הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66350

⸱

7 ביוני 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לרכישת לבלב חזירי לבידוד וטיהור איונים.

תקציר

השתלת איון לבלב היא טיפול מתפתח לסוכרת מסוג I; עם זאת, היא מוגבלת על ידי התאמת התורם וזמינותו. השתלת איון חזירי מציעה חלופה מבטיחה להשתלה, עם פוטנציאל לייצור בקנה מידה גדול של איים פונקציונליים לפי דרישה. היבול והכדאיות של איים מבודדים רגישים מאוד לאיכות הלבלב התורם ולשיטת הרכש, במיוחד משך זמן האיסכמיה החמה. כדי לשפר את שימור האיברים ואת תפוקת האיונים הבאים ואת הכדאיות, פיתחנו פרוטוקול לזילוח כירורגי וכריתה של הלבלב החזירי. פרוטוקול זה משתמש בקנולציה ישירה של אבי העורקים האינפרא-כלייתי ובזילוח איברים כדי למזער את זמן האיסכמיה החמה ולפשט את ההליך עבור מפעילים שאין להם מומחיות כירורגית נרחבת. זילוח עורקי עוקב של הלבלב דרך אבי העורקים שוטף דם עומד מן microvasculature, ובכך להפחית פקקת נזק חמצוני לרקמה. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט לזילוח כירורגי וכריתה של הלבלב החזירי, ולאחר מכן בידוד וטיהור איונים.

מבוא

סוכרת מסוג 1 נגרמת על ידי הרס אוטואימוני של תאי בטא בלבלב1. כתוצאה מכך, חולים תלויים באינסולין אקסוגני, מה שמציב אותם בתנודות גליקמיות בסיכון גבוה עם פרקים של היפרגליקמיה והיפוגליקמיה2. השתלת איילט היא תרופה פוטנציאלית לסוכרת מסוג I; עם זאת, הזמינות המוגבלת של תורמי איברי לבלב נותרה מחסום מרכזי לאימוץ נרחב של הליך 2,3. השתלת קסנו מתורמים חזיריים היא חלופה מבטיחה מכיוון שבעלי חיים אלה זמינים. אופטימיזציה וקנה מידה של בידוד איון לבלב חזירי יהיה קריטי להתקדמות השתלת איון.

למרות שמספר טכניקות לרכישת לבלב חזירי פורסמו בעבר, רבות מההליכים הללו מתארות כריתת לבלב לאחר השראת מוות לבבי או כריתה 4,5,6,7,8,9,10. אחד החיסרונות העיקריים של טכניקות אלה הוא הזמן האיסכמי החם המשתנה (WIT) המתרחש בין זמן המוות הלבבי לבין התחלת עירוי תוך עורקי ו / או אינטרדוקטלי של תמיסת שימור. אפילו 10 דקות של WIT ישפיעו לרעה על תשואת האי וכדאיות5. מזעור WIT דורש זילוח מהיר של הלבלב עם פתרון שימור. במהלך רכישת איברי הבטן, קנולציה של אבי העורקים ואחריה זילוח תוך גופי עם תמיסת אוניברסיטת ויסקונסין (UW) חיונית להסרת דם, מניעת פקקת תוך וסקולרית, הגנה מפני נזק איסכמי ומזעור הפגיעה התאית11,12.

מחקרים קודמים הראו כי במהלך רכישת לבלב חזירי, שטיפה בלחץ נמוך של גזע הצליאק ועורק מזנטרי עליון עם תמיסת UW משפרת את תפוקת האיונים ואת טוהר4. עם זאת, שיטות שפורסמו בעבר לרכישת לבלב חזירי כוללות קנולציה פתוחה של אבי העורקים, שיכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד עבור חזירים קטניםיותר 13,14,15. בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט, שלב אחר שלב, עם עזרים חזותיים נלווים לזילוח כירורגי ורכישה של הלבלב החזירי, ולאחר מכן בידוד וטיהור איונים. טכניקה חדשה זו של קנולציה של אבי העורקים במהלך בידוד הלבלב פותחה במיוחד כדי למזער WIT ולאפשר את רכישת הלבלב להתבצע בשדה ללא דם כאמצעי למקסם את תפוקת בידוד האיונים ואת הכדאיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, המחלקה לרפואה השוואתית. חזירי יורקשייר בוגרים הנעים בין 35 ל -35 ק"ג אידיאליים להליך זה; עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לחזירים בגדלים שונים בהתאם להקשר הניסוי. ההליך כולו צריך להתבצע בצורה סטרילית במערך חדר ניתוח.

