בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

אינטראקציות בין ביומולקולות הן החלק הבסיסי ביותר של תופעות ביולוגיות. אינטראקציות חלבון-חלבון מהוות חלק משמעותי מאינטראקציות כאלה. לכן, זיהוי של שותפי האינטראקציה של חלבון מעניין הוא קריטי כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציה של החלבון/גן המעניין. שיטת השמרים הדו-היברידיים (Y2H) היא טכניקה פופולרית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון in vivo¹. במערכת זו, שני חלבונים (X ו-Y) שהאינטראקציה ביניהם אמורה להיבדק מאוחים לתחום קשירת הדנ"א (DB) ולתחום הפעלת השעתוק (AD), בהתאמה. חלבון ההיתוך DB-X נקשר לרצף זיהוי של תחום DB; לכן, כאשר חלבונים X ו-Y מתקשרים, חלבון ההיתוך AD-Y מגיע לקרבת רצף הזיהוי. כתוצאה מכך, מופעל שעתוק של גן המדווח במורד הזרם של רצף הזיהוי. לכן, נוכחות או היעדר פעילות גן מדווח יכול לשמש כדי לקבוע את נוכחותה או היעדרה של אינטראקציה חלבון-חלבון¹.

לאחר זיהוי שותף אינטראקציה ספציפי של החלבון המעניין, יש לבצע ניתוחים נוספים כדי להבהיר את הפונקציה הביולוגית של האינטראקציה. לשם כך, אם ניתן יהיה לבודד מוטנטים של החלבונים הפוגעים או מסירים את האינטראקציה הספציפית חלבון-חלבון, הם ישמשו ככלים רבי עוצמה. ניתן להשתמש במערכת Y2H ישירות כדי לבודד מוטנטים כאלה על ידי סינון שיבוטים 'שליליים לאינטראקציה', החל משיבוט 'אינטראקציה-חיובית' מסוג פראי. כדי להאיץ תהליך זה, פותחו מערכות Y2H 'הפוכות' (rY2H) ^2,3. במערכות rY2H, זני השמרים המארחים מכילים גנים של סמנים הניתנים לבחירה נגדית כגנים מדווחים, כלומר תאי שמרים גדלים רק כאשר חלבוני AD-Y ו-DB-X אינם מתקשרים זה עם זה.

למרות שגם מערכת Y2H וגם מערכת rY2H מאפשרות בידוד של מוטנטים שליליים לאינטראקציה, תהליך בידוד המוטנטים הוא מייגע מכיוון שלא כל המועמדים המתקבלים על ידי סינון נושאים את סוג המוטציות הרצוי (בדרך כלל מוטציות שגויות). הבעיה החמורה ביותר היא שלחלק ניכר מהמועמדים יש מוטציות של שינוי מסגרת או שטויות, ויש צורך לבצע כתם מערבי כדי לא לכלול שיבוטים לא רצויים. כדי להתגבר על בעיה זו, פותחו וקטורי פלסמיד חדשים⁴. בווקטורים אלה, KanMX, סמן עמידות לתרופות, ממוקם מחוץ לפריים במורד הזרם של תחום DB או AD. גן הסמן הופך למסגרת עם תחום DB או AD רק כאשר הגן המעניין מוכנס. כאשר מוטציה אקראית מוחדרת לגן המעניין, מוטציות בלתי רצויות, כגון אלה עם מוטציות frameshift או שטויות, ניתן לחסל בקלות על ידי ביצוע סלקציה עמידות לתרופות, ומועמדים הנושאים מוטציות רצויות missense ניתן לזהות בקלות עם מסך Y2H⁴. מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד מוטציות אינטראקציה-null/לקוי של חלבון מעניין באמצעות אסטרטגיה זו.

