מאמר שיטה

זרימת עבודה להערכה כמותית של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיפיטי של קליפת הצפצפה

DOI:

10.3791/66318

⸱

27 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה אמינה ויעילה מאיסוף דגימות ועד ניתוח נתונים לפרופיל המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיפיטי הקיים בקליפת הצפצפה הטריכוקרפה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרואורגניזמים המאכלסים משטחי צמחים ורקמות פנימיות עשויים להיות בעלי פונקציות מועילות בקידום צמיחת הצמח ובריאותו. עם זאת, המידע על המיקרוביום של רקמות הקליפה של צמחים מעוצים נותר מוגבל, במיוחד לגבי המיקרוביוטה האנדופיטית והחיידקית האפיפיטית של קליפת הצפצפה. כדי להתגבר על מגבלה זו, הקמנו זרימת עבודה לכימות ההרכב והמגוון של המיקרוביוטה החיידקית האנדופיטית והאפיפיטית המתיישבת בקליפת הצפצפה הטריכוקרפה. בקצרה, האפידרמיס של הגבעול של P. trichocarpa ניגב שוב ושוב עם כדור צמר גפן טבול ב-0.1% Tween 20 כדי להשיג דגימות חיידקים אפיפיטיים. האפידרמיס המופשט עוקר ולאחר מכן הוקפא ונמעך שוב ושוב באמצעות חנקן נוזלי ומקצף חרוזים, בהתאמה, כדי לאסוף דגימות חיידקים אנדופיטיים. DNA גנומי חולץ מקהילות החיידקים האפיפיטיות הדבוקות בכותנה ומהקליפה המרוסקת של P. trichocarpa, ועבר הגברת תגובת שרשרת פלוימראז (PCR) עם פריימרים המכוונים לאזורי V5-V7 ו-V4 המשתנים של הגן החיידקי 16S rRNA. שלושה שכפולים של תוצרי ה-PCR שהתקבלו מכל דגימה אנדופיטית או אפיפיטית עורבבו בריכוזים שווים לבניית ספריית האמפליקון, שלאחר מכן רוצפה. הרצפים שהתקבלו נותחו על ידי שחבור רצף, סינון איכות, הסרת כימרה והערות טקסונומיות. לסיכום, הקמנו זרימת עבודה אמינה ויעילה מאיסוף דגימות ועד ניתוח נתונים לקביעת המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיפיטי של קליפת P . trichocarpa באמצעות פרופיל גן 16S rRNA. יחד עם השיטות לחקר קליפות המתיישבות במיקרוביוטה שנקבעו במחקר הקודם, המתודולוגיה שלנו עשויה לשמש כתוכנית לתכנון פרוטוקולים לחקירת מיקרוביום הקליפה של מיני צמחים עציים אחרים, במיוחד עצים חשובים מבחינה כלכלית ביערות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קליפה היא השכבה החיצונית ביותר של גבעולי צמחים עציים, המתייחסת לכל הרקמות מחוץ לקמביום כלי הדם, כולל הפלום והפרידרם 1,2. מחקר מקיף הראה כי הקליפה ממלאת תפקידים מרכזיים בהעברת מים ופחמימות, הגנה על עצים מפני שריפות ונזק מכני3, והסתגלות ללחצים אביוטיים4וביוטיים5. חשוב מכך, כממשק בין עץ לאוויר שמסביב, הקליפה משמשת גם כבית גידול ייחודי למיקרואורגניזמים6. יש לציין כי חיידקים הקשורים לקליפה אושרו כבעלי פונקציות של קידום צמיחת מארח7, סיוע לעצים ברכישת חומרים מזינים8, שיפור סינתזת הורמוני הצמח9 והגנה על מארחים מפני זיהום פיטופתוגני5. עם זאת, הרבה פחות תשומת לב הוקדשה לקהילות המיקרוביאליות המאכלסות את הקליפה בהשוואה למיקרוביוטה של פילוספרה וריזופשר10,11. קיים ידע מוגבל לגבי התכונות הביולוגיות של המיקרוביום של קליפת העץ. מטרת מאמר המתודולוגיה הנוכחי היא לספק לחוקרים סט של פרוטוקולים לתיאור המגוון וההרכב של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיפיטי של קליפת הצמח העץ.

