ותחזוקה של מספר חממות. יתר על כן, צריכת האנרגיה הגבוהה הנדרשת מעוררת חששות סביבתיים ופיננסיים משמעותיים.

עבודה זו מציגה שיטה להתמודד עם האתגרים הנתקלים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. בהתבסס על טכניקה שפותחה על ידי Baes et al. לחקר תגובת הלם חום^14,21, השיטה שפותחה כאן משתמשת בתרמומיקסרים על ספסל לדגרה עקבית ואמינה בטמפרטורה גבוהה. המדרגיות שלה מאפשרת הערכה בו זמנית של טיפולי טמפרטורה מרובים, עם עלויות מופחתות ברכישת ציוד דגירה נוסף. זה משפר את יעילות הניסוי, ומאפשר ניתוח סטטיסטי חזק וחקירה מקיפה של גורמים המשפיעים על דינמיקה אבולוציונית בתרמופילים²². יתר על כן, גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את ההשקעה הראשונית הפיננסית ואת צריכת האנרגיה בהשוואה לחממות מסורתיות, ומציעה חלופה בת קיימא וידידותית יותר לסביבה.

השיטה שלנו מניחה את היסודות לחקירה ניסויית של דינמיקה אבולוציונית בסביבות המאופיינות בטמפרטורות קיצוניות, שייתכן שמילאו תפקיד מפתח בשלבים המוקדמים של גיוון החיים על פני כדור הארץ. לאורגניזמים תרמופיליים יש תכונות ייחודיות, אך תנאי הגידול הקיצוניים שלהם והדרישות המיוחדות שלהם הגבילו לעתים קרובות את נגישותם כמערכת מודל. התגברות על מחסומים אלה לא רק מרחיבה את הזדמנויות המחקר לחקר דינמיקה אבולוציונית, אלא גם משפרת את התועלת הרחבה יותר של תרמופילים כמערכות מודל במחקר מדעי.

פרוטוקול

1. הכנת מדיום גידול S. acidocaldarius (BBM ⁺)

הערה: כדי לטפח S. acidocaldarius, פרוטוקול זה משתמש במדיום ברוק בסיסי (BBM⁺)²³. זה מוכן על ידי שילוב ראשוני של פתרונות מלאי אנאורגניים המפורטים להלן כדי ליצור BBM ⁻, אשר עשוי להיות מוכן מראש. לאחר מכן BBM⁺ מוכן לפי הצורך על ידי הוספת פתרונות מלאי אורגניים ל- BBM⁻. מתכוני תמיסות מלאי מוצגים גם בטבלה 1. כל פתרונות המדיה והמלאי צריכים להיות מוכנים בזיקוק כפול H₂O (ddH₂O).

1. הכנת פתרונות מלאי אנאורגניים למדיום צמיחה
   1. הכן פתרון מלאי של Trace Element.
      1. הכן תמיסת מלאי יסודות קורט על ידי הוספת 9 גרם / ליטר של נתרן טטרבוראט decahydrate (Na₂B₄O₇·10H₂O) ל- ddH₂O, ואחריו תוספת של 1: 1 H₂SO₄ טיפה עד שהוא מתמוסס.
      2. הצג ברצף 0.44 גרם/ליטר אבץ גופרתי הפטהידראט (ZnSO₄·7H₂O), 0.1 גרם/ליטר נחושת(II) כלוריד דיהידרט (CuCl₂·2H₂O), 0.06 גרם/ליטר נתרן מוליבדט דיהידרט (Na₂MoO₄·2H₂O), 0.06 גרם/ליטר של ונדיום(IV) סולפט דיהידרט (VOSO_{4.2H 2}O), 0.02 גרם/ליטר קובלט(II) סולפט הפטהידראט (CoSO₄·7H₂O), ו-3.6 גרם/ליטר של טטרהידרט כלוריד מנגן(II) (MnCl₂·4H₂O). Autoclave את הפתרון ולאחסן ב 4 ° C.
   2. הכינו את תמיסת מלאי Fe (1000x) על ידי המסת 20 גרם/ליטר ברזל כלוריד הקסהידראט (FeCl₃·6H₂O) ב-ddH₂O. עקרו את התמיסה על ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
   3. הכינו את תמיסת ברוק I (1000x) על ידי המסת סידן כלורי 70 גרם/ליטר (CaCl₂·2H₂O) במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O). Autoclave ולאחסן ב 4 °C.
      זהירות: המסת CaCl₂·2H₂O במים היא תהליך אקסותרמי. בצע שלב זה בזהירות. יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה. אין לסגור היטב את כלי השיט, מכיוון שהלחץ עלול להצטבר.
   4. הכן את תמיסת ברוק II/III על ידי שילוב של 130 גרם/ליטר של אמוניום סולפט ((NH₄)₂SO₄), 25 גרם/ליטר של מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO₄·7H₂O), 28 גרם/ליטר אשלגן דימימן פוספט (KH₂PO₄), ו-50 מ"ל של תמיסת מלאי יסודות קורט שהוכנה בעבר. באמצעות 1:1 H₂SO₄, התאם את ה- pH של פתרון המניות ל- 2-3. בצע Autoclave של הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכנת פתרונות מלאי אורגני למדיום צמיחה
   1. הכינו את D-Glucose Stock Solution (פי 100) על ידי המסת 300 גרם/ליטר (30% w/v) של D-גלוקוז ב-ddH₂O ובצעו חיטוי (דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: ניתן להשתמש במקורות פחמן אחרים במקום D-גלוקוז בהתאם לדרישות הניסוי (למשל, D-xylose).
   2. הכינו פפטון מתמיסת מלאי קזאין (100x) על ידי המסת פפטון מקזאין ב-100 גרם/ליטר ב-ddH₂O. Autoclave כדי לעקר ולאחסן את תמיסת המלאי ב-RT.
   3. הכנת Uracil Stock Solution (100x) על ידי המסת 2 גרם / ליטר של אורציל ב- ddH₂O וסינון סטריליזציה (דרך מסנן 0.22 מיקרומטר); יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
3. הכנת מדיום גידול BBM⁺ בריכוז עבודה 1x
   1. ראשית, להכין 988 מ"ל של ddH_{סטרילי 2}O על ידי autoclaving.
   2. הכן 1 ליטר BBM⁻ על ידי הוספת 1 מ"ל של Brock Stock Solution I, 10 מ"ל של Brock Stock Solution II/III ו-1 מ"ל של תמיסת מלאי Fe ל-988 מ"ל של ddH₂O סטרילי שהופעל בעבר. התאם את ה- pH הבינוני לטווח של 2-3 עם 1:1 H₂SO₄.
      הערה: BBM⁻ ניתן להכין מראש ולאחסן ב- RT עד חודש אחד.
   3. לבסוף, כדי לייצר 1 ליטר BBM⁺, שלבו 10 מ"ל כל אחד של D-Glucose Stock Solution, Peptone מ-Casein Stock Solution ו-Uracil Stock Solution עם 985 מ"ל BBM⁻. מערבבים היטב ומתאימים את רמת החומציות הבינונית ל-2-3 עם 1:1 H₂SO₄.
      הערה: BBM⁺ צריך להיות מיוצר טרי לפי הצורך.
4. הכנת מדיום מוצק ^BBM+
   1. להכין 1 M פתרונות מלאי של MgCl₂ ו CaCl₂; אלה יסייעו בהתמצקות התווך המוצק BBM. עבור 1 M MgCl₂, להוסיף 9.5 גרם ל 100 מ"ל של ddH₂O. עבור 1 M CaCl₂, להוסיף 11 גרם עד 100 מ"ל של ddH₂O. Autoclave כדי לעקר.
      זהירות: המסת CaCl₂·2H₂O במים היא תהליך אקסותרמי. בצע שלב זה בזהירות. יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה. אין לסגור היטב את כלי השיט, מכיוון שהלחץ עלול להצטבר.
   2. יש לערבב 3% (w/v) גאם gellan (למשל, 30 גרם/ליטר) ב-ddH₂O ו-autoclave לעיקור.
      הערה: מסטיק Gellan (למשל, Gelrite) משמש כאן כסוכן gelling, כמו אגר בקטריולוגי סטנדרטי לא יכול להתמצק ב 75 ° C.
   3. בנפרד, הכינו את BBM⁺ למדיום מוצק, אותו יש לערבב ביחס של 1:1 עם מסטיק הגלן הסטרילי שהוכן בשלב 1.4.1.
      1. ראשית, הכינו 1 ליטר BBM⁻ כמו בשלב 1.3.2. שלב 887 מ"ל של BBM⁻ עם 1 מ"ל של תמיסת Fe Stock Solution ו-20 מ"ל כל אחד של D-Glucose Stock Solution, Peptone מ-Casein Stock Solution ו-Uracil Stock Solution.
      2. הוסף 40 מ"ל של 1 M MgCl₂ ו- 12 מ"ל של 1 M CaCl₂. מערבבים היטב ומתאימים את רמת החומציות הבינונית ל-2-3 עם 1:1 H₂SO₄.
         הערה: נפחי פתרונות המלאי שנוספו כאן גדולים במכוון מאשר להכנת BBM⁺ נוזלי בשלב 1.3. זה כדי להסביר ערבוב ביחס של 1:1 עם מסטיק gellan מותך בשלב הבא.
   4. מחממים את BBM⁺ לקבלת מדיום מוצק עד כ-75°C ומערבבים ביחס של 1:1 עם מסטיק gellan מותך ב-ddH₂O. מערבבים היטב ומוזגים לפלסטיק יציב בחום (למשל, פוליפרופילן), צלחות פטרי מזכוכית או צלחות בעלות שש בארות לצמיחה שלS. acidocaldarius. השתמשו באגר מיד לאחר הערבוב, מכיוון שהוא יתחיל במהירות.
      הערה: חלק מצלחות הפטרי בקוטר 90 מ"מ מפוליסטירן המשמשות בדרך כלל למיקרוביולוגיה יתעוותו אם ידגרו עליהן בטמפרטורות גבוהות לפרקי זמן ממושכים.
      זהירות: יש לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בעת התמודדות עם נוזלים חמים; יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה.

