הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66271

⸱

14 ביוני 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Evolution, Infection and Genomics, School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Sciences, The University of Manchester, 3Department of Earth and Environmental Sciences, School of Natural Sciences, The University of Manchester

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.

תקציר

הארכיאון Sulfolobus acidocaldarius התגלה כמערכת מודל תרמופילית מבטיחה. חקירת האופן שבו תרמופילים מסתגלים לטמפרטורות משתנות היא דרישת מפתח, לא רק להבנת תהליכים אבולוציוניים בסיסיים אלא גם לפיתוח S. acidocaldarius כמארז לביו-הנדסה. מכשול עיקרי אחד לביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים הוא הוצאות תחזוקת ציוד ושימוש באנרגיה של אינקובטורים מסורתיים לגידול בטמפרטורה גבוהה. כדי להתמודד עם אתגר זה, מוצג פרוטוקול ניסויי מקיף לביצוע אבולוציה ניסיונית ב- S. acidocaldarius , תוך שימוש בתרמומיקסרים בעלי עלות נמוכה וחסכוניים באנרגיה. הפרוטוקול כולל טכניקת תרבית אצווה עם נפחים קטנים יחסית (1.5 מ"ל), המאפשרת מעקב אחר הסתגלות במספר שושלות עצמאיות. שיטה זו ניתנת להרחבה בקלות באמצעות שימוש בתרמומיקסרים נוספים. גישה כזו מגדילה את הנגישות של S. acidocaldarius כמערכת מודל על ידי הפחתת ההשקעה הראשונית והעלויות המתמשכות הקשורות לחקירות ניסיוניות. יתר על כן, הטכניקה ניתנת להעברה למערכות מיקרוביאליות אחרות לחקר הסתגלות לתנאי סביבה מגוונים.

מבוא

ייתכן שהחיים המוקדמים על פני כדור הארץ מקורם בסביבות קיצוניות, כגון נביעות הידרותרמיות, המאופיינות בטמפרטורות וחומציות גבוהות במיוחד1. מיקרובים ממשיכים לאכלס סביבות קיצוניות, כולל מעיינות חמים וסולפטארה וולקנית. אפיון הדינמיקה האבולוציונית המתרחשת בתנאים קיצוניים אלה עשוי לשפוך אור על התהליכים הפיזיולוגיים המיוחדים המאפשרים הישרדות בתנאים אלה. עשויות להיות לכך השלכות נרחבות, החל מהבנתנו את מקורות המגוון הביולוגי ועד לפיתוח אנזימים חדשים בטמפרטורה גבוהה עם יישומים ביוטכנולוגיים.

ההבנה של דינמיקה אבולוציונית מיקרוביאלית בסביבות קיצוניות נותרה מוגבלת למרות חשיבותה הקריטית. לעומת זאת, גוף ידע משמעותי על אבולוציה בסביבות מזופיליות נרכש באמצעות יישום טכניקה המכונה אבולוציה ניסיונית. אבולוציה ניסויית כוללת התבוננות בשינויים אבולוציוניים בתנאי מעבדה 2,3,4,5. לעתים קרובות, מדובר בסביבת שינוי מוגדרת (למשל, טמפרטורה, מליחות, הכנסת רעלן או אורגניזם מתחרה)7,8,9. בשילוב עם ריצוף גנום שלם, האבולוציה הניסויית אפשרה לנו לבחון היבטים מרכזיים של תהליכים אבולוציוניים, כולל תקבולת, חזרתיות והבסיס הגנומי להסתגלות. עם זאת, עד כה, רוב האבולוציה הניסויית בוצעה עם מיקרובים מזופיליים (כולל חיידקים, פטריות ווירוסים 2,3,4,5, אך במידה רבה לא כולל ארכאה). שיטה לאבולוציה ניסיונית הישימה למיקרובים תרמופיליים תאפשר לנו להבין טוב יותר כיצד הם מתפתחים ותתרום להבנה מקיפה יותר של האבולוציה. יש לכך השלכות פוטנציאליות נרחבות, החל מפענוח מקורות החיים התרמופיליים על פני כדור הארץ וכלה ביישומים ביוטכנולוגיים הכוללים "אקסטרמוזימים" המשמשים בתהליכים ביולוגיים בטמפרטורה גבוהה10 ובמחקר אסטרוביולוגי11.

הארכאון Sulfolobus acidocaldarius הוא מועמד אידיאלי כאורגניזם מודל לפיתוח טכניקות אבולוציה ניסיוניות עבור תרמופילים. S. acidocaldarius מתרבה באופן אירובי, עם טמפרטורת גידול אופטימלית ב 75 ° C (טווח 55 ° C עד 85 ° C) וחומציות גבוהה (pH 2-3) 4,6,12,13,14. למרבה הפלא, למרות תנאי הגידול הקיצוניים שלו, S. acidocaldarius שומר על צפיפות אוכלוסייה ושיעורי מוטציות דומים למזופילים 7,15,16,17,18. בנוסף, הוא בעל גנום קטן יחסית, מבואר היטב (זן DSM639: 2.2 Mb, 36.7% GC, 2,347 גנים)12; S. acidocaldarius נהנה גם מכלים חזקים להנדסת גנום, המאפשרים הערכה ישירה של התהליך האבולוציוני באמצעות נוקאאוטים גנטיים ממוקדים19. דוגמה בולטת לכך היא זמינותם של זנים מהונדסים גנטית של S. acidocaldarius, כגון זנים auxotrophic uracil של MW00119 ו- SK-120, אשר יכולים לשמש סמנים לבחירה.

ישנם אתגרים משמעותיים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. דגירה ממושכת בטמפרטורות גבוהות הנדרשות למחקרים אלה כופה אידוי ניכר הן בטכניקות גידול נוזליות והן בטכניקות גידול מוצקות. פעולה ממושכת בטמפרטורות גבוהות עלולה לפגוע גם באינקובטורים המסורתיים המשמשים בדרך כלל באבולוציה ניסיונית במדיה נוזלית. חקר טמפרטורות מרובות מחייב השקעה כספית משמעותית לרכישה ותחזוקה של מספר חממות. יתר על כן, צריכת האנרגיה הגבוהה הנדרשת מעוררת חששות סביבתיים ופיננסיים משמעותיים.

