מאמר שיטה

הקמת פגמים מרוכבים בתפרים גרמיים קלווריאליים בחולדות: מודל סטנדרטי לחקירת טיפול בתפרים-רגנרטיביים

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66417

⸱

10 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את ההליכים הכירורגיים המפורטים של פגמים מרוכבים בתפרים קלבריאליים גרמיים בחולדות, לצד החקירות של הפרוגנוזות קצרות הטווח והארוכות של המודל. אנו שואפים לבנות מודל סטנדרטי לפיתוח טיפולים בתפרים-רגנרטיביים.

תקציר

פגמים קלווריאליים בקנה מידה גדול עולים לעתים קרובות בקנה אחד עם הפרעה בתפר הגולגולת, מה שמוביל לליקויים בשיקום פגם קלווריאלי ופיתוח גולגולת (האחרון מתרחש בגולגולת המתפתחת). עם זאת, היעדר מודל סטנדרטי מעכב את ההתקדמות בחקירת טיפולים רגנרטיביים בתפרים ומציב אתגרים לביצוע ניתוחים השוואתיים על פני מחקרים שונים. כדי לטפל בבעיה זו, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את תהליך המידול המפורט של פגמים מרוכבים בתפר קלבריאלי גרמי בחולדות.

המודל נוצר על ידי קידוח חורים מלבניים בעובי מלא בגודל 4.5 מ"מ × 2 מ"מ על פני התפרים העטרתיים. החולדות עברו המתת חסד, ודגימות הגולגולת נלקחו לאחר הניתוח ביום 0, בשבוע 2, בשבוע 6 ובשבוע 12. תוצאות μCT מדגימות שנאספו מיד לאחר הניתוח אישרו את ההקמה המוצלחת של הפגם המרוכב התפר-גרמי, הכולל את הסרת התפר העטרתי ורקמות העצם הסמוכות.

נתונים מהשבועותה-6 וה-12 שלאחר הניתוח הדגימו נטיית ריפוי טבעית לסגירת הפגם. צביעה היסטולוגית אימתה מגמה זו עוד יותר על ידי הצגת סיבים מינרליים מוגברים ועצם חדשה במרכז הפגמים. ממצאים אלה מצביעים על איחוי תפרים מתקדם לאורך זמן בעקבות פגמים קלווריאליים, ומדגישים את חשיבות ההתערבויות הטיפוליות להתחדשות התפרים. אנו צופים כי פרוטוקול זה יקל על פיתוח טיפולים לחידוש התפרים, ויציע תובנות חדשות לגבי שיקום תפקודי של פגמים קלווריאליים והפחתת התוצאות השליליות הקשורות לאובדן תפרים.

מבוא

תפרים גולגולתיים הם קשרים סיביים צפופים בין עצמות הגולגולת, הפועלים כמפרקים כדי להקל על תנועת גולגולת קלה ומספקים כרית מגן למוח תחת לחץ1. בשנים האחרונות, מחקר מוגבר הדגיש את התפקיד המרכזי של תפרים גולגולתיים בהתפתחות הגולגולת, הומאוסטזיס גולגולתי, ופוטנציאל אוסטאו-תיקון מובנה 2,3,4,5,6,7,8. בתקופות של צמיחה והתפתחות, תפרים גולגולתיים משמשים כמרכזי הצמיחה העיקריים בגולגולת4. היווצרות עצם חדשה מתרחשת בחזיתות האוסטאוגניות משני צידי התפרים, בעוד התאים בתוך התפרים שומרים על מצב מזנכימלי בלתי ממוין, מה שמבטיח התרחבות מאוזנת של הגולגולת לצד צמיחת המוח1. אובדן התפרים הגולגולתיים בשלב זה גורם לפער בין צמיחת הגולגולת והמוח, מה שמוביל לבעיות חמורות כמו פגיעות מוחיות, הידרוצפלוס, לחץ תוך גולגולתי מוגבר ותפקוד קוגניטיבילקוי 3,9.