1. הכנה לפני הניתוח והרדמה

  1. הרגיעו את החזיר עם קוקטייל של 4 מ"ג/ק"ג טילטמין וזולאזפם, 20 מ"ג/ק"ג קטמין ו-2 מ"ג/ק"ג קסילזין מוזרק תוך שרירית.
  2. ליצור גישה ורידית היקפית דרך הווריד האוריקולרי.
  3. יש להשרות הרדמה כללית עם איזופלורן 1%-3% ב-100% חמצן ב-100% אינטובציה אנדוטרכאלית של החזיר.
    הערה: ייתכן שעדיף להשתמש בפרופופול או בכל חומר אינדוקציה תוך ורידי אחר לעומת ממסים נדיפים לזירוז להליך אינדוקציה ואינטובציה חלק יותר. הסימנים החיוניים, CO2 של סוף הגאות, רוויית החמצן וצורת הגל הלבבית מנוטרים ברציפות כדי להעריך ולשמור על עומק ההרדמה. המישור הכירורגי הבטני מאושר באמצעות אולטרסאונד ליד המיטה.
  4. לגלח ולהכין את החזיר עם gluconate chlorhexidine מן החריץ החזה אל המפשעות דו צדדיות.
  5. עטפו את שדה הניתוח במבט ברור על כל הבטן (איור 1A).

2. הגדרה אופרטיבית וחשיפת הרטרופריטונאום

  1. בצעו חתך לפרוטומי בקו האמצע (איור 1B).
    1. השתמש אזמל 10 להבים electrocautery כדי להפוך laparotomy קו אמצע מתהליך xiphoid אל הערווה. יש להקפיד לעקם את החתך סביב פתח הבטן התחתון.
  2. בצע סיבוב קרביים ימני.
    1. להחצין את המעי הגס הימני ואת המעי הדק, לעטוף אותם במגבת סטרילית.
    2. משכו בעדינות את המעי הגס והמעי שמאלה כדי לחשוף את הרטרופריטונאום הימני תוך הימנעות מפיתול המעי או מלרוטציה.
  3. מסננים את שלפוחית השתן (אופציונלי).
    1. אם שלפוחית השתן מלאה ומשפיעה על החשיפה, אחזו את שלפוחית השתן בין שני מלקחיים של DeBakey והשתמשו באזמל בעל 11 להבים כדי לחתוך את דופן שלפוחית השתן הגחון.
    2. הכניסו קצה יניקה של Yankauer לשלפוחית השתן כדי לנקז את השתן ולשחרר את הלחץ על שלפוחית השתן.
  4. הגדירו סט של מחזיר בטן כדי לאפשר חשיפה אופטימלית של הרטרופריטונאום הימני (איור 1C).

3. דיסקציה רטרופריטוניאלית

  1. התחלת דיסקציה רטרופריטוניאלית (איור 2A).
    1. באמצעות electrocautery, לחתוך את הצפק מימין לקו האמצע, מרמת הכליה הימנית לביפורקציה אבי העורקים.
    2. חשוף בחדות את אבי העורקים האינפרא-כלייתי (IVC), את עורק הכליה והווריד הימני
  2. קבל שליטה היקפית של אבי העורקים האינפרא כלייתי הדיסטלי עם לולאת כלי דם גדולה.
  3. Ligate the IVC (איור 2B).
    1. להשיג שליטה היקפית של IVC באמצע infrarenal.
    2. כבשו את ה-IVC בתיקו 2-0 ממשי.
  4. לקשור את כלי הדם הכלייתיים (איור 2C).
    1. להשיג שליטה היקפית של עורקי הכליה הימנית והשמאלית וורידים.
    2. קשרו מבנים אלה באמצעות עניבות משי 2-0.
    3. אם ישנם עורקי כליות מרובים, באופן דומה לבודד ולקשור כל אחד מכלי הדם האלה.