1. בניית הספרייה המוטנטית

1. הגדר את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (דוגמה מוצגת להלן). בדרך כלל, להכין 50 μL של התגובה, אשר מחולק עשרה aliquots של 5 μL, ולהגביר את מקטע גן המטרה במכונת PCR⁴.
   הערה: על המשתמשים לבחור פולימראז מתאים כדי להציג מוטציות ביעילות. אם מקטע הדנ"א שיש להגביר הוא קצר, אז יש צורך בפולימראז עם שיעור שגיאות גבוה יותר, כגון Taq פולימראז, אשר חסר פעילות הגהה. אם מקטע הדנ"א שיש להגביר הוא ארוך, יש צורך בפולימראז בנאמנות גבוהה יותר כדי להפחית את מספר המוטציות. מוטציות מתרחשות כל כמה מאות זוגות בסיסים לאחר 30 מחזורי הגברה עם Taq פולימראז⁴ רגיל. בתוצאות המייצגות נעשה שימוש בפולימראז Taq שונה (ראו טבלת חומרים), בעל נאמנות גבוהה יותר מאשר Taq פולימראז רגיל, ושיעור המוטציות היה אחד ל-600 זוגות בסיסים. דוגמה לתערובות PCR, פרטי הפריימר ותנאי התגובה מובאים בקובץ משלים 1.
2. כאשר ה- PCR הושלם, שלב את כל aliquots של התגובה, לאשר כי קטעי DNA של עניין הוגברו באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose, וכו ', ולטהר את ה- DNA⁵.
3. הרכיבו את מקטע הדנ"א שנוצר בשלב 1.2 עם וקטור Y2H המתאים באמצעות אסטרטגיית שיבוט "חלקה" (איור 1).
   הערה: מערכת השיבוט החלקה, כגון הרכבה⁶ של גיבסון, ממזערת את זיהום הספרייה המוטנטית הבנויה על ידי וקטורים ריקים הנוצרים באמצעות קשירה עצמית. רשימה של וקטורי Y2H מופיעה בטבלה 1. הם יכולים להיות מוכנים על ידי עיכול BamHI לפני ההרכבה. כל הפלסמידים זמינים מפרויקט המשאבים הביולוגיים הלאומי - שמרים (ראה טבלת חומרים).
4. הכניסו את תערובת התגובה שנוצרה בשלב 1.3 לתאים מוכשרים של Escherichia coli שהוכנו על פי פרוטוקול טרנספורמציה יעיל ביותר של E. coli (למשל, Inoue et al.7). יש לפזר את כל התאים המתאימים על מספר צלחות LB (1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 1% NaCl ו-2% אגר) המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (ראו טבלת חומרים). בשלב זה, פזרו כמות קטנה (~1/100 מכלל התגובה) על אותה לוחית בחירה כדי לחשב את הטייטר של הספרייה. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך הלילה.
5. לאחר שהופיעו מספר רב של מושבות E. coli , גרדו את כל התאים מפני השטח של הצלחת באמצעות לולאת פלסטיק חד פעמית. לשחזר DNA פלסמיד מתאים אלה באמצעות שיטות פופולריות, כגון ליזה אלקליין⁸. במקביל, לספור את מספר המושבות המופיעות לאחר פיזור aliquots קטן של תערובת טרנספורמציה על הצלחת. באמצעות מספר זה, הערך את המספר הכולל של שיבוטים עצמאיים בספריה.
   הערה: בשלב זה, אספו כמה מושבות עצמאיות (4-6) המופיעות על הצלחת שעליה התפשטו האליציטוטים הקטנים של תגובת הטרנספורמציה, תרבו אותם בנפרד, ובודדו מהם פלסמידים כדי לוודא שכמעט כל השיבוטים נושאים את מקטעי הדנ"א הרצויים⁵. ערכות מסחריות רבות זמינות לבידוד פלסמידים מ - E. coli. מספר המושבות המופיעות על הצלחת לאחר פיזור אליציטוטים קטנים ניתן לספור באופן ידני.
6. למדוד את ריכוז מאגר הדנ"א של הספרייה. בדרך כלל, כמה מאות ננוגרם של דנ"א ספרייה מספיקים כדי להשיג כמה אלפי טרנספורמנטים בשלב הבא.
   הערה: מומלץ למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות צבע פלואורסצנטי הנקשר לדנ"א מכיוון שמדידה של A₂₆₀ לעתים קרובות אינה מדויקת.