על בסיס השיטות שפורסמו לחקירת מיקרוביוטת הקליפה12,13 בעבודה זו, תכננו ובדקנו זרימת עבודה משוכללת המבוססת על ניתוח ריצוף אמפליקון של גן 16S rRNA כדי לחקור את המיקרוביום החיידקי המיישב את הרקמות הפנימיות או את פני השטח של קליפת הגזע של Populus trichocarpa, אורגניזם מודל חשוב המשמש בביולוגיה של צמחים עציים14. ל-P. trichocarpa יש מאפיינים של צמיחה מהירה15, קלות יחסית של מניפולציה ניסויית16, וטרנספורמציה גנטית קלה, וכמו כן, ידוע ביישומו הרחב בייצור עץ17. באופן ספציפי, השיטה המוצעת בעבודה זו מתחילה בתיאור מפורט של הדגימה של המיקרוביוטה האנדופיטית והאפיפיטית של קליפת הגזע של P. trichocarpa. עם הכללת שלב לעיקור פני השטח של הקליפה עם אלכוהול ונתרן היפוכלוריט לאחר קצירת המיקרוביום המתיישב על פני השטח, מחקר זה קבע נוהל לאיסוף בו זמנית ונפרד של מיקרואורגניזמים השוכנים במבנה הפנימי של הקליפה (אנדופיטים) ואלה החיים על פני השטח החיצוניים של הקליפה (אפיפיטים). למיטב ידיעתנו, מבין המחקרים שפורסמו על המיקרוביום של קליפת הצמח העץ, לא בוצעו בדיקות על קהילות המיקרוביאליות האנדופיטיות והאפיפיטיות שנאספו מאותה דגימת קליפה על סמך הבחנה ברורה שנעשתה בין הגומחות הפנימיות והחיצוניות של הקליפה 18,19,20. כך, השיטה שפותחה במחקר זה תאפשר לחוקרים לבחון את המגוון וההרכב של קהילות החיידקים המאכלסות את הקליפה בצורה מדויקת ומקיפה. בנוסף, מחקר זה מספק תיאורים מפורטים של ההליכים למיצוי DNA גנומי, הגברת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), הכנת ספריית ריצוף האמפליקון של הגן 16S rRNA21 וניתוח נתוני ריצוף. בפרט, מחקר זה השתמש בזוג פריימרים המכוונים לאזורי V5-V7 ההיפר-משתנים של הגן החיידקי 16S rRNA כדי להפחית את ההגברה הלא ספציפית של רצפי המיטוכונדריה והכלורופלסט של צמחים מארחים22, שהניבו פרופילים בלתי מוטים של המיקרוביום הקשור לקליפה. α הגיוון הוערכו באמצעות מדד שאנון23, מדד גיוון פופולרי הנמצא בשימוש נרחב בחקר האקולוגיה, וההרכב הטקסונומי ברמת הפילום חושב והוצג בתוכנות תובנות כמותיות לאקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) 24ו-R25. יחד עם השיטות לחקר קליפות המתיישבות במיקרוביוטה שנקבעו במחקר הקודם 1,6, המתודולוגיה שלנו עשויה לשמש כתוכנית לתכנון פרוטוקולים לחקר מיקרוביום הקליפה של מיני צמחים עציים אחרים, במיוחד עצי יער בעלי חשיבות כלכלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף דוגמאות

  1. גדל P. בן 3 חודשים.שתילי טריכוקרפה בתא גידול (21-25 מעלות צלזיוס; 16 שעות אור / מחזור חושך של 8 שעות עם אור משלים של כ-300 מיקרו-אמפר-2 שניות-1 ממנורת פלורסנט ליניארית תלת-פסית [T5 28 W 6400 K]; ו-60-80% לחות)26.
  2. חותכים את קטעי הגבעול באורך 10 ס"מ של P. טריכוקרפה מגובה 2-12 ס"מ מעל פני האדמה המעוקרת (איור 1A) באמצעות גוזם מעוקר. מניחים את קטעי הגבעול בצלחת פטרי מרובעת מעוקרת (13 ס"מ על 13 ס"מ).
    הערה: שישה עצים באותו גודל נבחרו למחקר זה, מתוכם שלושה שימשו להגברת ה-PCR עם כל ערכת פריימר.

