מאמר שיטה

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

DOI:

10.3791/66335

⸱

2 בפברואר 2024

 ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance Interdisciplinary Research Group

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AQRNA-seq מספק קשר ליניארי ישיר בין ריצוף ספירות קריאה לבין מספרי העתקי RNA קטנים בדגימה ביולוגית, ובכך מאפשר כימות מדויק של מאגר הרנ"א הקטן. הליך הכנת ספריית AQRNA-seq המתואר כאן כולל שימוש במקשרי ריצוף שתוכננו בהתאמה אישית וצעד להפחתת שינויי RNA מתילציה החוסמים את תהליך השעתוק ההפוך, מה שמביא לתפוקה מוגברת של cDNA באורך מלא. בנוסף, מוצג יישום מפורט של צנרת הביואינפורמטיקה הנלווית. הדגמה זו של AQRNA-seq נערכה באמצעות ניתוח כמותי של 45 tRNAs ב- Mycobacterium bovis BCG שנקטפו ב -5 ימים נבחרים במהלך זמן של 20 יום של מחסור בחומרים מזינים ו -6 ימי החייאה. מאמצים מתמשכים לשיפור היעילות והקפדנות של AQRNA-seq יידונו גם כאן. זה כולל בחינת שיטות למייתר טיהור ג'ל להקלה על בעיות דימר פריימר לאחר הגברת PCR ולהגדיל את שיעור הקריאות באורך מלא כדי לאפשר מיפוי קריאה מדויק יותר. שיפורים עתידיים ב-AQRNA-seq יתמקדו בהקלה על אוטומציה ויישום בתפוקה גבוהה של טכנולוגיה זו לכימות כל מיני הרנ"א הקטנים בדגימות תאים ורקמות מאורגניזמים מגוונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריצוף הדור הבא (באנגלית: Next generation sequencing או בקיצור NGS) היא טכנולוגיית ריצוף DNA הכוללת פיצול DNA, קשירת אוליגונוקלאוטידים מתאמים, הגברה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף הדנ"א והרכבה מחדש של רצפי המקטעים לגנום. ההתאמה של NGS לרצף RNA (RNA-seq) היא גישה רבת עוצמה לזיהוי וכימות תעתיקי RNA וגרסאותיהם1. התפתחויות חדשניות בתהליכי עבודה של הכנת ספריות RNA וצינורות ניתוח ביואינפורמטיקה, יחד עם התקדמות במכשור מעבדתי, הרחיבו את הרפרטואר של יישומי RNA-seq, והתקדמו מעבר לריצוף אקסומי לאומיקה פונקציונלית מתקדמת כמו פרופיל RNA לא מקודד2, אנליזה של תא בודד3, תעתיק מרחבי 4,5, ניתוח שחבור חלופי6בין היתר., שיטות RNA-seq מתקדמות אלה חושפות תפקודי RNA מורכבים באמצעות ניתוח כמותי של השעתוק בתאים ורקמות נורמליים וחולים.

למרות התקדמות זו ב- RNA-seq, מספר תכונות טכניות מרכזיות מגבילות את הכוח הכמותי של השיטה. בעוד שרוב שיטות ה-RNA-seq מאפשרות כימות מדויק ומדויק של שינויים ברמות ה-RNAs בין משתני ניסוי (כלומר, דגימות ביולוגיות ו/או מצבים פיזיולוגיים), הן אינן יכולות לספק השוואה כמותית של רמות מולקולות ה-RNA בתוך דגימה. לדוגמה, רוב שיטות ה-RNA-seq אינן יכולות לכמת במדויק את המספר היחסי של עותקים של מולקולות איזו-מקובלות tRNA בודדות במאגר תאי של tRNA מבוטא. כפי שמודגש בפרסום הנלווה7, מגבלה זו ל-RNA-seq נובעת ממספר תכונות של מבנה הרנ"א והביוכימיה של הכנת ספריות. לדוגמה, פעילותם של אנזימי הקשירה המשמשים לחיבור מקשרי הריצוף מקצה 3' ו-5' למולקולות RNA מושפעת מאוד מזהות הנוקלאוטידים הסופיים של הרנ"א ומקשרי הריצוף. זה מוביל לשינויים גדולים ביעילות של קשירת המקשרים ולעלייה מלאכותית עמוקה ברצף קריאות 8,9,10.

קבוצה שנייה של מגבלות נובעת מהתכונות המבניות הטבועות במולקולות RNA. באופן ספציפי, היווצרות מבנה משני של RNA ושינויים דינמיים בעשרות שינויי RNA שלאחר שעתוק של האפיטרנסקריפטום יכולים לגרום לנפילה או מוטציה של פולימראז במהלך שעתוק הפוך. שגיאות אלה גורמות לסינתזה חלקית או קטועה של cDNA או לשינוי ברצף הרנ"א. בעוד שניתן לנצל את שתי התופעות הללו כדי למפות מבנים משניים או שינויים מסוימים, הן פוגעות בדיוק הכמותי של RNA-seq אם שלבי הכנת הספרייה הבאים נכשלים בלכידת cDNA קטוע או אם עיבוד נתונים זורק רצפים מוטנטים שאינם תואמים למערך נתוני ייחוס11,12. יתר על כן, המגוון הכימי, האורך והמבני העצום של תעתיקי רנ"א, כמו גם היעדר כלים לשבר אחיד של רנ"א ארוך, מקטין את התחולה של רוב שיטות הרנ"א-seq על כל מיני הרנ"א13.

שיטת AQRNA-seq (ריצוף RNA לכימות מוחלט) פותחה כדי להסיר כמה מהאילוצים הטכניים והביולוגיים הללו המגבילים את הדיוק הכמותי7. על ידי מזעור הטיות תלויות רצף בלכידה, קשירה והגברה במהלך הכנת ספריית ריצוף RNA, AQRNA-seq משיג ליניאריות מעולה בהשוואה לשיטות אחרות, ומכמת במדויק 75% מספריית הייחוס של 963 miRNA בדיוק של פי 2. מתאם ליניארי זה של ריצוף, ספירת קריאה ושפע RNA נצפה גם בניתוח של מאגר אורך משתנה של תקני RNA אוליגונוקלאוטידים ובהתייחסות לשיטות אורתוגונליות כמו כתם צפוני. קביעת ליניאריות בין ריצוף ספירת הקריאה לבין שפע הרנ"א מאפשרת ל-AQRNA-seq להשיג כימות מדויק ומוחלט של כל מיני הרנ"א בדגימה.

להלן תיאור של הפרוטוקול עבור זרימת עבודה להכנת ספריית AQRNA-seq וצינור ניתוח הנתונים הנלווה במורד הזרם. השיטה יושמה כדי להבהיר את הדינמיקה של שפע tRNA במהלך תרדמה הנגרמת על ידי רעב ולאחר מכן החייאה במודל Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) של שחפת. הוצגו תוצאות להדמיה גישושית של נתוני הריצוף, יחד עם אשכולות וניתוחי ביטוי דיפרנציאליים שחשפו דפוסים ניתנים להבחנה בשפע tRNA הקשורים לפנוטיפים שונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איור 1 מספק המחשה גרפית של ההליכים הכרוכים בהכנת ספריית AQRNA-seq. מידע מפורט לגבי ריאגנטים, כימיקלים ועמודות/ערכות המשמשים בהליך ניתן למצוא בטבלת החומרים. מומלץ לבצע הערכה מקיפה של טוהר, שלמות וכמות דגימות RNA קלט באמצעות (i) אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 3%, (ii) כלי אלקטרופורזה אוטומטיים לבקרת איכות הדגימה של ביומולקולות (ראה טבלת חומרים), ו- (iii) ספקטרופוטומטריה UV-Visible ו / או כימות פלואורומטרי. חובה לשמור את כל התגובות ואת תערובות המאסטר על קרח, אלא אם כן צוין אחרת. שינוע ריאגנטים (למשל, אנזימים) בקופסאות קירור אל אחסון של -20°C וממנו כדי לשמור על חיי המדף שלהם ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים של מתווכי ספריות.