חוץ מזה, תפרים גולגולתיים לשחק תפקיד מכריע בקביעת הפרוגנוזה של פגמים calvarial 5,7,10. פוטנציאל ההתחדשות על פני השטח הקלוואריאלי מפוזר באופן לא אחיד, כאשר תפרים גולגולתיים מראים יכולות טובות להפליא בהשוואה לאזורים שאינם תפרים10,11. מחקר אחד מצביע על כך שמהירות ריפוי הפגם הקלוואריאלי נמצאת בקורלציה הפוכה עם המרחק בין תפר הגולגולת לאתר הפציעה10. באופן ספציפי, הסרת תפרים קורונליים ו sagittal מוביל לאי ריפוי של פגמים עצם קודקודית7, תוך הדגשת הצורך של התחדשות התפרים פגמים calvarial. עם זאת, ההתמקדות של המחקרים הנוכחיים היא בעיקר על שיקום של מבנה גלוסקמה גולגולתית תוך הזנחת התחדשות של mesenchyme התפרים.

באשר להתקדמות בהתחדשות התפרים, נצפו תוצאות מבטיחות עם השתלת דשי עצם המכילים תפרים, תאי גזע מזנכימליים (MSC) וביו-חומרים מלאכותיים. כאשר הושתלו דשי עצם עם תפרים בפגמים קלווריאליים, הם השתלבו בהצלחה והחלימו, בניגוד לאלה ללא תפרים המציגים חוסר איחוד וחוסר יכולת ליצור פריאוסטאום, דורה מאטר או אוסטיאוציטים5. כמו כן, השתלת MSCs שמקורם במח עצם לתוך פגמים מרוכבים של תפר גרמי קלת הקלה על היווצרות רווחים דמויי תפר12. יש לציין כי מחקר שנערך לאחרונה הדגיש את המימוש של התחדשות התפרים עם Gli1+ MSCs, המאפשר בקרת לחץ תוך גולגולתי, תיקון עיוות גולגולת ותפקוד נוירו-קוגניטיבי משופר13. ככל שהרפואה הרגנרטיבית וההנדסה הביו-רפואית מתפתחות, החוקרים מתמקדים יותר ויותר בביו-חומרים של הנדסת רקמות בשל תכונותיהם הניתנות להתאמה אישית14. יש לציין כי קרומי פוליטטרה-פלואוראתילן הוכחו כיעילים בשחזור עצם גולגולתית ותפר מזנכימה בו זמנית15,16.

עם זאת, במחקר הקרניופציאלי חסרים מודלים מבוססים לחקר טיפולים רגנרטיביים מזנכימליים בתפרים, בניגוד למודלים בוגרים יחסית בתיקון רקמות אחרות כגון עצם, עור, סחוס ושרירים17. היעדר מודל סטנדרטי מגביל את המחקר של טיפולים תפרים-רגנרטיביים ומקשה על ביצוע ניתוח השוואתי בין מחקרים שונים. לכן, המחקר שלנו קבע פגם מעשי וניתן לשחזור בתפר קלבריאלי-גרמי מרוכב של חולדה. באמצעות שיטה זו, אנו שואפים לפתח התערבויות קליניות מתאימות לשחזור תפר גולגולתי, תוך מתן נקודות מבט חדשות על תיקון פונקציונלי של פגמים קלווריאליים והפחתת תוצאות שליליות הנובעות מאובדן תפרים.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה במערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2021-597). בסך הכל התקבלו 12 (3 חולדות בכל אחת מארבע נקודות הזמן) חולדות Sprague-Dawley (SD) (זכר, 300 גרם, 8 שבועות) ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנה טרום ניתוחית

