מאמר שיטה

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66381

⸱

16 בפברואר 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

במאמר זה

סיכום

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

תקציר

לרוב האורגניזמים החיים יש מקצבים צירקדיים, שהם תהליכים ביולוגיים המתרחשים בפרק זמן של כ-24 שעות ומווסתים רפרטואר מגוון של תהליכים תאיים ופיזיולוגיים, החל ממחזורי שינה-ערות ועד חילוף חומרים. מנגנון שעון זה מאמן את האורגניזם בהתבסס על שינויים סביבתיים ומתאם את הוויסות הזמני של אירועים מולקולריים ופיזיולוגיים. בעבר, הוכח כי מקצבים צירקדיים אוטונומיים נשמרים אפילו ברמת התא הבודד באמצעות קווי תאים כגון פיברובלסטים NIH3T3, אשר סייעו בחשיפת המנגנונים של מקצבים צירקדיים. עם זאת, קווי תאים אלה הם תרביות הומוגניות חסרות רב-תאיות ותקשורת בין-תאית חזקה. בעשור האחרון נעשתה עבודה נרחבת על פיתוח, אפיון ויישום של אורגנואידים תלת-ממדיים, שהם מערכות רב-תאיות במבחנה המזכירות מבנים ופונקציות מורפולוגיות in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול לזיהוי מקצבים צירקדיים באמצעות כתב ביולומינסנטי באנטרואידים של מעיים אנושיים, המאפשר לחקור מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות במבחנה.

מבוא

שעון ביולוגי
לכל האורגניזמים, מחיידקים ועד יונקים, יש מערכת יחסים מורכבת ודינמית עם סביבתם. בתוך מערכת יחסים זו, הסתגלות לשינויים סביבתיים היא קריטית להישרדותם של אורגניזמים. לרוב האורגניזמים יש מקצבים צירקדיים המאפשרים להם להסתגל ולייעל את תפקודיהם למחזורים יומיים של כ-24 שעות. השעון הצירקדי הוא רשת היררכית של שעונים מרכזיים והיקפיים הפועלים בשיתוף פעולה כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגי ולשמור על אורגניזמים מסונכרנים עם שינויים יומיים 1,2. ביונקים, השעון המרכזי או השעון הראשי הממוקם בגרעין העל-תצלומי (SCN) מקבל רמזים חיצוניים, כגון אור, ומעביר את המידע לשעונים ההיקפיים באמצעות משחק גומלין מתקדם של מסלולי איתות עצביים והומורליים3. בנוסף לשעון המרכזי, לרקמות היקפיות יש מנגנון שעון ביולוגי תאי אוטונומי משלהן, המתוחזק על ידי לולאת משוב שלילי שעתוק תרגומי (TTFL) המווסתת גנים מבוקרי שעון ספציפיים לרקמות (CCGs)4,5. מנגנון מולקולרי זה מייצר ריתמיות של כ-24 שעות באירועים תאיים ופיזיולוגיים, כגון ביטויי גנים, מסלולי איתות, תגובות חיסוניות ועיכול. השעון הצירקדי קיים כמעט בכל תאי היונקים, והוכח כי עד 50% מדפוסי הביטוי של הגנים מפגינים שעון ביולוגי6. בהתחשב בשפע של CCGs, שיבוש של מנגנון שעון זה עלול לגרום לבעיות פיזיולוגיות קריטיות. לפיכך, חקירות של מקצבים צירקדיים נחוצות כדי להבהיר מנגנונים ביולוגיים חיוניים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות.