1. דה-פוספורילציה של RNA

הערה: הסרת 5'-פוספט (P; תורם) מונעת קשירה עצמית ל-3'-הידרוקסיל (OH; מקבל) של RNAs. המקשרים לא יעשו קשר עצמי מכיוון שקצה ה-3' שלהם שונה כך שיכלול דידאוקסיציטידין (לינקר 1) או ספייסר (לינקר 2). ניתן לקשור את המקשרים רק על ידי חיבור ה-5'-P שלהם ל-3'-OH של הרנ"א או cDNA.

  1. הכן את תגובת הזרחן בצינור PCR סטרילי (למשל, 200 μL או 500 μL צינור) על ידי הוספת עד 2 μL של דגימת RNA, 0.5 μL של 40 U/μL מעכב RNase, 1 μL של 0.5 μM תקן פנימי (טבלה 1), 0.5 μL של 10x T4 RNA ligase מאגר תגובה, 1 μL של 1 U/μL שרימפס אלקליין phosphatase, ומים נטולי RNase מספיקים כדי להביא את הנפח הכולל ל -5 μL.
    הערה: עבור דגימות טיפוסיות, 75 ננוגרם של RNA (או בערך 2 pmol עבור RNA 80 nt) נחשב מספיק לכימות של RNA קטן באמצעות פרוטוקול זה.
  2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לדה-פוספורילט RNAs ולאחר מכן ב-65°C למשך 5 דקות כדי להשבית את האנזים ולנטרל את ה-RNAs. יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות לפחות כדי למנוע רטיורה.

2. קשירת לינקר 1 עד קצה ה-3' של RNAs

  1. הכן את תגובת הקשירה Linker 1 בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 5 μL של RNA dephosphorylated (מוצרים משלב 1), 0.5 μL של 40 U/μL מעכב RNase, 1 μL של 100 μM Linker 1 (טבלה 1), 3 μL של 10 mM ATP, 2.5 μL של 10x T4 RNA ligase מאגר תגובה, 15 μL של PEG8000 (50% פתרון), 2 μL של 30 U/μL T4 RNA ligase 1, ו-1 μL של מים נטולי RNase.
    הערה: ניתן להפוך ריאגנטים לתערובת מאסטר כדי להקל על עיבוד הדגימות. אין לכלול PEG8000 ו-T4 RNA ligase 1 בתערובת המאסטר.
  2. יש לדגור ב-25°C למשך שעתיים ולאחר מכן ב-16°C למשך 16 שעות כדי לקשור את Linker 1 ל-RNAs.
  3. לטהר את ה-RNA בעל ליגת Linker-1. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים).
    הערה: פרוטוקול טיהור עמודות זה חל על כל טיהור העמודות הבאות באמצעות אותה ערכה. לא ניתן להשתמש כאן בערכות המשתמשות בטכנולוגיית סינון ג'ל כדי להסיר מסופי צבע מתגובות ריצוף (ראו טבלת חומרים), מכיוון PEG8000 אינו תואם למסנני הג'ל של ערכות כאלה. מומלץ לשמור aliquot (1.2 μL) של כל דגימה לאחר טיהור. במידת הצורך, aliquots אלה יכולים לשמש לבדיקת יעילות הקשירה על ידי הפעלת מנתח חומצת גרעין מסחרי. שמור את הדגימות המטוהרות הנותרות על קרח או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשלבים נוספים.
    1. לנפח הדגימה < 50 μL, הוסיפו מים נטולי RNase כדי להביא אותו ל-50 μL. הוסיפו 2 כרכים של חיץ הקישור של אוליגו (שסופק בערכה) לנפח אחד של הדגימה. הוסף 8 כרכים של 100% אתנול לנפח אחד של הדגימה.
    2. טען את הדגימה (עד 750 μL בכל פעם) לעמודה הממוקמת בתוך צינור איסוף של 2 מ"ל (מסופק בערכה). כדי לקשור רנ"א לעמודה, צנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את הזרימה (כלומר, את הנוזל בצינור האיסוף). החזירו את העמוד לצינור האיסוף.
    3. כדי לשטוף את הזיהומים מהעמודה, הוסף 750 μL של מאגר שטיפת ה- DNA (המסופק בערכה) לעמודה. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ולבטל את הזרימה. החזירו את העמוד לצינור האיסוף.
    4. צנטריפוגה במהירות מרבית (למשל, 16,000 x גרם עבור מיקרו-צנטריפוגה על ספסל) למשך דקה אחת נוספת כדי להסיר שאריות של מאגר שטיפת DNA.
    5. כדי ללוטש את RNAs, בזהירות להעביר את העמודה לצינור סטרילי 1.5 מ"ל, להוסיף מים ללא RNase לעמודה. השתמש בנפח גדול יותר מהנדרש בעת פליטת הרנ"א כדי לקחת בחשבון אובדן נפח פוטנציאלי במהלך תהליך האלוציה. לדוגמה, אם 15 μL נדרש לשלב הבא, להוסיף 17 μL של מים נטולי RNase עבור elution. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות.

3. הסרת מתילציות שלאחר שעתוק על ידי AlkB demethylase

הערה: AlkB הוא אנזים חיידקי המסיר קבוצות מתיל מחלק מהנוקלאוטידים שעברו מתילציה, אך לא מכולם, בדנ"א וב-RNA. הסרה של מספר סוגים של ריבונוקלאוטידים מתילטיים ב-RNA מונעת נפילה של התעתיק ההפוך כדי לאפשר יותר קריאות באורך מלא וזיהוי של אתרי שינוי. שלב זה צריך להיות נשלט ב- pH נמוך כדי למנוע השפלה בלתי צפויה של RNAs.