  1. פריטים כירורגיים
    1. הכינו כלי ניתוח שמוצגים באיור 1A, כולל מלקחיים מעוקלים, אזמל סטרילי חד-פעמי, מעלית פריאוסטלית, מחט השקיה, כדורי צמר גפן, ידית במהירות נמוכה, מנוע כירורגי, בורות עגולות דנטליות במהירות נמוכה (איור 1B, קוטר 1.2 מ"מ ו-0.8 מ"מ, בהתאמה), מחזיק מחט, תפרים מונופילמנטיים 3-0 ומספריים ישרים.
  2. עיקור וחיטוי
    1. לעקר את המכשירים על ידי עיקור בקיטור (125-135 מעלות צלזיוס, 20-25 דקות) מראש.
    2. השתמש באתנול כדי לעקר ציוד רפואי רגיש לחום, כגון מכונות גילוח חשמליות.
    3. השתמש בבדים לא ארוגים רפואיים סטריליים כדי לכסות את פלטפורמת הניתוח ולחטא את הסביבה עם אתנול 75%.
  3. הרדמה
    1. הכינו בעלי חיים לניתוח עם תקופת התאקלמות של שבוע.
    2. הזריקו לחולדות קסילזין (10 מ"ג/ק"ג) וקטמין (100 מ"ג/ק"ג) 20 דקות לפני הניתוח להרדמה או השתמשו בכל פרוטוקול הרדמה מתאים להשגת הרדמה כללית.
      הערה: קוקטייל ההרדמה קטמין-קסילזין הניתן תוך צפקית בחולדות נכנס לתוקף בדרך כלל תוך 10-15 דקות, ומגיע לשיא ההרדמה בסביבות 35-40 דקות לאחר ההזרקה. כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההרדמה, חולדות ממוקמות בצורה הטובה ביותר על כרית חימום.
    3. מתן זריקה תת עורית טרום ניתוחית של קרפרופן ב 5 מ"ג / ק"ג כדי לספק שיכוך כאבים.
    4. השתמשו ב"שיטת צביטת הבוהן" כדי לקבוע אם החולדות בהכרה ומגיבות.

2. תהליך כירורגי

  1. הכנת האתר
    1. הניחו את החולדה בתנוחה נוטה כשראשה נמשך באופן טבעי אנכית, מבלי להזדקק למכשירים מיוחדים או למעצורים כדי לשמור על התנוחה הזו (איור 2A).
    2. יש למרוח משחה וטרינרית, כלומר וזלין, על עיני החולדה כדי למנוע יובש בקרנית.
    3. הסירו את השיער מהקרקפת שבין גשר האף למפרק עמוד השדרה הצווארי בעזרת מכונת גילוח חשמלית (איור 2B). יש לחטא את אזור הניתוח בתנועות מעגליות המוקרנות מהמרכז בתמיסת יודופור 2% ואחריה 75% אתנול. השתמשו בוילון כירורגי כדי לכסות את החלק האחורי של בעל החיים ואת הפרווה המקיפה את החתך.
  2. פתיחת אתר כירורגי
    1. החל מנקודת האמצע של עצם האף, בצעו חתך עור אורכי בקוטר 2 ס"מ עם אזמל חד פעמי בעקבות קו האמצע של הגולגולת (איור 2C).
    2. בצעו חתך פריאוסטאלי בקו האמצע המשקף את הנקודה וההיקף הראשוניים של שכבת העור בעזרת אזמל (איור 2D). לאחר מכן, הרימו בעדינות את הפריאוסטאום משני צידי החתך באמצעות מעלית פריאוסטאלית (איור 2E1) כדי לחשוף עצמות קודקודיות, עצמות קדמיות ותפרים קורונליים (איור 2E2).
      הערה: בעת חיתוך periosteum, יש להקפיד שלא לפגוע בתפרים גולגולתיים כדי למנוע דימום מוגזם בעת החיתוך. חשיפה נאותה של תפר העטרה היא בעלת חשיבות עליונה עבור ההליכים הבאים.
    3. שוטפים את הפצע בתמיסת מלח ומייבשים את אזור הניתוח בכדורי צמר גפן.
  3. הקמת מודל פגם תפר-גרמי מרוכב
    1. כוונו את המנוע הכירורגי ל-35,000 סל"ד על-ידי סיבוב הידית (איור 1A, חץ צהוב), ואז הפעילו את המתג (איור 1A, חץ לבן).
    2. החל מכל נקודה בתפר העטרה, יש להפעיל כוח אנכי באמצעות בור עגול בקוטר 1.2 מ"מ עד לתחושת פריצת דרך.
      הערה: ממליץ על נקודת האמצע של תפר העטרה (מסומנת בחצים צהובים באיור 2E2) כנקודת ההתחלה לחדירה. בעת השחזה, מקדחות שיניים צריך להישמר בניצב למשטח הגולגולת. יש להיזהר שלא להמשיך בקידוח לאחר חדירה לעובי המלא של הגולגולת כדי למנוע פגיעה נוספת בחולדות, כולל נזק מוחי או דימום מוחי.
    3. מנקודת החדירה, הזיזו את הבור לרוחב לאורך תפר העטרה כדי ליצור חריץ מיקום באורך של כ-4 מ"מ (איור 2F1). הסירו את רקמת העצם עם הבור משני צידי חריץ המיקום כדי ליצור בתחילה פגם מלבני בעובי מלא (איור 2F2).
    4. השתמשו בבור עגול בקוטר 0.8 מ"מ כדי לעדן פרטים (איור 2G1), הכולל השחזה של זוויות ישרות והחלקה של שולי הפגמים, ובסופו של דבר להשיג פגם מלבני סטנדרטי ברוחב 2 מ"מ ובאורך 4.5 מ"מ (איור 2G2).
      הערה: כדי להשיג הסרה מלאה של התפר העטרתי תוך שמירה על התפרים הסגיטליים והקדמיים בחולדות SD של 300 גרם, אורך הפגם המרבי האפשרי הוא כ-4.5 מ"מ. בהתחשב ברוחב התפר העטרה בכיוון הקדמי-אחורי (איור משלים S1), רוחב הפגם נקבע כ-2 מ"מ.
    5. יצירת שני פגמים על פני החצי השמאלי והימני של תפר העטרה לצורך השוואה עצמית.
    6. שמור על השקיה רציפה של תמיסת מלח במהלך הליך הקידוח כדי להגן מפני פגיעה תרמית בגולגולת ובמוח. בינתיים, השתמשו בצמר גפן כדי לייבש את אזור הניתוח.
  4. אימות ממד לדוגמה
    1. ודאו באופן קבוע את אורך ורוחב הפגמים באמצעות קליפר ורנייה (איור 2H1, H2) כדי להבטיח עקביות בכל הדגימות.
  5. סגירת אתר כירורגי
    1. סגרו את העור עם 3-0 תפרי מונופילמנט (איור 2I).
  6. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת מיידית in vivo (μCT)
    1. במידת האפשר, יש לבצע סריקות μCT in vivo על כל החולדות מיד לאחר הניתוח כדי לאשר את הצלחת ההליך הכירורגי ולעקוב אחר מגמות החלמת פגמים עבור כל אדם.