מערכת הכתבים Luciferase
במחקרים צירקדיים, ניטור בזמן אמת הוא קריטי להבנה טובה יותר של התנהגויות ותגובות תאיות מכיוון שהוא מאפשר מעקב אחר שינויים זמניים בביטוי גנים ו / או ברמות החלבון, ומספק תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים המווסתים על ידי השעון הצירקדי. יתר על כן, ניטור בזמן אמת מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינויים סביבתיים על מנגנונים מולקולריים 7,8. ישנן טכניקות רבות למחקרי ניטור בזמן אמת, כולל בדיקת ביולומינסנציה, אשר נמצאת בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר ביטוי גנים או רמות חלבון לאורך זמן. בדיקת ביולומינסנציה היא שיטה לזיהוי תהליכים ביולוגיים באמצעות ייצור אור כקריאה. בבדיקה זו, אנזים חמצוני המייצר ביולומינסנציה (למשל, לוציפראז) מועתק באופן זמני או יציב לתאים מעניינים, וקריאת הביולומינסנציה נמדדת בנוכחות מצע (למשל, לוציפרין) לאורך זמן. לדוגמה, האנזים luciferase מייצר bioluminescence על ידי חמצון המצע luciferin בנוכחות ATP9. בשל זמן מחצית החיים הקצר שלו, 3-4 שעות10, Firefly luciferase הוא כלי רב עוצמה למחקרים צירקדיים במונחים של מתן ניטור דינמי בזמן אמת עם רעש רקע מינימלי 11,12,13. עבור החדרת DNA עם מקדם מתויג luciferase או מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מערכת העברת גנים lentiviral היא שיטה אמינה המספקת יעילות התמרה גבוהה, אינטגרציה יציבה, אימונוגניות נמוכה. התמרה יציבה של כתב ביולומינסנט מספקת ביטוי חזק בתאים מתחלקים ולא מתחלקים, ומייצרת נתונים עקביים עבור מחקרים צירקדיים14.

אורגנואיד כמודל
קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים בני אלמוות סייעו במחקרים ביולוגיים, החל מחשיפת מנגנונים מולקולריים בסיסיים של מקצבים צירקדיים וכלה בבדיקת תרופות. למרות הנוחות של ניצול קווי תאים הומוגניים, הם חסרים מבנים רב-תאיים ואינטראקציות בין-תאיות. לעומת זאת, אורגנואידים הם מבנים "דמויי איברים" רב-תאיים במבחנה תלת-ממדית המחקים את מבנה האיברים בצלוחית על ידי הצגת דמיון לארכיטקטורה ורב-תאית של רקמות in vivo, כולל גזע, אב וסוגי תאים ממוינים15,16. תכונות של ארגון עצמי, רב-תאיות ופונקציונליות הופכות את האורגנואידים למודל יוצא דופן במבחנה המייצג את התהליכים התאיים והפיזיולוגיים המתרחשים ברקמות אמיתיות17. ניתן להפיק סוגים שונים של אורגנואידים מתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות התמיינות מכוונת או מתאי גזע בוגרים שנקצרו מאיברים שונים, כולל המעי הדק, המוח, הכבד, הריאות והכליות18,19. מאחר שלמבנים אורגנואידים יש ארכיטקטורה אמיתית דמוית רקמה והם מתפקדים עם רב-תאיות ואינטראקציה דינמית בין תאים, הם עדיפים על קווי תאים הומוגניים להבנת האירועים התאיים המתרחשים ברקמות in vivo. אורגנואידים גם ניתנים למניפולציה בקלות וניתן לגדל אותם בתנאים מבוקרים, מה שהופך אותם לשימושיים למחקרים צירקדיים20.

המטרה העיקרית של עבודה זו היא להציג שיטת ניטור בזמן אמת באמצעות בדיקת ביולומינסנציה המותאמת במיוחד לחקר מקצבים צירקדיים באורגנואידים תלת-ממדיים רב-תאיים. ניטור בזמן אמת של אירועים תאיים באמצעות טכניקת בדיקת ביולומינסנציה בוצע באופן נרחב עבור תרביות תאים חסרות את המורכבות הרב-תאית והתקשורת הבין-תאית הקיימת ברקמות אמיתיות. אורגנואידים תלת-ממדיים מציגים הזדמנויות ייחודיות לחקור את תפקודי המקצבים הצירקדיים במערכות רב-תאיות במבחנה. לדוגמה, אפשר לחקור מקצבים צירקדיים באורגנואידים עם הרכב תאים שונה או אורגנואידים שמקורם ברקמות החולות של החולים. פרוטוקול זה מאפשר שימוש בבדיקת ביולומינסנציה כדי לחקור היבטים שונים של מקצבים צירקדיים במודל מבחנה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, אורגנואידים, אשר יסייע לנו להבין טוב יותר את תפקידי המקצבים הצירקדיים באיברים היקפיים.

פרוטוקול

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות ליצירת HIEs אושרו על ידי IRB ב- CCHMC (IRB #2014-0427). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

הערה: כדי להמחיש את ההליך המתואר בפרוטוקול זה, השתמשנו באנטרואידים של המעי האנושי Bmal1-luc (HIEs). אנטרואידים אלה עברו התמרה לנטיויראלית יציבה22 עם פלסמיד כתב pABpuro-BluF, המכיל את מקדם Bmal1 מאוחה ללוציפראז, המראה את הפעילות של מקדם Bmal1 21.

