זריקות תוך פמורליות מאפשרות קליטה של מספר קטן של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), על ידי הצבת התאים ישירות בחלל מח העצם. כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני של הזרקה תוך-פמורלית של HSPCs אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקה תוך-פמורלית של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע המטופויטיים (HSCs) מוגדרים על ידי יכולתם לייצר את כל סוגי תאי הדם לכל החיים. זה נבדק כירורגית על ידי השתלת אוכלוסיות תאים המכילות HSCs בעכברים סינגניים או מדוכאי חיסון. הגודל וההרכב הרב-שושלתי של השתל נמדדים לאחר מכן לאורך זמן, בדרך כלל על ידי ציטומטריית זרימה. באופן קלאסי, אוכלוסייה המכילה HSCs מוזרקת למחזור הדם של החיה, ולאחר מכן HSCs ביתם מח העצם, שם הם שוכנים ומתחילים בייצור הדם. לחלופין, HSCs ו / או תאי אב (HSPCs) ניתן למקם ישירות בחלל מח העצם.
מאמר זה מתאר פרוטוקול להזרקה תוך-פמורלית של HSPCs אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון. בקיצור, עכברים מותנים מראש מורדמים, וחור קטן נקדח דרך הברך לתוך עצם הירך באמצעות מחט. באמצעות מחט אינסולין קטנה יותר, התאים מוזרקים ישירות לתוך אותו צינור שנוצר על ידי המחט הראשונה. שיטה זו של השתלה יכולה להיות מיושמת בעיצובים ניסיוניים מגוונים, תוך שימוש בתאי עכבר או בני אדם כתאי תורם. זה כבר בשימוש נרחב ביותר עבור xenotransplantation, כי בהקשר זה, הוא נחשב לספק קליטה משופרת על פני זריקות תוך ורידי, ובכך לשפר את הכוח הסטטיסטי ולהפחית את מספר העכברים לשימוש.
מבוא
הדם יש אחד שיעורי התחדשות הגבוהים ביותר בגוף האדם, לייצר 1 × 1012 תאים ליום במוח העצם האנושי הבוגר1. תאי גזע המטופויטיים (HSC) מבטיחים ייצור דם לאורך תוחלת החיים בתהליך של המטופויזיס ומוגדרים על ידי יכולתם לייצר את כל סוגי תאי הדם (מולטיפוטנציאל) תוך שמירה על עצמם (התחדשות עצמית). מבחינה היסטורית, תקן הזהב לבדיקת תפקודו של HSC הסתמך תמיד על השתלות, ובחן את יכולתה של אוכלוסיית התורמים לשחזר את כל שושלות הדם של עכבר לטווח ארוך (המוגדר בדרך כלל כמינימום של 20 שבועות)2. גוף גדול של עבודה פונקציונלית המתפרשת על פני כמה עשורים הוכיח כי תא HSC הוא הטרוגני הן בתפוקת השושלת והן בבנייה מחדש לטווח ארוך. ארגז הכלים לחקר המטופויזיס התרחב במידה ניכרת במהלך השנים, עם טכניקות חדשות רבות, כולל בדיקות פונקציונליות של תאים בודדים במבחנה , גישות של אומיקה של תא בודד ומעקב אחר שושלת3. האחרונים הוכיחו באופן חד משמעי כי התרומות של HSC ואבות רב-פוטנטיים שונות במידה רבה בהמטופויזיס הילידי ותחת הלחץ המוטל על ידי השתלה. כל הטכניקות הללו משלימות את מבחני ההשתלה, שנותרו חשובים להערכת יכולת האכלוס מחדש לטווח ארוך של HSC. בהקשר של המחקר של hematopoiesis האדם, xenotransplantation מספק את השיטה היחידה להעריך באופן ניסיוני התחדשות עצמית בסביבה אורגניזם שלם.