2. החייאת S. acidocaldarius מתרבית מלאי מקפיא

1. הכנת צינורות גדילה מאווררים להבטחת אוורור וזמינות חמצן מספקת.
   1. מראש, להכין פירסינג 2 מ"ל צינורות microcentrifuge לצמיחה Sulfolobus . מחממים בזהירות חוט קהה (>0.7 מ"מ, כגון אטב נייר מיושר) באמצעות להבת מבער Bunsen ומנקבים את מכסה הצינור, תוך יצירת חור קטן של כ-1 מ"מ.
   2. הניחו צינורות מנוקבים בכלי שיט אוטוקלאבנטי (למשל, קופסת קצה פיפטה ריקה) ואוטוקלאבה לעיקור.
      אזהרה: יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 כדי להגן מפני פגיעה תרמית בידיים כתוצאה ממתכת מחוממת. חממו את החוט לזמן קצר בלבד (1-2 שניות) כדי למנוע התחממות יתר. יש להשתמש רק במתכות בעלות טמפרטורת התכה גבוהה (פלדה).
2. לחסן תרביות Starter של S. acidocaldarius.
   1. מלאו את צינורות ה-2 מ"ל המחוררים ב-1.5 מ"ל של BBM⁺ שחומם מראש (כפי שהוכן בסעיף 1, מודגר מראש ב-75°C למשך 15 דקות לפחות).
   2. יש לחסן את הצינורות המלאים ב-BBM⁺ באמצעות גירוד (שווה ערך ל-50-60 מ"ג) ממלאי גליצרול (25% v/v גליצרול, מאוחסן ב-80°C-). כאן, S. acidocaldarius זן DSM639 משמש. מלא צינור נוסף עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
3. כדי למנוע מאירוסולים כלשהם לברוח ממכסה הצינור המנוקב בנפח 2 מ"ל ולזהם את סביבת הגידול (וכל דגימה אחרת) וכדי להפחית את השונות של אידוי התרבית בתוך הצינורות, הניחו על גבי המכסה קרום חדיר לגז שיכול לעמוד בטמפרטורות גבוהות (65-85 מעלות צלזיוס) ולחסום בריחה/חדירה מיקרוביאלית.
   הערה: השימוש בקרומים חדירים לגז לאיטום צינורות מפחית באופן משמעותי את האידוי. במהלך תקופה של 48 שעות ב 75 ° C, צינורות אטומים להציג אובדן נפח ממוצע של 8.63% (טווח: 3.29-16.45%, n = 24 עותקים טכניים, חזר פעמיים), לעומת 25.05% (טווח: 11.92-62.91%, n = 24 עותקים טכניים, חזר פעמיים) עבור צינורות לא אטומים.
4. יש לדגור על הצינורות המחוסנים בתרמומיסר בטמפרטורה של 75°C עם טלטול מתמיד ב-400 סיבובים לדקה (סל"ד) למשך 48-72 שעות או עד ש-OD_600nm של 0.3-0.8 יגיע כפי שנמדד על ידי ספקטרופוטומטר.
   הערה: המכסה המנוקב של צינורות 2 מ"ל ורעד מאפשרים אוורור מתאים לצמיחה אופטימלית. מכסה התרמיקסר צריך להיות במקום כדי להבטיח שמירה על טמפרטורה עקבית ולהפחית אידוי.
5. לאחר תקופת הדגירה, תנו לתרבויות המחודשות שלב צמיחה שני (התניה מוקדמת).
   1. גלולה למטה את התרביות על ידי סיבוב צינורות ב 5000 x גרם במשך 2 דקות ב RT. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-BBM⁺ חם טרי של 1.5 מ"ל.
      הערה: ניסוי זה משתמש בזן הבר DSM639 מסוג S. acidocaldarius , אך שיטות גידול ואבולוציה ניסיונית אלה יכולות להיות מיושמות על כל זן Sulfolobus ואולי תרמופילים אחרים.