4. דיסקציה תוך חזה

  1. חתך את הסרעפת הימנית (איור 3A).
    1. נסוגו בעדינות את הכבד בנחיתות כדי לחשוף את ההמידיאפרגמה הימנית. יש למרוח שני מהדקי אליס על החלק הקרומי של ההמידיאפרגמה הימנית ולחתוך את הסרעפת בין שני המלחציים באמצעות אלקטרוקאוטריה.
    2. הרחבת מיוטומיית הסרעפת לכ-7 ס"מ אופקית.
  2. להשיג שליטה היקפית של IVC תוך חזי (איור 3B).
    1. מניחים עניבת משי 2-0 סביב IVC intrahuracic. הצמד את קצות התפר עם hemostat קטן מבלי להסתיר את IVC.
  3. הרחיבו את הסרעפת להמידיאפרגמה השמאלית (איור 3C).
    1. השתמש בשני מלחציים של אליס כדי למשוך את קצה הסרעפת בצורה נחותה ולהאריך את חצי הסרעפת השמאלית.
      הערה: הימנע מכניסה לקרום הלב במהלך הסרעפת.
  4. חשוף את אבי העורקים החזי היורד באזור החזה האחורי השמאלי.

5. קנולציה אינפרא כלייתית של אבי העורקים, בידוד הקרביים וזילוח

  1. מערכת anticoagulate חזיר.
    1. מתן הפרין מערכתי (100 U/kg) באמצעות גישה ורידית היקפית. המתן 3 דקות לפני שתמשיך עם קנולציה אבי העורקים.
  2. גשו לאבי העורקים האינפרא-כלייתי באמצעות מחט מיקרו-ניקור 18G (איור 4A).
  3. מעבירים חוט J דרך המחט לתוך אבי העורקים ומוציאים את המחט מעל החוט.
  4. הניחו נדן של 10Fr מעל החוט לתוך אבי העורקים והוציאו את החוט (איור 4B).
  5. חבר צינורות IV לנדן 10Fr ובאופן סטרילי, להחדיר תמיסת UW דרך הנדן. להחדיר תמיסת UW בקצב של 40-60 טיפות לדקה.
    הערה: הזרימה לא תתחיל עד שאבי העורקים החזי מוצלב. ודא כי הצינור תוך ורידי אינו על מתח כדי למנוע תזוזה של נדן intraaortic.
  6. בצע בידוד קרביים וזילוח ברצף מהיר.
    1. מהדקים את אבי העורקים האינפרא כלייתי באמצעות מהדק אבי העורקים.
    2. מהדקים את אבי העורקים החזי היורד באמצעות מהדק אבי העורקים.
    3. תיקו מול IVC תוך חזי עם תיקו 2-0 שהוצב קודם לכן.
    4. יש לתת 100 מ"ג/ק"ג KCl להמתת חסד באמצעות גישה ורידית היקפית.
      הערה: מוות לבבי מתחיל עם מתן KCl.
    5. צרו ארס ב-IVC האינפרא-כליתי, העולה על קשר 2-0, והכניסו יניקה עם קצה לבריכה דרך הווריד (איור 4C).
    6. מחוררים את הקרביים עם 2-3 ליטר של תמיסת UW קרה.
    7. המשך עם דיסקציה עבור pancreatectomy הכולל במהלך זילוח.
      הערה: הקרביים, ובמיוחד הלבלב, צריכים להחוויר כאשר תמיסת UW מחוררת לאזור האיבר המוצק (איור 5A).