1. התמרה Lentiviral

  1. בצע את ההתמרה הלנטיויראלית22 בתנאים מועשרים בתאי גזע עבור HIEs. באופן ספציפי, יש לוודא היווצרות ספרואידים ב-HIE תוך 3-4 ימים לאחר המעבר במצע גדילת המעי, מה שיוצר תנאים מועשרים בתאי גזע.
  2. לאחר הטרנסדוקציה הלנטיויראלית22, בצע סלקציה אנטיביוטית עם 2 מיקרוגרם / מ"ל פורומיצין, לשחזר את HIE עמיד puromycin, ולהעביר אותם עם צפיפות גבוהה יחסית (כלומר, 1 באר לתוך 2 בארות) עבור 2-3x. אם קצב הגדילה של HIEs איטי, הוסף מעכבי ROCK של 10 מיקרומטר (Y-27632) ומעכב GSK-3 של 10 מיקרומטר (CHIR-99021) למדיום הגידול של אורגנואיד המעי.

2. הכנת אורגנואידים לבדיקת ביולומינסנציה

  1. יום 1: מעבר לכלים עגולים בקוטר 35 מ"מ.
    1. בקצרה, להרחבת HIEs, ערבבו את ה-HIEs עם מטריצת תרבית תלת-ממדית מופחתת גורמי גדילה (GFR) וזרעו אותם על לוחות של 24 בארות עם שלוש טיפות של 10 μL של מטריצת תרבית תלת-ממדית לכל באר. מוסיפים 350 μL של מדיום הגידול HIE ומשנים אותו כל יומיים.
      הערה: צפיפות HIE במטריצת התרבית התלת-ממדית היא קריטית לצמיחת אנטרואידים. בערך, מספר הספרואידים צריך לעלות על יותר מ -50 בכל טיפה. אם המספר נמוך, קצב הצמיחה של HIE מושפע לרעה.
    2. כאשר HIEs גדלים מספיק (כ -7 ימים לאחר המעבר), לאסוף HIEs מארבע בארות לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל.
    3. שטפו את ה-HIEs עם PBS הקר באמצעות מיני צנטריפוגה (2,000 × גרם) לסחרור מהיר של 40 שניות כדי להסיר פסולת ומטריצת תרבית תלת-ממדית מוגזמת על ידי פיפט.
    4. הוסף 0.5 מ"ל של PBS קר לתוך הגלולה ולהחיל מערבולות פיזיות על ידי מזרק עד 10x עם מזרק אינסולין 1 מ"ל כדי לנתק את HIEs.
    5. סובב את ה- HIE המנותקים עם מיני צנטריפוגה כמו בשלב 2.1.3 והסר בעדינות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט. לאחר מכן, הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה עם גלולת HIE על קרח כדי להתקרר למשך כ-3 דקות.
    6. הוסף מטריצת תרבית תלת ממדית GFR לצינור המיקרוצנטריפוגה וערבב אותה עם גלולת HIE.
      הערה: חשב את כמות מטריצת התרבית התלת-ממדית בהתבסס על מספר הכלים העגולים בקוטר 35 מ"מ שישמשו לניסוי. בדרך כלל אנו זורעים 30 μL של טיפות מטריצת תרבית תלת ממדית לכל מנה עגולה.
    7. זרעו את תערובת ה-HIE ואת מטריצת התרבית התלת-ממדית במרכז התבנית העגולה בקוטר 35 מ"מ ודגרו על המנה בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות כדי לחזק את מטריצת התרבית התלת-ממדית.
      הערה: צפיפות הזריעה צריכה להיקבע באופן ניסיוני. בהתבסס על עוצמת הביולומינסנציה, ניתן לקבוע את מספר ה-HIE במהלך תהליך זה.
    8. מוסיפים 2 מ"ל של מצע גידול אורגנואיד מעיים שחומם מראש לכל מנה ודגרים על הכלים באינקובטור CO2 עד לשלב הבא.
  2. יום 3: התחלת בידול
    1. כדי ליזום בידול של HIEs, להסיר את מדיום הגידול ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום בידול מחומם מראש.
      הערה: ראה טבלה 1 למתכונים של אמצעי הבידול HIE23.