3. קביעת צפיפות אוכלוסין, זמן הכפלה ושלב גידול מעריכי עבור S. acidocaldarius

1. קבע צפיפות אוכלוסייה וזמן לשלב גידול מעריכי עבור תנאי הבחירה שנבחרו. עבור כל מצב סביבתי שייבדק, הכינו שלוש תרביות התחלה בעקבות שלבים 2.1-2.5.
2. דללו את שלוש התרביות ב-BBM⁺ ל-OD_600nm של 0.01. לעשות לפחות 20 מ"ל מכל תרבית. שלוש תרבויות אלה מייצגות העתקים טכניים.
3. בצע עקומות גדילה משוכפלות של OD_600nm לאורך זמן באמצעות דגימה הרסנית.
   1. הכינו 24 צינורות 2 מ"ל מנוקבים משלב 2.1, הפרידו אותם לשלושה סטים של שמונה, ותייגו את השכפולים הטכניים האלה 1, 2 ו-3 (למשל, שמונה צינורות המסומנים כמשוכפלים 1 וכו').
   2. מכל אחת משלוש התרביות המדוללות משלב 3.2, פיפטה 1.5 מ"ל לשבעה צינורות מוכנים. מלא את הצינור הנותר עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
4. יש לדגור על כל 24 הצינורות בתרמומיקסר בטמפרטורה של 75°C ו-400 סל"ד. חותמים עם קרום חדיר לגז. במרווחי זמן קבועים (כגון 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 שעות), הסר צינור אחד מכל אחד משלושת העותקים המשוכפלים ומדוד OD_600nm באמצעות ספקטרופוטומטר, ולאחר מכן השליך את הצינור. החלף את הממברנה החדירה לגז לאחר הסרת צינור.
5. במקביל, לקבוע את הקשר בין OD_600nm לבין צפיפות האוכלוסייה. בצע דילולים טוריים (1 x ^10-1 עד 1 x ^10-6) בתווך BBM⁺ למשך שלוש נקודות זמן לפחות (באופן אידיאלי, התחלה, אמצע וסוף). יש לחסן 100 מיקרוליטר מכל דילול על מדיום BBM⁺ מוצק (מוכן כמו בשלב 1.4).
   הערה: כדי להשיג צמיחה עקבית של המושבה וספירה מדויקת, עדיף להעביר את התרבית המדוללת למדיה מוצקה במקום מבלי לבצע פיזור מכני, כגון שימוש בפיזור בצורת L או חרוזי זכוכית. נראה כי התפשטות מכנית משפיעה לרעה על היווצרות מושבות.
6. לדגור את הלוחות באינקובטור סטטי ב 75 מעלות צלזיוס עד הופעת מושבות (5-7 ימים).
   1. במהלך פרק זמן זה, שמרו על לחות האינקובטור כדי למנוע התייבשות מוגזמת של הלוחות, אחרת לא ייווצרו מושבות.
   2. השיגו זאת על ידי הנחת הצלחות בקופסת פוליפרופילן סגורה המרופדת במטלית לחה. נקבו את מכסה הקופסה לפחות שלוש פעמים כדי לאפשר אוורור.
   3. מניחים דליי מים באינקובטור כדי להגביר את הלחות. מלאו את הדליים מדי יום.
7. לאחר שכל מדידות OD_600nm נאספו, קבע את זמן וזמן ההכפלה כדי להגיע לשלב הצמיחה המעריכית על ידי התאמת עקומה לוגיסטית לקשר בין OD_600nm לזמן, לדוגמה, באמצעות SummarizeGrowth מחבילת Growthcurver ב- R.
8. לאחר שנוצרו מושבות גלויות על מדיה מוצקה, ספרו יחידות יוצרות מושבות (CFUs), במטרה לספור מגורם הדילול, ולייצר 50-100 מושבות לדיוק הטוב ביותר.
9. חשב את צפיפות התא בתווך התרבית באמצעות הנוסחה: CFU/mL = מספר מושבות/(גורם דילול × מצופה נפח).
10. בצע רגרסיה ליניארית של יומן רישום כדי לקבוע את הקשר בין log10(CFU) ו- log10(OD_600nm). לפיכך, חשב את ה- CFU/mL החזוי עבור OD נתון מהשיפוע והיירוט של מודל הרגרסיה: CFU חזוי = 10^{[שיפוע × log10(OD600nm) + יירוט]}.
11. (אופציונלי) כמו כן, בצע שלבים 3.1-3.10 באינקובטור רעד כדי לקבוע אם צמיחה דומה מושגת בתרמומיקסרים.

4. ייזום שושלות עצמאיות לאבולוציה ניסויית

1. יום 1: כדי ליצור מושבות בודדות, תחילה בצע את כל השלבים של סעיף 2 לעיל כדי ליצור תרבות התחלתית.
2. יום 3: מדוד OD_600nm של התרבית כדי לוודא שהיא הגיעה לצפיפות מספקת בשלב המעריכי (OD_600nm 0.3-0.8 על ידי ספקטרופוטומטר).
3. צור דילולים סדרתיים של תרבית S. acidocaldarius DSM639 מ- 1 x ^10-1-1 x ^10-6 ופזר 100 μL מכל דילול 1 x ^10-5 ו- 1 x ^10-6 לבארות של צלחת בת 6 בארות המכילה מדיום BBM⁺ מוצק (סעיף 1 וטבלה 1) במספר העתקים. לדגור על לוחות ב 75 ° C באינקובטור סטטי כמו בשלב 3.5 במשך 5-7 ימים עבור מושבות בודדות להופיע.
4. ימים 8-10 (5-7 ימים לאחר הדגירה):
   1. קבע את מספר השושלות המתפתחות ממושבות בודדות. עבור כל שושלת, בחר מושבה אחת באופן אקראי מתוך הצלחות באמצעות לולאת חיסון. השהה מחדש את המושבה בצינור מנוקב של 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל של מדיום BBM⁺ שחומם מראש. תייגו כראוי את הצינור.
   2. חזור על המספר הרצוי של שושלות; כאן הוקמו שבע שושלות שסומנו כ-SA1-7. מלא צינור נוסף עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
   3. אוטמים את החלק העליון של הצינורות עם קרום נושם ודגרים בתרמומיקסר ב 75 ° C, 400 סל"ד במשך 48-72 שעות, עד התרביות להיות עכור (שווה ערך OD_600nm 0.3-0.8 על ידי ספקטרופוטומטר).
5. ימים 10-12 (7-9 ימים לאחר החיסון):
   1. בצנטריפוגה על ספסל, סובבו את תרביות השבט במהירות של 5,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 200 מיקרוליטר של BBM⁺ נוזלי.
   2. ערבבו את מתלי התאים של 200 μL עם 200 μL של 50% גליצרול (25% v/v גליצרול) כדי ליצור מלאי גליצרול של שבע השושלות העצמאיות ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. אלה הן אוכלוסיות האבות של ניסויי האבולוציה.

5. ביצוע ניסוי אבולוציית הטמפרטורה

הערה: תרשים מושגי המתאר את ההיבטים העיקריים של פרוטוקול הניסוי מוצג באיור 1.