3. טיפול לאחר ניתוח

  1. על פי פרוטוקולים לטיפול בבעלי חיים, מתן משככי כאבים מבוססים לפי הצורך לאחר הניתוח, למשל, קרפרופן (5 מ"ג / ק"ג, שימוש תת עורי).
  2. העבירו את החולדות לכרית חימום קבועה (37°C) להתאוששות לאחר הניתוח.
  3. לאחר הכרה מלאה, העבירו את החולדות לכלוב הדיור שלהן המכיל מצעים נקיים.
    הערה: יש לעקוב ברציפות אחר החולדות לאחר הניתוח. אל תשאיר אותם ללא השגחה עד שהם יכולים לשמור על שכיבה עצם החזה. יש לשמור על חולדות מנותחות מבודדות מאחרות עד להחלמה מלאה.
  4. בצע ניהול משככי כאבים ומעקב לאחר הניתוח במשך 24 שעות, ולאחר מכן הערכות יומיות במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח. עקבו אחר החולדות לפחות 1-2 פעמים בשבוע לאחר מכן.

4. איסוף דגימות וניתוח נתונים

  1. הכנת דוגמאות
    1. יש לאסוף דגימות גולגולת ביום 0, בשבוע 2, בשבוע 6 ובשבוע 12 לאחר הניתוח. הרדימו את החולדות באמצעות שאיפתCO2 .
    2. תקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 24 שעות לפני ניתוח נוסף.
  2. הערכת μCT
    1. בצע סריקות μCT על עצמות גולגולת של יום 0, שבוע 6, שבוע 12 עם פרמטרי הסריקה הבאים: פוטנציאל צינור רנטגן, 70 kVp; עוצמת רנטגן, 0.2 mA; מסנן, AL 0.5 מ"מ; זמן אינטגרציה, 1 x 300 אלפיות השנייה; וגודל ווקסל, 10 מיקרומטר.
    2. קבל שחזור תלת-ממדי ותמונות חתך באמצעות תוכנה לעיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים).
    3. מדוד נפח פגם שיורי ובצע ניתוח סטטיסטי עם התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים).
  3. צביעה היסטולוגית
    1. בטל את הסתיידות עצמות הגולגולת בתמיסת חומצה טטראצטית אתילן דיאמין (pH = 7.2) ב -4 מעלות צלזיוס למשך 6 שבועות.
      הערה: בטל את ההסתיידות בדגימות עם שינויי תמיסה כל 3 ימים. השתמש בשייקר כדי לזרז את התהליך. ההשלמה מסומנת כאשר מחט 25 גרם חודרת בקלות לדגימה.
    2. המשך עם התייבשות, שיבוץ פרפין והכנת חתכים של 6 מיקרומטר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים18.
    3. ביצוע ניתוח היסטולוגי באמצעות hematoxylin ו eosin (H&E) ואת צביעת trichrome של Masson בעקבות פרוטוקול ערכה18.