עבודה זו מציגה שיטה להתמודד עם האתגרים הנתקלים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. בהתבסס על טכניקה שפותחה על ידי Baes et al. לחקר תגובת הלם חום14,21, השיטה שפותחה כאן משתמשת בתרמומיקסרים על ספסל לדגרה עקבית ואמינה בטמפרטורה גבוהה. המדרגיות שלה מאפשרת הערכה בו זמנית של טיפולי טמפרטורה מרובים, עם עלויות מופחתות ברכישת ציוד דגירה נוסף. זה משפר את יעילות הניסוי, ומאפשר ניתוח סטטיסטי חזק וחקירה מקיפה של גורמים המשפיעים על דינמיקה אבולוציונית בתרמופילים22. יתר על כן, גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את ההשקעה הראשונית הפיננסית ואת צריכת האנרגיה בהשוואה לחממות מסורתיות, ומציעה חלופה בת קיימא וידידותית יותר לסביבה.

השיטה שלנו מניחה את היסודות לחקירה ניסויית של דינמיקה אבולוציונית בסביבות המאופיינות בטמפרטורות קיצוניות, שייתכן שמילאו תפקיד מפתח בשלבים המוקדמים של גיוון החיים על פני כדור הארץ. לאורגניזמים תרמופיליים יש תכונות ייחודיות, אך תנאי הגידול הקיצוניים שלהם והדרישות המיוחדות שלהם הגבילו לעתים קרובות את נגישותם כמערכת מודל. התגברות על מחסומים אלה לא רק מרחיבה את הזדמנויות המחקר לחקר דינמיקה אבולוציונית, אלא גם משפרת את התועלת הרחבה יותר של תרמופילים כמערכות מודל במחקר מדעי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיום גידול S. acidocaldarius (BBM +)

הערה: כדי לטפח S. acidocaldarius, פרוטוקול זה משתמש במדיום ברוק בסיסי (BBM+)23. זה מוכן על ידי שילוב ראשוני של פתרונות מלאי אנאורגניים המפורטים להלן כדי ליצור BBM −, אשר עשוי להיות מוכן מראש. לאחר מכן BBM+ מוכן לפי הצורך על ידי הוספת פתרונות מלאי אורגניים ל- BBM−. מתכוני תמיסות מלאי מוצגים גם בטבלה 1. כל פתרונות המדיה והמלאי צריכים להיות מוכנים בזיקוק כפול H2O (ddH2O).

  1. הכנת פתרונות מלאי אנאורגניים למדיום צמיחה
    1. הכן פתרון מלאי של Trace Element.
      1. הכן תמיסת מלאי יסודות קורט על ידי הוספת 9 גרם / ליטר של נתרן טטרבוראט decahydrate (Na2B4O7·10H2O) ל- ddH2O, ואחריו תוספת של 1: 1 H2SO4 טיפה עד שהוא מתמוסס.
      2. הצג ברצף 0.44 גרם/ליטר אבץ גופרתי הפטהידראט (ZnSO4·7H2O), 0.1 גרם/ליטר נחושת(II) כלוריד דיהידרט (CuCl2·2H2O), 0.06 גרם/ליטר נתרן מוליבדט דיהידרט (Na2MoO4·2H2O), 0.06 גרם/ליטר של ונדיום(IV) סולפט דיהידרט (VOSO4.2H 2O), 0.02 גרם/ליטר קובלט(II) סולפט הפטהידראט (CoSO4·7H2O), ו-3.6 גרם/ליטר של טטרהידרט כלוריד מנגן(II) (MnCl2·4H2O). Autoclave את הפתרון ולאחסן ב 4 ° C.
    2. הכינו את תמיסת מלאי Fe (1000x) על ידי המסת 20 גרם/ליטר ברזל כלוריד הקסהידראט (FeCl3·6H2O) ב-ddH2O. עקרו את התמיסה על ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
    3. הכינו את תמיסת ברוק I (1000x) על ידי המסת סידן כלורי 70 גרם/ליטר (CaCl2·2H2O) במים מזוקקים פעמיים (ddH2O). Autoclave ולאחסן ב 4 °C.
      זהירות: המסת CaCl2·2H2O במים היא תהליך אקסותרמי. בצע שלב זה בזהירות. יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה. אין לסגור היטב את כלי השיט, מכיוון שהלחץ עלול להצטבר.
    4. הכן את תמיסת ברוק II/III על ידי שילוב של 130 גרם/ליטר של אמוניום סולפט ((NH4)2SO4), 25 גרם/ליטר של מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4·7H2O), 28 גרם/ליטר אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4), ו-50 מ"ל של תמיסת מלאי יסודות קורט שהוכנה בעבר. באמצעות 1:1 H2SO4, התאם את ה- pH של פתרון המניות ל- 2-3. בצע Autoclave של הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
  2. הכנת פתרונות מלאי אורגני למדיום צמיחה
    1. הכינו את D-Glucose Stock Solution (פי 100) על ידי המסת 300 גרם/ליטר (30% w/v) של D-גלוקוז ב-ddH2O ובצעו חיטוי (דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: ניתן להשתמש במקורות פחמן אחרים במקום D-גלוקוז בהתאם לדרישות הניסוי (למשל, D-xylose).
    2. הכינו פפטון מתמיסת מלאי קזאין (100x) על ידי המסת פפטון מקזאין ב-100 גרם/ליטר ב-ddH2O. Autoclave כדי לעקר ולאחסן את תמיסת המלאי ב-RT.
    3. הכנת Uracil Stock Solution (100x) על ידי המסת 2 גרם / ליטר של אורציל ב- ddH2O וסינון סטריליזציה (דרך מסנן 0.22 מיקרומטר); יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
  3. הכנת מדיום גידול BBM+ בריכוז עבודה 1x
    1. ראשית, להכין 988 מ"ל של ddHסטרילי 2O על ידי autoclaving.
    2. הכן 1 ליטר BBM− על ידי הוספת 1 מ"ל של Brock Stock Solution I, 10 מ"ל של Brock Stock Solution II/III ו-1 מ"ל של תמיסת מלאי Fe ל-988 מ"ל של ddH2O סטרילי שהופעל בעבר. התאם את ה- pH הבינוני לטווח של 2-3 עם 1:1 H2SO4.
      הערה: BBM− ניתן להכין מראש ולאחסן ב- RT עד חודש אחד.
    3. לבסוף, כדי לייצר 1 ליטר BBM+, שלבו 10 מ"ל כל אחד של D-Glucose Stock Solution, Peptone מ-Casein Stock Solution ו-Uracil Stock Solution עם 985 מ"ל BBM−. מערבבים היטב ומתאימים את רמת החומציות הבינונית ל-2-3 עם 1:1 H2SO4.
      הערה: BBM+ צריך להיות מיוצר טרי לפי הצורך.
  4. הכנת מדיום מוצק BBM+
    1. להכין 1 M פתרונות מלאי של MgCl2 ו CaCl2; אלה יסייעו בהתמצקות התווך המוצק BBM. עבור 1 M MgCl2, להוסיף 9.5 גרם ל 100 מ"ל של ddH2O. עבור 1 M CaCl2, להוסיף 11 גרם עד 100 מ"ל של ddH2O. Autoclave כדי לעקר.
      זהירות: המסת CaCl2·2H2O במים היא תהליך אקסותרמי. בצע שלב זה בזהירות. יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה. אין לסגור היטב את כלי השיט, מכיוון שהלחץ עלול להצטבר.
    2. יש לערבב 3% (w/v) גאם gellan (למשל, 30 גרם/ליטר) ב-ddH2O ו-autoclave לעיקור.
      הערה: מסטיק Gellan (למשל, Gelrite) משמש כאן כסוכן gelling, כמו אגר בקטריולוגי סטנדרטי לא יכול להתמצק ב 75 ° C.
    3. בנפרד, הכינו את BBM+ למדיום מוצק, אותו יש לערבב ביחס של 1:1 עם מסטיק הגלן הסטרילי שהוכן בשלב 1.4.1.
      1. ראשית, הכינו 1 ליטר BBM− כמו בשלב 1.3.2. שלב 887 מ"ל של BBM− עם 1 מ"ל של תמיסת Fe Stock Solution ו-20 מ"ל כל אחד של D-Glucose Stock Solution, Peptone מ-Casein Stock Solution ו-Uracil Stock Solution.
      2. הוסף 40 מ"ל של 1 M MgCl2 ו- 12 מ"ל של 1 M CaCl2. מערבבים היטב ומתאימים את רמת החומציות הבינונית ל-2-3 עם 1:1 H2SO4.
        הערה: נפחי פתרונות המלאי שנוספו כאן גדולים במכוון מאשר להכנת BBM+ נוזלי בשלב 1.3. זה כדי להסביר ערבוב ביחס של 1:1 עם מסטיק gellan מותך בשלב הבא.
    4. מחממים את BBM+ לקבלת מדיום מוצק עד כ-75°C ומערבבים ביחס של 1:1 עם מסטיק gellan מותך ב-ddH2O. מערבבים היטב ומוזגים לפלסטיק יציב בחום (למשל, פוליפרופילן), צלחות פטרי מזכוכית או צלחות בעלות שש בארות לצמיחה שלS. acidocaldarius. השתמשו באגר מיד לאחר הערבוב, מכיוון שהוא יתחיל במהירות.
      הערה: חלק מצלחות הפטרי בקוטר 90 מ"מ מפוליסטירן המשמשות בדרך כלל למיקרוביולוגיה יתעוותו אם ידגרו עליהן בטמפרטורות גבוהות לפרקי זמן ממושכים.
      זהירות: יש לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בעת התמודדות עם נוזלים חמים; יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה.