1. השתמש בשבע האוכלוסיות הקדמוניות שנוצרו בסעיף 4 לניסוי האבולוציה.
   1. בצע את כל בדיקות האבולוציה הניסיונית בצינורות סטריליים מנוקבים של 2 מ"ל אטומים בקרום חדיר (המתואר לעיל, סעיף 2).
   2. לצד אוכלוסיות אלה, יש לשמור על צינורות 2 מ"ל מנוקבים נפרדים עם 1.5 מ"ל של BBM⁺ כבקרות שליליות ללא תרבית כדי לפקח על זיהום (צולב) ולקבוע סף OD המציין שאין גידול בתרבית.
2. קביעת טיפולי טמפרטורה: שימוש בתרמומיקסרים מאפשר לקבוע טיפולי טמפרטורה מרובים. כאן, השתמש בטיפולי הטמפרטורה הבאים: קבוע 75 ° C, קבוע 65 ° C, וירידה הדרגתית מ 75- 65 ° C על ידי הפחתת הטמפרטורה על ידי 1 ° C כל 4 ימים ("טיפול ירידת טמפרטורה").
   הערה: טיפולים אלה יכולים להיות מותאמים לדרישות ניסוי ספציפיות. יש צורך בתרמומיקסר נפרד לכל טיפול בטמפרטורה.
3. יום 1: החיו את אוכלוסיות האבות הקדמונים ממלאי הגליצרול שלהם (שהוכן בשלב 4.5) בהתאם לצעדים המתוארים בסעיף 2.
4. יום 3:
   1. דללו תרביות אלה ל-OD_600nm של 0.01 (נמדד על ידי ספקטרופוטומטר) לנפח כולל של לפחות 6 מ"ל של BBM⁺ שחומם מראש. Aliquot 1.5 מ"ל מכל אחת משבע תרבויות האוכלוסייה הקדומה המדוללת לשלוש צינורות נפרדים מנוקבים של 2 מ"ל, אחד לכל טיפול טמפרטורה שנקבע בשלב 5.2.
      הערה: שלב זה מבטיח שכל שונות גנטית הקיימת בכל אוכלוסיית אבות תהיה נוכחת בכל טיפולי הטמפרטורה בתחילת ניסוי האבולוציה. תרבויות אלה יפעלו כהעברה 0 (Tx0) כדי להתחיל את ניסוי אבולוציית הטמפרטורה.
   2. אטמו את הצינורות עם הממברנה הנושמת והכניסו כל קבוצה של שבע אוכלוסיות קדמוניות לתרמומיקסרים נפרדים. כוונו כל תרמומיקסר לטמפרטורה הנדרשת ול-400 סל"ד כדי להתחיל את ניסוי האבולוציה.
5. יום 5:
   1. לאחר 48 שעות, בצע העברה 1 (Tx1) על ידי חיסון 1.5 מ"ל מחומם BBM⁺ בינוני בצינור מנוקב 2 מ"ל עם 15 μL של תרבית מכל אחת מתרבויות Tx0 (דילול 1:100). עבור מהירות, בצע שלב זה עם פיפטה רב ערוצית ברוחב משתנה כדי להשלים העברות מרובות מניסוי יחיד ביחד, ובכך להפחית את הזמן שהתרביות נמצאות מחוץ לתרמיקוסר.
   2. כמו קודם, אטמו את הצינורות לפני החזרתם למיקומים אקראיים לתרמומיקסרים המתאימים. בצע אקראיות באופן ידני או באמצעות iMetaLab 96 randomizers היטב.
6. מדוד את OD_600nm של Tx0 בספקטרופוטומטר מבוסס לוחות (200 μL ב-96 לוחות באר; נפח זהה של BBM⁺ משמש ריק) כדי לעקוב אחר צמיחת השושלות הבלתי תלויות.
   הערה: יש למדוד את OD_600nm לאחר ביצוע ההעברה למדיום טרי כדי למנוע זיהום. צפיפות אופטית יכולה להימדד גם באמצעים אחרים, כגון באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי. השימוש בספקטרופוטומטר מבוסס לוחות מאפשר מדידה סימולטנית של תרביות מרובות ומייעל את התהליך.
7. חזור על שלבים 5.5 ו- 5.6 בימים 7, 9, 11 וכו', המתאימים ל- Tx2, Tx3, Tx4 וכו'. החזק את הטמפרטורה קבועה עבור טיפולים 75 ° C ו 65 ° C. לטיפול בנפילת טמפרטורה, הפחיתו את הטמפרטורה ב-1°C בכל העברה שנייה (כלומר, ב-Tx2, Tx4, Tx6 וכו').
8. הכינו מלאי גליצרול (שלב 3.2.3) של אוכלוסיות לאחר כל העברה¹⁰ (כלומר, Tx10, Tx20 וכו'), תיוג הצינור עם מזהה האוכלוסייה הקדומה (למשל, SA1 עבור האוכלוסייה העצמאית^{הראשונה} ) ומספר ההעברה (למשל, Tx10 עבור ההעברה^{העשירית} ). השתמש במאגרי גליצרול אלה מאוחר יותר כדי להחיות אוכלוסיות כדי לחקור כיצד אוכלוסיות השתנו לאורך זמן או כדי להפעיל מחדש את הניסוי במידת הצורך (למשל, עקב זיהום או תקריות בלתי צפויות הגורמות לאובדן תרביות).
9. תנו לניסוי להמשיך או למספר קבוע מראש של העברות או עד שיחלוף מספר דורות קבוע מראש. בהעברה הסופית, הכינו מלאי גליצרול של כל השושלות הצאצאיות.
   הערה: כאן, הניסוי המשיך עד שהטיפול בצניחת הטמפרטורה הגיע ל -65 מעלות צלזיוס, שהתרחש ב- Tx22. זה מתאים לכ -150 דורות (מחושב על בסיס גורם דילול של 100 ב 4.6: יומן₂(100) = 6.64 דורות להעברה). ניתן להתאים את אורך ניסויי האבולוציה בהתאם לדרישות הניסוי.

6. ניסוי שלאחר האבולוציה מבחני צמיחה: שושלות אבות לעומת שושלות מפותחות

הערה: תרשים מושגי המתאר את פרוטוקול בדיקת הצמיחה/הכושר ניתן באיור 2.

1. הכינו צינורות 2 מ"ל מנוקבים עם 1.5 מ"ל BBM⁺. הכינו מספיק צינורות כדי לגדל את כל השושלות הצאצאיות בתוספת כל אחד מזני האבות.
2. להחיות אוכלוסיות אבות, וכל אוכלוסיית צאצאים שאוחסנה בשלב 5.9 לאחר ההעברה הסופית של ניסוי האבולוציה בשיטה המתוארת בשלבים 2.2-2.5, אך עם דגירה בטמפרטורה שכל אוכלוסייה חוותה עבור שתי ההעברות האחרונות של ניסוי האבולוציה, כלומר, 75 ° C עבור הטיפול הקבוע של 75 ° C, ו 65 ° C עבור 65 ° C קבוע וניסויי ירידת טמפרטורה. כדי להשיג צפיפות אוכלוסייה דומה, בצע את הדגירה של 75 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות ואת הדגירה של 65 מעלות צלזיוס במשך 120 שעות.
3. מדוד OD_600nm של התרביות הגדלות באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס לוחות.
4. בצע בדיקות גדילה של כל אוכלוסיית צאצאים וכל זן קדמון בשתי הטמפרטורות (כלומר, 75 ° C ו 65 ° C) בשלושה עותקים משוכפלים. הכינו צינורות צנטריפוגות 2 מ"ל מנוקבים עם 1.5 מ"ל של BBM⁺. הכינו שישה צינורות לכל שושלת מפותחת ולכל זן אבות. תייגו את הצינורות בשם השושלת (SA1-7 או האב הקדמון), טמפרטורת הגידול (75°C או 65°C) והמזהה המשוכפל (1, 2 או 3).
   הערה: אם פחות משישה תרמומיקסרים זמינים, ניתן לשכפל את בדיקת הגידול במשך מספר ימים על פני מספר בלוקים ניסיוניים. במקרה זה, חשוב למדוד כל שושלת ואב קדמון בכל בלוק ניסיוני, כך שניתן יהיה להעריך את השפעות הבלוק ולהסביר אותן סטטיסטית.
5. חסנו את המדיום הטרי בששת הצינורות המוכנים עם 15 μL של תרבית מכל שושלת צאצאים וזן אבות.
6. הגדר שלושה תרמומיקסרים ל- 75 ° C ושלושה תרמומיקסרים ל- 65 ° C, ייעד כל תרמומיקסר למזהה משוכפל. מקם את הצינורות ב- thermomixer המתאים לטמפרטורה ומשכפל ID. בתוך כל תרמומיקסר, ודא כי השושלות והאבות הקדמונים ממוקמים באופן אקראי כדי לשלוט על הטרוגניות.
7. אוטמים כל סט של 24 צינורות עם קרום חדיר. דגירה במשך 48 שעות.
8. מעבירים 200 μL מכל תרבית לצלחת של 96 בארות. מדוד OD_600nm באמצעות ספקטרופוטומטר.
   הערה: ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית ברוחב משתנה כדי להקל על המעבר בין צינורות מיקרוצנטריפוגות וצלחות 96 בארות.
9. שרטט ונתח נתונים באמצעות תוכנות סטטיסטיות (למשל, R).