2. טרנספורמציה של שמרים עם הספרייה המוטנטית וציפוי העתק

1. הכניסו את הספרייה המוטנטית לזן השמרים המארח (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) עבור בדיקת Y2H באמצעות כ-100 ננוגרם של DNA. התמירו מראש את התאים המארחים עם פלסמיד 'פיתיון'.
   1. לאחר הליך הטרנספורמציה, מרחפים תאי שמרים במים סטריליים ומפזרים אליציטוטים בכמויות שונות על לוחות מתאימים (בדרך כלל SC בינוני חסר לאוצין וטריפטופן: SC-LW [0.67% בסיס חנקן שמרים, 2% גלוקוז, 1.546 גרם / ליטר SC תערובת נשירה כפולה -Leu -Trp, ו 2% אגר, ראה טבלת חומרים]). לדגור על צלחות אלה לילה ב 30 °C (75 °F).
      הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי, כגון שיטת ליתיום אצטט-PEG¹¹ עם ~ 5 × 10⁶ תאים הגדלים לוגריתמית, מספיק להתמרה של שמרים. שיטה נוספת עם יעילות טרנספורמציה גבוהה, כגון electroporation, ניתן להשתמש גם.
2. למחרת, כאשר מושבות זעירות מופיעות, לבחור את הלוחות עם מספר מתאים של תאים (500-2000) ולעשות עותקים משוכפלים מהם כדלקמן.
3. הגדר שני גיליונות של נייר סינון על בלוק משוכפל כדי ליצור מספר עותקים משוכפלים (המדיום הוא SC-LW ו- SC-LW המכיל kanamycin) (ראה טבלת חומרים). לדגור ב 30 ° C במשך 1-2 ימים.
   הערה: ריכוז הקנמיצין (G418) הוא 600 מיקרוגרם/מ"ל. אין להשתמש בקטיפה לציפוי העתק מכיוון שהרזולוציה של מושבות תאבד.
4. לאחר שהמושבות גדלו, השוו צלחות ובחרו מועמדים. בצע בדיקת צבע Y2H (ראה שלב 3) אם lacZ משמש ככתב.
   הערה: עבור כתב Y2H, lacZ בדרך כלל טוב יותר בזיהוי אינטראקציה חלשה מאשר HIS3.

3. בדיקת צבע Y2H

1. הניחו גיליון נייר סינון חתוך מראש לגודל המתאים על לוח העתק שהוכן בשלב 2. היזהרו שלא לאפשר להיווצרות בועות אוויר בין נייר הסינון לצלחת.
   הערה: השתמש בנייר סינון מס' 4A או בנייר סינון דרגה 50 (ראה טבלת חומרים). כל SC-LW או SC-LW המכילים לוחות קנמיצין, המיוצרים על ידי ציפוי העתק, יכולים לשמש לבדיקת הצבע.
2. כאשר נייר הסינון על הצלחת רטוב לחלוטין (כאשר צבע נייר הסינון משתנה לחלוטין), הניחו מספר גיליונות של מגבת נייר מעל וגרמו לו לבוא במגע עם נייר המסנן כדי להסיר לחות עודפת. הסירו את מגבת הנייר כשהיא סופגת את המים ומשנה את צבעה. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש.
3. הרימו את שולי נייר הסינון בפינצטה, קלפו אותו מהצלחת במהירות, טבלו אותו בחנקן נוזלי והקפיאו אותו. אם חנקן נוזלי אינו זמין, הניחו את נייר הסינון על מגש פלסטיק כשדופן המושבה כלפי מעלה והכניסו אותו מיד למקפיא (-20°C עד -80°C) להקפאה מלאה.
4. מוציאים את נייר הסינון הקפוא ומניחים אותו, כשדופן המושבה כלפי מעלה, על מגבת נייר יבשה להפשרה. מיד לאחר ההפשרה, הניחו את נייר הפילטר, כשדופן המושבה כלפי מעלה, על נייר סינון אחר שהונח על מגש פלסטיק או מיכל אטום והושרה בחיץ Z (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl ו-1 mM MgSO₄, pH 7.0) המכיל X-gal (5-bromo-5-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) ו-2-מרקפטואתנול⁹ (ראה טבלת חומרים). היזהרו שלא לאפשר לבועות אוויר להיווצר בין ניירות הסינון העליונים והתחתונים.
5. כסו את מגש הפלסטיק המכיל את נייר הסינון והכניסו אותו למיכל אטום או לשקית ניילון. סגור את המיכל האטום או שקית הניילון ודגור אותו ב 37 ° C עד צבע כחול מופיע.
6. כאשר מופיע צבע כחול, הניחו את נייר הסינון עם דופן המושבה כלפי מעלה על כ-500 מיקרוליטר של תמיסת עצירה (1 M Na₂CO₃) על מגש פלסטיק נקי. עצור פתרון נספג במהירות; לכן, הסירו מיד את הפילטר, הניחו אותו על מגבת נייר טרייה כשדופן המושבה כלפי מעלה, והניחו לה להתייבש.
7. לאחר החלפת מגבת הנייר והמסנן יבש מספיק, השתמש בסורק או במכשיר אחר כדי ללכוד את הנתונים.