2. החייאת S. acidocaldarius מתרבית מלאי מקפיא

  1. הכנת צינורות גדילה מאווררים להבטחת אוורור וזמינות חמצן מספקת.
    1. מראש, להכין פירסינג 2 מ"ל צינורות microcentrifuge לצמיחה Sulfolobus . מחממים בזהירות חוט קהה (>0.7 מ"מ, כגון אטב נייר מיושר) באמצעות להבת מבער Bunsen ומנקבים את מכסה הצינור, תוך יצירת חור קטן של כ-1 מ"מ.
    2. הניחו צינורות מנוקבים בכלי שיט אוטוקלאבנטי (למשל, קופסת קצה פיפטה ריקה) ואוטוקלאבה לעיקור.
      אזהרה: יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 כדי להגן מפני פגיעה תרמית בידיים כתוצאה ממתכת מחוממת. חממו את החוט לזמן קצר בלבד (1-2 שניות) כדי למנוע התחממות יתר. יש להשתמש רק במתכות בעלות טמפרטורת התכה גבוהה (פלדה).
  2. לחסן תרביות Starter של S. acidocaldarius.
    1. מלאו את צינורות ה-2 מ"ל המחוררים ב-1.5 מ"ל של BBM+ שחומם מראש (כפי שהוכן בסעיף 1, מודגר מראש ב-75°C למשך 15 דקות לפחות).
    2. יש לחסן את הצינורות המלאים ב-BBM+ באמצעות גירוד (שווה ערך ל-50-60 מ"ג) ממלאי גליצרול (25% v/v גליצרול, מאוחסן ב-80°C-). כאן, S. acidocaldarius זן DSM639 משמש. מלא צינור נוסף עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
  3. כדי למנוע מאירוסולים כלשהם לברוח ממכסה הצינור המנוקב בנפח 2 מ"ל ולזהם את סביבת הגידול (וכל דגימה אחרת) וכדי להפחית את השונות של אידוי התרבית בתוך הצינורות, הניחו על גבי המכסה קרום חדיר לגז שיכול לעמוד בטמפרטורות גבוהות (65-85 מעלות צלזיוס) ולחסום בריחה/חדירה מיקרוביאלית.
    הערה: השימוש בקרומים חדירים לגז לאיטום צינורות מפחית באופן משמעותי את האידוי. במהלך תקופה של 48 שעות ב 75 ° C, צינורות אטומים להציג אובדן נפח ממוצע של 8.63% (טווח: 3.29-16.45%, n = 24 עותקים טכניים, חזר פעמיים), לעומת 25.05% (טווח: 11.92-62.91%, n = 24 עותקים טכניים, חזר פעמיים) עבור צינורות לא אטומים.
  4. יש לדגור על הצינורות המחוסנים בתרמומיסר בטמפרטורה של 75°C עם טלטול מתמיד ב-400 סיבובים לדקה (סל"ד) למשך 48-72 שעות או עד ש-OD600nm של 0.3-0.8 יגיע כפי שנמדד על ידי ספקטרופוטומטר.
    הערה: המכסה המנוקב של צינורות 2 מ"ל ורעד מאפשרים אוורור מתאים לצמיחה אופטימלית. מכסה התרמיקסר צריך להיות במקום כדי להבטיח שמירה על טמפרטורה עקבית ולהפחית אידוי.
  5. לאחר תקופת הדגירה, תנו לתרבויות המחודשות שלב צמיחה שני (התניה מוקדמת).
    1. גלולה למטה את התרביות על ידי סיבוב צינורות ב 5000 x גרם במשך 2 דקות ב RT. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-BBM+ חם טרי של 1.5 מ"ל.
      הערה: ניסוי זה משתמש בזן הבר DSM639 מסוג S. acidocaldarius , אך שיטות גידול ואבולוציה ניסיונית אלה יכולות להיות מיושמות על כל זן Sulfolobus ואולי תרמופילים אחרים.