7. ריצוף גנום שלם של שושלות מפותחות וזיהוי מוטציות

1. החיו שושלות צאצאים שאוחסנו בשלב 5.9 ב-BBM⁺ שחומם מראש ב-75°C של 48-72 שעות על ידי חיסון פיסת קרח מכל אוכלוסייה קפואה ל-BBM⁺ כמו בסעיף 2, שלבים 2.2-2.5. הכינו בין 1-10 מ"ל של נפח תרבית כדי לקבל כמות מספקת של DNA גנומי. עוצמת הקול המדויקת הנדרשת תלויה באפשרות שנבחרה לרצף בשלבים 7.2 או 7.3 (להלן).
   הערה: מומלץ גם לרצף את הזן המשמש להתחלת אוכלוסיות האבות. זאת כדי לקבוע נכונה אם מוטציות כלשהן שהתגלו בשושלות הצאצאים נוצרו במהלך ניסוי האבולוציה ולא לפני כן.
2. (אפשרות 1) לחלץ DNA גנומי ולהכין ספריות ריצוף Illumina עבור ריצוף Illumina.
   1. חילוץ וטיהור DNA גנומי באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית עבור חיידקים.
   2. ודא שהדנ"א הגנומי המופק עומד בדרישות הכמות והאיכות של ספק הריצוף באמצעות ערכות מסחריות המומלצות על ידי הספק.
   3. ביצוע הכנת ספריית DNA גנומית באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. מומלץ פרוטוקול קצה זוגי של 250 bp. אחסן DNA גנומי שחולץ ב -20 ° C עד מוכן לשלוח דגימות לספק ריצוף.
3. (אפשרות 2) לחלופין, שלח את הדגימות לספק מסחרי המבצע מיצוי DNA, בדיקות איכות DNA גנומיות, הכנת ספריית Illumina וריצוף Illumina כשירות משולב.
4. לנתח רצף גנומים כדי לזהות מוטציות.
   1. קבל קבצי FASTQ, ואם עדיין לא בוצע על ידי ספק הרצף, בצע חיתוך מתאם באמצעות Trimmomatic עם חיתוך איכות חלון הזזה של Q15.
   2. באמצעות קבצי FASTQ החתוכים, הפעל את צינור breseq (גרסה 0.38.1) כדי לזהות מוטציות, תוך השוואת קריאות הדנ"א הגנומי לרצף הייחוס של הזן שנבחר. עבור S. acidocaldarius DSM639, זהו RefSeq ID NC_007181.

8. (אופציונלי) הערכת צריכת האנרגיה של תרמומיקסר לעומת צריכת אנרגיה באינקובטור

1. כדי להשוות את צריכת האנרגיה של שימוש באינקובטור לעומת תרמומיקסר לצמיחה, מדוד את צריכת האנרגיה של כל מכשיר במשך 24 שעות באמצעות תקע ניטור אנרגיה.
2. השתמש בשני תקעים כדי למדוד את צריכת האנרגיה של שני המכשירים בו-זמנית. לחלופין, מדדו את צריכת האנרגיה בימים עוקבים.
3. נתק את האינקובטור או התרמומיקסר משקע החשמל. חבר את תקע ניטור האנרגיה לשקע ואתחל אותו בהתאם להוראות היצרן, כולל התקנת תוכנת הניטור והבקרה.
4. חבר את האינקובטור או התרמומיקסר לתקע ניטור האנרגיה ואפשר לו לפעול לפחות שעתיים (אך באופן אידיאלי למשך 24 שעות או יותר) כדי להשיג הערכה טובה של צריכת אנרגיה טיפוסית. רשום את צריכת האנרגיה של כל מכשיר.

תוצאות

מדידות עקומת גדילה
עקומות גדילה עבור S. acidocaldarius DSM639 מוצגות באיור 3A. הגידול נמצא דומה כאשר משווים דגירה באמצעות תרמומיקסרים לזו של אינקובטורים קונבנציונליים. פרמטרים של קצב צמיחה ממוצע הוערכו על ידי התאמת עקומה לוגיסטית לכל עקומת צמיחה משוכפלת וחישוב הממוצע וטעות התקן. זמני השלב המעריכי הבינוני בתרמומיקסר ובאינקובטור היו 27.2 שעות ± 1.1 שעות ו-31.1 שעות ±-1.9 שעות, בהתאמה. זמני ההכפלה הראשוניים המשוערים של התרמומיקסר והאינקובטור ב-75°C היו 4.29 שעות ±-0.28 שעות ו-4.19 שעות ±-0.44 שעות, בהתאמה, נתון העולה בקנה אחד עם ערכים שפורסמו בעבר²⁴. הקשר בין log₁₀(OD_600nm) לבין log₁₀(CFU) אופיין היטב על ידי מודל ליניארי (מותאם R² = 0.82, F(1,22) = 104, p < 0.00001, שיפוע = 1.73 ± 0.17, יירוט = 9.73 ± 0.14). הקשר בין OD_600nm ו- CFU ניתן אפוא על ידי הנוסחה CFU = 10^{(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73)}. OD_600nm של 0.3 מתאים אפוא לכ- 6.7 × 10⁸ CFU/mL (איור 3B).

ניסוי אבולוציית טמפרטורה
שלושה תנאי טמפרטורה, קבוע 75 ° C, קבוע 65 ° C, וירידת טמפרטורה (75-65 ° C, ירידה ב 1 ° C כל שתי העברות), הופעלו באמצעות שבע שושלות עצמאיות הנגזרות מ S. acidocaldarius DSM639. מדידות OD_600nm נלקחו לאחר כל העברה במהלך 45 ימי הניסוי (כ-150 דורות ב-75°C) ומוצגות באיור 4. מדידות OD_600nm שנלקחות על פני ימים הן רועשות מטבען, מכיוון שהן עשויות להיות כפופות להבדלים עדינים, למשל, בתקופת הצמיחה, הטמפרטורה וכו '. עם זאת, מדידות שנעשות על פני ימים עדיין יכולות להיות שימושיות כדי להעריך את כדאיות האוכלוסייה, כמו גם לתת אינדיקציה אם הכושר משתפר עם הזמן. שושלות ממצב קבוע של 75 מעלות צלזיוס גדלו ב-OD_600nm מטווח התחלתי של 0.125-0.3 לטווח של 0.248-0.471 בסוף הניסוי. זה מצביע על כך שהכושר השתפר עם טיפול זה. לעומת זאת, שושלות מהטיפול הקבוע של 65 מעלות צלזיוס הציגו ירידה ב-OD_600nm, מטווח התחלתי של 0.018-0.087 ל-0.008-0.04 בנקודת הזמן הסופית. זה מצביע על כך שאוכלוסיות לא היו מסוגלות להסתגל לטמפרטורה קבועה של 65 מעלות צלזיוס, אם כי העובדה שניתן היה לשחזר אורגניזמים בני קיימא מראה שהאוכלוסיות לא נשטפו החוצה באמצעות דילולים עוקבים, מה שמרמז על מידה מסוימת של הסתגלות. לבסוף, האוכלוסיות בטיפול בצניחת טמפרטורה גדלו מהטווח הראשוני של OD_600nm של 0.099-0.279 ל- 0.3-0.39 ב- Tx6 (המקביל ל- 288 שעות ו- 73 ° C בטיפול זה), ולאחר מכן ירידה מתמדת לטווח של 0.003-0.024 בנקודת הזמן הסופית.