תוצאות

במחקר זה, פגם תפר קלבריאלי-גרמי מרוכב של חולדה נקבע על ידי קידוח חור מלבני בגודל 4.5 מ"מ x 2 מ"מ לרוחב התפר העטרתי. האיור הסכמטי הכירורגי ותרשים זרימת המחקר מתוארים באיור 3. התמונה התלת-ממדית ותצוגת החתך של דגימות 0 ימים לאחר הניתוח, כלומר דגימות שנאספו מיד לאחר הניתוח, אישרו את היצירה המוצלחת של פגם קלוואריאלי בעובי מלא, הכולל הסרה מלאה של תפר העטרה כמו גם של מבני העצם הסמוכים בשני הקצוות (איור 4A). תמונות μCT ותוצאות הניתוח הסטטיסטי התואמות לאחר 6 שבועות לאחר הניתוח חשפו נטייה טבעית לסגירת פגם המלווה בגושים מסוידים לא סדירים שנוצרו בתוך הפגם (איור 4). נטייה זו הפכה בולטת יותר 12 שבועות לאחר הניתוח (איור 4), מה שמצביע על איחוי התפרים הפוטנציאלי ככל שהזמן התקדם. ניתוח היסטולוגי נוסף בוצע באמצעות צביעת הטריכרום של H&E ו-Masson. שבועיים לאחר הניתוח ראינו הרחבה והמשכיות יוצאות דופן של הפריאוסטאום והדורה מאטר, שיצרו רקמה סיבית צפופה ועבה ואטמו ביעילות את אזור הפגם (איור 5). יש לציין שבנקודת זמן מוקדמת זו זוהתה הופעתם של סיבים מינרליים מוכתמים בכחול, שנוכחותם עברה עלייה משמעותית עד 6 שבועות לאחר הניתוח (איור 5). לאחר 12 שבועות לאחר הניתוח, נצפו חתיכות גדולות של עצם חדשה במרכז הפגמים (איור 5), מה שאישר מחדש את הפרוגנוזה השלילית של הסתיידות סטרומה וסגירת תפרים. תוצאות הריפוי הטבעיות השליליות של פגמים מרוכבים בתפרים-גרמיים מדגישות את הצורך בהתחדשות תפר גולגולתי באמצעות התערבויות טיפוליות, כגון השתלת ביו-חומרים 13,15,16.