2. עיבוד מדגם

  1. נגבו שוב ושוב את האפידרמיס של הגבעול על צלחת הפטרי המרובעת המעוקרת באמצעות צמר גפן סטרילי טבול ב-0.1% Tween 20 כדי לאסוף בצורה יעילה יותר את המיקרואורגניזמים שמתיישבים על משטחי הקליפה (איור 1B).
    הערה: כותנה סטרילית תת-לחה משמשת לאיסוף מיקרואורגניזמים הנצמדים למשטח הגבעול. אל תשתמש בכותנה יבשה מדי או רטובה מדי בעת ניגוב משטח הגבעול. טווין 20 הוא חומר פעילי שטח המסוגל להפחית את מתח הפנים, תכונה מועילה להשגת דגימות מיקרוביאליות נוספות ממשטחי הצמח27,28.
  2. חותכים את קצה הכותנה מהספוגית בעזרת להב סטרילי, ומניחים כל קצה כותנה המכיל דגימות מיקרוביאליות אפיפיטיות בצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר ניגוב משטח הגבעול, חתכו את הקליפה שממנה נדגמו המיקרואורגניזמים האפיפיטיים באמצעות אזמל סטרילי, קלפו את הקליפה והניחו אותה בצלחת פטרי מרובעת.
  4. חתכו את הקליפה שהופשטה מהגבעול בשלב 2.3 למקטעים של כ-1 ס"מ (איור 1C) בעזרת אזמל סטרילי.
  5. עקרו את הקטעים על ידי השרייתם באלכוהול של 70% (v/v) למשך 2 דקות. לאחר מכן, יש להשרות את הקטעים בנתרן היפוכלוריט (תכולת כלור אפקטיבית של 2.5%) בתוספת 0.1% טווין 80 למשך 5 דקות.
  6. עקר את הקטעים שהתקבלו בשלב 2.5 למשך 30 שניות ב-70% אלכוהול (v/v)29. לאחר מכן, שטפו את כל הדגימות שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים והניחו אותן על ספסל נקי לייבוש באוויר.
    הערה: דגימות הקליפה מערבבות קדימה ואחורה באמצעות פינצטה סטרילית כדי להבטיח עיקור משטח מספיק.
  7. אחסן כל קטע קליפת גזע מעוקר על פני השטח (דגימות אנדופיטיות) בצינור צנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. מיצוי DNA גנומי

  1. בצע את השלבים הבאים כדי לטפל בדגימות למיצוי DNA.
    1. הנח את מקטעי קליפת הגבעול המעוקרים על פני השטח שהתקבלו בשלב 2.7 בצינורות קשים סטריליים של 5 מ"ל והוסף שלושה חרוזי פלדה מעוקרים (4 מ"מ) לכל צינור.
      הערה: בצע שלב זה על ספסל נקי כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. כדורי הצמר גפן שהוכנו בשלב 2.2 (דגימות אפיפיטיות) אינם זקוקים לעיבוד מראש ומשמשים ישירות למיצוי DNA גנומי.
    2. הקפיאו את הצינורות הקשים המכילים את הדגימות בחנקן נוזלי למשך 10 דקות.
    3. מרסקים את דגימות הקליפה למשך 5 דקות בעזרת מקצף חרוזים. לאחר מכן, הקפיאו שוב את הצינור הקשה בחנקן נוזלי למשך דקה אחת וחזרו על שלב הכאת החרוזים למשך 5 דקות.
  2. חלץ DNA גנומי.
    הערה: השתמש בערכת מיצוי DNA מסחרית כדי לבודד DNA גנומי מהדגימות האנדופיטיות והאפיפיטיות.
    1. מוסיפים את קליפת הגבעול הכתושה של P. טריכוקרפה וקהילות החיידקים האפיפיטיות הדבוקות בכותנה (0.25 גרם כל אחת) לכל אחד מצינורות החרוזים. לאחר מכן הוסף 60 מיקרוליטר של תמיסה C1 המסופקת על ידי ערכה מסחרית וערבב בעדינות על ידי היפוך.
    2. לאחר מכן, הומוגניזציה של הדגימות האנדופיטיות והאפיפיטיות באמצעות מקצף חרוזים בארבע ריצות של דקה. לאחר כל ריצה, הניחו את הדגימות על קרח למשך 30 שניות.
    3. צנטריפוגה את הצינורות ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת.
    4. חלץ את הדגימות האנדופיטיות והאפיפיטיות באמצעות ערכה (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
    5. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסה C6 למרכז קרום המסנן הלבן ודגר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה.