3. קביעת צפיפות אוכלוסין, זמן הכפלה ושלב גידול מעריכי עבור S. acidocaldarius

  1. קבע צפיפות אוכלוסייה וזמן לשלב גידול מעריכי עבור תנאי הבחירה שנבחרו. עבור כל מצב סביבתי שייבדק, הכינו שלוש תרביות התחלה בעקבות שלבים 2.1-2.5.
  2. דללו את שלוש התרביות ב-BBM+ ל-OD600nm של 0.01. לעשות לפחות 20 מ"ל מכל תרבית. שלוש תרבויות אלה מייצגות העתקים טכניים.
  3. בצע עקומות גדילה משוכפלות של OD600nm לאורך זמן באמצעות דגימה הרסנית.
    1. הכינו 24 צינורות 2 מ"ל מנוקבים משלב 2.1, הפרידו אותם לשלושה סטים של שמונה, ותייגו את השכפולים הטכניים האלה 1, 2 ו-3 (למשל, שמונה צינורות המסומנים כמשוכפלים 1 וכו').
    2. מכל אחת משלוש התרביות המדוללות משלב 3.2, פיפטה 1.5 מ"ל לשבעה צינורות מוכנים. מלא את הצינור הנותר עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
  4. יש לדגור על כל 24 הצינורות בתרמומיקסר בטמפרטורה של 75°C ו-400 סל"ד. חותמים עם קרום חדיר לגז. במרווחי זמן קבועים (כגון 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 שעות), הסר צינור אחד מכל אחד משלושת העותקים המשוכפלים ומדוד OD600nm באמצעות ספקטרופוטומטר, ולאחר מכן השליך את הצינור. החלף את הממברנה החדירה לגז לאחר הסרת צינור.
  5. במקביל, לקבוע את הקשר בין OD600nm לבין צפיפות האוכלוסייה. בצע דילולים טוריים (1 x 10-1 עד 1 x 10-6) בתווך BBM+ למשך שלוש נקודות זמן לפחות (באופן אידיאלי, התחלה, אמצע וסוף). יש לחסן 100 מיקרוליטר מכל דילול על מדיום BBM+ מוצק (מוכן כמו בשלב 1.4).
    הערה: כדי להשיג צמיחה עקבית של המושבה וספירה מדויקת, עדיף להעביר את התרבית המדוללת למדיה מוצקה במקום מבלי לבצע פיזור מכני, כגון שימוש בפיזור בצורת L או חרוזי זכוכית. נראה כי התפשטות מכנית משפיעה לרעה על היווצרות מושבות.
  6. לדגור את הלוחות באינקובטור סטטי ב 75 מעלות צלזיוס עד הופעת מושבות (5-7 ימים).
    1. במהלך פרק זמן זה, שמרו על לחות האינקובטור כדי למנוע התייבשות מוגזמת של הלוחות, אחרת לא ייווצרו מושבות.
    2. השיגו זאת על ידי הנחת הצלחות בקופסת פוליפרופילן סגורה המרופדת במטלית לחה. נקבו את מכסה הקופסה לפחות שלוש פעמים כדי לאפשר אוורור.
    3. מניחים דליי מים באינקובטור כדי להגביר את הלחות. מלאו את הדליים מדי יום.
  7. לאחר שכל מדידות OD600nm נאספו, קבע את זמן וזמן ההכפלה כדי להגיע לשלב הצמיחה המעריכית על ידי התאמת עקומה לוגיסטית לקשר בין OD600nm לזמן, לדוגמה, באמצעות SummarizeGrowth מחבילת Growthcurver ב- R.
  8. לאחר שנוצרו מושבות גלויות על מדיה מוצקה, ספרו יחידות יוצרות מושבות (CFUs), במטרה לספור מגורם הדילול, ולייצר 50-100 מושבות לדיוק הטוב ביותר.
  9. חשב את צפיפות התא בתווך התרבית באמצעות הנוסחה: CFU/mL = מספר מושבות/(גורם דילול × מצופה נפח).
  10. בצע רגרסיה ליניארית של יומן רישום כדי לקבוע את הקשר בין log10(CFU) ו- log10(OD600nm). לפיכך, חשב את ה- CFU/mL החזוי עבור OD נתון מהשיפוע והיירוט של מודל הרגרסיה: CFU חזוי = 10[שיפוע × log10(OD600nm) + יירוט].
  11. (אופציונלי) כמו כן, בצע שלבים 3.1-3.10 באינקובטור רעד כדי לקבוע אם צמיחה דומה מושגת בתרמומיקסרים.