  1. הכינו תמיסת מלאי של 1 M 2-ketoglutarate על ידי המסת 1.4611 גרם של 2-ketoglutarate (146.11 גרם למטר) ב 10 מ"ל של מים נטולי RNase. סנן לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
  2. הכינו תמיסת מלאי של 0.5 M חומצה L-אסקורבית על ידי המסת 0.88 גרם של חומצה L-אסקורבית (176.12 גרם ל-M) ב-10 מ"ל מים נטולי RNase. סנן לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
  3. הכינו תמיסת מלאי של 0.25 M אמוניום ברזל סולפט hexahydrate על ידי המסת 0.9835 גרם של אמוניום ברזל סולפט hexahydrate (392.14 גרם לכל M) ב 10 מ"ל של מים ללא RNase. סנן לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
  4. הכינו תמיסת מלאי של 1 M HEPES על ידי המסת 2.383 גרם HEPES (238.30 גרם למטר) ב -10 מ"ל של מים נטולי RNase. התאם את רמת החומציות של התמיסה ל-8 באמצעות NaOH וסנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים של 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
  5. הכינו מאגר תגובה 2x AlkB. כדי לייצר 10 מ"ל של החיץ, לשלב 1.5 μL של 1 M 2-ketoglutarate (עשה בשלב 3.1), 80 μL של 0.5 M L-חומצה אסקורבית (עשה בשלב 3.2), 6 μL של 0.25 M אמוניום ברזל סולפט hexahydrate (עשה בשלב 3.3), 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל BSA, 1000 μL של 1 M HEPES (עשה בשלב 3.4; להוסיף אחרון), ו-8812.5 מיקרוליטר מים נטולי RNase. סנן לעקר את המאגר באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
    הערה: יש להכין את חיץ התגובה 2x AlkB טרי מיד לפני כל ניסוי בשל היכולת הכימית של הרכיבים.
  6. הכן את תגובת העיכול AlkB בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 20 μL של RNA Linker-1-ligated RNA (מוצרים משלב 2), 50 μL של 2x AlkB reaction buffer (מיוצר בשלב 3.5), 2 μL של AlkB demethylase, 1 μL של מעכב RNase, ו 27 μL של מים נטולי RNase.
  7. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי להסיר מתילציות שלאחר שעתוק מהרנ"א.
  8. כדי להסיר את AlkB מהתגובה, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. להפרדת פאזה נקייה, הוסף 50 μL של מים נטולי RNase לתגובת AlkB, ולאחר מכן הוסף 100 μL פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 25:24:1 (pH = 5.2).
    2. נער ביד במשך 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות. ודא כי הרוטור של צנטריפוגת הספסל תואם צינורות PCR. השתמש במתאמים במידת הצורך.
    3. מעבירים את הרנ"א (כלומר, השכבה המימית למעלה; בערך 140 μL) לתוך צינור סטרילי של 1.5 מ"ל. אם מערבבים כלורופורם (כלומר, השכבה התחתונה) לתוך השכבה המימית, הצנטריפוגה שוב עם אותן הגדרות.
    4. הוסף 100 μL של כלורופורם לרנ"א שחולץ כדי להסיר שאריות פנול. נער ביד במשך 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות.
    5. מעבירים את הרנ"א (כלומר, השכבה המימית למעלה; בערך 120 μL) לתוך צינור סטרילי של 1.5 מ"ל.
  9. לטהר את הרנ"א שחולץ. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את הפרוטוקול המפורט בשלב 2.3 כדי לבצע את טיהור העמודות.

4. הסרת מקשר עודף 1

הערה: מומלץ לשמור aliquot (1.2 μL) של כל דגימה לאחר טיהור. במידת הצורך, aliquots אלה יכולים לשמש לבדיקת היעילות של עיכול RecJf על ידי הפעלת מנתח חומצות גרעין מסחרי. המשך עם הדגימות המטוהרות באופן מיידי כדי להפוך את התעתיק לאחור.

  1. הכינו את תגובת ה-deadenylation בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 15 μL של RNA מסוג Linker-1-ligated RNA (מוצרים משלב 3), 1 μL של 40 U/μL RNase inhibitor, 2 μL של 10x kit buffer 2 (ראה טבלת חומרים), ו-2 μL של 50 U/μL 5'-deadenylase.
  2. יש לדגור בטמפרטורה של 30°C למשך שעה אחת כדי להסיר את האדנין בקצה 5' של Linker 1. הוסף 2 μL של 30 U/μL RecJf לתגובת deadenylation.
  3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לעכל עודפי Linker 1. הוסף עוד 2 μL של 30 U/μL RecJf לתוך התגובה.
  4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי להמשיך בעיכול של עודפי Linker 1 ולאחר מכן בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות כדי לנטרל את האנזים.
  5. לטהר את ה-RNA בעל ליגת Linker-1. השתמש בערכה המשתמשת בטכנולוגיית סינון ג'ל כדי להסיר טרמינטורים של צבע מתגובות ריצוף (ראה טבלת חומרים), מכיוון שהיא יעילה בהסרת שאריות קצרות (למשל, אוליגונוקלאוטידים באורך של 2 עד 10 bp). בצע את השלבים המתוארים להלן לטיהור.
    1. הכינו עמודות מסנן ג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן. מניחים עמודה לתוך צינור סטרילי של 1.5 מ"ל וטוענים את העמודה עם 24 μL של הדגימה.
    2. כדי לטהר את RNAs, צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 3 דקות ולהשליך את העמודה. הרנ"א המטוהר נמצא באלוונט.

5. תגובת שעתוק לאחור (RT)

הערה: הגדרת התגובה הבאה של RT (ראה טבלת חומרים) עוקבת אחר פרוטוקול היצרן, עם שינויים קלים כדי לאפשר תאימות AQRNA-seq.

  1. הכינו את תגובת החישול של פריימר RT בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 24 μL של RNA תבנית (מוצרים משלב 4), 1 μL של פריימר RT 2 μM (טבלה 1), ו-1 μL של dNTP (10 מילימטר מכל סוג של נוקלאוטידים).
  2. יש לדגור בטמפרטורה של 80°C למשך 2 דקות כדי לחבר פריימרים RT ל-RNA של התבנית, ולאחר מכן מצננים על קרח מיד למשך 2 דקות.
  3. הכן את תגובת RT על ידי הוספת 6 μL של 5x RT reaction buffer, 1 μL של 40 U/μL RNase inhibitor, ו 1 μL של transcriptase הפוך לתוך צינור התגובה חישול.
  4. יש לדגור ב-50°C למשך שעתיים כדי לתמלל לאחור את תבניות ה-RNA, ולאחר מכן ב-70°C למשך 15 דקות כדי להשבית את האנזים. מוצרי RT (כלומר, היברידים RNA-cDNA) ניתן לאחסן ב 4 ° C או -20 ° C במשך הלילה.

6. הידרוליזה RNA

  1. הוסף 1 μL של 5 M NaOH להכלאה RNA-cDNA (מוצרים משלב 5). יש לדגור בטמפרטורה של 93°C למשך 3 דקות כדי לבצע הידרוליזה של גדיל ה-RNA של הכלאיים RNA-cDNA.
  2. הוסף 0.77 μL של 5 M HCl כדי לנטרל את התגובה. לאחר הוספת HCl, יש לערבב ולסובב את הצינור. הנטרול הוא מיידי.
    הערה: מומלץ לבדוק את הכמות המדויקת של 5M HCl הדרושה לנטרול 1 μL של NaOH (למשל, באמצעות רצועות pH) בתנאי חיצוץ.
  3. לטהר את ה-cDNA החד-גדילי. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את הפרוטוקול המפורט בשלב 2.3 כדי לבצע את טיהור העמודות.
    הערה: לא ניתן להשתמש כאן בערכות המשתמשות בטכנולוגיית סינון ג'ל כדי להסיר חומרים מסופי צבע מתגובות ריצוף (ראה טבלת חומרים) עקב שינוי ה- pH בשלבים קודמים.
  4. יש לזרז את ה-cDNA המטוהר ל-< 5μL ולאחר מכן להוסיף מים נטולי RNase כדי להחזיר את הנפח ל-5 μL. היזהרו שלא לזרז את ה-cDNA כדי להשלים את היובש.
  5. העבר את cDNA מטוהר לתוך צינור PCR סטרילי. cDNA מטוהרים ניתן לאחסן ב -20 ° C עד שבוע אחד.

7. קשירה של לינקר 2 לסוף 3' של cDNA

  1. הכן את תגובת הקשירה Linker 2 בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 5 μL של cDNA (מוצרים משלב 6), 1 μL של 50 μM Linker 2 (טבלה 1), 2 μL של 10x T4 DNA ligase brafer, 1 μL של 10 mM ATP, 9 μL של PEG8000 (50% תמיסה), ו 2 μL של 400 U/μL T4 DNA ligase.
    הערה: ריאגנטים יכולים להפוך לתערובת מאסטר כדי להקל על עיבוד הדגימות. אין לכלול ליגאז DNA PEG8000 ו-T4 בתערובת האב.
  2. יש לדגור בטמפרטורה של 16°C למשך 16 שעות כדי לקשור את Linker 2 ל-cDNAs.
  3. לטהר את ה-cDNA של Linker-2-ligated. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את הפרוטוקול המפורט בשלב 2.3 כדי לבצע את טיהור העמודות.

