ייצור של ערוצים Microfluidic תרמופלסטיים

סיכום

כאן אנו מדגימים כיצד לייצר שבבי microfluidic תרמופלסטיים באמצעות הבלטות חם ואיטום חום. ואז אנחנו מדגימים כיצד להשתמש במשטח אור באתרו מכוון השתלת ו פילמור באמצעות שבב האטום כדי ליצור את העמודות מרוכבים שלב מוצק.

תקציר

במעבדה שלנו, יש לנו בהצלחה מבודד חומצות גרעין ישירות כרכים microliter ו submicroliter של שתן אנושי דם, צואה באמצעות פולימר / nanoparticle תמוגה microscale מרוכבים מוצק מיצוי עמודות שלב. דגימות שנמצאו מרוכזים, דגימות נפח קטן, כי הם PCRable, ללא ניקוי נוסף. כאן, אנו מדגימים כיצד לייצר שבבי microfluidic תרמופלסטיים באמצעות הבלטות חם ואיטום חום. ואז, אנחנו מדגימים כיצד להשתמש במשטח אור באתרו מכוון השתלת ו פילמור באמצעות שבב האטום כדי ליצור את העמודות מרוכבים שלב מוצק. אנו מדגימים השתלת ו פילמור של עמודה פחמן Nanotube / פולימר מרוכבים עבור תמוגה תא החיידק. לאחר מכן, אנו מראים את תהליך תמוגה ואחריו מיצוי שלב מוצק של חומצות גרעין מן המדגם על שבב באמצעות סיליקה / טור פולימר מרוכב. הפרוטוקולים המצורף מכיל הוראות מפורטות כיצד להכין גם תמוגה מוצק מיצוי עמודות שלב.

פרוטוקול

ערוצי microfluidic מיוצרים polyolefin מחזורית (Zeonex ® 690R, Zeon כימיים בע"מ, Louisville, KY). Zeonex יש טמפרטורה זכוכית המעבר (ט _ז) 136 ° C ו-UV היא שקופה, אשר חיוני עבור כימיה מכוונת את האור משמש להיווצרות מונולית נקבובי. Microchannels מיוצרים על ידי מיקרו חם הבלטות עם עובש אב electroformed ניקו, אשר השלילי (הפוך) התכונות של הפלטפורמה microfluidic. הבלטות חם מתבצע כדלקמן:

1. עובש ואת המצע פולימר ממוקמים בין שני platens מתכת מקבילים.
2. Platens מחוממים עד לטמפרטורה הבלטות (166 ° C), המהווה 30 מעלות צלזיוס מעל T _g של Zeonex.
3. Platens נלחצים אז יחד כ 5 דקות והלחץ נשמר 250 psi.
4. עובש ואת המצע יוסרו אז מן platens מחוממת, מותר לקרר 1-2 דקות, ולאחר מכן מופרדים אחד מהשני באופן ידני.
5. וולס בקוטר 1.5 מ"מ הם קדחו בקצות ערוצי הקדמה מדגם האוסף.
6. מצע הפלסטיק בולטות לאחר מכן מלוכדות תרמית עם חתיכה נוספת של Zeonex ליצור ערוצי microfluidic סגורה. המצע בולטות ואת פיסת ניתן לכסות-UV האוזון או פלזמה שטופלו לפני מגע תרמי כדי לשפר את היעילות איטום להבטיח את נאמנות של המבנה ערוץ סגורה (Bhattacharyya ו Klapperich, 2007).

המצאה של טור מוצק שלב החילוץ (SPE) בתוך ערוצי microfluidic פלסטיק

המצאה של שלב מוצק הוא תהליך בן שני שלבים. בתחילה, microchannels מפוברק הם פני השטח שונה על מנת לשפר את הידבקות של הטור SPE למכשיר פלסטיק. השתלת דרך photopolymerization השטח משמש functionalize קירות microchannels פולימריות.