השתלת קסנו של HSCs מבוצעת בדרך כלל באמצעות הזרקה תוך ורידית של תאים לעכברים מדוכאי חיסון. עם זאת, HSCs הם נדירים4 והגישה לדגימות אנושיות המכילות HSCs מוגבלת. בשנת 2003, הקבוצה של ג'ון דיק התאימה פרוטוקול לשאיפת מח עצם והזרקה תוך נשית של עכברי סוכרת/כשל חיסוני משולב חמור (NOD-SCID) שאינם שמנים, עם תאי דם טבורי (CB) לין-CD34+ (CB)5. למיטב ידיעתנו, לא דווח על השוואה רשמית בין זריקות תוך ורידי לעומת זריקות תוך פמורליות בתוצאות השתלות ארוכות טווח וסדרתיות. עם זאת, בהשוואה ישירה לזריקות תוך ורידי, זריקות תוך פמורליות מספקות גודל השתל גדול יותר עם אותו מספר תאים מושתלים6, לפחות בטווח הקצר. בנוסף, ניתן לזהות השתלה עם הרבה פחות תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs) מושתלים. הסברה היא שהסיבה לכך היא שהעברה תוך-פמורלית עוקפת את הצורך ב-HSCs כדי לאכלס את מח העצם, שבהקשר של קסנוגרפט הוא מגביל בשל היעדר תגובתיות בין מינים עבור מספר קולטנים וציטוקינים. באמצעות שימוש בזריקות תוך פמורליות, נוטע ועמיתיו היו הראשונים להשתילHSCs 7 אנושיים יחידים, אם כי יש לקחת שיקולים נוספים, כפי שמתואר בשיטותיהם. למסירה תוך-פמורלית של HSPCs יש גם מגבלות. ההזרקה עצמה משבשת והורסת חלק ממח העצם, ולכן אינה מצוינת למחקרים על ההצלבה בין HSCs לבין מיקרו-סביבת מח העצם שלהם. בנוסף, מספר התאים המרבי מוגבל על ידי נפח חלל העצם וזה עשוי להיות מעט מדי עבור יישומים מסוימים. כמו בכל טכניקה, יש לשקול את יישומה בניסוי ספציפי בהתבסס על היתרונות/חסרונות והשאלה הנשאלה. בהקשר של השתלת קסנו, אם מטרת הניסוי היא לבחון קליטה של מספר נמוך של HSPCs אנושיים ללא הערכה של מיקרו-סביבה, מתן תוך פמורלי בדרך כלל עדיף על הזרקה תוך ורידית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים בבעלי חיים המוצגים כאן עומדים בתקנות התיקון לחוק בעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986 2012 ובוצעו לאחר בדיקה אתית ואישור על ידי הגוף לרווחת בעלי חיים וסקירה אתית של אוניברסיטת קיימברידג '(AWERB). נקבה מהנהנת. עכברי Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), בגילאי 12 עד 16 שבועות (~21-30 גרם), שגודלו בבית והוחזקו במתקן בעלי חיים ספציפי ללא פתוגנים, שימשו לזריקות תוך עצם הירך. דגימות CB ללא זיהוי נאספו מתורמים בריאים לאחר הסכמה מדעת של ביובנק הדם ותאי הגזע של קיימברידג '(CBSB) בהתאם לנהלים מוסדרים שאושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של המחקר בקמברידג'שייר (18/EE/0199).
1. הכנת העכבר
- לפני ההקרנה, חריצו את אוזני העכברים לזיהוי ושקלו אותן למשקל בסיסי.
- עשרים וארבע שעות לפני השתלת התאים, מקרינים את העכברים באופן תת-קטלני עם קרינת 2.4 Gy.
2. הכנת תאים
הערה: עבור זריקות אלה, ניתן להשתמש בתאים מדגימות טריות או קפואות. ניתן למיין תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים לפי ציטומטריית זרימה. לחלופין, ניתן לגדל תאים בתרבית בתנאים הרצויים לפני ההשתלה. עבור הניסויים המוצגים, אנו משתמשים בתאי CB CD34+ קפואים.
- הפשיר את התאים בצינור של 50 מ"ל על ידי תוספת טיפתית של פי 10 מנפח התא של IMDM שחומם מראש + 50% סרום בקר עוברי (FBS) + 0.1 מ"ג / מ"ל DNase תוך כדי התססת הצינור באופן ידני. צנטריפוגה את התאים ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
- להשעות מחדש את התאים ב 20-40 μL (רצוי 25 μL) של PBS + פניצילין-סטרפטומיצין (10 U/mL או 0.1%) לכל עכבר. במידת האפשר, אפשרו תאים נוספים לנפח מת כאשר אתם מכניסים את התאים למזרק לצורך הזרקות. אחסנו את התאים על קרח עד לזריקות. מספר התאים המרבי בכל זריקה הוא 4 מיליון תאים.