מבחני צמיחה/כושר
בדיקות כושר גופני בוצעו עבור כל אוכלוסיית צאצאים בעקבות ניסויי האבולוציה. OD_600nm נבדק לאחר צמיחה של 48 שעות עבור כל שבע השושלות העצמאיות, ולאחר מכן התאמת מודלים ליניאריים ב-R לכל טמפרטורת בדיקה, עם 'סביבת בחירה' כאפקט עיקרי ו'שכפול/תרמיקוסר' כאפקט בלוק. צמיחת הזן הקדמון שימשה כרמת ייחוס לניגודי טיפול. הנתונים מוצגים באיור 5.

כאשר נבדק ב 75 ° C, היו בממוצע עליות משמעותיות בכושר על פני הזן הקדמון עבור שושלות מן קבוע 75 ° C (t-test: t₂₁₀ = 3.64, p = 0.0003) קבוע 65 ° C (t-test: t₂₁₀ = 2.8, p = 0.005) טיפולים, אבל לא מן הטיפול בטמפרטורה ירידה (t-test: t₂₁₀ = −0.87, p=0.38). בממוצע, שושלות מכל הטיפולים הציגו עלייה בכושר (שושלות קבועות של 75 מעלות צלזיוס; מבחן t: t₂₁₀=4.68, p<0.0001, קבוע 65 °C שושלות; מבחן t: t₂₁₀,=4.24, p<0.0001, שושלות ירידת טמפרטורה; מבחן T: T₂₁₀=3.15, P=0.002). אולם עבור שתי הטמפרטורות שנבדקו היו הבדלים ניכרים בין שושלות בכושר שלהן (איור 5). חלק מהשושלות לא היו שונות במידה ניכרת מהזן הקדמון או ירדו בכושרן; זה היה בולט במיוחד עבור שושלות מהטיפול בצניחת טמפרטורה.

ראוי לציין כי הקשר בין OD_600nm ו- CFU/mL עשוי להשתנות במהלך ניסוי האבולוציה. ניתן להעריך זאת על ידי קביעת פרמטרים לצמיחה עבור שושלות מפותחות (לאחר שלבים 3.1-3.10).

תוצאות ריצוף גנום שלם
ניתוח גנום שלם בוצע באמצעות breseq (גרסה 0.38.1)²⁵ על שבע השושלות מהמצב הקבוע 75 מעלות צלזיוס באמצעות גנום הייחוס של S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq accession NC_007181.1). התגלו מגוון מוטציות הכוללות החדרות, מחיקות ופולימורפיזם של נוקלאוטידים בודדים (SNP) על פני הגנום של כל שושלות הצאצאים (טבלה 2). החדרות מרובות ומוטציות לא נרדפות היו בגנים מקודדי חלבונים, כמו גם באזורים בין-גניים שעשויים להשפיע על ביטוי גנים עקב שינויי מסגרת באזורים מקדמי הגנים. חלק מהמוטציות היו עקביות בשושלות צאצאים מרובות בגנים המעורבים בתפקודים שונים כמו ביוסינתזה של דופן התא, שעתוק, חילוף חומרים, הובלה תאית ופעילות קטליטית (טבלה 2). בין המוטציות הללו הייתה מחיקה גדולה של 54,667 זוגות בסיסים בחמש מתוך שבע השושלות; הדבר אושר על ידי תרשים ראיות כיסוי חסר לכל אוכלוסייה (תדירות הנעה בין 93.2% ל -100%). האזור שנמחק שווה לאובדן של 53 גנים; תפקידם של גנים אלה בהסתגלות ייחקר במחקרים עתידיים. כמה הבדלים נרשמו בין המבודד בשימוש של DSM639 לבין רצף הייחוס שפורסם (מוצג בטבלה משלימה 1).

צריכת אנרגיה של אינקובטור טלטול לעומת תרמומיקסר
צריכת האנרגיה של אינקובטור רועד הושוותה לתרמומיקסר באמצעות תקע חכם לניטור אנרגיה זמין מסחרית על פני מגוון טמפרטורות דגירה נפוצות וטמפרטורת 75 מעלות צלזיוס הנהוגה כאן. בטמפרטורה של 75°C, התרמומיקסר צרך בערך 1/40^{מהאנרגיה} של אינקובטור טלטול מסורתי (איור 6), מה שמרמז על תרמומיקסרים כאמצעי פוטנציאלי להפחתת טביעת הרגל הפחמנית הקשורה לאבולוציה ניסיונית.

איור 1: תרשים זרימה שמדגים את פרוטוקול ניסוי האבולוציה בשלושה טיפולי טמפרטורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תרשים זרימה המדגים את השלבים של פרוטוקול בדיקת גדילה/כושר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: קביעת פרמטרי גדילה מרכזיים והשוואת התקני דגירה עבור S. acidocaldarius DSM639. שלוש תרביות משוכפלות גודלו בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס ב-7 צינורות נפרדים. דגימה הרסנית שימשה למדידת (A) OD_600nm (פירושו ± שגיאת תקן של n=3 משכפלים טכניים; קווי שגיאה מסוימים קטנים יותר מסימני התווייה); עקומות מייצגות מודלים מותאמים של צמיחה לוגיסטית ו-(B) יחידות יוצרות מושבות (CFU); קווים מייצגים מודלים מותאמים של רגרסיה ליניארית לוג-לוג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תוצאות מייצגות עבור צפיפויות אופטיות (OD_600nm) שהתקבלו במהלך ניסויי אבולוציה. צפיפויות אופטיות של שושלות עצמאיות שנמדדו במהלך ניסויי האבולוציה תחת שלושה טיפולי טמפרטורה (קבוע 65 ° C, קבוע 75 ° C, ירידה 75 ° C - 65 ° C) שנערכו במשך כ -150 דורות. עקומות מתארות את לס מחליק לאורך זמן עבור כל שושלת עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים 5: תוצאות מייצגות למבחני צמיחה. מבחני גדילה לשושלות עצמאיות שמקורם ב-S. acidocaldarius DSM639 בעקבות ניסויי אבולוציה של טמפרטורה (קבוע 65°C, קבוע 75°C, ירידה 75°C-65°C) בהשוואה לזן האב הקדמון. עבור כל השושלות, הצמיחה נבדקה ב 65 ° C ו 75 ° C. נקודות צבעוניות מציגות את ממוצע ± שגיאת התקן של משכפלים טכניים (מוצגים באפור, n = 12 עבור האב הקדמון ו - n = 3 עבור כל שושלת מפותחת). הסרגל האפור מציין את ממוצע ± שגיאת התקן של הכושר הקדמון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: צריכת אנרגיה של אינקובטור מסורתי לעומת מכשירי תרמומיקסר. צריכת האנרגיה נרשמה באמצעות תקע חכם לניטור אנרגיה הזמין מסחרית במשך שעתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: מתכוני מדיה ופתרונות מלאי הדרושים לגידול S. acidocaldarius. כל פתרונות המדיה והמלאי צריכים להיעשות עם H₂O מזוקק כפול (ddH₂O) ולאחר מכן מעוקר על ידי autoclaving או סינון סטריליזציה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, כפי שצוין. עיין בסעיף 1 של הפרוטוקול לקבלת תיאור מפורט של אופן הכנת כל פתרונות המדיה והמלאי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: תוצאות מייצגות עבור ריצוף גנום שלם של שושלות צאצאים. מוטציות שנמצאו בשושלות צאצאים צאצאים של S. acidocaldarius DSM639 מטיפול קבוע של 75 מעלות צלזיוס. מוטציות מצביעות על שינויים ביחס לאב הקדמון הישיר של השושלת, שיש בו מספר שינויים ביחס לרצף הייחוס של S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; מוטציות באב הקדמון מוצגות בטבלה משלימה 1). n מציין את מספר השושלות שבהן נמצאה מוטציה. → גן על 'מסגרת הקריאה קדימה'; ← גן על 'מסגרת קריאה הפוכה'. †שינויים אלה הם יחסיים להסטת מסגרת (A)10→11 הקיימת בבידוד של S. acidocaldarius DSM639 (טבלה משלימה 1). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 1: מוטציות הקיימות בבידוד של S. acidocaldarius DSM639 ביחס לרצף הייחוס (RefSeq accession NC_007181.1). → גן על 'מסגרת הקריאה קדימה'; ← גן על 'מסגרת קריאה הפוכה'. ‡SACI_RS04020 מבואר כפסאודוגן ב-NC_007181.1, אך מוטציית Δ1 bp frameshift שנצפתה כאן משחזרת לכאורה את תפקודה כמו עם המוטציה, היא מקודדת חלבון עם 100% זהות לגן rgy reverse gyrase (RefSeq accession WP_176586667.1). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