הליך השתלת הוא כדלקמן:

1. Microchannels מלאים תערובת 01:01 של diacrylate אתילן (EDA) methacrylate מתיל (MMA) עם benzophenone 3%, המהווה photoinitiator מימן הפשטה. , EDA MMA ו benzophenone נרכשים מבית סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי.
2. השבב ואז-UV מוקרן במשך 10 דקות באורך גל 254 ננומטר UV ו 200 mJ / ² ס"מ אנרגיה מכשיר חשיפה אולטרה סגול (CL-1000 Crosslinker UV, UPV Inc, Upland, CA). השתלת מתרחשת באמצעות פילמור H-הפשטה תוצאות משטח קשור שרשראות הפולימר, אשר מקבל שולבו בתוך התערובת פילמור משמש להכנת מונולית בשלב השני.
3. מונומר עודף יוסר הערוצים ע"י שטיפה μL 15 של מתנול באמצעות שאיפת אבק.

לאחר תהליך photografting, microporous פולימר מונולית נוצר בתוך microchannels כי ללכוד חלקיקי סיליקה להפקת DNA. מונולית נקבובי מוכן באתרו כדלקמן:

1. ערוצי משטח שונה מלאים בתערובת המורכבת מבשר מונולית בומה (15% wt), EDMA (10% wt), 1-dodecanol (52.5% wt), cyclohexanol (22.5% wt), DMPAP (wt 1% ביחס כדי מונומרים) ו 0.7 חלקיקי סיליקה מיקרומטר (15% ביחס להיקף הכולל של התערובת מראש הפולימר). סיליקה microspheres נרכשו מ Polysciences, Inc (וורינגטון, הרשות הפלסטינית) לבין מונומרים ממיסים porogenic נרכשים מבית סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי.
2. השבב הוא מוקרן עם UV ב crosslinker UV ב 200 mJ / cm ² דקות 1.1 ליזום פילמור, ואת עודף מונומר יוסר הערוצים ע"י שטיפה μL 15 של מתנול באמצעות שאיפת אבק.
3. הקשרים fluidic ^(TM NanoPorts קשרים, אפצ'רץ' מדעי, Oak Harbor, WA) מחוברים אז על כניסתה ובארות אוסף של הערוצים microfluidic.
4. מונולית נקבובי נשטף אז שוב לפחות 30 דקות באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימת 100mL/hour עם מתנול.

המצאה של CNT תמוגה מונולית בתוך ערוצי microfluidic פלסטיק

ייצור של (Nanotube פחמן) CNT תמוגה מונולית הוא תהליך בן שני שלבים. ראשית, microchannels מפוברק הם משטח שונה (מורכבים) באופן זהה עבור העמודות SPE במכשיר הפלסטיק.

לאחר תהליך photografting, microporous פולימר מונולית נוצר בתוך microchannel כי היא ספוגה רב חומה פחמן. מונולית נקבובי מוכן באתרו כדלקמן:

1. Multi קירות צינורות הם resuspended ב cyclohexanol בריכוז של 2.27M. Resuspension זה ultrasonicated במשך 30 דקות על משרעת 50% מחזור של 50% עם המשבש תא sonifier (Sonifier S-250ד ', מיוצרים על ידי ברנסון Ultrasonic, Danbury, CT). Sonication בתנאי מתלה 0.5m יעיל ויציב של CNTs. CNTs נרכשו מ Nanolabs (Brighton, MA).
2. ערוצי משטח שונה מלאים תערובת מונולית דומה מבשר אלא שכעת הפתרון של cyclohexanol + CNTs משמש. התערובת מורכבת מונולית בומה (15% wt), EDMA (10% wt), 1-dodecanol (52.5 wt%), ו cyclohexanol + CNTs (22.5 wt%). כדי שפתרון זה DMPAP photoinitiator נוסף (1.13% wt ביחס מונומרים). מונומרים, ממיסים porogenic ו DMPAPA נרכשים מבית סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי.
3. השבב הוא מוקרן עם UV ב crosslinker UV ב ² 120 mJ / 0.9 ס"מ דקות ליזום פילמור. המכשיר הוא התהפך 180 מעלות crossliker ו מוקרן על 0.9 דקות אחר ב 120 mJ / ² ס"מ. מונומר עודף יוסר הערוצים ע"י שטיפה μL 50 של מתנול באמצעות שאיפת אבק.
4. הקשרים fluidic ^(TM NanoPorts קשרים, אפצ'רץ' מדעי, Oak Harbor, WA) מחוברים אז על כניסתה ובארות אוסף של הערוצים microfluidic.