4. ייזום שושלות עצמאיות לאבולוציה ניסויית

  1. יום 1: כדי ליצור מושבות בודדות, תחילה בצע את כל השלבים של סעיף 2 לעיל כדי ליצור תרבות התחלתית.
  2. יום 3: מדוד OD600nm של התרבית כדי לוודא שהיא הגיעה לצפיפות מספקת בשלב המעריכי (OD600nm 0.3-0.8 על ידי ספקטרופוטומטר).
  3. צור דילולים סדרתיים של תרבית S. acidocaldarius DSM639 מ- 1 x 10-1-1 x 10-6 ופזר 100 μL מכל דילול 1 x 10-5 ו- 1 x 10-6 לבארות של צלחת בת 6 בארות המכילה מדיום BBM+ מוצק (סעיף 1 וטבלה 1) במספר העתקים. לדגור על לוחות ב 75 ° C באינקובטור סטטי כמו בשלב 3.5 במשך 5-7 ימים עבור מושבות בודדות להופיע.
  4. ימים 8-10 (5-7 ימים לאחר הדגירה):
    1. קבע את מספר השושלות המתפתחות ממושבות בודדות. עבור כל שושלת, בחר מושבה אחת באופן אקראי מתוך הצלחות באמצעות לולאת חיסון. השהה מחדש את המושבה בצינור מנוקב של 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל של מדיום BBM+ שחומם מראש. תייגו כראוי את הצינור.
    2. חזור על המספר הרצוי של שושלות; כאן הוקמו שבע שושלות שסומנו כ-SA1-7. מלא צינור נוסף עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
    3. אוטמים את החלק העליון של הצינורות עם קרום נושם ודגרים בתרמומיקסר ב 75 ° C, 400 סל"ד במשך 48-72 שעות, עד התרביות להיות עכור (שווה ערך OD600nm 0.3-0.8 על ידי ספקטרופוטומטר).
  5. ימים 10-12 (7-9 ימים לאחר החיסון):
    1. בצנטריפוגה על ספסל, סובבו את תרביות השבט במהירות של 5,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 200 מיקרוליטר של BBM+ נוזלי.
    2. ערבבו את מתלי התאים של 200 μL עם 200 μL של 50% גליצרול (25% v/v גליצרול) כדי ליצור מלאי גליצרול של שבע השושלות העצמאיות ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. אלה הן אוכלוסיות האבות של ניסויי האבולוציה.

5. ביצוע ניסוי אבולוציית הטמפרטורה

הערה: תרשים מושגי המתאר את ההיבטים העיקריים של פרוטוקול הניסוי מוצג באיור 1.

  1. השתמש בשבע האוכלוסיות הקדמוניות שנוצרו בסעיף 4 לניסוי האבולוציה.
    1. בצע את כל בדיקות האבולוציה הניסיונית בצינורות סטריליים מנוקבים של 2 מ"ל אטומים בקרום חדיר (המתואר לעיל, סעיף 2).
    2. לצד אוכלוסיות אלה, יש לשמור על צינורות 2 מ"ל מנוקבים נפרדים עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרות שליליות ללא תרבית כדי לפקח על זיהום (צולב) ולקבוע סף OD המציין שאין גידול בתרבית.
  2. קביעת טיפולי טמפרטורה: שימוש בתרמומיקסרים מאפשר לקבוע טיפולי טמפרטורה מרובים. כאן, השתמש בטיפולי הטמפרטורה הבאים: קבוע 75 ° C, קבוע 65 ° C, וירידה הדרגתית מ 75- 65 ° C על ידי הפחתת הטמפרטורה על ידי 1 ° C כל 4 ימים ("טיפול ירידת טמפרטורה").
    הערה: טיפולים אלה יכולים להיות מותאמים לדרישות ניסוי ספציפיות. יש צורך בתרמומיקסר נפרד לכל טיפול בטמפרטורה.
  3. יום 1: החיו את אוכלוסיות האבות הקדמונים ממלאי הגליצרול שלהם (שהוכן בשלב 4.5) בהתאם לצעדים המתוארים בסעיף 2.
  4. יום 3:
    1. דללו תרביות אלה ל-OD600nm של 0.01 (נמדד על ידי ספקטרופוטומטר) לנפח כולל של לפחות 6 מ"ל של BBM+ שחומם מראש. Aliquot 1.5 מ"ל מכל אחת משבע תרבויות האוכלוסייה הקדומה המדוללת לשלוש צינורות נפרדים מנוקבים של 2 מ"ל, אחד לכל טיפול טמפרטורה שנקבע בשלב 5.2.
      הערה: שלב זה מבטיח שכל שונות גנטית הקיימת בכל אוכלוסיית אבות תהיה נוכחת בכל טיפולי הטמפרטורה בתחילת ניסוי האבולוציה. תרבויות אלה יפעלו כהעברה 0 (Tx0) כדי להתחיל את ניסוי אבולוציית הטמפרטורה.
    2. אטמו את הצינורות עם הממברנה הנושמת והכניסו כל קבוצה של שבע אוכלוסיות קדמוניות לתרמומיקסרים נפרדים. כוונו כל תרמומיקסר לטמפרטורה הנדרשת ול-400 סל"ד כדי להתחיל את ניסוי האבולוציה.
  5. יום 5:
    1. לאחר 48 שעות, בצע העברה 1 (Tx1) על ידי חיסון 1.5 מ"ל מחומם BBM+ בינוני בצינור מנוקב 2 מ"ל עם 15 μL של תרבית מכל אחת מתרבויות Tx0 (דילול 1:100). עבור מהירות, בצע שלב זה עם פיפטה רב ערוצית ברוחב משתנה כדי להשלים העברות מרובות מניסוי יחיד ביחד, ובכך להפחית את הזמן שהתרביות נמצאות מחוץ לתרמיקוסר.
    2. כמו קודם, אטמו את הצינורות לפני החזרתם למיקומים אקראיים לתרמומיקסרים המתאימים. בצע אקראיות באופן ידני או באמצעות iMetaLab 96 randomizers היטב.
  6. מדוד את OD600nm של Tx0 בספקטרופוטומטר מבוסס לוחות (200 μL ב-96 לוחות באר; נפח זהה של BBM+ משמש ריק) כדי לעקוב אחר צמיחת השושלות הבלתי תלויות.
    הערה: יש למדוד את OD600nm לאחר ביצוע ההעברה למדיום טרי כדי למנוע זיהום. צפיפות אופטית יכולה להימדד גם באמצעים אחרים, כגון באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי. השימוש בספקטרופוטומטר מבוסס לוחות מאפשר מדידה סימולטנית של תרביות מרובות ומייעל את התהליך.
  7. חזור על שלבים 5.5 ו- 5.6 בימים 7, 9, 11 וכו', המתאימים ל- Tx2, Tx3, Tx4 וכו'. החזק את הטמפרטורה קבועה עבור טיפולים 75 ° C ו 65 ° C. לטיפול בנפילת טמפרטורה, הפחיתו את הטמפרטורה ב-1°C בכל העברה שנייה (כלומר, ב-Tx2, Tx4, Tx6 וכו').
  8. הכינו מלאי גליצרול (שלב 3.2.3) של אוכלוסיות לאחר כל העברה10 (כלומר, Tx10, Tx20 וכו'), תיוג הצינור עם מזהה האוכלוסייה הקדומה (למשל, SA1 עבור האוכלוסייה העצמאיתהראשונה ) ומספר ההעברה (למשל, Tx10 עבור ההעברההעשירית ). השתמש במאגרי גליצרול אלה מאוחר יותר כדי להחיות אוכלוסיות כדי לחקור כיצד אוכלוסיות השתנו לאורך זמן או כדי להפעיל מחדש את הניסוי במידת הצורך (למשל, עקב זיהום או תקריות בלתי צפויות הגורמות לאובדן תרביות).
  9. תנו לניסוי להמשיך או למספר קבוע מראש של העברות או עד שיחלוף מספר דורות קבוע מראש. בהעברה הסופית, הכינו מלאי גליצרול של כל השושלות הצאצאיות.
    הערה: כאן, הניסוי המשיך עד שהטיפול בצניחת הטמפרטורה הגיע ל -65 מעלות צלזיוס, שהתרחש ב- Tx22. זה מתאים לכ -150 דורות (מחושב על בסיס גורם דילול של 100 ב 4.6: יומן2(100) = 6.64 דורות להעברה). ניתן להתאים את אורך ניסויי האבולוציה בהתאם לדרישות הניסוי.