עבודה זו פיתחה פרוטוקול אבולוציה ניסיוני עבור תרמופילים, המותאם כאן לארכאון S. acidocaldarius, אך ניתן להתאמה למיקרובים אחרים עם דרישות גידול בטמפרטורה גבוהה. פרוטוקול זה מתבסס על טכניקות שתוכננו בתחילה עבור חיידקים מזופיליים, אך שונה במיוחד כדי להתגבר על האתגרים הטכניים הקשורים לצמיחה אירובית בטמפרטורה גבוהה 2,4,5,24. יצירת שיטה זו תאפשר לחקור דינמיקות אבולוציוניות שלא אופינו קודם לכן, המתרחשות בתנאי טמפרטורה קיצוניים, בדומה לתנאים שהתקיימו באופן פוטנציאלי בשלבים המוקדמים ביותר של האבולוציה של החיים¹.

ישנם מספר היבטים קריטיים של הפרוטוקול שיש להקפיד עליהם כדי להשיג תוצאות אמינות מניסויי אבולוציה. הראשון הוא עצמאות בין שושלות, המושגת על ידי יציאה למושבות בודדות לפני תחילת הניסוי. זה הכרחי כדי להבטיח שלכל מוטציה משותפת שנמצאת בשושלות נפרדות יש מקורות עצמאיים. אם, במקום זאת, תרבית נוזלית בתפזורת היא aliquoted כדי ליזום את השושלות, וריאנטים גנטיים נפוצים עשויים להיות מופצים לכל אוכלוסייה. שיקול מרכזי שני הוא בקרה על זיהום, המושגת באמצעות שמירה על בקרה שלילית ללא תרבות וניטור לצמיחה. שלא כמו ניסויים עם מזופילים, ניסויים אבולוציוניים קיצוניים אינם צפויים להיות מזוהמים ממקורות חיצוניים, אך זיהום צולב בין שושלות עדיין עשוי להתרחש. שמירה על איזון בין אוורור לאידוי היא שיקול מרכזי נוסף. S.acidocaldarius הוא אירוב מחייב ולכן זקוק לחמצן לגדילה^10,23. פירסינג ידני של צינורות מיקרוצנטריפוגות פוליפרופילן ואיטום שלהם בקרום חדיר גז^21,25, היה המפתח לשמירה על אוורור ללא אידוי מוגזם בשל. הפחתה זו עשויה להיות מיוחסת לשמירה על סביבה אחידה בתוך הצינורות האטומים (הנתונים אינם מוצגים).

שני היבטים של השיטה עשויים לדרוש התאמה או פתרון בעיות בהתאם לתנאים הסביבתיים הספציפיים המשמשים לניסוי האבולוציה: גורם הדילול והזמן בין ההעברות. בשיטה זו בוצע דילול בקנ"מ 1:100 בכל העברה, מה שהצריך ממוצע של לוג₂(100) = 6.64 הכפלות כדי לחזור לאותו גודל אוכלוסייה. זה מספק איזון טוב בין פוטנציאל ההסתגלות (גורם דילול אופטימלי מחושב על ידי וואהל וג'ריש²⁶) לבין יכולת הטרקציה הניסיונית. באופן עקרוני, מקדם דילול חזק יאפשר ליותר דורות להתרחש ביום, מכיוון שהוא דורש יותר הכפלות כדי לחזור לאותה צפיפות אוכלוסייה (למשל, 1:1000 דורש יומן₂(1000) = 9.97 הכפלות בממוצע). עם זאת, אם יושגו פחות הכפלות מהנדרש בין העברות, האוכלוסיות יישטפו בהדרגה באמצעות דילול, אלא אם כן תתרחש מוטציה מועילה המפחיתה את זמן ההכפלה. עם אוכלוסיות המועברות כל 48 שעות, נדרש כי זמני ההכפלה יהיו פחות מ 8 שעות, אשר מיישר קו עם זמן ההכפלה המשוער וערכים שפורסמו בעבר עבור צמיחה הטרוטרופית ב S. acidocaldarius ב 75 ° C (4-6 שעות) ^23,27. עם זאת, הירידה ההדרגתית ב- OD_600nm לאורך זמן עבור טיפולים קבועים של 65 ° C וירידה בטמפרטורה מצביעה על כך שזה לא יכול להיות מספיק זמן כדי להשיג את מספר ההכפלות הנדרש וכי תקופת העברה ארוכה יותר תהיה מועילה.

מספר יתרונות חשובים של שימוש בתרמומיקסרים על פני אינקובטורים מסורתיים לאבולוציה ניסיונית צוינו, במיוחד כאשר חוקרים הסתגלות לטמפרטורה. תרמומיקסרים מהווים חלופה חסכונית לחממות רעידות, עם יתרון נוסף של טביעת רגל מרחבית מופחתת. מאפיינים אלה מאפשרים הערכה יעילה של טיפולי טמפרטורה מרובים במקביל. תרמומיקסרים גם מציגים צריכת אנרגיה נמוכה יותר מאשר אינקובטורים מטלטלים, כך שהשימוש בהם יכול להפחית את ההשפעה על הסביבה כאשר מספר צנוע של צינורות מודגר (למשל, פחות מ -100). הפער הזה בצריכת האנרגיה בולט במיוחד בטמפרטורות הרלוונטיות לתרמופילים, אולם הוא ישים גם על פני ספקטרום של טווחי טמפרטורות מתונים יותר (איור 6), כלומר ניתן לאמץ תרמומיקסרים גם להפחתת ההשפעה הסביבתית של אבולוציה ניסיונית מזופילית. באופן קולקטיבי, תכונות אלה מצביעות על כך שלשימוש בתרמומיקסרים באבולוציה ניסיונית יש פוטנציאל לשפר את הנגישות של מתודולוגיית מחקר זו, במיוחד בסביבות מוגבלות במשאבים, כגון מעבדות במדינות מתפתחות ובחינוך היסודי והעל-יסודי.