4. הגברת PCR

  1. תקנן את ריכוז ה-DNA שחולץ.
    1. למדוד את ריכוזי ה-DNA הגנומי המופק מדגימות אפיפיטיות ואנדופיטיות באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
    2. יש לדלל כל דגימת DNA ב-ddHסטרילי 2O עד 2 ננוגרם/מיקרוליטר כדי לקבל את תבנית ה-DNA להגברת PCR.
  2. הגבירו את דגימות ה-DNA הללו.
    1. הגביר את אזור V5-V7 של הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות פריימר קדמי 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCG-3') והפריימר ההפוך 1193R (5'-ACGTCATCCACCACCTTCC-3') 10. הגבירו את אזור V4 של הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות הפריימר הקדמי 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') והפריימר ההפוך 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      הערה: ה-DNA הגנומי המופק מכל דגימה משמש כתבנית לכל אחת מתגובות ההגברה המשולשות של PCR, ותגובה נוספת שאינה מכילה DNA מוגדרת כבקרה שלילית. עבור כל דגימה, נפח תערובת תגובת ה-PCR הוא 25 מיקרוליטר. עבור זוג הפריימר 799F/1193R, כל תגובה מכילה 12 מיקרוליטר של מי PCR, 1 מיקרוליטר מכל אחד מהפריימרים F/R (10 מיקרומטר), 1 מיקרוליטר של תבנית DNA ו-10 מיקרוליטר של תמיסת תערובת. עבור זוג הפריימר 515F/806R, כל תגובה מכילה 12 מיקרוליטר של מי PCR, 1 מיקרוליטר מכל אחד מהפריימרים F/R (10 מיקרומטר), 1 מיקרוליטר של תבנית DNA ו-10 מיקרוליטר של תמיסת תערובת. תגובות PCR עם זוג הפריימר 799F/1193R מבוצעות בתנאי המחזור הבאים: דנטורציה ראשונית ב-98 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 53 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, והארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. תגובות ה-PCR עם זוג הפריימר 515F/806R מבוצעות בתנאי המחזור הבאים: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, והארכה סופית למשך 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס.
    2. מערבבים היטב כל דגימה וצנטריפוגה כדי לחסל בועות.
    3. בצע הגברה של אזור V5-V7 או V4 של הגנים החיידקיים 16S rRNA על מחזור תרמי.
  3. זהה את המוצרים המוגברים.
    1. טען 5 מיקרוליטר מכל אמפליקון על ג'ל אגרוז 1% ובצע אלקטרופורזה ב-120 וולט למשך 30 דקות.
    2. צפו בג'ל תחת אור UV כדי לאמת הגברת PCR מוצלחת. הגדלים של מוצרי ה-PCR המתקבלים עם זוגות הפריימר 799F/1193R ו-515F/806R צריכים להיות כ-430 bp ו-400 bp, בהתאמה.

5. הכנת ספריית רצף אמפליקון

  1. מערבבים את המוצרים המוגברים וקובעים את ריכוזיהם.
    1. מערבבים את המוצרים הנוצרים משלושת השכפולים של הגברת ה-PCR עבור כל דגימה בצינור PCR.
    2. הוסף 5 מיקרוליטר ממוצרי ה-PCR ו-195 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לבאר של מיקרו-פלטה של 96 בארות בהתאם להוראות היצרן לערכה (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של ה-DNA הסטנדרטי (ריאגנטים של DNA בריכוזים של 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 ו-100 ננוגרם/מיקרוליטר מהערכה) ו-190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לבאר של אותה מיקרופלטת. לאחר שלב זה, קבע את עוצמת הקרינה של תוצרי ה-PCR וה-DNA הסטנדרטי.
    3. מדוד את הקרינה באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