6. ניסוי שלאחר האבולוציה מבחני צמיחה: שושלות אבות לעומת שושלות מפותחות

הערה: תרשים מושגי המתאר את פרוטוקול בדיקת הצמיחה/הכושר ניתן באיור 2.

  1. הכינו צינורות 2 מ"ל מנוקבים עם 1.5 מ"ל BBM+. הכינו מספיק צינורות כדי לגדל את כל השושלות הצאצאיות בתוספת כל אחד מזני האבות.
  2. להחיות אוכלוסיות אבות, וכל אוכלוסיית צאצאים שאוחסנה בשלב 5.9 לאחר ההעברה הסופית של ניסוי האבולוציה בשיטה המתוארת בשלבים 2.2-2.5, אך עם דגירה בטמפרטורה שכל אוכלוסייה חוותה עבור שתי ההעברות האחרונות של ניסוי האבולוציה, כלומר, 75 ° C עבור הטיפול הקבוע של 75 ° C, ו 65 ° C עבור 65 ° C קבוע וניסויי ירידת טמפרטורה. כדי להשיג צפיפות אוכלוסייה דומה, בצע את הדגירה של 75 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות ואת הדגירה של 65 מעלות צלזיוס במשך 120 שעות.
  3. מדוד OD600nm של התרביות הגדלות באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס לוחות.
  4. בצע בדיקות גדילה של כל אוכלוסיית צאצאים וכל זן קדמון בשתי הטמפרטורות (כלומר, 75 ° C ו 65 ° C) בשלושה עותקים משוכפלים. הכינו צינורות צנטריפוגות 2 מ"ל מנוקבים עם 1.5 מ"ל של BBM+. הכינו שישה צינורות לכל שושלת מפותחת ולכל זן אבות. תייגו את הצינורות בשם השושלת (SA1-7 או האב הקדמון), טמפרטורת הגידול (75°C או 65°C) והמזהה המשוכפל (1, 2 או 3).
    הערה: אם פחות משישה תרמומיקסרים זמינים, ניתן לשכפל את בדיקת הגידול במשך מספר ימים על פני מספר בלוקים ניסיוניים. במקרה זה, חשוב למדוד כל שושלת ואב קדמון בכל בלוק ניסיוני, כך שניתן יהיה להעריך את השפעות הבלוק ולהסביר אותן סטטיסטית.
  5. חסנו את המדיום הטרי בששת הצינורות המוכנים עם 15 μL של תרבית מכל שושלת צאצאים וזן אבות.
  6. הגדר שלושה תרמומיקסרים ל- 75 ° C ושלושה תרמומיקסרים ל- 65 ° C, ייעד כל תרמומיקסר למזהה משוכפל. מקם את הצינורות ב- thermomixer המתאים לטמפרטורה ומשכפל ID. בתוך כל תרמומיקסר, ודא כי השושלות והאבות הקדמונים ממוקמים באופן אקראי כדי לשלוט על הטרוגניות.
  7. אוטמים כל סט של 24 צינורות עם קרום חדיר. דגירה במשך 48 שעות.
  8. מעבירים 200 μL מכל תרבית לצלחת של 96 בארות. מדוד OD600nm באמצעות ספקטרופוטומטר.
    הערה: ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית ברוחב משתנה כדי להקל על המעבר בין צינורות מיקרוצנטריפוגות וצלחות 96 בארות.
  9. שרטט ונתח נתונים באמצעות תוכנות סטטיסטיות (למשל, R).