  3. יום 4: אין צורך בתהליך נוסף.
  4. יום 5: להחליף את המדיום של enteroids עם 2 מ"ל של מדיום התמיינות מחומם מראש.
  5. יום 6: סנכרון שעון ורישום ביולומינסנציה
    1. כדי לסנכרן את השעון המולקולרי של אנטרואידים, הוסף 2 μL של 100 μM dexamethasone (Dex) כדי להפוך את הריכוז הסופי 100 ננומטר בכל צלחת ולאחר מכן לדגור את הכלים באינקובטור CO2 (37 ° C, 5% CO2) במשך 1 שעות24.
    2. במהלך איפוס Dex, הכינו את לומנומטר הדגירה. בדוק את CO2 ואת הטמפרטורה של לומנומטר הדגירה ולהגדיר 5% ו 37 ° C, בהתאמה.
      הערה: מומלץ לנגב את החלק הפנימי של לומנומטר הדגירה עם 70% אלכוהול לפני ואחרי כל שימוש במכונה כדי לשמור על סטריליות.
    3. לאחר סנכרון השעון, לחדש את enteroids עם 3 מ"ל של מדיום הבחנה מחומם מראש המכיל 200 מיקרומטר D-luciferin.
      הערה: מכיוון שלוציפרין רגיש לאור, יש לעטוף את המדיום המכיל לוציפרין בנייר כסף ולחמם אותו מראש באמבט חום של 37 מעלות צלזיוס לפני החלתו על המנה.
    4. מניחים את הכלים בשולחן כלים בן 8 בארות של הלומנומטר הדוגר ומכסים את שולחן הכלים לדוגמה במכסה. הניחו שני תאי אדים עם רקמה רטובה או ספוג על החלק העליון של שולחן הכלים לדוגמה. זהו תהליך חד פעמי.
      הערה: לאחר תחילת הניסוי, יש לשמור על מכסה הלומנומטר הדוגר סגור עד לסיום הניסוי. הקפידו להרטיב מספיק את הרקמות/ספוגים.
    5. סגור את מכסה המכונה והתחל את התוכנית למדידת ביולומינסנציה למספר הימים והרזולוציה הרצוי.
      1. בתוכנה, בחר את הגדרות התנאי על ידי לחיצה על הכרטיסייה תנאי והתאם את ההגדרות בחלונית זו: מספר מנות, זמן מדידה, עיבוד רקע וסוג סינון.
        הערה: עבור הדגמה זו, בחרנו את כל הכלים מ A עד H; זמן מדידה ברירת מחדל, אשר נקבע על ידי התוכנה בהתבסס על מספר המנות; זמן המתנה לעיבוד רקע, וסוג מסנן F0. מכיוון שיש שלוש אפשרויות סינון, ניתן למדוד שלושה צבעים זוהרים בו זמנית.
      2. לאחר הזנת כל ההגדרות המתאימות בהתבסס על הניסוי, שמור את ההגדרות בלחיצה על אישור.
      3. כדי להתחיל להפעיל את הניסוי, לחץ על הכרטיסיה הפעלה | לחצן התחל (סמל משולש ירוק). התבונן בנתונים כגולמיים, מסוננים לרעש או כלא מגמתיים על-ידי ביצוע בחירות מתאימות בחלק העליון של מסך התוכנה בעת הפעלת ניסויים. לחץ על הכרטיסיות Raw, Noise Filtered או Detrended כדי לצפות בנתונים שנבחרו.
      4. שימו לב לאותות עד 5 ימים.
        הערה: לאחר 5 ימים של ניטור בלומינומטר דגירה, אנטרואידים עלולים להתחיל למות עקב דלדול מדיה. כדי למנוע הפרעה צירקדית אפשרית במהלך הניסוי, איננו מבצעים שינוי מדיה למשך הניסוי.
      5. בסוף הניסוי, עצור את הריצה על-ידי לחיצה על לחצן עצור (סמל הריבוע הכחול), עבור אל הכרטיסיה קובץ ולחץ על שמירה בשם. שמור את הנתונים בפורמט Kronos; יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני במקטע קובץ על-ידי לחיצה על האפשרות קובץ ולאחר מכן בחירה באפשרות יצא כתבנית Excel תחת קובץ לניתוח נוסף.