8. הסרת מקשר עודף 2

  1. הכן את תגובת deadenylation בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 16 μL של cDNA Linker-2-ligated, 2 μL של 10x kit buffer 2, ו 2 μL של 50 U/μL 5'-deadenylase. יש לדגור בטמפרטורה של 30°C למשך שעה אחת כדי להסיר את האדנין בקצה 5' של Linker 2.
  2. הוסף 2 μL של 30 U/μL RecJf לתגובת deadenylation. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לעכל עודפי Linker 2. הוסף עוד 2 μL של 30 U/μL RecJf לתוך התגובה.
  3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי להמשיך בעיכול של עודפי Linker 2 ולאחר מכן בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות כדי לנטרל את האנזים.

9. הגברה PCR של cDNAs עם פריימרים ריצוף

  1. הקצו פריימרים ל-PCR לדגימות. כל דגימה זקוקה לשילוב ייחודי של פריימרים קדימה ואחורה (טבלה 1) לריבוב יעיל.
  2. הוסף מים נטולי RNase כדי להביא את נפח הדגימה ל -25 μL. שמור 5 μL מכל דגימה לתוך צינור PCR סטרילי כגיבוי למקרה PCR צורך לחזור על PCR.
  3. הכן את תגובת ה-PCR (ראה טבלת חומרים עבור ערכת PCR) על-ידי הוספת 20 μL של cDNA (מוצרים משלב 8), 1 μL של פריימר קדמי של 2.5 μM, 1 μL של פריימר הפוך של 2.5 μM, 25 μL של 2x DNA פולימראז, 2 μL של מים נטולי RNase ו-1 μL של DNA פולימראז.
    הערה: ריאגנטים יכולים להפוך לתערובת מאסטר כדי להקל על עיבוד הדגימות. אין להוסיף DNA פולימראז לתערובת האב.
  4. בצע PCR עם דנטורציה ראשונית ב 94 ° C למשך דקה אחת, ואחריה 18 מחזורים של דנטורציה ב 98 ° C במשך 20 s - חישול ב 58 ° C במשך 20 s - הארכה ב 68 ° C למשך דקה אחת.
    הערה: אין להגביר PCR מעבר לטווח הליניארי. סך של 18 מחזורים יהיה אופטימלי עבור רוב הניסויים, אבל זה עשוי להיות תלוי הקשר.
  5. יש לחסן במהירות את מוצרי ה-PCR לפחות מ-25 μL ולאחר מכן להוסיף מים נטולי RNase כדי להחזיר את הנפח ל-25 μL. העבר 5 μL של מוצרי PCR לצינור סטרילי של 0.5 מ"ל לבדיקת התפלגות הגודל (ראה שלב 9.6). אחסן את 20 μL הנותרים של מוצרי PCR ב -20 ° C עד צעדים נוספים.
  6. בדוק את התפלגות הגודל של מוצרי PCR כמתואר להלן.
    1. מכינים ג'ל אגרוז 3% במאגר TAE.
      הערה: בפרוטוקול זה, אתידיום ברומיד (EtBr) משמש לצביעת ג'ל לאחר אלקטרופורזה (ראה שלב 9.6.5). כתמי DNA מתאימים ניתן להוסיף לתמיסת הג'ל בשלב זה או להשתמש בהם לצביעת ג'ל מאוחר יותר.
    2. יש לערבב 1 μL של 6x צבע העמסה לתוך 5 μL של מוצרי PCR (משלב 9.5) ולטעון את הג'ל עם התערובת.
    3. טען 5 μL של סולמות DNA לתוך הבאר לפני הדגימה הראשונה ואת הבאר אחרי הדגימה האחרונה. השתמש בסולמות DNA של 50 bp או 100 bp כדי לאפשר אפליה משופרת בגודל של מוצרי PCR בין 150 bp ל -300 bp.
    4. הפעל אלקטרופורזה ג'ל כדי לאתר את מוצרי ה- PCR. מצב הריצה המתאים עשוי להיות תלוי הקשר. כאן, לרוץ ב 120 V, 400 mA במשך 75 דקות עבור 17.78 ס"מ (רוחב) x 10.16 ס"מ (גובה) x 1 ס"מ (עובי) לוח ג'ל.
    5. מניחים את הג'ל בקופסה וממלאים את הקופסה במים נטולי יונים, עד שהג'ל טובל לחלוטין. הוסף 10 μL של EtBr למי DI השריית הג'ל. עוטפים את הקופסה בנייר כסף ומניחים על שייקר. מכתימים את הג'ל למשך 30 דקות תוך כדי רעידה.
    6. השליכו את הפסולת המכילה EtBr לבקבוק פסולת שהונח במכסה אדים. שטפו את הג'ל במי DI פעם אחת והשליכו את המים המכילים EtBr לבקבוק הפסולת.
    7. ממלאים את הקופסה במי DI עד שהג'ל שקוע לחלוטין. עוטפים את הקופסה בנייר כסף ומניחים על שייקר. יש לשטוף את הג'ל במשך 10 דקות תוך כדי ניעור.
    8. השליכו את המים המכילים EtBr לבקבוק הפסולת שבמכסה האדים. השתמש במצלמת ג'ל כדי להמחיש את הפסים. לרכוש תמונה ברזולוציה גבוהה של הג'ל.

10. טיהור ג'ל

  1. מכינים ג'ל אגרוז 3% במאגר TAE. הכינו ג'ל בעובי 1 ס"מ עם מסרקים רחבים (1 מ"מ עובי; 5 מ"מ רוחב; 15 מ"מ עומק), כך שכל באר יכולה להכיל לפחות 25 מיקרוליטר של תערובת צבע להעמסת דגימות.
  2. מערבבים 4 μL של צבע טעינה 6x עם 20 μL של מוצרי PCR (משלב 9.5) וטוענים את הג'ל בתערובת. השאירו נתיבים ריקים בין הדגימות כדי למזער זיהום צולב במהלך כריתת הג'ל.
  3. טען סולמות DNA, הפעל אלקטרופורזה בג'ל, הכתים ושטוף את הג'ל, וצלם תמונות ג'ל כמתואר בשלב 9.6.
  4. בלו בלוקים ג'ל המכילים מוצרי PCR בטווח גודל היעד. כדי למזער זיהום עם דימרים פריימר (175 bp linkers ללא תוספות), לחלץ מוצרי PCR בגודל מעל 195 bp (175 bp linkers + 20 bp miRNAs).
  5. לטהר את מוצרי PCR באמצעות מיצוי ג'ל. השתמשו בערכת מיצוי ג'ל (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול הטיהור מבוסס על פרוטוקול היצרן, עם שינויים קלים בתאימות AQRNA-seq. כל שלבי הצנטריפוגה צריכים להתבצע במהירות של 17,900 x גרם למשך דקה אחת באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. למדוד את המשקל של בלוקים ג'ל בתוך צינורות. הוסף 6 כרכים של Buffer QG (מסופק בערכה) לנפח אחד של בלוק ג'ל (1 מ"ג ג'ל הוא בערך 1 μL).
    2. יש לדגור ב-50°C למשך 10 דקות או עד להמסה מלאה של קוביות הג'ל. צינורות מערבולת כל 2 דקות כדי להקל על המסת ג'ל. לאחר המסת הג'ל, התערובת צריכה להידמות לצבע של Buffer QG ללא הג'ל המומס. אם הצבע כתום או סגול, להוסיף 10 μL של 3 M נתרן אצטט (pH = 5.0) ולערבב היטב.
    3. מוסיפים נפח ג'ל אחד של איזופרופנול לתערובת ומערבבים היטב. מניחים עמוד ספין בצינור איסוף של 2 מ"ל (מסופק בערכה).
    4. כדי לקשור DNA, יש למרוח את הדגימה (עד 750 μL בכל פעם) על העמוד והצנטריפוגה. מחק את הזרימה והחזיר את העמודה לאותו צינור איסוף. הכמות המקסימלית של ג'ל לכל עמוד ספין היא 400 מ"ג.
    5. הוסף 500 μL של Buffer QG לעמוד ולצנטריפוגה. מחק את הזרימה והחזיר את העמודה לאותו צינור איסוף.
    6. כדי לשטוף את הזיהומים, הוסף 750 μL של Buffer PE (מסופק בערכה) לעמודה, תן לעמוד במשך 5 דקות, וצנטריפוגה. מחק את הזרימה והחזיר את העמודה לאותו צינור איסוף. צנטריפוגה שוב כדי להסיר חיץ שטיפה שיורי.
    7. הכניסו את העמוד לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. כדי לשלול DNA, הוסף 30 μL של Buffer EB (מסופק בערכה) למרכז קרום העמודה, תן לעמוד במשך 4 דקות, וצנטריפוגה.
    8. Speed-vac ולהשהות מחדש את מוצרי PCR מטוהרים בג'ל ב-12 μL של Buffer EB.
  6. למדוד את ריכוז הספריות הבנויות על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Visible ו / או כימות פלואורומטרי.