7. ריצוף גנום שלם של שושלות מפותחות וזיהוי מוטציות

  1. החיו שושלות צאצאים שאוחסנו בשלב 5.9 ב-BBM+ שחומם מראש ב-75°C של 48-72 שעות על ידי חיסון פיסת קרח מכל אוכלוסייה קפואה ל-BBM+ כמו בסעיף 2, שלבים 2.2-2.5. הכינו בין 1-10 מ"ל של נפח תרבית כדי לקבל כמות מספקת של DNA גנומי. עוצמת הקול המדויקת הנדרשת תלויה באפשרות שנבחרה לרצף בשלבים 7.2 או 7.3 (להלן).
    הערה: מומלץ גם לרצף את הזן המשמש להתחלת אוכלוסיות האבות. זאת כדי לקבוע נכונה אם מוטציות כלשהן שהתגלו בשושלות הצאצאים נוצרו במהלך ניסוי האבולוציה ולא לפני כן.
  2. (אפשרות 1) לחלץ DNA גנומי ולהכין ספריות ריצוף Illumina עבור ריצוף Illumina.
    1. חילוץ וטיהור DNA גנומי באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית עבור חיידקים.
    2. ודא שהדנ"א הגנומי המופק עומד בדרישות הכמות והאיכות של ספק הריצוף באמצעות ערכות מסחריות המומלצות על ידי הספק.
    3. ביצוע הכנת ספריית DNA גנומית באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. מומלץ פרוטוקול קצה זוגי של 250 bp. אחסן DNA גנומי שחולץ ב -20 ° C עד מוכן לשלוח דגימות לספק ריצוף.
  3. (אפשרות 2) לחלופין, שלח את הדגימות לספק מסחרי המבצע מיצוי DNA, בדיקות איכות DNA גנומיות, הכנת ספריית Illumina וריצוף Illumina כשירות משולב.
  4. לנתח רצף גנומים כדי לזהות מוטציות.
    1. קבל קבצי FASTQ, ואם עדיין לא בוצע על ידי ספק הרצף, בצע חיתוך מתאם באמצעות Trimmomatic עם חיתוך איכות חלון הזזה של Q15.
    2. באמצעות קבצי FASTQ החתוכים, הפעל את צינור breseq (גרסה 0.38.1) כדי לזהות מוטציות, תוך השוואת קריאות הדנ"א הגנומי לרצף הייחוס של הזן שנבחר. עבור S. acidocaldarius DSM639, זהו RefSeq ID NC_007181.

8. (אופציונלי) הערכת צריכת האנרגיה של תרמומיקסר לעומת צריכת אנרגיה באינקובטור

  1. כדי להשוות את צריכת האנרגיה של שימוש באינקובטור לעומת תרמומיקסר לצמיחה, מדוד את צריכת האנרגיה של כל מכשיר במשך 24 שעות באמצעות תקע ניטור אנרגיה.
  2. השתמש בשני תקעים כדי למדוד את צריכת האנרגיה של שני המכשירים בו-זמנית. לחלופין, מדדו את צריכת האנרגיה בימים עוקבים.
  3. נתק את האינקובטור או התרמומיקסר משקע החשמל. חבר את תקע ניטור האנרגיה לשקע ואתחל אותו בהתאם להוראות היצרן, כולל התקנת תוכנת הניטור והבקרה.
  4. חבר את האינקובטור או התרמומיקסר לתקע ניטור האנרגיה ואפשר לו לפעול לפחות שעתיים (אך באופן אידיאלי למשך 24 שעות או יותר) כדי להשיג הערכה טובה של צריכת אנרגיה טיפוסית. רשום את צריכת האנרגיה של כל מכשיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מדידות עקומת גדילה
עקומות גדילה עבור S. acidocaldarius DSM639 מוצגות באיור 3A. הגידול נמצא דומה כאשר משווים דגירה באמצעות תרמומיקסרים לזו של אינקובטורים קונבנציונליים. פרמטרים של קצב צמיחה ממוצע הוערכו על ידי התאמת עקומה לוגיסטית לכל עקומת צמיחה משוכפלת וחישוב הממוצע וטעות התקן. זמני השלב המעריכי הבינוני בתרמומיקסר ובאינקובטור היו 27.2 שעות ± 1.1 שעות ו-31.1 שעות ±-1.9 שעות, בהתאמה. זמני ההכפלה הראשוניים המשוערים של התרמומיקסר והאינקובטור ב-75°C היו 4.29 שעות ±-0...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו פיתחה פרוטוקול אבולוציה ניסיוני עבור תרמופילים, המותאם כאן לארכאון S. acidocaldarius, אך ניתן להתאמה למיקרובים אחרים עם דרישות גידול בטמפרטורה גבוהה. פרוטוקול זה מתבסס על טכניקות שתוכננו בתחילה עבור חיידקים מזופיליים, אך שונה במיוחד כדי להתגבר על האתגרים הטכניים הקשורים לצמיחה אירובית בטמפרטורה גבוהה 2,4,5,24. יצירת שיטה זו תאפשר לחקור דינמיקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