3. הכנה להזרקה תוך פמורלית במתקן בעלי חיים
- הכינו את שלוש המחטים הבאות הדרושות להליך זה:
- הכינו מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 גרם 1/2 אינץ '.
- הכינו מזרק אינסולין 0.5 מ"ל עם מחט 29 גרם x 12.7 מ"מ המכילה את תרחיף התא.
- הכינו מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 29 גרם x 0.5 אינץ' עם 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין (100 מיקרוליטר).
- מרדימים את העכברים בקופסת הרדמה (באמצעות שאיפת איזופלורן 2% (v/v) וחמצן 2 ליטר/דקה). העבר את העכבר לקונוס האף ואשר את מוכנותו להליך על ידי צביטת בוהן. החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש.
הערה: הליך זה מתבצע במכסה מנוע בטיחות ביולוגית ברמת הכלה 2 ונעשה שימוש בתנאים סטריליים.
4. הזרקת intrafemoral
- השכיבו את העכבר על גבו וכופפו את רגלו האחורית. אבטחו את הרגל האחורית באמצעות היד הלא דומיננטית על ידי הנחת האגודל על כף הרגל, האצבע האמצעית על הירך והאצבע המורה בצד החיצוני של עצם הירך.
- יש לגלח או למרוט בעדינות את השיער סביב פיקת הברך ולהשתמש במקלון אלכוהול כדי לנגב את האזור.
- השתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G 1/2" וכוון לפינה הפנימית העליונה של פיקת הברך כדי לקדוח בעדינות חור דרך העור לכיוון עצם הירך. למרות שניתן לסובב את המחט קדימה ואחורה בהתחלה, השתמש רק בתנועה בכיוון השעון פעם אחת לתוך העצם, עד שכל המחט נמצאת בעצם.
הערה: המטרה של שלב זה היא ליצור צינור למשלוח תאים. (אופציונלי) כדי לבדוק אם המחט נמצאת כראוי בעצם, שחרר את הרגל וסובב את המזרק מצד לצד; אם זה נכון בעצם, כל הרגל צריכה לנוע עם הסיבוב. אבטחו מחדש את הרגל באמצעות היד הלא דומיננטית על ידי הנחת האגודל על כף הרגל, האצבע האמצעית על הירך והאצבע המורה בצד החיצוני של עצם הירך, לפני שתמשיכו. אם המחט מוחדרת בצורה לא נכונה, סביר להניח שהמחט תהיה בשריר או בגיד, הרגל לא תסתובב עם המזרק, וייתכן שתרגישו את המחט מתחת לעור. - הסר את המחט באמצעות סיבוב נגד כיוון השעון עד שהיא באמצע הדרך. בשלב זה, השתמש במקלון אלכוהול כדי לנגב סביב המחט (ייתכן שיש טיפת דם קטנה) ולאחר מכן להמשיך לסובב את המחט נגד כיוון השעון ולהסיר את המחט.
- הכנס את מזרק האינסולין 0.5 מ"ל המכיל את התאים בפיר הירך דרך אותו צינור. ברגע שהמחט נכנסת, רשום לעצמך תחושה של שריטה המציינת את המיקום הנכון. בשלב זה, שחררו את האחיזה ברגל, אך היזהרו שלא להסיר את המחט מהרגל. לאחר מכן, בעדינות, להזריק את 25 μL של תרחיף התא לתוך עצם הירך ולהסיר את המחט.
הערה: ה'שריטה' המתוארת היא כמו פגיעה במשטח מחוספס ואם המחט מרגישה שהיא נכנסה בצורה חלקה ללא תחושה גסה, היא לא במקום הנכון. רוב המשתמשים מבינים זאת בבירור ברגע שהם מצליחים בתרגול שלהם.