11. רצף הספרייה

  1. הגש את הספריות שנבנו למרכז ריצוף חיצוני להערכת איכות וריצוף Illumina. כדי להבטיח רגישות מספקת במיפוי כמותי של נופי רנ"א קטנים, בחרו בריצוף זוגי עם קריאות של 75 bp מכל כיוון (כלומר, PE75), תוך שאיפה לקריאות רצף גולמי של לפחות 1.5 M לכל כיוון עבור כל דגימה. השתמש פריימרים מותאמים אישית (טבלה 1) עבור ריצוף NextSeq, אבל זה אופציונלי עבור רצף על MiSeq.
    הערה: ניתן לבצע ריצוף באמצעות פלטפורמות MiSeq או NextSeq500. בחירת הפלטפורמה עשויה להיות תלויה באופי הדגימות ובספירת המדגם הכוללת.

12. צינור ניתוח נתונים

הערה: איור 2 מספק המחשה גרפית של פרוצדורות פשוטות המעורבות בצינור ניתוח הנתונים, אשר לוקח קריאות רצף גולמיות (בתבנית FASTQ) כקלט ויוצר מטריצת שפע עם שורות המייצגות חברים של מיני RNA קטנים בעלי עניין ועמודות המייצגות דגימות. עבור ריצוף משויך, כל דגימה מתאימה לשני קובצי FASTQ, אחד עבור הקריאות קדימה והשני עבור הקריאות ההפוכות. צינור ניתוח הנתונים המלא, עם כל הסקריפטים המשויכים ומדריך עם ביאורים נרחבים לכל שלב, זמין ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

  1. אחזר קריאות רצף גולמיות ממרכז הרצף החיצוני והערך את איכות הרצף באמצעות תוכניות קוד פתוח כגון FastQC14 או Fastp15.
  2. צור ספריית רצפי הפניות בתבנית FASTA.
    הערה: המפתח ליכולת ההסתגלות של הצינור למגוון מחלקות RNA קטנות הוא ספריית רצפי ייחוס מתאימה. כדי להשיג הערכות שפע מדויקות של חברים במחלקות RNA ספציפיות המעניינות (למשל, miRNA), המשתמשים צפויים לאצור בקפידה ספריית רצפי ייחוס לשימוש עם הצינור. כל ההוראות האחרות לביצוע צנרת נשארות עקביות בין מחלקות RNA קטנות שונות.
  3. צור ספריה בשם AQRNA-seq ליישום צינור ניתוח הנתונים ומקם את כל קבצי ה- Script, קריאות הרצף המסוננות באיכות וספריית רצפי ההפניות לספריה זו. בצע את ההוראות המפורטות ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) כדי להכין ספריות משנה ולבצע שינויים חיוניים בקבצים למיקוד אורגניזמים שונים ו / או מיני RNA קטנים, כמו גם תאימות של מערכת ההפעלה ו / או מתזמן העבודה.
  4. יישם את צינור ניתוח הנתונים בהתאם לשלבים המתוארים במדריך ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), המכיל תיאורים, קבצי קלט ופלט, וכן שורות פקודה עבור כל שלב. לסיכום, הצינור כולל (i) חיתוך רצפי מקשרים ונוקלאוטידים אקראיים מהקריאות, (ii) סינון קריאות על פי אורכן, (iii) מיפוי הקריאות לרצפי הייחוס, (iv) פתרון מיפויים דו-משמעיים, ו-(v) יצירת מטריצת השפע.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקובקטריום בוביס זן BCG (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2 שעבר גדילה אקספוננציאלית היה נתון לסדרת זמן (0, 4, 10 ו-20 יום) של רעב תזונתי, ואחריו החייאה של 6 ימים בתווך עשיר בחומרים מזינים כפי שהוצג קודם לכן בהו ואחרים.7. רנ"א קטן בודד מתרבית חיידקים, עם שלושה העתקים ביולוגיים, בכל אחת מחמש נקודות הזמן שנקבעו. ספריות Illumina נבנו באמצעות תהליך העבודה של הכנת ספריית AQRNA-seq שתואר לעיל (איור 1), ולאחר מכן ריצוף על רצף במרכז BioMicro של המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס. לאחר מכן נתוני הרצף עובדו באמצעות צינור ניתוח הנתונים AQRNA-seq (איור 2) שהותאם לכימות שפע tRNA.

לאחר הגברת ה-PCR של ספריית cDNA עם פריימרים לריצוף, נצפתה נוכחות של מוצרי PCR בגודל של 175 זוגות בסיסים (bp) בכל הדגימות (איור 3A), מה שמרמז על היווצרות דימרים ראשוניים. כדי למתן את הנשיאה של דימרים פריימרים, מוצרי PCR שגודלם עולה על 195 bp הוצאו מהג'ל וטוהרו (איור 3B).

קריאות רצף מסוננות וגזוזות מופו לספריית רצפי ייחוס מותאמת אישית הכוללת את 45 איזוקבלי tRNA, התקן הפנימי ורצפי בקרה (כלומר, 23S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA, rnpB ו-ssr). איזוקבלטורים של tRNA היוו 10.5% עד 40.2% מכלל הקריאות שמופו של מדגם נתון, והראו שפע גבוה בהרבה מרצפי הבקרה (איור 4). חשוב לציין כי ניתן לייחס את פרופורציות הקריאה הנמוכות יחסית של איזוקבלי tRNA לשפע היחסי הגבוה יותר של התקנים הפנימיים. לכן, פרופורציות הקריאה של איזוקבלי tRNA ביחס לתקנים פנימיים (איור 4, בלוקי צבע ורודים לעומת ירוקים) ניתנות לשליטה על-ידי המפעיל, באמצעות כוונון עדין של כמות התקן הפנימי המוקפץ לתוך התגובה.