6. כריתת פנקטומיה כוללת

  1. שחררו את המעי הדק מנסיגה מכיוון שתמיסת UW מבלבלת.
  2. התחל בדיסקציה של אונות התריסריון, החיבור והטחול של הלבלב במהלך הזלוף הקרבי. משכו את הבטן בצורה מעולה כדי לחשוף את הלבלב. עם שילוב של דיסקציה קהה ו electrocautery, לנתח את הלבלב מן החיבורים omental שלה.
    הערה: גוף הלבלב עוטף ביעילות את וריד הפורטל. יש להקפיד להימנע מווריד הפורטל העובר אחורית לאונה התריסריון ולאחר מכן קדמית לגשר וחיבור אונות.
  3. בודדו את צינור הלבלב (איור 5B). אתר את צינור הלבלב שבו הוא נכנס לתריסריון. קשרו את הצינור באמצעות שתי עניבות משי 3-0 והעבירו את הצינור בין הקשרים.
  4. כריתת פנקטומיה מלאה (איור 5C).
    1. נתחו את שארית אונת התריסריון מלולאת C של התריסריון עד שהיא ניידת באופן חופשי.
    2. להפריד את הלבלב מן המצורפים הנותרים שלה. בזהירות לקשור ולחלק את כלי הדם הקטנים מן העורק mesenteric העליון אל הלבלב.
    3. להפריד את הלבלב מן הווריד הפורטלי. לנתח את הגוף של הלבלב ואת האונה המחברת מן הווריד הפורטלי. קשרו את כל הענפים הורידיים מווריד הפורטל אל הלבלב, כולל וריד הטחול.
      1. חצו את גשר הלבלב בין האונה המחברת לאונה הטחולית כדי לאפשר ניוד חופשי מווריד הפורטל.
        הערה: יש להקפיד לא להפריע לאונה התריסריון של הלבלב מהאונה הטחולית.
  5. לטבול את הלבלב כולו בתמיסת UW סטרילית קרה, ולהניח את המיכל מיד על קרח. העבירו את הלבלב למכסה מנוע סטרילי לבידוד איונים. המשיכו עם בידוד איון הלבלב (איור 6).

7. קנולציה של צינור הלבלב

  1. הניחו את הלבלב על מגש סטרילי על קרח בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
  2. יש לנתח עודפי רקמה סיבית ודם הרחק מהלבלב.
  3. במידת הצורך, לחתוך את הצינור לרוחב כדי לדמיין טוב יותר את לומן. אתר וקדם את הצינורית לתוך הצינור עם קטטר בגודל מתאים (16 G).
  4. אבטחו את הצנתר במקומו עם עניבת משי 2.0 אך הימנעו מהסתרת הלומן.
  5. הכינו שלוש תמיסות טיהור והטביעו את הלבלב המשומר בכל תמיסת טיהור במשך 60 שניות.

8. זילוח וניפוח הלבלב

  1. הכינו את תמיסת עיכול האנזימים (איור 6).
    1. יש לערבב 100 מ"ג של תמיסות collagenase 1 ו-2 הזמינות מסחרית (ראו טבלת חומרים לפרטים נוספים) עם הכמות הרצויה של 1x HBSS ותמיסת 10,000 U הפרין. אם רקמת הלבלב המבודדת היא בין 100 גרם ל -200 גרם, ערבבו את האנזים עם 200 מ"ל בסך הכל של 1x HBSS ותמיסת הפרין.
  2. להחדיר את הלבלב עם פתרון אנזים.
    1. בכוח מתון מבוקר, להחדיר תמיסת אנזים ב 60 מ"ל בולוסים לתוך צינור הלבלב. המשך בתהליך זה עד שכל תמיסת האנזים מוחדרת ללבלב.
      הערה: עירוי יעיל אמור לגרום לרקמת הלבלב להתפוגג.
    2. אם תמיסת אנזים כלשהי דולפת מרקמת הלבלב לתוך המגש הסטרילי, הזריקו מחדש את התמיסה הנותרת ללבלב בשלב 8.3 או הניחו אותה בתא ריקורדי בשלב 9.2.
  3. יש להזריק ישירות כל תמיסת אנזים שנותרה לכל מקטעי פרנכימה של הלבלב שאינם מנופחים היטב באמצעות מחט 22 גרם.