4. שחזור ואישור שיבוטים של מועמדים

1. בחר שיבוטים לבנים ומועמדים של Kan^R מהלוח המקורי של העותק המשוכפל (או מהלוח המשוכפל שאינו משמש לבדיקת הצבע). דוגמאות לכך מוצגות באיור 1C. אשרו כי השיבוטים המועמדים הם לבנים ו- Kan^R על ידי פסים מחדש שלהם כטלאי קטן על מדיום SC-LW המכיל קנמיצין ודגירה עליהם ב 30 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים. הכינו לפחות שני סטים או הכינו עותקים משוכפלים למחרת.
   הערה: יש לבחור מושבות לבנות מכיוון שמושבות כחולות בהירות עשויות לשמור על האינטראקציה.
2. לאחר שהשיבוטים המועמדים גדלו מחדש היטב, חזרו על בדיקת הצבע עם לפחות לוח אחד שנוצר בשלב 4.1 כמתואר בשלב 3 ואשרו שהם נשארים לבנים ואינם הופכים לכחולים (איור 2A).
   הערה: בעת פסים מחדש של המועמדים, אין לשאת כמויות גדולות של תאים. תאים רבים מדי אינם מאפשרים להבחין בין שיבוטים של Kan^R ו- Kan^S .
3. קח שיבוטים שהם עדיין לבנים ו- Kan^R שנוצר בשלב 4.2 משאריות הצלחת וגדל אותם באופן עצמאי ב 1 מ"ל של מדיום בחירה (SC-L או SC-W, תלוי איזה וקטור משמש לבניית הספרייה) לילה ב 30 ° C.
4. מעבירים את התרבית למיקרו-צינורית ואוספים תאים באמצעות צנטריפוגה (~15,000 × גרם, למשך 10-30 שניות בטמפרטורת החדר). בודד DNA שלם מכדורית התא באופן הבא.
5. יש להשהות את כדורית התא ב-400 מיקרוליטר של חיץ ליזה (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) ו-1 mM EDTA) המכילים 1 μL כל אחד של 2-מרקפטואתנול ו-20 מ"ג/מ"ל Zymolyase 100T (ראו טבלת חומרים), ולדגור ב-37°C למשך 30 דקות כדי לעכל את דפנות התא. בשלב זה, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור כל 5-10 דקות.
6. כאשר מתלה התא נעשה אטום או שקוף, הוסף נפח שווה של תערובת של אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל (25:24:1) וערבב היטב על ידי ערבול במהירות בינונית במשך 10-20 שניות.
7. צנטריפוגות את המיקרו-צינוריות במיקרו-צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות מלאה (~15,000 × גרם, בטמפרטורת החדר) ומשחזרים את הפאזה המימית המכילה DNA במיקרו-צינורית חדשה. מוסיפים נפח 0.8 של איזופרופנול ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור.
8. השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במיקרו-צנטריפוגה למשך 4-5 דקות במהירות מלאה (~15,000 × גרם, בטמפרטורת החדר) כדי לזרז את הדנ"א.
9. הסר את supernatant ולשטוף את המשקע עם כ 500 μL של 70% אתנול. מוציאים אתנול לחלוטין ומייבשים את המשקע לזמן קצר.
10. הוסף 20 μL של חיץ TE (10 mM Tris-Cl (8.0) ו- 1 mM EDTA) למשקע, ערבב לזמן קצר והשאר את הצינור למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי להמיס את המשקע.
    הערה: אם משתמשים ממהרים, שמור על צינורות ב 37-50 ° C. משקע הדנ"א יתמוסס תוך מספר שעות.
11. לאחר שהגלולה מומסת לחלוטין, הפוך E. coli עם כמות קטנה של תמיסת DNA זו.
    הערה: כ 0.5 μL של תמיסת DNA מספיק אם E. coli עם יעילות טרנספורמציה גבוהה משמש.
12. כאשר מושבות E. coli מופיעות, לבחור כמה מושבות עצמאיות, לתרבית אותם, ולשחזר פלסמידים בשיטות סטנדרטיות, כגון ליזה אלקליין.
13. הכניסו את הדנ"א של פלסמיד שהתקבל בשלב 4.12 לתאי מארח Y2H המכילים את פלסמיד הפיתיון. כאשר טרנספורמנטים מופיעים, לבדוק אותם על ידי בדיקת צבע (הם צריכים להופיע לבן) ו כתם מערבי⁴ (הם צריכים לבטא חלבון בגודל הרצוי).
    הערה: השיטה הפוסט-אלקליין¹² היא דרך קלה ומהירה להכין תמצית של תאים שלמים משמרים.
14. אם שני הקריטריונים הנ"ל מתקיימים, לקבוע את אתר המוטציה של השיבוטים על ידי ריצוף נוקלאוטידים⁴.