נתוני שפע ה-tRNA הגולמיים נורמלו באמצעות שיטת חציון היחסים שיושמה בגרסת חבילת DESeq2 (להלן v) 1.36.016 בסביבת תכנות סטטיסטית R (להלן R) v 4.2.117. לאחר הנורמליזציה, מושג נוף כמותי של איזוקבלטורים של tRNA ב-Mycobacterium bovis BCG במהלך תקופה של רעב והחייאה של חומרים מזינים (איור 5).

כדי לחשוף אשכולות נפרדים של דגימות עם פנוטיפים שונים בהתבסס על דפוסים בשפע האיזוקבילטורים של tRNA, ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) בוצע על נתוני שפע tRNA מנורמלים באמצעות חבילת הנתונים הסטטיסטיים v 4.2.117 in R (איור 6). הניתוח הבחין בין דגימות של יום הרעב 0 ויום ההחייאה 6 לבין דגימות של ימי הרעב 4, 10 ו-20, מה שמצביע על הבדל ניכר בנוף ה-tRNA של Mycobacterium bovis BCG שגדל במדיום חסר חומרים מזינים ובמדיום עשיר בחומרים מזינים.

כדי לאפיין את הדינמיקה של השפע של כל איזוקבלור tRNA על פני חמש נקודות הזמן המיועדות, בוצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי על נתוני שפע tRNA מנורמל באמצעות חבילת DESeq2 v 1.36.0 ב- R (איור 7). הניתוח גילה כי 17 מתוך 20 משפחות האיזוקבילטורים הכילו איזוקבלים שהתבטאו באופן דיפרנציאלי (כלומר, מווסתים באופן משמעותי למעלה או למטה) לפחות באחת מנקודות הזמן, מה שמרמז על תפקיד פוטנציאלי של ויסות מאגר tRNA במצב המתמשך של Mycobacterium bovis BCG במהלך שחפת.

figure-results-1
איור 1: סכמה של זרימת העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq. שלבי המפתח המתוארים בתהליך העבודה מפורטים במרכז הסכימה ומחוברים לאיורים הגרפיים המתאימים שלהם באמצעות קווים מנוקדים. ניתן למצוא את התיאור המפורט של כל שלב בסעיף הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סכמה של צינור ניתוח הנתונים AQRNA-seq. שלבי המפתח המתוארים בקו הצינור מפורטים במרכז הסכימה ומחוברים לאיורים הגרפיים המתאימים שלהם באמצעות קווים מקווקוים. התיאור המפורט של כל שלב זמין ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של מקטעי cDNA לאחר הגברה של PCR עם פריימרים לריצוף. (A) תמונה של הג'ל לפני מיצוי וטיהור הג'ל. נתיבים 7 ו-14 מצד שמאל מכילים 5 μL של סולם DNA של 50 bp, ואילו הנתיבים האחרים מכילים 20 μL של כל אחת מ-15 הדגימות. לוקליזציה של גודל מוצרי PCR מצביעה על הריכוז הגבוה ביותר שלהם בטווח שבין 175 bp (דימרים פריימר) ל 300 bp (שני פריימרים + 120 bp 5S rRNA). (B) תמונה של הג'ל לאחר מיצוי וטיהור הג'ל. עבור כל דגימה, בלוק הג'ל בין 200 bp ל 400 bp נכרת כדי למזער את הזיהום של דימרים פריימר בספריית הריצוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מספר קריאות הרצף שמופו בהצלחה לספריית רצפי הייחוס. ציר ה-x מציג את שמות הדגימות (לדוגמה, D18-69XX) מקובצות לפי נקודת זמן (לדוגמה, יום הרעב 0). עבור כל דגימה, ספירת הקריאה המשויכת לקטגוריות נושא יעד שונות מיוצגת באמצעות גושי צבע המוערמים זה על גבי זה. מספרים הממוקמים במרכז גושי הצבע מייצגים את יחסי הקריאות המתאימים לנושאי היעד המתאימים במדגם נתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: נוף כמותי של איזוקבלי tRNA של Mycobacterium bovis BCG בנקודות זמן שונות לאורך מסלול זמן הרעב וההחייאה. נתוני שפע tRNA גולמיים נורמלו באמצעות שיטת חציון היחסים. כאן, כל שורה מתארת שפע tRNA מנורמל (ציר y) כממוצע ± שגיאת תקן עבור 3 העתקים ביולוגיים בכל נקודת זמן. על ציר ה-x, איזוקבלטורים מאותה משפחה קובצו יחד ותויגו עם חומצת האמינו המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: תרשים קוסינוס בריבוע של דגימות שנגזרו מניתוח רכיבים עיקריים (PCA). PCA בוצע על בסיס שפע tRNA מנורמל. הקוסינוס בריבוע מציין את חשיבות המרכיבים העיקריים לדגימות, והדגימות שורטטו ביחס לקוסינוס בריבוע של שני המרכיבים העיקריים הראשונים. הדגימות סומנו באמצעות מזהים לדוגמה וקודדו בצבע לפי נקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: ביטוי דיפרנציאלי של איזוקבלי tRNA על פני נקודות זמן שונות. שפע tRNA מנורמל סוכם כאמצעי (קשרי קו) ± שגיאת תקן (פסי שגיאה) על פני 3 עותקים ביולוגיים. בשל מגבלת מקום, התנאים קוצרו כדלקמן: S0-S20 = ימי רעב 0-20; R6 = יום החייאה 6. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע עבור כל איזוקבלור tRNA, תוך השוואה בין נקודות זמן שונות באופן זוגי באמצעות מבחן יחס הסבירות ומבחן Wald. אותיות קומפקטיות שימשו לייצוג מובהקות סטטיסטית, כאשר השפע של איזוקנטור tRNA נתון בנקודות זמן החולקות לפחות אות משותפת אחת לא היה שונה באופן משמעותי זו מזו. לדוגמה, השפע של tRNA-Lys-CTT-1-1 (בלוח ליזין) היה מווסת באופן משמעותי מ-S0 ל-S4 ומ-S4 ל-S10, אך לא מ-S10 ל-S20. לאחר מכן הוא הוסדר משמעותית מ-S20 ל-R6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: אוליגונוקלאוטידים המעורבים בתהליך הכנת ספריית AQRNA-seq. התקן הפנימי הוא RNA, בעוד שכל שאר האוליגונוקלאוטידים הם DNA. פריימרים PCR ופריימרים לריצוף מותאם אישית המפורטים הם ספציפיים לפלטפורמות הריצוף. ניתן לעצב פריימרים נוספים ל-PCR עם רצפי אינדקס חדשניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq נועד למקסם את לכידת הרנ"א בתוך דגימה ולמזער את נפילת הפולימראז במהלך שעתוק לאחור7. באמצעות קשירת מקשר דו-שלבית, אוליגוס DNA חדש (Linker 1 ו-Linker 2) נקשר בעודף כדי להשלים באופן מלא את ה-RNA שבתוך הדגימה. ניתן להסיר ביעילות קישורים עודפים באמצעות RecJf, אקסונוקלאז בגודל 5' עד 3' הספציפי לדנ"א חד-גדילי, ולהשאיר את המוצרים הקשורים ללא פגע. בנוסף, טיפול AlkB מפחית שינויים מתיל על RNA18, אשר עלול לגרום לנפילת פולימראז במהלך שעתוק לאחור, ובכך מקל על הבעיה של תוצרי cDNA קטועים מלאכותית. AQRNA-seq מייצגת את השיטה המדווחת הראשונה לאופטימיזציה שיטתית של יעילות הקשירה וההגברה. AQRNA-seq אומת בזכות הדיוק הכמותי שלו והיעדר ממצאי הטיה, והוא הוכח כיישום המדויק ביותר למחקרי פרופיל miRNA.