לדוגמא הכנה חיידקית לשימוש עם CNT תמוגה מונולית

הכנת המדגם למדגם חיידקי כולל נטילת מדידת צפיפות אופטית ב 600nm על מנת להבטיח כי המדגם לא מרוכז מאוד כדי למנוע סתימת הערוץ.

1. קח קריאת OD ב 600nm עם חיידקים בתקשורת, זה נעשה עם biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf מדעיים, Inc, ווסטבורי, ניו יורק). לדלל את המדגם עד קריאות OD ליפול בטווח 0.18-0.25 א
2. צנטריפוגה מדגם בסל"ד 6500 למשך 5 דקות למזוג supernatant.

תמוגה

1. חיידקים Resuspend ב GuSCN * + 0.01% SDS + 4% proteinase K (0.8mg/ml). בקצרה וורטקס (1ml של חיידקים התקשורת צריכה להיות resuspended ב 1ml GuSCN). Proteinase K נוספה פתרון כדי לסייע עם denaturing חלבונים המצורפים-DNA של החיידק וכן לעכב DNAases ו RNAases. יתרון נוסף של K proteinase היא שזה גם מסייע עם פירוק החלבונים קיר הסלולר אשר רצוי שכן הן חיידקים גראם חיוביים ו חיידקים גראם שליליים, דפנות התאים מכילים כמויות גדולות של חלבון (למרות חיידקים גראם שליליים בדרך כלל יש יותר חלבון ). חיץ chaotropic בנוסף מסייע K proteinase עם denaturing חלבונים תוך אבקת משבש את דופן התא. Proteinase K ו thiocyanate guanidinium (GuSCN) נרכשו מ Qiagen Inc (ולנסיה, CA). SDS (Dodecyl נתרן גופרתי) נרכש פירס (Rockford, IL).
2. מיד לטעון את הדוגמה מזרק המחובר צינורות הצצה. לשאוב את המזרק כך שהאוויר לא נמצא במערכת. חבר את צינורות אל nanoport ערוץ.

משאבת מזרק KDS100 (שיוצרו על ידי KD מדעי, Holliston, MA) שימש הניסויים ואת קצב הזרימה משמש הוא 450 μL / שעה על כל המדרגות. תזרים תמוגה מדגם ערוץ ב 450ul/hr.

1. איסוף המדגם והמשך מיצוי DNA באמצעות SPE (ראה פרוטוקול מיצוי DNA). הערה: זהו מדגם חיידקי לא צריך לבצע שלב 2 טען, כי ההשעיה היא GuSCN *.

הפקת DNA פרוטוקול

ההליך החילוץ כוללת 3 שלבים:

1. טען.
2. וושינגטון
3. Elute.

משאבת מזרק KDS100 (שיוצרו על ידי KD מדעי, Holliston, MA) שימש הניסויים ואת קצב הזרימה היה בשימוש 300 μL / שעה לכל המדרגות.

עומס

1. מצב הערוץ עם חיץ chaotropic (GuSCN ^*, guanidinium thiocyanate) במשך 1-2 דקות לפני תחילת הניסוי.
2. מערבבים את המדגם עם חיץ chaotropic ביחס 01:01.
3. תזרים תערובת מדגם דרך ערוץ 3 דקות.

לשטוף

1. לשטוף את הערוץ עם אתנול 70% עבור 2 דקות.
2. לשטוף את הערוץ עם אתנול 100% עבור 2 דקות.

Elute

1. Elute את ה-DNA חילוץ במים Millipore דקות 3. איסוף של 15 μL מטוהרים, PCR-DNA מוכן.

* GuSCN מן ערכת Qiagen (Buffer RLT) היה בשימוש.