תוצאות

רישום ביולומינסנציה נערך כדי להעריך את השעון הביולוגי של אנטרואידים במעי אנושי (HIEs) בשני תנאים נפרדים: תנאים מועשרים בתאי גזע באמצעות מדיום גידול אורגנואיד במעי (איור 3) לעומת תנאים מעוררי התמיינות, שהושגו על-ידי החלפת מדיום הגידול של אורגנואיד המעי במדיום התמיינות. ביום הניסוי, סנכרנו את השעונים הצירקדיים על ידי ביצוע טיפול של שעה אחת עם 100 ננומטר Dexamethasone. לאחר מכן, החלפנו את המדיום עם 3 מ"ל של מדיום גידול אורגנואיד המעי או מדיום התמיינות בתוספת 200 מיקרומטר D-Luciferin ויזמנו ניטור של פעילות bioluminescence. לאחר תקופת הקלטה של 4-5 ימים, ערכנו ניתוח התמרת פורייה מהירה (FFT) כדי לקבוע את תקופת המקצבים הצירקדיים הנצפים. איור 3 מראה את הדינמיקה הטמפורלית של פעילות מקדם Bmal1 בתנאים שהוזכרו לעיל. בתנאים מתמיינים, ביולומינסנציה Bmal1-luc הציגה תנודות צירקדיות חזקות עם מחזוריות ממוצעת של 22.92 שעות. לעומת זאת, HIEs הדגימו שיבושים בשעון הביולוגי בתנאים מועשרים בתאי גזע (איור 3). נתונים אלה מראים כי HIEs בתנאים מועשרים בתאי גזע אינם מראים תנודות צירקדיות חזקות. במילים אחרות, יש להעריך את ההשפעה של תנאי גדילה ביחס לשעון הביולוגי לפני שחוקרים פונקציות תלויות שעון ביולוגי באורגנואידים.

figure-results-1
איור 1: שרטוט סכמטי של הפרוטוקול. HIE מועברים לצלחות 35 מ"מ ביום הראשון ומתורבתים עם 2 מ"ל של מדיום גידול עד יום 3. ביום השלישי לאחר המעבר, המדיום מוחלף עם 2 מ"ל של מדיום התמיינות שחומם מראש כדי ליזום את ההבחנה של enteroids. שינוי בינוני חוזר על עצמו עם 2 מ"ל של מדיום שחומם מראש ביום 5 כדי למנוע דלדול תזונתי. ביום 6, אנטרואידים מטופלים עם 100 ננומטר Dexamethasone במשך 1 שעה עבור סנכרון שעון היממה. לאחר שעה, התקשורת מוחלפת עם 3 מ"ל של 200 מיקרומטר D-luciferin המכיל מדיום, ואת הכלים מותקנים luminometer הדגירה. לאחר הקלטת ביטוי הביולומינסנציה במשך 4-5 ימים, הניסוי מסתיים, והנתונים שנוצרו מיוצאים כגיליונות אלקטרוניים לניתוח נוסף. קיצור: HIE = אנטרואיד מעיים אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונה מייצגת של HIEs תחת מדיום צמיחה. התמונה צולמה על ידי מיקרוסקופ רחב שדה עם מטרה פי 25. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. קיצור: HIE = אנטרואיד מעיים אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: רישומי ביולומינסנציה מ-HIEs מתנאים מועשרים והתמיינות של תאי גזע. (A) Raw ו-(B) נתוני רישום ביולומינסנציה מגמתית של Bmal1-luc HIE בתנאים מועשרים בתאי גזע (אדום) והתמיינות (שחור). (C) תקופת תנודות Bmal1-luc ב-HIEs בתנאי התמיינות. התקופה מחושבת באמצעות ניתוח FFT; n = 3 עבור Bmal1-luc HIEs במצב מועשר בתאי גזע ו- n = 4 עבור Bmal1-luc HIE בתנאי התמיינות. קווי שגיאה מציינים SD. קיצורים: HIE = אנטרואיד מעיים אנושי; FFT = התמרת פורייה מהירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מתכוני מדיה בידול
שם מגיבחברהמספר קטלוגיריכוז סופיהערות
DMEM/F12 מתקדםלייף טכנולוגיות12634-028הוסף כרכיב האחרון. אם אתה מכין מדיה של 50 מ"ל, לאחר הוספת כל שאר הרכיבים, מלא את השאר עד 50 מ"ל עם DMEM/F12 מתקדם בסוף.
א 83-01סיגמא אולדריץ'SML0788500 נאנומטר
תוסף B-27 (50x)גיבקו17504-0441x
גסטרין I אנושיסיגמא אולדריץ'G902010 נאנומטר
גלוטמקסגיבקו350500611x
HEPESגיבקו1563008010 מ"מ
תוסף N-2 (100x)גיבקו17502-0481x
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא אולדריץ'A91651 מ"מ
NOGGIN מותנה בינוני5%מיוצר במעבדה
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו15140122100 U/מ"ל
מורין רקומביננטי EGFפפרוטק315-0950 נ"ג/מ"ל
R-SPONDIN מותנה בינוני10%מיוצר במעבדה

טבלה 1: הרכב אמצעי הבידול של HIE23.