AQRNA-seq נרחב במיוחד, וטיפול תפעולי מומלץ לצעדים רגישים לטמפרטורה ו/או לזמן במהלך הכנת הספרייה. באופן ספציפי, שלבים לפני סינתזת cDNA (איור 1; שלבים 1-4), שבהם דגימות מכילות RNA חד-גדילי (ssRNA) בלתי יציב מטבעו או ssRNA מקושר DNA, צריכים להתבצע ללא הפרעות מיותרות. הידרוליזה של רנ"א (איור 1; שלב 6) שימוש בבסיס חזק בטמפרטורה גבוהה יעיל מאוד בעיכול תבניות רנ"א לאחר שעתוק לאחור19. עם זאת, יש להקפיד להימנע מחשיפה ממושכת של הדגימה לבסיס החזק ומנטרול מושהה עם חומצה חזקה, במיוחד בהינתן ספירת דגימות גדולה. באופן כללי, מומלץ מאוד להכין את כל התגובות על קרח ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים של מוצרי ביניים בספרייה.

דגימה של מתווכי הספרייה בנקודות מפתח לאורך זרימת העבודה מומלצת לצורך בדיקות איכות ופתרון בעיות בזמן של התהליך. ניתוח דגימות על כלי אלקטרופורזה אוטומטיים יכול לקבוע את ההצלחה והיעילות של קשירת מקשר (איור 1; שלבים 2 ו-7). הדמיה של לוקליזציה של מוצרי cDNA אינדקסיים לאחר הוספת PCR של פריימרים לריצוף (איור 1; שלב 9) באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז יכולה לסייע בהערכת הלימות מחזורי PCR, כמו גם בזיהוי השפלה אפשרית של דגימות ו/או נוכחות של דימרים ראשוניים. ניתן לעצב מחדש את פריימר ה-PCR והריצוף כך שיתאימו לפלטפורמת הריצוף של המפעיל.

בין השאר בשל התכנונים הייחודיים הכרוכים בהכנת ספריות, צינור ניתוח הנתונים של AQRNA-seq נבנה בעיקר וכלל סקריפטים מותאמים אישית, ושילב רק קומץ תוכניות ביואינפורמטיקה קיימות. עם זאת, ליישור קריאות רצף כנגד ספריית רצפי הייחוס, נעשה שימוש בכלי החיפוש הבסיסי ליישור מקומי (BLAST)20 בשל עוצמותיו השונות העונות על צרכים ספציפיים של ניתוח נתוני AQRNA-seq. אלה כוללים (i) את היכולת ליישר קריאות קצרות מ- 20 bp ולבצע יישור תת-מחרוזות, (ii) טיפול הגיוני בבסיסים מעורפלים (N's), (iii) דיוק היישור מעט גבוה יותר, ו- (iv) הפלט האינפורמטיבי המספק פרטים משמעותיים כגון אי-התאמות ופערים, התורם לניתוחים מגוונים במורד הזרם.