      הערה: העירור/פליטה של אורכי גל פלואורסצאין סטנדרטיים מוגדרים ל-480/530 ננומטר כדי למדוד את כמות ה-DNA הדו-גדילי בכל דגימה.
    4. קבע את העקומה הסטנדרטית של ריכוזי ה-DNA ועוצמות הקרינה באמצעות ריכוזי ה-DNA הסטנדרטיים של תמיסות ה-DNA הסטנדרטיות (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 ו-100 ננוגרם/מיקרוליטר) ועוצמת הקרינה של כל אחת מתמיסות ה-DNA הסטנדרטיות. החלף את ערך עוצמת הקרינה של כל אחד מתוצרי ה-PCR בעקומה הסטנדרטית כדי לחשב את ריכוזי ה-DNA של מוצרי ה-PCR.
  2. בנה ספריות רצף amplicon.
    1. על פי הריכוזים שזוהו בשלב 5.1.4, מערבבים את שאר תוצרי ה-PCR המוגברים על ידי אותו זוג פריימר בריכוזים שווים כדי לבנות את ספריית ריצוף האמפליקון.
      הערה: החלק של תוצרי ה-PCR של כל דגימה המשמש לכימות ריכוז ה-DNA הדו-גדילי על ידי מדידת עוצמת הקרינה אינו נכלל בספריית ריצוף האמפליקון, הבנויה משאר תוצרי ה-PCR של אותה דגימה.
  3. בצע מיצוי ג'ל.
    1. לבצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז באמצעות מכשיר אלקטרופורזה. בקצרה, הכינו ג'ל אגרוז 1.3% (כלומר, 1.3 גרם אבקת אגרוז ב-100 מ"ל של 1 x מאגר TAE).
      הערה: מקפידים להבטיח שכמות הבארות בג'ל מספיקה כדי להחזיק כל מוצר PCR וסולם DNA; במחקר זה, 1.3% ג'ל אגרוז מוכן על ידי המסת 1.3 גרם אבקת אגרוז ב-100 מ"ל של 1 x מאגר TAE.
    2. הסר את המסרקים לאחר התמצקות הג'ל והנח את הג'ל במיכל אלקטרופורזה עם 1 x מאגר TAE. לאחר מכן, הוסף יחידת נפח אחת של 6 x מאגר טעינה כתום ל-5 יחידות נפח של כל מוצר PCR, כאשר 100 מיקרוליטר מהאחרון נטען בכל באר. הוסף 30 מיקרוליטר מסולם ה- DNA לבאר אחת. לאחר חיבור החוטים החיוביים והשליליים, בצע אלקטרופורזה ב 80 וולט למשך 50 דקות.
      הערה: במחקר זה, מיצוי ג'ל משמש לטיהור ספריית ריצוף האמפליקון המיוצגת על ידי הפס של 400 bp או 430 bp המוגבר עם זוג הפריימר 515F/806R או 799F/1193R, בהתאמה.
    3. הסר מקטעי DNA מג'ל האגרוז באמצעות אזמל נקי וחד.
    4. שוקלים את פרוסת הג'ל ומעבירים אותה לצינור חסר צבע. הוסף חיץ כדי לטבול את פרוסת הג'ל.
      הערה: הכמות המקסימלית של ג'ל לכל עמודת סיבוב היא 400 מ"ג. שלוש יחידות נפח של חיץ מתווספות ליחידת נפח אחת של פרוסת ג'ל נתונה.
    5. בצע מיצוי ג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: ספריית האמפליקונים הבנויה מתוצרי ה-PCR המכוונים לגן החיידקי 16S rRNA המשמש לריצוף קהילות החיידקים האנדופיטיים והאפיפיטיים מתקבלת בשיטה זו.
  4. אשר את איכות ספריית רצף המגברים המטוהרים.
    1. קבע את ריכוז ה-DNA הדו-גדילי בספריית ריצוף האמפליקון המטוהר המתקבל בשלב 5.3.5 על ידי פלואורומטר באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן (איור 2).
    2. קבע את גודל שבר ה-DNA היעד של ספריית ריצוף האמפליקון שהתקבלה בשלב 5.3.5 באמצעות מערכת ניתוח בקרת איכות חומצות גרעין עם שבבים וערכות מסחריות (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      הערה: ודא שגודל המקטע נמצא בטווח הצפוי ואין דימרים של פריימר בספריית הרצף של amplicon.
    3. קבע את הריכוז האפקטיבי של ספריית הריצוף שהתקבלה בשלב 5.3.5 על ידי שימוש בתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) עם ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    4. לדלל את ספריית ריצוף האמפליקון כדי לעמוד בריכוז הטעינה המומלץ לפלטפורמת הרצף.