5. טיפול לאחר הזרקה
- הזריקו לעכבר תת עורית בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג, 100 מיקרוליטר) לפני החזרתו לכלוב שלו ומעקב אחר התאוששות מההרדמה.
הערה: אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה ולא יוחזר לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. עכברים אינם צפויים להראות תופעות לוואי כלשהן להזרקה intrafemoral; עם זאת, הזרקה תוך פמורלית עלולה לגרום לפעילות מופחתת ולכאב באזור המנותח. - להעריך נפיחות של hock, כאב, וניידות לאחר ההליך.
הערה: עכברים צריכים לחזור לניידות גפיים רגילה תוך 24 שעות מההזרקה.
6. ניתוח הנתונים
- הרדימו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם או כל שיטה מאושרת לאחר הזרקה בכל עת, למשל, 24-48 שעות לניסויי ביות, 4-12 שבועות לפעילות HSC לטווח קצר, >18 שבועות לקליטה לטווח ארוך. אם מתוכנן ניתוח של דם היקפי (PB), לדמם את העכברים לפני ההקרבה בכל שיטה מוסמכת, והניב באופן אידיאלי 50-100 מיקרוליטר דם (לא יותר מ -10% מהנפח הכולל). הסר עצמות רגליים אחוריות וטחול על פי פרוטוקולי דיסקציה סטנדרטיים.
- למח עצם:
- יש להפריד בין עצם הירך המוזרקת (IF) לבין העצמות שאינן מוזרקות (עצם הירך האחורית ועצם הירך שאינה מוזרקת, הנקראות BM). שטפו את העצמות באמצעות 1 מ"ל IMDM + 5% FBS ומחט וצנטריפוגה בגודל 36 גרם x 3/4 אינץ' למשך 5 דקות ב-500 × גרם.
- השהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של PBS + 3% FBS ולאחר מכן להעביר 50 μL לבאר של צלחת 96 תחתית עגולה עבור צביעה.
- הקפיאו את מח העצם שנותר ואחסנו אותו בחנקן נוזלי לניסויים נוספים של ex vivo או משניים in vivo .
- עבור PB:
- לשטוף את צינור האיסוף עם 100 μL של PBS + 3% FBS, להעביר את הדם 5 מ"ל FACS צינור, ולפצות את נפח ל 2.5 מ"ל עם PBS + 3% FBS.
- בזהירות פיפטה 1 מ"ל של Pancoll לתוך החלק התחתון של צינורות FACS וצנטריפוגה במשך 25 דקות ב 500 × גרם עם הבלם כבוי.
- אספו את שכבת המעיל הבאפי, העבירו אותה לצינורות 1.5 מ"ל ומלאו עד 1.5 מ"ל עם PBS + 3% FBS. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 × גרם.
- להשהות את הגלולה ב 50 μL של PBS + 3% FBS ולהעביר לבאר של צלחת 96 תחתית עגולה להכתמה.
- לטחול:
- מניחים את הטחול במסננת תאים המונחת על צינור 50 מ"ל ומועכים עם הבוכנה ממזרק 3 מ"ל.
- מיליליטר אחד בכל פעם, להוסיף 5 מ"ל של IMDM + 5% FBS כדי לשטוף את התאים דרך. קח 50 μL לבאר של צלחת 96 תחתית עגולה להכתמה.
- הכן מאסטרמיקס נוגדנים; הנה דוגמה ל-10 דוגמאות:
- Aliquot 550 μL של PBS + 3% FBS (50 μL / מדגם + 10% תוספת) בצינור 1.5 או 2 מ"ל.
- הוסף נוגדנים בודדים כך שהריכוז הסופי שלהם יהיה פי 2 בהתבסס על הטיטרציה שלהם (למשל, עבור נוגדן עם טיטרציה 1:100, הוסף 11 μL).
הערה: בחר פאנל נוגדנים המעריך התמיינות פוטנציאלית בכל שושלות הדם המעניינות, לדוגמה, CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 ו-CD3/APCCy7.
- צביעה: יש להוסיף 50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים לכל אחת מהבארות של 96 הלוחות בעלי התחתית העגולה המכילה את הדגימות לצביעה. יש לצבוע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, להוסיף 100 μL של PBS + 3% FBS כדי לשטוף את התאים, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 × גרם. הסר את supernatant.