דיון

בדיקת Bioluminescence מציעה מספר יתרונות לחקר מקצבים צירקדיים, הדורשים איסוף נתונים מניסויי מסלול ארוכי טווח. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר ביטוי הגן או החלבון המעניין בזמן שתאים נעים ומתרבים. מבלי לבצע התאמות מיותרות או לשבש את תפקודי התאים, ניתן לתעד אירועים תאיים מתעניינים או ביטוי גנים באמצעות קריאת ביולומינסנציה, המספקת נתונים אמינים בזמן אמת. חשוב לציין, בדיקת ביולומינסנציה מייצרת רעשי רקע מינימליים בהשוואה למבחני פלואורסצנטיות מכיוון שהיא מבוצעת בחושך מתמיד25. יתר על כן, בדיקת ביולומינסנציה עדיפה לניטור ארוך טווח מכיוון שהעירור המתמשך לבדיקת פלואורסצנטיות במשך מספר ימים עלול לגרום לפוטוטוקסיות גבוהה ולהלבנה פוטו-לבנה. עם זאת, בשל היעדר התרגשות אור, בדיקת bioluminescence מספק אות עמום יותר מאשר חלבונים פלואורסצנטיים26. זמן מחצית החיים הקצר של לוציפראז הופך אותו לעדיף למחקרים צירקדיים, וניתן לקצר אותו עוד יותר על ידי הוספת רצפים מערערי יציבות נוספים12.

למרות הצעת מספר יתרונות לניטור תאים חיים, לבדיקות ביולומינסנציה יש כמה מגבלות. למרות שבדיקת הביולומינסנציה מספקת קריאה חזקה לביטוי גנים זמני או ניטור חלבונים מאוכלוסיית תאים, הרזולוציה המרחבית שלה מוגבלת, מה שהופך אותה לפחות ישימה לניסויים האוספים נתוני לוקליזציה של חלבונים מתאים בודדים. בהתחשב ביתרונותיו ובחסרונותיו, בדיקת ביולומינסנציה עדיפה על שיטות אחרות, במיוחד למחקרים צירקדיים; הוא מציע פחות רעילות ורגישות גבוהה, מה שהופך אותו לאידיאלי לניטור לטווח ארוך.

יש לקחת בחשבון מספר גורמים קריטיים בשלב ההכנה לניסוי. בראש ובראשונה, יישום אסטרטגיית בחירה מתאימה להתמרה לנטיוויראלית הוא קריטי; במקרה שלנו, ביצענו 2 מיקרוגרם / מ"ל בחירת פורומיצין במשך שבועיים. ביצוע לקוי של הסלקציה עלול לגרום למספר לא מספיק של אנטרואידים המחזיקים את פלסמיד המדווח, מה שמניב רמות ביטוי לוציפראז לא עקביות. צפיפות זריעה אופטימלית חשובה לא פחות; צפיפות יתר עלולה לגרום לדלדול מוקדם מדי של חומרי מזון במהלך הניסוי מכיוון שאין תחליף בינוני לאחר תחילת רישום ביולומינסנציה. לעומת זאת, צפיפות נמוכה של HIEs עלולה לגרום לתפוקה ביולומינסנטית מופחתת, ובכך להשפיע על החוסן של הקריאה. הבטחת סביבה מתאימה לאנטרואידים במהלך ניטור היא בסיסית לאמינות תוצאות הניסוי. שמירה על תנאים אופטימליים, כוללCO2, טמפרטורה ורמות לחות, היא קריטית לשמירה על HIEs, ומקדמת את החוסן של תהליכים תאיים בתוך האנטרואידים. סטיות מהטמפרטורה האופטימלית ומרמותCO2 יכולות להשפיע על חילוף החומרים בתאים ועל מסלולי האיתות, ולהשפיע על השעון הביולוגי. רמות לחות נאותות חשובות באותה מידה, מניעת התייבשות ושמירה על שלמות מבנית של אנטרואידים. לפיכך, תשומת לב קפדנית לתנאי הסביבה היא קריטית לדיוק של מודל הניסוי והמחקרים הצירקדיים המערבים אנטרואידים.