9. עיכול הלבלב

  1. הניחו את המאגר המעגלי המכיל 500 מ"ל של HBSS 1x באמבט מים המוגדר לטמפרטורה של 47°C כדי לחמם מראש את תמיסת המאגר.
    הערה: תמיסת האנזים פועלת בצורה אופטימלית בטמפרטורה של 36-38 מעלות צלזיוס ויש להגיע לטמפרטורה זו תוך 5 דקות מהפעלת המשאבה הפריסטלטית. הטמפרטורה של התוכן של Ricordi, כולל הלבלב אנזים, הוא בתחילה 4 °C (75 °F). על ידי חימום מראש של מאגר המעגל ל -47 מעלות צלזיוס, תכולת המאגר ותא ריקורדי תתערבב, ותביא את טמפרטורת המעגל כולו ל 36-38 מעלות צלזיוס תוך 5 דקות מהפעלת המשאבה הפריסטלטית.
  2. מוציאים ומשליכים את הצנתר מצינור הלבלב וחותכים את הלבלב לחתיכות ~1-3 ס"מ.
  3. הכינו את מעגל העיכול. המשאבה הפריסטלטית תזרם תמיסה ממאגר מעגל העיכול, דרך סליל החימום, אל תוך תא ריקורדי (איור 6).
  4. מניחים את חתיכות הלבלב עם תשע גולות סיליקון ניטריד בקוטר 1.5 ס"מ בתוך תא ריקורדי וממלאים עד רמת המסנן בתמיסת האנזים שנותרה.
  5. כדי לאטום את תא Ricordi, הניחו את מסנן הרשת ואטם הגומי, ולאחר מכן את המכסה על תא Ricordi. אבטחו את מכסה תא Ricordi על ידי הידוק הברגים וודאו שהחדר אטום היטב לפני שתמשיכו.
  6. הניחו את סליל החימום באמבט מים חמים בטמפרטורה של 47°C.
  7. הניחו את צינוריות הזרימה והזרימה לתוך מאגר מעגל העיכול המכיל 500 מ"ל של 1x HBSS.
  8. יש להפעיל את המשאבה בקצב זרימה של 450 מ"ל/דקה עד שכל התא מתמלא בתמיסת העיכול. הפחת את קצב הזרימה ל -100 מ"ל / דקה כאשר הנוזל מסתובב בתוך המעגל.
  9. נערו ידנית את תא העיכול כדי לעורר את הרקמה עם גולות סיליקון ניטריד.
  10. החל מ-8 דקות של עיכול, יש לקחת דגימה של 1 מ"ל ממאגר המעגלים עבור צביעת Dithizone (DTZ) כדי לעקוב אחר התקדמות העיכול.
    1. להכנת צביעת DTZ, יש להמיס 10 מ"ג DTZ ב-2 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    2. הוסף 10 μL של כתם DTZ מוכן 1 מ"ל של מדגם העיכול. בדוק את הדגימה תחת הגדלה של פי 4. האיים יופיעו בצבע אדום כהה עד שחור עם צביעת DTZ.
      הערה: העיכול מושלם כאשר רוב או כל האיים שנצפו הם "חופשיים" ושלמים, כאשר רקמת הצינר מפוזרת לצבירים קטנים יותר.
  11. כאשר העיכול הושלם, העבירו את הסליל לאמבט הקרח, הוציאו את צינורית הזרימה מהמאגר והגדילו את מהירות המשאבה ל 210-250 מ"ל / דקה. הניחו לרקמה המעוכלת להתנקז מתא ריקורדי אל מאגר המעגלים.
    הערה: אופייני לראות מעט מאוד רקמה שנשארת בתא ריקורדי לאחר העיכול. בדרך כלל, <10% מרקמת הלבלב הלא מעוכלת תישאר, אם כי זה עשוי להשתנות עקב גורמים ספציפיים לדגימה.
  12. לשקול את הרקמה הנותרת כדי לקבוע את היעילות של העיכול. מעבירים את הרקמה המעוכלת ממאגר המעגל לצינורות חרוטיים של 250 מ"ל שנשמרים קרירים על קרח.