figure-results-1
איור 1: כלי ניתוח. (א) פריטי הניתוח מוספרו לפי סדר השימוש, כולל (1) מלקחיים מעוקלים, (2) אזמל סטרילי חד פעמי, (3) מעלית פריאוסטאלית, (4) מחט השקיה, (5) כדורי צמר גפן, (6) ידית במהירות נמוכה, (7) מנוע כירורגי (חץ צהוב מייצג את ידית הסל"ד וחץ לבן מייצג את המתג), (8) בורות עגולות דנטליות במהירות נמוכה, (9) מחזיק מחט, (10) 3-0 תפרי מונופילמנט, ו-(11) מספריים ישרים. (B) בורות עגולים במהירות נמוכה בקוטר 1.2 מ"מ ו-0.8 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הליך כירורגי. (A) מקמו את החולדה במצב נוטה. (B) לגלח את שיער הקרקפת באמצעות מכונת גילוח חשמלית. (C) חותך עור באזמל חד פעמי. (D) חותך את periosteum עם אזמל. (ה1, ה2) הרם את periosteum כדי לחשוף תפרים coronal עם מעלית periosteal. החיצים הצהובים מצביעים על תפרים קורונליים. (ו1) נשא חריץ מיקום. (ו2) צור באופן ראשוני פגם מלבני עם בור עגול בקוטר 1.2 מ"מ. (G1, G2) חתוך את הפגם עם בור עגול בקוטר 0.8 מ"מ לקבלת צורה מלבנית סטנדרטית בגודל 4.5 x 2 מ"מ. (ח1, ח2) כיילו את רוחב ואורך הפגם בעזרת קליפר ורנייר. (I) סגור את העור באמצעות 3-0 תפרים מונופילמנטיים. תיאור זה משתמש בגופה, אשר נותרת בכוונה ללא אונס כדי לאפשר הדמיה אנטומית משופרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: המחשה סכמטית של הפגם המרוכב בתפר הקלוריאלי-גרמי ואסטרטגיית המחקר של מחקר זה. קיצורים: H&E = hematoxylin ו eosin; μCT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: נטיית הסגירה של פגם תפר קלבריאלי-גרמי מרוכב. (A) תמונות μCT מייצגות ותצוגות חתך של פגמים מרוכבים גרמיים ביום 0, בשבוע 6 ובשבוע 12 לאחר הניתוח. חתכי הרוחב מתארים את המיקומים המסומנים על ידי הקווים המקווקווים הצהובים בתמונות תלת-ממדיות. מוטות קנה מידה = 2 מ"מ. (B) ניתוח כמותי של נפח פגם שיורי לאחר ניתוח באמצעות הערכות μCT. n = 6 משכפלים/קבוצה. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD. ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של דנט. עמ<0.001. קיצורים: PO = לאחר הניתוח; μCT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: שינויים היסטולוגיים במומים מרוכבים גרמיים-תפרים. (A) H&E ו-(B) צביעת טריכרום של מאסון של פגמים מרוכבים גרמיים-תפרים בשבוע 2, שבוע 6 ושבוע 12. קווי המתאר המקווקווים האדומים מציינים את הרקמה הסיבית העוטפת את אזור הפגם. המחומשים השחורים מייצגים את הסיבים המינרליים המוכתמים בכחול. המחומשים הצהובים מדגישים את העצם החדשה שנוצרה במרכז הפגם. מוטות קנה מידה = 500 מיקרומטר; 200 מיקרומטר (inets). קיצורים: PO = לאחר הניתוח; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: רוחב תפר קורונלי בכיוון הקדמי-אחורי (תמונה קלווריאלית של מישור קשת). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מודלים קונבנציונליים של פגם קלווריאלי, בין אם מעורבים בהם תפרים גולגולתיים ובין אם לאו, מתרכזים בעיקר בתיקון רקמות קשות, ולעתים קרובות מזניחים את ההתחדשות החיונית של מזנכימה של התפרים19,20. במחקר התחדשות תפרים, מודלים קודמים, כמו אלה של Mardas et al.15,16, שהשתמשו בטרפין בור כדי ליצור פגם מעגלי של 5 מ"מ על פני התפר הסגיטלי של חולדות, גרמו לאובדן משמעותי של רקמות קשות, ובכך סטו מהמטרה העיקרית של התחדשות התפרים. באופן דומה, המתודולוגיה של Wilk et al.7, המקיפה את הסרת שני התפרים העטרה הקשת והימנית, ויצירת פגם עצם קריטי בעצם הקודקוד הימנית, למרות שהיא אינפורמטיבית, הציגה מורכבויות ומשתנים מבלבלים פוטנציאליים עקב נוכחותם של אתרי פגם מרובים. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו יוצר פגמים מלבניים דו-צדדיים לאורך התפר העטרתי, במטרה ליצור מודל מחקר יעיל וממוקד יותר. התפרים הגולגולתיים העיקריים כוללים את התפרים העטרתיים, הסגיטליים, המטופיים והלמבדואידים21. בשונה מהתפרים המטופיים והקשתים, המסודרים לאורך על הגולגולת, התפרים הקורונליים והלמבדואידים ממוקמים באופן רוחבי וניתן לחלק אותם לשני חצאים, מה שמקל על יצירת שני פגמים בתנאים זהים. בניגוד לתפר הלמבדואיד, השדה הניתוחי שנחשף בחתך הקרקפת נגיש יותר לסדרת פרוצדורות בתפר העטרה. יצירת פגמים הן בחצי השמאלי והן בחצי הימני של התפר העטרתי והחלת התערבויות שונות על כל אתר מאפשרת השוואה פשוטה יותר של טיפולים שונים באמצעות שליטה עצמית. יתר על כן, גישה זו מאפשרת השוואה בין צדדים מטופלים ללא מטופלים, ומספקת תובנות על הפערים בין תהליך הריפוי המתערב לבין תהליך הריפוי הטבעי. לכן, המחקר שלנו מצביע על כך שיצירת פגמים מרוכבים גרמיים בשני צידי התפרים העטרתיים בחולדות היא מודל ניתוחי מתאים לחקר טיפולי תפרים-רגנרטיביים.