סנכרון שעון חיוני למחקרים צירקדיים מכיוון שהוא מיישר את השעון הצירקדי הפנימי של תאים בודדים, ומבטיח שהם נמצאים במצב מאוחד ומתואם. סנכרון זה הכרחי לתצפית מדויקת וניתוח של השעון הביולוגי ברמה של תרבית שלמה. בפרוטוקול זה, ביצענו סנכרון שעון עם 100 ננומטר Dexamethasone (Dex). ייתכנו חששות מסוימים לגבי השפעתו של דקס על מבנה התא או תפקודו. מחקרים קודמים מצביעים על כך שקורטיקוסטרואידים משפרים את תפקוד מחסום האפיתל באנטרואידים27. עם זאת, חשוב להדגיש כי פנוטיפ זה הוא ציין לאחר טיפול enteroids עם 10 μM prednisolone במשך 12 שעות. אנו מצפים כי טיפול קצר של שעה אחת בדקסמטזון לא יגרום לשינויים משמעותיים ביחס למבנה ולתפקוד של תאים בתוך אנטרואידים.

ניטור הפעילות הביו-לומינסנטית של תרבית אורגנואידים במקום תרבית חד-תאית הומולוגית הוא בעל חוזקות ייחודיות. ראשית, סוגי תאים מרובים מתקשרים זה עם זה בתרבית אורגנואידים כמו ברקמת in vivo , בעוד שתרבית תאים דו-ממדית טיפוסית מנטרת ביטוי גנים המעוניינים בכך במעין סביבה מבודדת המורכבת מסוג תא יחיד. תרבית אורגנואידים מספקת תוצאות מציאותיות יותר עם אינטראקציות רב-תאיות ומסלולי איתות. אינטראקציה בין תאים היא קריטית, במיוחד עבור מחקרי התמיינות ומסלולים בין-תאיים, הדורשים תרבית תאים הטרוגנית28. התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-HIEs במצב המובחן מראים תנודות צירקדיות חזקות אך משבשים את השעון הביולוגי במצב מועשר בתאי גזע. נתונים אלה מצביעים על עיצוב מחדש פוטנציאלי של מנגנון השעון הביולוגי מתאי גזע בוגרים לתאים ממוינים. לסיכום, אורגנואידים עם כתב ביו-לומינסנטי צירקדי מאפשרים לחקור מקצבים צירקדיים במערכת רב-תאית במבחנה ולחשוף פונקציות של מקצבים צירקדיים באופן רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

אנטרואידים במעי האנושי התקבלו ממעבדתו של ד"ר מייקל הלמראת במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי (CCHMC). עבודה זו נתמכה על ידי R01 DK11005 (CIH) ומימון פיילוט של מרכז הסרטן באוניברסיטת סינסינטי. אנו אסירי תודה על תמיכת הדמיה מאוניברסיטת סינסינטי Live Microscopy Core (NIH S10OD030402).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
35 x 10 צלחות תרבית רקמות פלקוןפישר סיינטיפיק08-772A
A 83-01סיגמא אולדריץ'SML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
תוסף B-27 (50x)Gibco17504-044
BD מזרקי אינסולין מיקרו-פיין IV פישרסיינטיפיק14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122מעכב GSK-3
דקסמתזוןסיגמא אולדריץ'D4902-500MG
D-לוציפרין (מלח אשלגן)Cayman Chemical14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
גורם גדילה מופחת (GFR) מטריג'לקורנינגCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (אנושי)טכנולוגיות תאי גזע06010מורכבות מ-IntestiCult OGM מדיום בסיסי אנושי, 50 מ"ל ותוסף אורגנואיד, 50 מ"ל. מערבבים את שניהם כיחס של 1:1 לשימוש כמדיום גידול אורגנואיד במעי
Kronos Dio Luminometer MachineATTO CorporationAB-2550
N-2 תוסף (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF מדווח פלסמידAddgene46824
PBS ללא סידן ומגנזיוםקורנינג21-040-CV
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122
עכבר רקומביננטי EGFPeproTech315-09
Y-27632R& מעכב D Systems1254/10ROCK

מקורות

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288(2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973(2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338(2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531(2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136(2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.