לאחרונה, נמצא כי מחצית C-terminal של חלבון Pol2 (Pol2-C) אינטראקציה עם Mcm10. שני החלבונים חיוניים להתחלת שכפול DNA, ומכאן לצמיחת תאים בשמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. כדי לעזור להבין את המשמעות הביולוגית של אינטראקציה זו, מוטנטים Pol2-C שיש להם אינטראקציה ללא / מופחתת עם Mcm10 בודדו באמצעות השיטה המתוארת כאן.

ספריית מוטציות נבנתה על פי השיטה המתוארת בשלב 1. מקטעי DNA Pol2-C הוגברו באמצעות GoTaq פולימראז ושוכפלו לווקטור Gal4AD (pST2525) באמצעות האנזים In-Fusion. מספר השיבוטים העצמאיים בספרייה הוערך בכ-5,000.

כפי שמתואר בשלב 2, DNA של פלסמיד הספרייה הוכנס לזן המארח Y2H TAT-7, אשר עבר טרנספורמציה מראש עם פלסמיד LexA-Mcm10. התאים פוזרו על לוח SC-LW ושוכפלו ללוחות SC-LW ו-SC-LW+G418 למחרת. העותקים המשוכפלים היו כפופים לבדיקת הצבע כמתואר בשלב 3. חלק מהתוצאות של בדיקת הצבע מוצגות באיור 1C.

ארבעים ושבע מושבות שהיו לבנות במבחן הצבע ועמידות בפני G418 בודדו כמועמדות הראשונות מתוך כ-8500 טרנספורמנטים. הם נבדקו שוב עם בדיקת הצבע, ו-25 מתוך 47 השיבוטים אושרו כלבנים (איור 2A). 25 השיבוטים הללו נשמרו כמועמדים. דנ"א פלסמיד של מועמדים נלקח מכל אחד מ-25 המועמדים כמתואר בשלב 4. הם הוכנסו מחדש לתאי מארח שמרים Y2H המכילים LexA-Mcm10 ונבדקו עם בדיקת הצבע, ונבחרו 16 שיבוטים חסרי צבע. כדי לאשר עוד יותר כי אלה היו מוטציות מוטציה Pol2-C, הביטוי של חלבון Pol2-C אושר על ידי כתם מערבי. שנים עשר מועמדים הציגו רצועה במיקום כמעט זהה לזה של הבקרה החיובית (Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX fusion protein, מחושב m.w.: 158.8 kDa) (איור 2B). בדיקת הצבע הראתה ש-12 השיבוטים האלה לא קיימו אינטראקציה עם Mcm10 (איור 2C). לאחר קביעת רצפי הנוקלאוטידים של שיבוטים אלה, אושר כי לכולם הייתה מוטציה מוטעית. מספר המוטציות בחוש שגוי נע בין אחת לחמש (הנתונים אינם מוצגים). בממוצע, התרחשה מוטציה מוטעית אחת בכל 1000 בסיסים.