- להשעות מחדש את הגלולה ב 200 μL של PBS + 3% FBS ולהעביר כל דגימה דרך צינור FACS עם מכסה מסננת התא. לדגימות מח עצם וטחול, הוסף 200 μL נוספים של PBS + 3% FBS.
- בקרות ציטומטריית זרימה: בצע בקרות כתם יחיד באמצעות חרוזי פיצוי על ידי הוספת 100 μL של PBS, טיפה אחת של חרוזים חיוביים, טיפה אחת של חרוזים שליליים ו 1 μL של הנוגדן לצינור FACS. להשאיר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 300 μL של PBS. קח 50 μL של תאי מח עצם לא מוכתמים המורכבים עד 400 μL עם PBS + 3% FBS כבקרה לא מוכתמת.
- נתח את הדגימות לפי ציטומטריית זרימה.
- הפעל בקרות עם כתם יחיד וללא כתמים לפיצוי כפי שהומלץ עבור הציטומטר שבו נעשה שימוש. הגדר gating כמו באיור 3A.
- עבור PB, הפעל את כל התאים ועבור מח עצם וטחול, הפעל מינימום של 50,000 אירועים לכל דגימה בהתאם לרמות הקליטה האנושית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתן להעריך את קליטת התאים המוזרקים תוך פמורלית בכל נקודת זמן מ -24 שעות ואילך בהתאם לתכנון הניסוי. בנקודת הזמן הסופית, ניתן לאסוף IF, BM, PB וטחול. אלה ניתנים לעיבוד, והערכת רמת הקליטה באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי לקרוא לאחיזה אנושית אפילו ברמות נמוכות, הכתמנו בשני נוגדנים שונים כנגד CD45 אנושי (שיבוט HI30 ושיבוט 2D1). רק תאים חיוביים לשני הנוגדנים (CD45++) נחשבו ממוצא אנושי. סף הקליטה נקבע באופן הבא: (% CD45++ + % GlyA+) ≥ 0.01% ומינימום של 30 תאים שנרשמו בשני השערים (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זריקות תוך פמורליות הן כלי שימושי בהשתלת קסנו כאשר רק מספר קטן של HSPCs זמינים, ומספקים קליטה משופרת בהשוואה לזריקות תוך ורידי. עם זאת, הטכניקה דורשת מיומנות ואימון. בעת התרגול נמליץ להשתמש בגופות טריות בטווח המשקל הנכון (ראו בהמשך) ולהזריק צבע צבעוני (כגון כחול טריפאן) כך שבעת הדיסקציה יהיה ברור אם הזריקה נכנסה לעצם הירך והוגבלה אליה (אין לראות צבע בשרירים). עבור הליך זה, ישנם שני שלבים קריטיים: מיקום ותחושה של החדרה נכונה של המחט השנייה בצינור. עבור מיקום, למרות שיטה מומלצת כאן, זה תלו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
המחברים מודים לקבוצה של ד"ר ג'ון דיק על עבודה קודמת על שיטה זו, ומוניקה דודנס על ההכשרה. אנו אסירי תודה לביובנק הדם ותאי הגזע של קיימברידג' (CBSB), במיוחד לד"ר ג'ואנה בקסטר ולצוות האחיות של CBSB שהסכימו ואספו דגימות דם טבורי; תורמי המדגם שלנו; השירות הביו-רפואי של האוניברסיטה, במיוחד ניקולס לאמלי והצוות בבניין אן מקלארן לתחזוקת זני העכברים שלנו ולתמיכה בניסויי in vivo שלנו; שאזמין בשיר לעריכת כתב היד.