יש לציין כי נותרו מספר אתגרי עיצוב הן בזרימת העבודה של הכנת הספרייה והן בצנרת ניתוח הנתונים של AQRNA-seq, המצדיקים אופטימיזציות נוספות ומייצגים את מוקד העבודה הנוכחית בתהליך. ראשית, הדיוק הכמותי המעולה של AQRNA-seq בהשוואה לשיטות RNA-seq קונבנציונליות הושג עם 50-75 ננוגרם של קלט RNA קטן, בעוד זרימת העבודה נבדקת כיום עם כמויות מופחתות של RNA קלט כדי לשפר את רגישותו ועם RNA ארוך יותר כדי להרחיב את התועלת שלו. שנית, למרות שמתילציה שלאחר שעתוק מוסרת באופן אנזימטי עם AlkB, ישנם שינויים אחרים ב-RNA שעלולים לגרום לנפילת פולימראז במהלך שעתוק לאחור10. זה עלול להוביל לתוצרי cDNA חתוכים באופן מלאכותי שלא ניתן להבדיל ביעילות מפירוק משמעותי ביולוגית של tRNA באורך מלא. לפיכך, מספר דרכים אפשריות לשפר עוד יותר את תהליך התמלול ההפוך מוערכות כיום ליעילות ותאימות עם AQRNA-seq. שלישית, הסרת דימרים פריימר באמצעות מיצוי וטיהור ג'ל אינה יעילה וגורמת תמיד לאובדן מקטעי המטרה ולשונות מוגברת בין ספריות. לכן, הפחתת הנשיאה הפוטנציאלית של דימרים ראשוניים מבלי לאבד שברי מטרה מהווה הזדמנות לשפר עוד יותר את הרגישות והדיוק הכמותי של AQRNA-seq. חשוב לציין, הן טיפול AlkB כמו גם מיצוי ג'ל וטיהור הם עתירי עבודה, מה שהופך אותם suboptimal לעיבוד מספר רב של דגימות. עם השיפורים שהושגו בתחומים לעיל, אוטומציה ועיבוד בתפוקה גבוהה של שיטת AQRNA-seq יתאפשרו בעתיד. השכלול המתמשך של צינור ניתוח הנתונים נותן עדיפות לשיפורים ביעילות, דיוק כמותי וגמישות. בעוד שהצינור הנוכחי חותך ביעילות מתאמי 3' מקריאות הרצף, תת-קבוצה של קריאות כוללת גם רצפי מתאמי 5', ככל הנראה בשל חסימה לא מספקת של קצה 3' של המקשרים במהלך הקשירה. נוכחותם של רצפי מתאם 5' עלולה לפגוע בדיוק הכמותי על ידי הפרעה ליישור קריאת הרצף. לכן, הסרה נאותה של רצפי מתאם 3' ו- 5' תובטח על ידי שימוש בכלי חיתוך מתאמים נוספים כגון Cutadapt21. כדי להגביר את היעילות, הצינור המתוקן ישלב אסטרטגיות רציונליות לקיצור זמן המחשוב. פעולה זו כוללת שלב הרכבה של קריאת סוף כדי למזג קריאות קדימה ואחורה על ידי זיהוי חפיפה משמעותית, וחילוץ רצפים ייחודיים יחד עם המופעים שלהם בכל ספרייה. אסטרטגיות כאלה צפויות להפחית במידה ניכרת את זמן המחשוב במורד הזרם על ידי הימנעות מניתוח מיותר של (i) קריאות משני הכיוונים ו-(ii) רצפים משוכפלים שעשויים לשלוט במאגר קריאת הרצפים של ספריות AQRNA-seq. במבט קדימה, האופטימיזציה הסינרגטית הן של זרימת העבודה של הכנת הספרייה והן של צינור ניתוח הנתונים של AQRNA-seq צפויה לפתוח הזדמנויות מגוונות בחקירה כמותית קפדנית של כל צורות הרנ"א (למשל, תעתוק, מקטעי tRNA ומיני רנ"א נדירים כמו רנ"א סרטני במחזור), מיפוי של שינויי tRNA ותחומים מרכזיים אחרים של ביולוגיה של סמנים ביולוגיים ותגליות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.C.D. הוא ממציא של שני פטנטים (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) הנוגעים לעבודה שפורסמה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברי העבודה הנוכחית אסירי תודה למחברי המאמר המקורי המתאר את טכנולוגיית AQRNA-seq7. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) וקרן המחקר הלאומית של סינגפור באמצעות הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה עמידות מיקרוביאלית IRG.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-קטוגלוטראט Sigma-Aldrich75890הכן תמיסת עבודה (1 מ ') ואחסן אותה ב -20º
C 2100 מכשיר ביואנלייזרAgilentG2938C
אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP) New England BiolabsM0437M (רכיב #: N0437AVIAL)NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ); הכינו פיתרון עבודה (10 מ"מ) ואחסנו אותו ב -20&ORDM; C
AGAROSE GPG/LEAmericanBioAB00972-00500אחסן בטמפרטורת הסביבה
אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידראטSigma-AldrichF2262הכן תמיסת עבודה (0.25 מ') ואחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות; C
ביואנלייזר ניתוח RNA קטןAgilent5067-1548 ניתוח ה-RNA הקטן משמש לבדיקת איכות ה-RNA הקלט והיעילות של תגובות אנזימטיות (למשל, קשירת Linker 1)
אלבומין בסרום בקר (BSA; 10 מ"ג/מ"ל) New England BiolabsB9000מוצר זה הופסק ב-15/12/2022 והוחלף באלבומין רקומביננטי, בדרגת ביולוגיה מולקולרית (NEB B9200).
כלורופורם Macron Fine Chemicals4441-10
דמתילאז ArrayStarAS-FS-004Demethylase מגיע עם טיפול מקדים rtStar tRNA & ערכת סינתזה cDNA של גדיל ראשון (AS-FS-004)
תערובת תמיסות דאוקסינוקלאוטיד (dNTP)ניו אינגלנד ביולאבסN0447L (רכיב #: N0447LVIAL)תערובת תמיסות dNTP זו מכילה ריכוזים שווי ערך של dATP, dCTP, dGTP ו-dTTP (10 מ"מ כל אחד)
בלוק חום כפול דיגיטליVWR Scientific Products13259-052בלוק חימום משמש עם QIAquick  ערכת מיצוי ג'ל 
דייקס  2.0 ערכת ספין קיאג'ן63204 יעיל בהסרת שאריות קצרות (למשל, אוליגוס באורך של פחות מ-10 bp)
ספק כוח אלקטרופורזהBio-Rad LabrotoriesPowerPac 300
Eppendorf PCR (0.5 מ"ל)של Eppendorf0030124537
Eppendorf (0.5 מ"ל)של Eppendorf022363611
Eppendorf (1.5 מ"ל)Eppendorf022363204
Eppendorf (2 מ"ל)Eppendorf022363352
אלכוהול אתילי (אתנול),סיגמא-אולדריץ'E7023 טהור האתנול הטהור משמש עם ערכת Oligo Clean and Concentrator מבית Zymo Research
מערכת הדמיית ג'לAlpha InnotechFluorChem 8900
צבע טעינת ג'ל, סגול (6X), ללא SDSNew England BiolabsN0556S (רכיב #: B7025SVIAL)NEB N0556S מכיל סגול מהיר 50 bp DNA סולם וצבע טעינת ג'ל, סגול (6X), ללא SDS
GENESYS 180 UV-Vis ספקטרופוטומטרThermo Fisher Scientific840-309000הספקטרופוטומטר משמש למדידת ריכוזי האוליגו באמצעות חוק הבירה
HEPESSigma-AldrichH4034הכן תמיסת עבודה (1 M; pH = 8 עם NaOH) ואחסן אותה ב-20 מעלות; C
חומצה הידרוכלורית (HCl) VWR Scientific ProductsBDH3028 הכן תמיסת עבודה (5 מ ') ואחסן אותה בטמפרטורת הסביבה
איזופרופיל אלכוהול (איזופרופנול),כימיקלים עדינים טהורים של מקרון3032-16איזופרופנול משמש עם QIAquick  ערכת מיצוי ג'ל 
חומצה L-אסקורביתSigma-AldrichA5960הכן תמיסת עבודה (0.5 מ ') ואחסן אותה ב -20º C
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5415D
NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטרתרמו פישר סיינטיפיקND-2000
NEBuffer 2 (10X)ניו אינגלנד BiolabsM0264L (רכיב #: B7002SVIAL)NEB M0264L מכיל RecJf (30 U/μ L) ו-NEBuffer 2 (פי 10); יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
מים נטולי נוקלאז (לא מטופלים על ידי DEPC)תרמו פישר סיינטיפיקAM9938 
אוליגו קלין & ערכת ריכוז זימו מחקרD4061 יש לאחסן בטמפרטורת הסביבה
PEG 8000 (תמיסה של 50%) New England BiolabsM0437M (רכיב #: B1004SVIAL)NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ); הכינו פיתרון עבודה (10 מ"מ) ואחסנו אותו ב -20&ORDM; C
Peltier תרמי CyclerMJ מחקרPTC-200
פנול: כולורופורם: איזואמיל  אלכוהול 25:24:1 pH = 5.2 תרמו פישר סיינטיפיקJ62336 
מאגר PrimeScript (5X)TaKaRa2680A 
PrimeScript Reverse TranscriptaseTaKaRa2680A 
QIAquick  ערכת מיצוי ג'ל Qiagen28704ערכה זו דורשת בלוק חימום ואיזופרופנול כדי לעבוד עם
Quick-Load Purple 100 bp DNA LadderNew England BiolabsN0551S (רכיב #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA LadderNew England BiolabsN0556S (רכיב #: N0556SVIAL)NEB N0556S מכיל סגול מהיר 50 bp סולם DNA וצבע טעינת ג'ל, סגול (6X), ללא SDS
RecJf  (30 U/μ L) New England BiolabsM0264L (רכיב #: M0264LVIAL)NEB M0264L מכיל RecJf (30 U/μ L) ו-NEBuffer 2 (פי 10); יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות;
מעכב C RNase (מורין; 40 U/μ L) ניו אינגלנד ביולאבסM0314L ( רכיב #: M0314LVIAL)יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
רצףAMP  DNA פולימראז TaKaRa638509 TaKaRa 638509 מכיל SeqAMP  DNA פולימראז  ו-SeqAMP  מאגר PCR (2X)
SeqAMP  מאגר PCR (פי 2) TaKaRa638509 TaKaRa 638509 מכיל SeqAMP  DNA פולימראז  ו-SeqAMP  מאגר PCR (2X)
שרימפס אלקליין פוספטאז (1 U/μ L) ניו אינגלנד ביולאבסM0371L ( רכיב #: M0371LVIAL)
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'  S5881הכן תמיסת עבודה (5 מ') ואחסן אותה בטמפרטורת הסביבה
T4 DNA Ligase (400 U/μ L) ניו אינגלנד ביולאבסM0202L ( רכיב #: M0202LVIAL)NEB M0202L מכיל T4 DNA Ligase (400 U/μ L) ו-T4 DNA Ligase Response Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Response Buffer (10X) ניו אינגלנד ביולאבסM0202L ( רכיב #: B0202SVIAL)NEB M0202L מכיל T4 DNA Ligase (400 U/μ L) ו-T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L) New England BiolabsM0437M (רכיב #: M0437MVIAL)NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ)
T4 RNA Ligase Response Buffer (10X) ניו אינגלנד BiolabsM0437M (רכיב #: B0216SVIAL)NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ)
צינורות צינורות נעילה בטוחה צינורות נעילה בטוחה צינורות נעילת כספת של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
  2. Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.". J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).
  3. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  4. Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
  5. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  6. Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).
  7. Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
  8. Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
  9. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).
  10. Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).
  11. Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
  12. Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
  13. García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).
  14. FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  15. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  16. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  17. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).
  18. Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
  19. Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4(2012).
  20. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  21. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AQRNA SeqSmall RNA QuantificationtRNA ModificationsLibrary PreparationReverse TranscriptionGel ElectrophoresisBioinformatics PipelineProtein TranslationMicroRNA MappingPhenol Chloroform Extraction

מאמרים קשורים