למרות שהיא מספקת דרך קדימה לאבולוציה ניסויית תרמופילית, לשיטה הנוכחית יש כמה מגבלות ביחס לאבולוציה הניסויית המזופילית. ראשית, מספר השושלות העצמאיות המשוכפלות שניתן להקים באמצעות תרמומיקסרים הוא קטן יחסית לשיטות בעלות תפוקה גבוהה הכוללות לוחות מיקרוטיטר, הנמצאים בשימוש נרחב עבור מזופילים⁴. אידוי בטמפרטורות גבוהות מונע כיום את השימוש בלוחות מיקרוטיטר בחלון הזמן הדרוש כדי להגיע לצמיחה אקספוננציאלית. שנית, הערכת פרמטרים מרכזיים של עקומת גדילה, כגון קצב צמיחה, זמן הכפלה וזמן השהיה, נעשית מאתגרת מכיוון שספקטרופוטומטרים מבוססי לוחות שיכולים לפעול בטמפרטורות גבוהות (>45 מעלות צלזיוס) אינם זמינים כעת לרכישה. בשיטה המתוארת כאן, אפיון עקומת הצמיחה כיום דורש דגימה הרסנית עתירת עבודה ולכן מגביל את התפוקה. לבסוף, טכניקות תפוקה גבוהה להערכת הכושר התחרותי של מבודדים מותאמים עדיין לא פותחו ביסודיות עבור תרמופילים. בפרט, פיתוח חלבון פלואורסצנטי תרמו-יציב שניתן להשתמש בו כדי להבדיל בין זנים יאפשר מבחני כושר מבוססי ציטומטריה בזרימה בתפוקה גבוהה^28,29; התפתחויות אחרונות של חלבונים פלואורסצנטיים תרמו-יציבים עם ספקטרום שונה מעלים זאת כהתפתחות עתידית פוטנציאלית 30,31,32. עלייה בתפוקה היא הצעד ההגיוני הבא לפיתוח נוסף של טכניקות אבולוציה ניסיוניות עבור תרמופילים, מכיוון שהיא תאפשר לתאר תהליכים אבולוציוניים בצורה מלאה יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 μ m מסנני ממברנה מונעי מזרק	StarLab	E4780-1226	לסינון רכיבי מדיה לעיקור שלא ניתן לבצע חיטוי.
1 μ L לולאות חיסון	גריינר	731161, 731165 או 731101	לחיסון תרביות. ניתן להשתמש בלולאות אחרות.
1000 μ L קצות פיפטה	StarLab	S1111-6811	ניתן להשתמש בקצות פיפטה אחרות.
צינורות מיקרו-צנטריפוגה 2 מ"ל	StarLab	S1620-2700	לתרבית S. acidocaldarius בתרמו-מיקסרים.
200 μ L קצות פיפטה	StarLab	S1111-0816	ניתן להשתמש בקצות פיפטה אחרות.
צינורות פוליסטירן 50 מ"ל עם תחתית חרוטית	קורנינג	או 430829	ניתן להשתמש בצינורות אחרים. בדוק ביצועים ב-75 מעלות צלזיוס. צינורות עם מכסי אטם תקע עשויים שלא לאפשר אוורור מספיק; בדוק לפני השימוש.
מזרק 50 מ"ל	BD פלסטיפק	300865	לשימוש עם מסננים מונעי מזרק.
96 לוחות מיקרוטיטר באר (לא מטופלים, תחתית שטוחה)	Nunc	260860	למדידת OD ב-600 ננומטר בספקטרופוטומטר.
פיפטה רב-ערוצית ברוחב מתכוונן	Pipet-Lite	LA8-300XLS	אופציונלי, אך חוסך זמן בהעברה בין מיקרו-צנטריפוגה ל-96 לוחות באר.
אמוניום גופרתי ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	לפתרון מלאי ברוק I.
ניתן להשתמש גם באוטוקלאב	Priorclave	B60-SMART או SV100-BASE	אוטוקלאבים אחרים.
Breathe-EASY קרום איטום חדיר גז	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	חתוך לגודל לשימוש בצינורות מיקרוצנטריפוגה מנוקבים. אם מחליפים ממרבנים חדירים אחרים לגז, ודא שהביצועים נאותים ב-75 מעלות; C
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl<תת>2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	לפתרון מניות ברוק I.
CELLSTAR שש צלחות באר (מתלה/לא מטופלות)	Greiner	M9062	סביר להניח שניתן להחליף את שש לוחות הבאר של יצרנים אחרים. בדוק ביצועים בטמפרטורות גבוהות.
קובלט סולפט הפטהידראט (CoSO4· 7H2O)	Supelco	1025560100	לפתרון מלאי יסודות קורט.
נחושת (II) כלוריד דיהידראט (CuCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	לפתרון מלאי יסודות קורט.
D-(+)-גלוקוז נטול מים (C6H12O6)	כימיקלים תרמו-מדעיים	11462858	ניתן להשתמש גם בפנטוז ובסוכרי הקסוז אחרים (למשל D-xylose, D-arabinose). גלוקוז אינו מקור פחמן מועדף עבור S. acidocaldarius (SV Albers, תקשורת אישית)
מים מזוקקים כפולים (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (מסטיק גלאן) משמש במקום אגר לייצור מדיה מוצקה בשל נקודת ההיתוך הגבוהה יותר שלו.
צלחות פטרי זכוכית 100 מ"מ	המותג	BR455742	כלי פטרי מזכוכית משמשים מכיוון שרוב צלחות הפטרי הסטנדרטיות מפוליסטירן 90 מ"מ מתעוותות ב-75 מעלות; C (תלוי במותג). לחלופין, ניתן להשתמש בשש צלחות באר מכיוון שאינן מתעוותות בטמפרטורות גבוהות.
חממה	ניו ברונסוויק	Innnova 42R	ניתן להשתמש גם בחממות אחרות. בדוק את טמפרטורת ההפעלה של ציוד לפני הרכישה/שימוש, מכיוון שחממות רבות אינן מסוגלות לטמפרטורות גבוהות מ-65 מעלות צלזיוס.
ברזל (III) כלוריד הקסהידרט (FeCl<תת>3· 6H2O)	Supelco	103943	לתמיסת מלאי Fe
מגנזיום סולפט הפטהידראט (מלח אנגלי) (MgSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	לפתרון מניות ברוק I.
מנגן (II) כלוריד טטרהידרט (MnCl2· 4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	לפתרון מלאי יסודות קורט.
שקע Wi-Fi מיני חכם, ניטור אנרגיה	Tapo	Tapo P110	לניטור צריכת אנרגיה
N-Z-אמין A - הידרוליזט אנזימטי קזאין	סיגמא-אולדריץ'	C0626-500G	N-Z-Amine-A משמש כמקור לחומצות אמינו.
מהדק נייר (או חוט יציב אחר)	ללא	אף אחד	לניקוב צינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל.
אשלגן דימימן פוספט (מונופוטסיום פוספט) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	לתמיסת מלאי ברוק I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	אופציונלי, לחילוץ DNA גנומי במעבדה
נתרן מוליבדט דיהידראט (Na2MoO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	לפתרון מלאי יסודות קורט.
נתרן טטרבוראט דקהידראט (בורקס) (Na2B4O7· 10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	לפתרון מלאי יסודות קורט.
ספקטרופוטומטר	BMG	SPECTROstar OMEGA	למדידת OD ב-600 ננומטר. ניתן להשתמש בספקטרופוטומטרים אחרים שיכולים לקרוא OD ב-600 ננומטר.
חומצה גופרתית (מדוללת ביחס של 1:1 עם מים) (H2SO4)	כימיקלים תרמו-מדעיים	11337588	משמש להתאמת ה-pH של תמיסת מלאי ברוק II/III ל-pH סופי של 2–3.
בתרמו-מיקסר	DLab	HM100-Pro	; השיקול העיקרי הוא היכולת לשמור על 65– 75 מעלות; טמפרטורות C ו-400 סל"ד
אורסיל (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	מחיקת פירE היא סמן גנטי נפוץ המשמש בS. acidocaldarius. יש להשלים זני מחיקה עם אוראציל לצורך גדילה. תוסף אינו נדרש לחלוטין עבור זן DSM639 מסוג פראי, אך הוא כלול כאן מכיוון שניסויים עתידיים עשויים לכלול זני מחיקה.
ונדיל סולפט דיהידראט (VOSO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	לפתרון מלאי יסודות קורט.
אבץ גופרתי הפטהידרט (ZnSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	לפתרון מלאי יסודות קורט.