E.L. ממומן על ידי מלגת סר הנרי דייל הממומנת במשותף על ידי קרן Wellcome והחברה המלכותית (107630/Z/15/A). L.M. נתמכת על ידי Sofinter - HR Welfare Program. מחקר זה מומן במלואו או בחלקו על ידי Wellcome Trust (203151/Z/16/Z, 203151/A/16/Z, 215116/Z/18/Z) והמועצה למחקר רפואי UKRI (MC_PC_17230). לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY לכל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק אינסולין 0.5 מ"ל עם 29 גרם x 12.7 מ"מ מחט | BD | 324892 | |
| מזרק אינסולין 1 מ"ל עם 29 גרם x 0.5 אינץ' מחט | BD | 324827 | |
| צינור 1.5 מ"ל | פישרברנד | 509-GRD-PFB | |
| 3 מ"ל | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
| 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים 12 x 75 מ"מ | פלקון | 352235 צינור FACS | |
| 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול עם מכסה הצמד 12 x 75 מ"מ | פלקון | 352058 | צינור FACS |
| 27 גרם מחט 1/2 אינץ' | BD | ||
| 40 ומיקרו; מסננת תא m לצינור 50 מ"ל | גריינר ביו-אחד | 542040 | |
| 50 מ"ל צינור | Sarstedt בע"מ | 62.547.254 | |
| 96 היטב צלחת תחתונה עגולה | ספוגית אלכוהול Falcon | 351177 | |
| VITREX MEDICAL A/S | |||
| BD LSR Fortessa X-20 מנתח תאים | ציטומטר זרימת | ||
| Buphrenorphine | Animalcare | XVD190 | |
| CD14 / PECy7 (Clone M5E2) | biolegend | 301814 | בשימוש ב 1 ל 1000 |
| CD19 / Alexa 700 (Clone HIB19) | biolegend | 302226 | בשימוש ב 1 ל 300 |
| CD19 / FITC (Clone HIB19) | biolegend | 302206 | בשימוש ב 1 ל 200 |
| CD3 / APCCy7 ( Clone HIT3a) | biolegend | 300318 | בשימוש ב-1 ל-100 |
| CD33/APC (Clone P67.6)BD | 345800 | בשימוש ב-1 ל-200 | |
| CD45/BV510 (Clone HI30) | biolegend | 304036 | בשימוש ב-1 ל-500 |
| CD45/PECy5 (Clone 2D1) | biolegend | 368526 | בשימוש ב-1 ל-300 |
| CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | ||
| Dnase 1 | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| גליקופורין A (GlyA)/PE (Clone GA-R2) | BD | 340947 | בשימוש ב-1 ל-1000 |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | PAN-Biotech | P04-20250 | |
| איזופלורן (IsoFlo 100% w/w אדי שאיפה, נוזל) | זוטיס | 115095 | |
| מיקרובט 300 ליתיום הפרין LH, 300 ומיקרו; L | Sarstedt Ltd | 20.1309 | צינור איסוף דם עכבר |
| NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) עכברים | צ'ארלס ריבר | ||
| פנקול אנושי, צפיפות: 1.077 גרם/מ"ל | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140122 | |
| פוספט מלח בופר (PBS) | Gibco | 14190169 |
מקורות
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Cosgrove, J., Hustin, L. S. P., de Boer, R. J., Perié, L. Hematopoiesis in numbers. Trends Immunol. 42 (12), 1100-1112 (2021).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9 (7), 959-963 (2003).
- McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
- Belluschi, S., et al. Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors. Nat Commun. 9 (1), 4100(2018).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγ(null) humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 32 (4), 364-372 (2014).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ−/− KitW41/W41 (NBSGW) Mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Notta, F., Doulatov, S., Dick, J. E. Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients. Blood. 115 (18), 3704-3707 (2010).
- Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Sci Rep. 6, 23886(2016).
- Mende, N., et al. Unique molecular and functional features of extramedullary hematopoietic stem and progenitor cell reservoirs in humans. Blood. 139 (23), 3387-3401 (2022).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
- Li, J., Chen, H., Zhao, S., Wen, D., Bi, L. Patient-derived intrafemoral orthotopic xenografts of peripheral blood or bone marrow from acute myeloid and acute lymphoblastic leukemia patients: clinical characterization, methodology, and validation. Clin Exp Med. 23 (4), 1293-1306 (2023).
- Dobson, S. M., et al. Relapse-fated latent diagnosis subclones in acute B lineage leukemia are drug tolerant and possess distinct metabolic programs. Cancer Discov. 10 (4), 568-587 (2020).
- Marktel, S., et al. Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia. Nat Med. 25 (2), 234-241 (2019).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