תודות

המחברים מודים לפרופ' SV Albers (אוניברסיטת פרייבורג), פרופ' אוולין פיטרס (Vrije Universiteit Brussel) וד"ר רני באס (Vrije Universiteit Brussel) על הייעוץ ועל הזן S. acidocaldarius DSM639. עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר של החברה המלכותית (הוענק ל- DRG: RGS\R1\231308), מענק מחקר UKRI-NERC "לחקור את הגבולות" (הוענק ל- DRG ו- CGK: NE/X012662/1), ומלגת דוקטורט של אוניברסיטת כווית (שהוענקה ל- ZA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 μ m מסנני ממברנה מונעי מזרקStarLabE4780-1226לסינון רכיבי מדיה לעיקור שלא ניתן לבצע חיטוי.
1 μ L לולאות חיסוןגריינר731161, 731165 או 731101לחיסון תרביות. ניתן להשתמש בלולאות אחרות.
1000 μ L קצות פיפטהStarLabS1111-6811ניתן להשתמש בקצות פיפטה אחרות.
צינורות מיקרו-צנטריפוגה 2 מ"לStarLabS1620-2700לתרבית S. acidocaldarius בתרמו-מיקסרים.
200 μ L קצות פיפטהStarLabS1111-0816ניתן להשתמש בקצות פיפטה אחרות.
צינורות פוליסטירן 50 מ"ל עם תחתית חרוטיתקורנינגאו 430829ניתן להשתמש בצינורות אחרים. בדוק ביצועים ב-75 מעלות צלזיוס. צינורות עם מכסי אטם תקע עשויים שלא לאפשר אוורור מספיק; בדוק לפני השימוש. 
מזרק 50 מ"לBD פלסטיפק300865לשימוש עם מסננים מונעי מזרק.
96 לוחות מיקרוטיטר באר (לא מטופלים, תחתית שטוחה)Nunc260860למדידת OD ב-600 ננומטר בספקטרופוטומטר.
פיפטה רב-ערוצית ברוחב מתכוונןPipet-LiteLA8-300XLSאופציונלי, אך חוסך זמן בהעברה בין מיקרו-צנטריפוגה ל-96 לוחות באר.
אמוניום גופרתי ((NH4)2SO4)Millipore168355לפתרון מלאי ברוק I.
ניתן להשתמש גם באוטוקלאבPriorclaveB60-SMART או SV100-BASEאוטוקלאבים אחרים.
Breathe-EASY קרום איטום חדיר גזSigma-AldrichZ763624-100EAחתוך לגודל לשימוש בצינורות מיקרוצנטריפוגה מנוקבים. אם מחליפים ממרבנים חדירים אחרים לגז, ודא שהביצועים נאותים ב-75 מעלות; C
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl<תת>2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306לפתרון מניות ברוק I.
CELLSTAR שש צלחות באר (מתלה/לא מטופלות)GreinerM9062סביר להניח שניתן להחליף את שש לוחות הבאר של יצרנים אחרים. בדוק ביצועים בטמפרטורות גבוהות.
קובלט סולפט הפטהידראט (CoSO4· 7H2O)Supelco1025560100לפתרון מלאי יסודות קורט.
נחושת (II) כלוריד דיהידראט (CuCl2· 2H2O)Sigma-Aldrich307483לפתרון מלאי יסודות קורט.
D-(+)-גלוקוז נטול מים (C6H12O6)כימיקלים תרמו-מדעיים11462858ניתן להשתמש גם בפנטוז ובסוכרי הקסוז אחרים (למשל D-xylose, D-arabinose). גלוקוז אינו מקור פחמן מועדף עבור S. acidocaldarius (SV Albers, תקשורת אישית)
מים מזוקקים כפולים (ddH2O)
GelriteDuchefa BiochemieG1101.1000Gelrite (מסטיק גלאן) משמש במקום אגר לייצור מדיה מוצקה בשל נקודת ההיתוך הגבוהה יותר שלו.
צלחות פטרי זכוכית 100 מ"מהמותגBR455742כלי פטרי מזכוכית משמשים מכיוון שרוב צלחות הפטרי הסטנדרטיות מפוליסטירן 90 מ"מ מתעוותות ב-75 מעלות; C (תלוי במותג). לחלופין, ניתן להשתמש בשש צלחות באר מכיוון שאינן מתעוותות בטמפרטורות גבוהות.
חממהניו ברונסוויקInnnova 42Rניתן להשתמש גם בחממות אחרות. בדוק את טמפרטורת ההפעלה של ציוד לפני הרכישה/שימוש, מכיוון שחממות רבות אינן מסוגלות לטמפרטורות גבוהות מ-65 מעלות צלזיוס.
ברזל (III) כלוריד הקסהידרט (FeCl<תת>3· 6H2O)Supelco103943לתמיסת מלאי Fe
מגנזיום סולפט הפטהידראט (מלח אנגלי) (MgSO4· 7H2O)Sigma-Aldrich230391לפתרון מניות ברוק I.
מנגן (II) כלוריד טטרהידרט (MnCl2· 4H2O)Sigma-AldrichSIALM5005-100Gלפתרון מלאי יסודות קורט.
שקע Wi-Fi מיני חכם, ניטור אנרגיהTapoTapo P110לניטור צריכת אנרגיה 
N-Z-אמין A - הידרוליזט אנזימטי קזאין סיגמא-אולדריץ'C0626-500GN-Z-Amine-A משמש כמקור לחומצות אמינו.
מהדק נייר (או חוט יציב אחר)ללאאף אחדלניקוב צינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל.
אשלגן דימימן פוספט (מונופוטסיום פוספט) (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662לתמיסת מלאי ברוק I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1120אופציונלי, לחילוץ DNA גנומי במעבדה
נתרן מוליבדט דיהידראט (Na2MoO4· 2H2O)Sigma-AldrichM1651-100Gלפתרון מלאי יסודות קורט.
נתרן טטרבוראט דקהידראט (בורקס) (Na2B4O7· 10H2O)Sigma-AldrichS9640לפתרון מלאי יסודות קורט.
ספקטרופוטומטרBMGSPECTROstar OMEGAלמדידת OD ב-600 ננומטר. ניתן להשתמש בספקטרופוטומטרים אחרים שיכולים לקרוא OD ב-600 ננומטר.
חומצה גופרתית (מדוללת ביחס של 1:1 עם מים) (H2SO4)כימיקלים תרמו-מדעיים11337588משמש להתאמת ה-pH של תמיסת מלאי ברוק II/III ל-pH סופי של 2–3.
בתרמו-מיקסרDLabHM100-Pro; השיקול העיקרי הוא היכולת לשמור על 65– 75 מעלות; טמפרטורות C ו-400 סל"ד
אורסיל (C4H4N2O2)Sigma-AldrichU0750מחיקת פירE היא סמן גנטי נפוץ המשמש בS. acidocaldarius. יש להשלים זני מחיקה עם אוראציל לצורך גדילה. תוסף אינו נדרש לחלוטין עבור זן DSM639 מסוג פראי, אך הוא כלול כאן מכיוון שניסויים עתידיים עשויים לכלול זני מחיקה.
ונדיל סולפט דיהידראט (VOSO4· 2H2O)Sigma-Aldrich204862לפתרון מלאי יסודות קורט.
אבץ גופרתי הפטהידרט (ZnSO4· 7H2O)Sigma-Aldrich221376לפתרון מלאי יסודות קורט.
430828 ניתן להשתמש גם אחרים

מקורות

  1. Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
  2. Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  3. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
  4. McDonald, M. J. Microbial experimental evolution - a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992(2019).
  5. Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
  6. McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
  7. Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
  8. Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
  9. Peeters, E., Thia-Toong, T. -L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
  10. Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus - A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474(2017).
  11. Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
  12. Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
  13. Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532(2021).
  14. Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
  15. Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
  16. Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605(2015).
  17. Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520(2009).
  18. Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
  19. Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214(2012).
  20. Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
  21. Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322(2023).
  22. González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
  23. Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
  24. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  25. Baes, R. Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master's Thesis. , Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018).
  26. Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
  27. Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
  28. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
  29. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  30. Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8(2018).
  31. Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791(2017).
  32. Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ארכאה תרמופיליותהסתגלות תרמופיליתתרבית באצ' (Batch Culture)דגירה ב-Thermomixerצפיפות אופטיתדילול סדרתימנוחי גליצרולשינוי סביבתי
הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.