10. אוסף רקמת הלבלב

  1. צנטריפוגה את רקמת הלבלב מעוכל בצינורות חרוטי 250 מ"ל ב 250 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C ללא בלימה.
  2. מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה בזהירות ושאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית תוך הימנעות משיבוש הכדורית.
  3. השהה מחדש את הכדוריות בכל צינור חרוטי בעדינות ושלב אותן לצינור חרוטי אחד של 250 מ"ל. אם יש ≤50 מ"ל של רקמה, להשעות מחדש את הגלולה לנפח כולל של 100 מ"ל בתמיסת איסוף Islet. אם יש >50 מ"ל של רקמה, להשעות את הגלולה לנפח כולל של 200 מ"ל בפתרון איסוף Islet. במקרה כי מעל 100 מ"ל של רקמה נאסף, להפעיל שני מחזורי טיהור מעבד התא.
  4. השהה מחדש את הרקמה בתווך RPMI כדי ליצור נפח כולל של 100 מ"ל (בהנחה שנאספו 50 מ"ל רקמה) וטען במעבד התא.

11. טיהור איילט בשיטת שיפוע רציף

  1. הגדר את מעבד התא בהתאם להוראות היצרן.
  2. טען 125 מ"ל של תמיסת שיפוע בצפיפות גבוהה לתוך לשעבר השיפוע הרציף, ולאחר מכן טען את תמיסת השיפוע בצפיפות גבוהה למעבד התא באמצעות משאבה המוגדרת במהירות של 200 מ"ל/דקה.
  3. הפעל את פונקציית הצנטריפוגה של מעבד התא במהירות 1,000 סל"ד.
  4. שחרר את האוויר מהמערכת ובצע פריים מחדש באמצעות פתרון שיפוע בצפיפות גבוהה.
  5. הוסף 125 מ"ל של תמיסת שיפוע בצפיפות גבוהה ו- 130 מ"ל של תמיסה בצפיפות נמוכה לקודמת ההדרגתית.
  6. לטעון את 100 מ"ל של השעיית רקמות מעוכל.
  7. הגדל את מהירות מעבד התא ל-2,000 סל"ד למשך 3 דקות.
  8. הכינו 16 50 מ"ל צינורות חרוטיים לאיסוף שברי איון מטוהרים. הוסף 25 מ"ל של מדיום RPMI לכל צינור וסדר את כל הצינורות בסדר עולה.
  9. אסוף את שברי האיון המטוהרים בצינורות החרוטיים המוכנים.

12. הערכה וצביעה של האי

  1. אספו אליציטוטים של 100-200 μL מכל אחד משברי האיון המטוהרים והניחו אותם בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות לצביעת DTZ כדי להעריך את תכולת האיונים ומכל חלק טיהור. בדוק כל שבר באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה פי 4. האיים יופיעו בצבע אדום כהה עד שחור עם צביעת DTZ.
  2. לאחר זיהוי האיונים, בחר את השברים עם התוכן הגבוה ביותר של איונים. צנטריפוגה את החלק המטוהר ב 250 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C ללא בלימה.
  3. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת האיון במצע גידול האיונים. העבירו את האיים המטוהרים ל-1-4 צלוחיות תרבית T-125.
  4. לאחר הטיהור, העריכו את האיים מבחינת כמות, כדאיות ותפקוד.
    1. השתמשו במונה תאי איון כדי להעריך את מספר האיון ואת התפלגות הגודל (איור 7A). לבלב שלם יניב בדרך כלל 1-2 מיליון שווה ערך לאיונים.
    2. לצביעת כדאיות, ערבבו 2 μL של calcein AM ו-2 μL של ethidium homodimer-1 (CaAM/EthD-1) עם 1,000 μL של PBS (איור 7B). הניחו לאיים להיות מוכתמים למשך 30 דקות, ולאחר מכן העריכו אותם בהגדלה של פחות מפי 4 או 10. איים בני קיימא יכתימו בירוק בעוד איים שאינם בני קיימא יכתימו באדום.