6. עיבוד רצפים וניתוח סטטיסטי

  1. לאחר ריצוף ספריית האמפליקונים שהושגה בשלב 5.4.4 באמצעות פלטפורמת ריצוף (ראה טבלת חומרים)31. צור תיקיה בשם emp-paired-end-sequences בספריית העבודה, ולאחר מכן שמור את קובץ הרצף הדחוס בפורמט fastq בתיקיה זו. לאחר מכן פתח את אובונטו והפעל את סביבת הקונדה ותובנות כמותיות לאקולוגיה מיקרוביאלית 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. כתוב קובץ מיפוי ושמור אותו כקובץ טקסט. תוכן הקובץ מוצג בטבלה 2.
  3. פצל את נתוני הרצף שהתקבלו באמצעות ספריית ריצוף המגיפה והסר פריימרים מנתוני הרצף באמצעות קובץ המיפוי.
    1. השתמש בפקודה הבאה כדי לפצל את נתוני הרצף: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. השתמש בפקודה הבאה כדי להסיר פריימרים: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F או 515F --p-front-r 1193R או 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. סנן והסר כל כימרה באמצעות צינור DADA233. אשכול את הרצפים המסוננים לגרסאות רצף אמפליקון (ASVs) בדמיון של 99%.
    1. השתמש בפקודה הבאה כדי לסנן ולהסיר רצפי כימרה ואשכול לתוך ASV: time qiime dada2 denoise-pair-pair --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. צור ביאורים טקסונומיים באמצעות מסד הנתונים SILVA (v138) בהתבסס על רצפי ההפניה34.
    1. השתמש בפקודה הבאה כדי להוסיף ביאורים ל-ASV שהתקבלו בשלב 6.4: זמן qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. צור טבלת ASV ב-QIIME2 (v2021.2) באמצעות הפקודות הבאות:
    Qiime Tools Export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    ייצוא כלי qiime --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --תצפית-כותרת OTUID, טקסונומיה --SC-מופרדת טקסונומיה
    המרת BOM -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --טקסונומיה של מפתח כותרת
    הערה: פקודות אלה יוצרות טבלה המכילה את מספר הקריאות של כל ה-ASV עבור כל דגימה.
  7. חשב את מספר ה-ASV והקריאות של קהילות החיידקים האנדופיטיות והאפיפיטיות שנוצרו עם זוגות הפריימר 799F/1193R ו-515F/806R, בהתאמה.
    1. חשב את המספר הכולל של ASV בעלי קריאות ≥ 1 ברמות של פילום, מחלקה, סדר, משפחה וסוג, בהתאמה, בכל דגימה בטבלת ה-ASV שהתקבלה בשלב 6.6 על ידי ספירה.
    2. חשב את המספר הכולל של קריאות בכל דגימה בהתבסס על סכום מספר הקריאות של כל ה-ASV בטבלת ה-ASV שהתקבלה בשלב 6.6 על ידי ספירה.
    3. חשב את מספר קריאות הצמח בכל דגימה באמצעות מספר הקריאות של ASV המבוארים ככלורופלסטים או מיטוכונדריה בטבלת ה-ASV שהתקבלה בשלב 6.6 על ידי ספירה.
    4. חשב את מספר קריאות החיידקים בכל דגימה באמצעות הנוסחה הבאה:
      מספר קריאות חיידקים = מספר הקריאות הכולל − מספר קריאות הצמח.
    5. לחשב ולהמחיש את המספר הממוצע של ASV (ברמות של פילום, מחלקה, סדר, משפחה וסוג, בהתאמה) או קריאות (בסך הכל או של צמח וחיידקים, בהתאמה) של קהילות החיידקים האנדופיטיות והאפיפיטיות שנוצרו על ידי זוגות הפריימר 799F/1193R ו-515F/806R באמצעות תוכנת Excel (2019) ו-Prism (v8.0).
    6. להעריך את משמעות ההבדלים בין מספרי ה-ASV (ברמות של פילום, מחלקה, סדר, משפחה וסוג, בהתאמה) או קריאות (בסך הכל או של צמח וחיידקים, בהתאמה) שנוצרו עם זוגות הפריימר 799F/1193R ו-515F/806R על ידי שימוש במבחן t של הסטודנט בתוכנת פריזמה (v8.0).
  8. סנן את הקריאות המבוארות ככלורופלסטים ומיטוכונדריה באמצעות הפקודה הבאה: Time qiime taxa filter-table table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. צור עץ פילוגנטי באמצעות הפקודה הבאה: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. לחשב ולדמיין את שונות האלפא המיוצגת על ידי אינדקס שאנון של קהילות החיידקים האנדופיטיים והאפיפיטיים באמצעות QIIME2 (v2021.2) וחבילת 'ggplot2' ב-R (v4.0.5)35.
    1. השתמש בפקודה הבאה כדי לחשב את גיוון האלפא: זמן qiime מגוון ליבה-מדדים-פילוגנטי --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth ערך הקריאה הנמוך ביותר מבין כל הדגימות --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. לחשב את השפע היחסי של האוכלוסיות ברמת הפילום של קהילות החיידקים האנדופיטיים והאפיפיטיים. צור קובץ בפורמט qzv בשם "taxa-bar-plots" באמצעות הפקודה הבאה של QIIME2 (v2021.2): זמן qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. פתח את הקובץ taxa-bar-plots.qzv באופן מקוון בכתובת https://view.qiime2.org/. הורד ושמור את הקובץ החדש שנוצר מרמה 2. חשב את השפע היחסי לפי הנוסחה הבאה עם R (v4.0.5):
      השפע היחסי של כל פילום חיידקים (%) = (מספר הקריאות של כל פילום חיידקים בכל דגימה / מספר סך הקריאות של כל דגימה) x 100%.
      דמיין את הנתונים באמצעות חבילות ggplot2, RColorBrewer, reshape ו-ggalluvial ב-R (v4.0.5).
  12. לנתח את משמעות ההבדל בין השפע היחסי של כל אחת מהפילות הדומיננטיות (המוגדרות כפילום בעל שפע יחסי של > 0.5%) בקהילות החיידקים האנדופיטיות והאפיפיטיות שרוצפו עם זוג הפריימר 799F/1193R על ידי שימוש בניתוח השונות החד-כיווני (ANOVA) עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי ברמת מובהקות של 0.05 בתוכנת STAMP36.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA גנומי איכותי של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיפיטי של קליפת P. טריכוקרפה הושגה באמצעות הפרוטוקול האופטימלי (טבלה 1). הגברת ה-PCR של כל 12 הדגימות הניבה פסים חזקים בודדים בגודל הנכון (איור 3). שני זוגות הפריימרים 799F/1193R ו-515F/806R הגבירו בהצלחה את תוצרי המטרה מדגימות רקמת קליפות אנדופיטיות או אפיפיטיות בסביבות 400 ו-430 bp, בהתאמה. ספריית האמפליקונים נבנתה עוד יותר עם שיא יחיד, גודל מקטע DNA מוסמך, ללא דימרים פריימר, ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה המוצעת על ידינו, שפותחה מהמתודולוגיה שפורסמה לבחינת מיקרוביוטת הקליפה 7,18, מספקת הנחיות כלליות לזיהוי ואפיון מיקרוביום אנדופיטי ואפיפיטי של קליפת צמחים עציים. שיטה זו כוללת פרוטוקולים לאיסוף ועיבוד דגימות, מיצוי DNA גנומי, הגברת PCR, הכנת ספריות ריצוף אמפליקון וניתוח נתוני ריצוף, המשמשת כתוכנית פוטנציאלית לתכנון פרוטוקולים לחקר מיקרוביום קליפות של מיני צמחים עציים.