בחירת מידות הפגם מונחית בקפידה על ידי שיקולים מעשיים ואנטומיים. עבור מודל בעל חיים ספציפי זה, האתגר העיקרי טמון בהסרה מוחלטת של התפר העטרה תוך שמירה על התפרים הסגיטליים והקדמיים, עם הסרת רקמת גלוסקמה מינימלית. האסטרטגיה האופטימלית, אם כן, כרוכה ביצירת פגם מלבני מדויק לאורך התפר העטרתי. החלטה אסטרטגית זו היא הכרחית, שכן כל שארית מזנכימה בתפר העטרה או בתפרים סמוכים עלולה לגרום לאי דיוקים בהערכת ההשפעה הרגנרטיבית האמיתית של הטיפול. כתוצאה מכך, קבענו את אורך הפגם הגדול ביותר האפשרי עבור 300 גרם חולדות SD זכרים בערך 4.5 מ"מ. יתר על כן, בהתחשב ברוחב התפר העטרתי בכיוון הקדמי-אחורי (כ-1.5 מ"מ במישור הסגיטלי, כפי שמוצג באיור משלים S1), קבענו את רוחב הפגם על 2 מ"מ כדי להבטיח הסרה מלאה של התפר משטח הגולגולת לעומקו. ראוי לציין כי הממדים הספציפיים של הפגם, הן באורך והן ברוחב, עשויים לדרוש התאמה על בסיס גורמים כגון סוג וגיל החיה, כמו גם את מטרות הניסוי. מחקר אחר יצר פגם מלבני דק, ברוחב 0.3-0.4 מ"מ, לאורך התפר העטרתי, המתאים לגודל הקטן יותר של עכברים13.

יש לציין כי הקושי ביצירת מודל כירורגי זה טמון בבניית פגמים מלבניים סטנדרטיים ואחידים. הכרחי לשמור על עקביות בצורת הפגם כדי להבטיח מינון אחיד של גורמים ביו-אקטיביים בין הדגימות, ובכך למזער הן את השונות הבין-קבוצתית והן את השונות הבין-קבוצתית. בהקשר זה, במהלך תהליך הסרת קומפלקס התפרים-גרמיים, השתמשנו תחילה בבור עגול בקוטר 1.2 מ"מ כדי לאתר את התפר העטרתי וליצור מתאר גס של הפגם המלבני בעובי מלא (איור 1B). לאחר מכן, עברנו לבור העגול הקטן ביותר (קוטר 0.8 מ"מ) כדי לעדן את הסיבובים בזווית ישרה ולהחליק את הקצוות הפגומים (איור 1B). כדי להבטיח את עקביות אורכו ורוחבו של כל פגם, נעשה שימוש בקליפר ורנייה כדי למנוע שחיקת יתר או תת-שחיקה במהלך תהליך הקידוח. למרות גישה זו, סריקת μCT גילתה שהפגם המלבני שיצרנו עדיין בצורת קשת מסוימת (איור 4), מה שמרמז על הדרישה לאופטימיזציה נוספת של שיטת המידול כדי לקבל צורות השחזה מדויקות.