13. תרבית תאים של איי הלבלב

  1. במהלך 48 השעות הראשונות, תרבית את האיים במדיום התאוששות ב 37 ° C כדי לספק מספיק חומרים מזינים (~ 1,000 איים / מ"ל של מדיום התאוששות).
  2. מימים 2-21, תרבית את האיים במדיום גידול סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מערך הניתוח והלפרוטומיה של קו האמצע מוצגים באיור 1. חתך הלפרוטו צריך להיות מעוקל כדי למנוע את פתח האורגניטל (איור 1B). בעת הגדרת ה- retractor, חבר את העמוד עבור Omni או Bookwalter retractor לפינה השמאלית והנחותה של השולחן. נסיגה אידיאלית כוללת שני להבים נשלפים עבור דופן הבטן הימנית, שניים עבור דופן הבטן השמאלית, ו-1-2 עבור המעי הגס הימני והמעי הדק העטופים במגבת סטרילית (איור 1C). ניתן להשתמש בלהבי קיר גוף, ספלנצ'ניים או נשלפים, בהתא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השתלת איון לבלב באמצעות תורמים חזיריים היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בסוכרת מסוג I. בידוד האיון הוא מאתגר, והכדאיות והתשואה הסופית של האיון רגישים מאוד ללחץ דם נמוך ולאיסכמיה רקמתית בה נתקלים במהלך רכישת איברים16,17. כדי לייעל את הרכישה והשימור של הלבלב, פרוטוקול זה מציג שיטה חדשה לקנולציה של אבי העורקים, בידוד הקרביים והזלוף במהלך רכישת הלבלב החזירי לפני בידוד האיונים.

הצלחת בידוד האיון החזירי תלויה ברכי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

תודות

כתב יד זה נתמך על ידי מענק חדשנות קלינית מקרן ההשתלות של מרכז אמריקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 M NaOH, 100 מ"לMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 מ"ל (15 עד 30 מעלות; C)תרמו פישר14065056
1x D-PBS, 500 מ"לתרמו פישר14200075
1x HBSS, 1 ליטרתרמו פישר14025076
250 מ"ל צינורות חרוטייםMillipore SigmaCLS430236-6EA
אמפוטריצין B [50 מ"ג]Millipore SigmaPHR1662
אנטיספטי פובידון יוד 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradient לשעברBioRad395
סידן כלוריד דיהידרטתרמו פישר10035-04-8
מעבד תאיםCOBE Ebay317690 
מאגר מעגל עיכול, בקבוק ג'יבקו, 1 ליטרתרמו פישר10341001
דימתילסולפוקסיד (DMSO)ThermoFisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
שיפוע ערכת חיבור לשעברBioRad1652008
Heparin [1000 U/mL]מוצרי רפואת חירום0409-2720-01
HEPES Buffer (1 מ '), 100 מ"לתרמו פישר15630080
סרום אנושי אלבומין 25%, 100 מ"לCelprogenHSA2001-25-1
IsofluraneCovetrusפריט#:11695067772
קטמיןפטרסוןפריט #:07-894-8462
ליבראז (100 מ"ג)Millipore Sigma5401020001
חי/מת ערכת כדאיות/ציטוטוקסיותתרמו פישרL3224
לימפוליט 1.1 מדיה 500 מ"לCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 צינורותמאסטרפל96419-16
משאבה פריסטלטית MasterflexMasterflex 07522-30
PenStrep (2 מ"ג/מ"ל)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 מ"ג/מ"ל, 2.5 מ"ל/בקבוקון)Dornase Alfa8931278
Recovery Medium, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
מדיום תרבית סטנדרטי, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (טילטמין וזולאזפאם) הזרקה Cפטרסוןפריט #:07-894-6240
פתרון אוניברסיטת ויסקונסין (UW), 3 LGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
WaterbathSigma AlderichCLS6783-1EA
XylazinePattersonפריט #:07-891-6165

מקורות

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

איילטורים של הלבלבקסנוטרנספלנטציהקנולציה של אבי העורקיםשימור איבריםעיכול הלבלבטיהור איילטוריםסנטריפוגציה במדרגית
זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.