נושא נפוץ במחקרי מיקרוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למר דיוויד אנתוני אתרטון על מתן קריינות הווידיאו ולחברי מעבדת B.N. על עצות יקרות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מענק מספר 32071741 [ל-BN]), פרויקטי תוכנית המו"פ המרכזיים באזור האוטונומי האויגורי שינג'יאנג (מספר מענק 2022B02014), תוכנית ההיכרות "כישרונות טיאנצ'י" (ל-BN), תוכנית המו"פ הלאומית של סין (מספר מענק 2021YFD2200203 [ל-GQ]), ופרויקט החדשנות של מעבדת המפתח הממלכתית לגנטיקה והשבחה של עצים (אוניברסיטת היערנות הצפון-מזרחית) (מספר מענק 2019A01 [ל-BN]).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ציוד:
מקצף חרוזיםDHS צנטריפוגה 401265
החיים לצינורות 1.5 מ"ל75002440תרמו מדעית
לצינורות PCR קורא
מיקרופלייטBioTek8040528
NanodropDHS מדעי החיים & טכנולוגיה ושות', בע"מ2010/2020 ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח
קיוביט 3.0 פלואורומטר invitrogenQ33216פלואורומטר 
מקרר(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096תרמי
Cycler Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313לאלקטרופורזה
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Library זיהוי התפלגות שברי DNA, ניתוח בקרת איכות של חומצות גרעין
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694ספריית כימות
Illumina Novaseq6000Illumina רצף ספרייה
:
כפפותכלתרסיס NA
10 μ LAxygenTF-300-R-S
קצה מחסום אירוסול 20μ LAxygenTF-20-R-S
קצה מחסום אירוסול 200μ LAxygenTF-200-R-S
טיפר מחסום אירוסול 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לAxygenMCT-150-C
קורנינג 96 בארות שחור/שקוף שטוח תחתוןMicroplate קורנינג3631
מקל כותנהZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100למיצוי DNA
צינור צנטריפוגה ללא אנזים 1.5 מ"לארה"ב SCIENTIFIC1415-2600
אתנולטיאנג'ין יונגדה ריאגנט כימי חברה מוגבלת64-17-5
צינורות קשים (5 מ"ל)DHS מדעי החיים0401261-17
הוט מאסטר מיקס Quanta Bio2200400
צינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"לAxygenMCT-200-C-S
PCR מיםQIAGEN 17000-10
ערכת מיצוי ג'ל מהירה QIAGEN28704למיצוי ג'ל
ערכות בדיקת Quant-iT dsDNA, מגוון רחבInvitrogenQ33130לקביעת ריכוז של המוצרים המוגברים וספריות אמפליקון מטוהרות
צלחת פטרי מרובעתChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
חרוזי פלדהShangyu Yixin כדור תעשיה ושות', בע"מ
תמיסת נתרן היפוכלוריטטיאנג'ין Beilian פיין כימיקלים פיתוח ושות', בע"מ 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
פרוטוקול כפול DNA ערכת ריאגנטים עם חיישניםגבוהים PerkinElmerCLS760672זיהוי ספריית
DNA ערכת כימות ספריית VAHTS עבור IlluminaVazyme Biotech Co., LtdNQ104ספריית כימות
מדעי צנטריפוגה חומרי קצה מחסום YXB36985