כדי להעריך את הפרוגנוזה, סריקות μCT מספקות את האמצעים הישירים ביותר, כולל הערכת ריפוי רקמת העצם ומצב התפרים הגולגולתיים, בין אם הם סגורים או ללא הפרעה. יתר על כן, חקירה ברמה היסטופתולוגית חיונית לחקר התחדשות תפר גולגולתי. צביעה היסטופתולוגית מסייעת בהבחנה בין אי סגירת פגמים עקב היווצרות רקמות מזנכימליות, עיכוב משקם עצם או תופסת מקום חומרי. רק גישות המקלות על התחדשות הרקמה המזנכימלית עשויות להיות בעלות פוטנציאל להתחדשות תפר גולגולתי. מלבד זאת, למרות היעדר ניסויים רלוונטיים במהלך בניית המודל, מומלץ מאוד לזהות ביטוי ברמת החלבון של סמני MSC תפרים בתוך הרקמה המתחדשת לאחר התערבויות טיפוליות. ניתוח זה, תוך שימוש בטכניקות כגון אימונופלואורסצנציה, אימונוהיסטוכימיה או ציטומטריית זרימה, תורם לאישור ההצלחה של התחדשות התפרים. סמני MSC תפר ספציפיים כוללים Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk ועוד 1,22.

לסיכום, מחקר זה דיווח על תהליך מידול מפורט של פגמים מרוכבים בתפר קלבריאלי גרמי בחולדות כדי ללמוד את הפרוגנוזה של פגמים קלווריאליים בתפרים צולבים ולפתח טיפולים מתאימים לחידוש תפרים גולגולתיים. ראוי לציין כי תחום התחדשות התפרים הגולגולתיים הוא אכן נישתי, ואין בו מודלים או שיטות סטנדרטיות הרווחות בספרות לחידוש תפרים גולגולתיים. לפיכך, אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו מספק בסיס מתודולוגי מוצק לחקר גישות רגנרטיביות של תפרים ומציג פרספקטיבות חדשניות על שיקום תפקודי של פגמים קלווריאליים, במטרה הסופית לשפר את איכות החיים של המטופלים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) ומימון מחקר מבית הספר / בית החולים לסטומטולוגיה של מערב סין אוניברסיטת סצ'ואן (RCDWJS2021-5). איור 3 נוצר באמצעות Biorender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהידBiosharpBL539A
2% תמיסת יודופורChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.אף אחד
75% אתנולצ'נגדו ג'ינשאן ריאגנט כימי ושות 'בע"מללא
כדורי כותנהHaishi Hainuo קבוצה ושות', בע"מ ללא
צמר גפן ספוגיותLakong מכשור רפואי ושות',  ללא
מלקחיים מעוקליםצ'נגדו שיפנג ושות', בע"מNone
Dataviewer ותוכנת Ctan להערכות נפח פגמים שיורייםBrukerNone
Dental במהירות נמוכה עגול בורסDreybird ציוד רפואי ושות 'בע"מ.RA3-012
RA1-008
אזמל סטרילי חד פעמיHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.ללא
מזרקים חד פעמיים (22 גרם)צ'נגדו שיפנג ושות', בע"מSB1-089 (IX)
מכונת גילוח חשמליתJASEBM320210
אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)BioFroxx1340GR500
ערכת כתמי המטוקסילין ואאוזיןBiosharpBL700B
מחט השקיה (23 גרם)סצ'ואן ניו סנצ'ואן מוצרי פולימר רפואי ושות 'בע"מללא
ידית במהירות נמוכהגואנגג'ואו משמר שיניים טכנולוגיה ושות', בע"מאף אחד מאסון
s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
בדים לא ארוגים רפואייםHenan Yadu Industrial Co., Ltd. ללא
טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (&מיקרו; CT) Scanco Medical AGµ CT45
מחקה 20.0 לתמונות חתךMaterialiseNone
מחזיקי מחטChengdu Shifeng Co., Ltd.אין
מעלית Periostealצ'נגדו Shifeng ושות', בע"מללא תמיסת
מלחסצ'ואן קלון פרמצבטיקה ושות', בע"מאין
תוכנת ויזואליזציה רפואית של Scanco לשחזור תמונה תלת מימדיתScanco Medical AGNone
SPSS Statistics 20.0 לניתוח סטטיסטיIBMNone
Sprague-Dawley rats Byrness Weil Biotech בע"מללא
מספריים ישרצ'נגדו Shifeng ושות', בע"מללא
מנוע כירורגיMARATHONN3-140232
תפרים כירורגיים (3-0 מונופילמנט)האנגג'ואו Huawei ציוד רפואי ושות 'בע"מללא

מקורות

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Micro CT

מאמרים קשורים