איור 1: סכמות של הגישה המבוססת על Y2H לסינון מוטנטים ריקים/לקויים באינטראקציה. (A) מערכת Y2H. (B) אסטרטגיה לבידוד מוטנטים ריקים/לקויים באינטראקציה. 1: וקטור Y2H החדש שנבנה מכיל עותק של הגן KanMX במורד הזרם של תג Y2H, תחום DB ו- AD. חשוב לציין, גן KanMX זה חסר קודון התחלה והוא מחוץ למסגרת עם תג Y2H. לכן, הגן KanMX אינו צפוי להתבטא מווקטור זה. כאשר מקטע DNA מוגבר PCR מוכנס לתוך הווקטור, הגן KanMX נמצא בתוך מסגרת עם תג Y2H ומבוטא. כתוצאה מכך, רק פלסמידים המכילים את האינסרט מסוג פרא או אינסרט עם מוטציה מוטעית יכולים לבטא את הגן KanMX, המקנה עמידות ל-G418. פלסמידים עם מוטציה שטותית או שינוי מסגרת אינם יכולים לבטא את הגן KanMX. 2: הספרייה המוטנטית שנבנתה בשלב 1 מוחדרת לתאי השמרים המארחים Y2H. כאשר מופיעים טרנספורמנטים, נוצרים העתקים. על ידי השוואת הביטוי של גנים של כתב ועמידות ל- G418, ניתן לבחור מועמדים של מוטנטים ריקים / לקויים באינטראקציה. (ג) דוגמה למיון. ספריית הפלסמיד, שכללה Gal4-AD ומקטע DNA Pol2-C שעבר מוטגניזציה של PCR, הוכנסה לזן המארח Y2H TAT-7, שעבר טרנספורמציה מוקדמת עם פלסמיד LexA-Mcm10. מוצגות תמונות של תאים לפני (משמאל) ואחרי (באמצע) בדיקת הצבע ושל תאים שגדלו על לוח SC-LW+G418 (מימין). דוגמאות למועמדים של מוטנטים ריקים/לקויים ומועמדים כוזבים מסומנות על ידי ראשי חץ לבנים ושחורים, בהתאמה. (D) רצף דנ"א סביב אתר השיבוט של וקטורי Y2H, AD (למעלה) ו-DB (למטה). הרצף מעשר חומצות האמינו האחרונות (aa) של התג Y2H (אדום) לחלק המתאים לעשר ה-aa הראשונות של KanMX (ירוק) מוצג. אתרי זיהוי של SmaI ו- BamHI מוצגים גם כן. המיקומים של פריימרים PCR מוצגים בתחתית כאשר אתר BamHI משמש כאתר השיבוט. אותם פריימרים חלים על שיבוט הגן המעניין לפלסמידים האחרים (pST2303/2523). נתון זה שונה מ Tanaka et al.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמה לתהליך הסינון של מוטציות אינטראקציה-ריקות/לקויות. (A) 47 המושבות שבודדו כשיבוטים מועמדים, כפי שמוצג באיור 1C, גדלו שוב על מדיום SC-LW המכיל G418 ועברו בדיקת צבע. +: שליטה חיובית (Wt Pol2-C), -: שליטה שלילית (וקטור). שיבוטים של מועמדים שמספרם 1-25 גודלו בתרבית כדי לשחזר פלסמידים. (B) פלסמידים נמצאו מכל שיבוט מועמד ב-(A), הוכנסו לתאי מארח Y2H, ושוב עברו בדיקת צבע. 16 מהם היו לבנים (חסרי צבע). מהם הוכנו תמציות של תאים שלמים, ובוצעה הדבקה מערבית עם נוגדן חד-שבטי אנטי-HA. המספר בלוח מתאים למספר ב- (A). בוצעו ניתוחים של מספר שיבוטים פלסמידים עצמאיים שנמצאו מכל מועמד למעט #6. (C) תוצאות בדיקת הצבע עבור 12 השיבוטים הסופיים. המספרים מתאימים לאלה שב-(A). #16, ששמר על האינטראקציה עם Mcm10, שימש כבקרה החיובית בבדיקת הצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימה של וקטורי Y2H המכילים KanMX מחוץ למסגרת עם התג Y2H.

קובץ משלים 1: דוגמה לתערובות ה-PCR, פרטי הפריימר ותנאי התגובה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.