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aguirre-Von-Wobeser, E., Alonso-Sanchez, A., Mendez-Bravo, A., Villanueva Espino, L. A., Reverchon, F. Barks from avocado trees of different geographic locations have consistent microbial communities. Archs Microbiol. 203 (7), 4593-4607 (2021).
  2. Konopka, B., Pajtik, J., Seben, V., Merganicova, K. Modeling bark thickness and bark biomass on stems of four broadleaved tree species. Plants (Basel). 11 (9), 1148(2022).
  3. Rosell, J. A. Bark in woody plants: Understanding the diversity of a multifunctional structure. Integr Comp Biol. 59 (3), 535-547 (2019).
  4. Kobayashi, K., Aoyagi, H. Microbial community structure analysis inacer palmatumbark and isolation of novel bacteria IAD-21 of the candidate division FBP. PeerJ. 7, e7876(2019).
  5. Pellitier, P. T., Zak, D. R., Salley, S. O. Environmental filtering structures fungal endophyte communities in tree bark. Mol Ecol. 28 (23), 5188-5198 (2019).
  6. Dreyling, L., Schmitt, I., Dal Grande, F. Tree size drives diversity and community structure of microbial communities on the bark of beech (fagus sylvatica). Front For Glob Change. 5, 858382(2022).
  7. Jo, Y., et al. Changes in microbial community structure in response to gummosis in peach tree bark. Plants (Basel). 11 (21), 2834(2022).
  8. Dong, C., et al. core microbiota, and function of the rhizosphere soil and bark microbiota in Eucommia ulmoides. Front Microbiol. 13, 855317(2022).
  9. Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., Vorholt, J. A. A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genet. 10 (4), e1004283(2014).
  10. Bodenhausen, N., Horton, M. W., Bergelson, J. Bacterial communities associated with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLoS One. 8 (2), e52369(2013).
  11. Stone, B. W. G., Weingarten, E. A., Jackson, C. R. The Role of the phyllosphere microbiome in plant health and function. Annual plant reviews. 1, 1-24 (2018).
  12. Lambais, M. R., Lucheta, A. R., Crowley, D. E. Bacterial community assemblages associated with the phyllosphere, dermosphere, and rhizosphere of tree species of the atlantic forest are host taxon dependent. Microb. Ecol. 68 (3), 567-574 (2014).
  13. Arrigoni, E., Antonielli, L., Pindo, M., Pertot, I., Perazzolli, M. Tissue age and plant genotype affect the microbiota of apple and pear bark. Microbiol Res. 211, 57-68 (2018).
  14. Germain, H., Séguin, A. Innate immunity: Has poplar made its bed. New Phytol. 189 (3), 678-687 (2011).
  15. Varnagirytė-Kabašinskienė, I., et al. Evaluation of shoot collection timing and hormonal treatment on seedling rooting and growth in four poplar genomic groups. Forests. 15 (9), (2024).
  16. Lu, S., et al. Ptr-mir397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (26), 10848-10853 (2013).
  17. Krabel, D., et al. Early root and aboveground biomass development of hybrid poplars (populus spp.) under drought conditions. Can J For Res. 45 (10), 1289-1298 (2015).
  18. Vitulo, N., et al. Bark and grape microbiome of vitis vinifera: Influence of geographic patterns and agronomic management on bacterial diversity. Front Microbiol. 9, 3203(2018).
  19. Aschenbrenner, I. A., Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G., Grube, M. Differential sharing and distinct co-occurrence networks among spatially close bacterial microbiota of bark, mosses and lichens. Mol Ecol. 26 (10), 2826-2838 (2017).
  20. Liang, X., Wan, D., Tan, L., Liu, H. Dynamic changes of endophytic bacteria in the bark and leaves of medicinal plant eucommia ulmoides in different seasons. Microbiol Res. 280, 127567(2024).
  21. De Muinck, E. J., Trosvik, P., Gilfillan, G. D., Hov, J. R., Sundaram, A. Y. M. A novel ultra high-throughput 16s rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the illumina Hiseq platform. Microbiome. 5 (1), 68(2017).
  22. Anguita-Maeso, M., Haro, C., Navas-Cortes, J. A., Landa, B. B. Primer choice and xylem-microbiome-extraction method are important determinants in assessing xylem bacterial community in olive trees. Plants (Basel). 11 (10), 1320(2022).
  23. Wang, C., Liu, D. W., Bai, E. Decreasing soil microbial diversity is associated with decreasing microbial biomass under nitrogen addition. Soil Biol Biochem. 120, 126-133 (2018).
  24. Almeida, A., Mitchell, A. L., Tarkowska, A., Finn, R. D. Benchmarking taxonomic assignments based on 16s rRNA gene profiling of the microbiota from commonly sampled environments. GigaScience. 7 (5), giy54(2018).
  25. Liland, K. H., Vinje, H., Snipen, L. Microclass: An R-package for 16s taxonomy classification. BMC Bioinform. 18 (1), 172(2017).
  26. Li, S., et al. The AREb1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in Populus trichocarpa. Plant Cell. 31 (3), 663-686 (2019).
  27. Cregger, M. A., et al. The Populus holobiont: Dissecting the effects of plant niches and genotype on the microbiome. Microbiome. 6 (1), 31(2018).
  28. Maria Rodríguez, J. O., Ziani, K., Maté, J. I. Combined effect of plasticizers and surfactants on the physical properties of starch based edible films. Food Res Int. 39 (8), 840-846 (2006).
  29. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., Vangronsveld, J. Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome. 5 (1), 25(2017).
  30. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).
  31. Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments. J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).
  32. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  33. Callahan, B. J., et al. Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  34. Pruesse, E., et al. A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).
  35. Ginestet, C. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).
  36. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).
  37. Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643 (2017).
  38. Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis. Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).
  39. Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood. Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).
  40. Jeffrey, L. C., et al. Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees. Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).
  41. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l. Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

16S rRNADNAPCR

מאמרים קשורים