מודל עכבר שונה של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית המשלבת חלון גולגולת דליל וכלי הקשה נוזליים

סיכום

פרוטוקול זה מציג מודל עכברי שונה של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית (rmTBI) הנגרמת באמצעות שיטת פגיעת ראש סגור (CHI). הגישה כוללת חלון גולגולת דליל וכלי הקשה נוזליים כדי להפחית את הדלקת הנגרמת בדרך כלל על ידי חשיפה לקרומי המוח, יחד עם שיפור יכולת השחזור והדיוק במידול rmTBI במכרסמים.

תקציר

פגיעה מוחית טראומטית קלה היא הפרעה נוירולוגית הטרוגנית מאוד מבחינה קלינית. מודלים של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) הניתנים לשחזור גבוה עם פתולוגיות מוגדרות היטב נחוצים בדחיפות לחקר המנגנונים של נוירופתולוגיה לאחר פגיעה מוחית טראומטית קלה ולבדיקת טיפולים. שכפול כל הסקאלה של TBI במודלים של בעלי חיים הוכח כאתגר. לכן, הזמינות של מודלים מרובים של בעלי חיים של פגיעה מוחית טראומטית נחוצה כדי להסביר את ההיבטים והחומרה המגוונים שנצפו אצל מטופלי TBI. CHI היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לייצור מודלים של מכרסמים של rmTBI. עם זאת, שיטה זו רגישה לגורמים רבים, כולל שיטת ההשפעה בה נעשה שימוש, עובי וצורה של עצם הגולגולת, דום נשימה בבעלי חיים, וסוג תמיכת הראש והאימוביליזציה בה נעשה שימוש. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים שילוב של חלון גולגולת דליל ושיטות פציעה של כלי הקשה נוזליים (FPI) כדי לייצר מודל עכבר מדויק של rmTBI הקשור ל- CHI. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא למזער גורמים שעלולים להשפיע על הדיוק והעקביות של מידול CHI ו- FPI, כולל עובי עצם הגולגולת, צורתה ותמיכת הראש. על-ידי שימוש בשיטה של חלון גולגולת דליל, דלקת פוטנציאלית כתוצאה מקרניוטומיה ו-FPI ממוזערת, והתוצאה היא מודל עכבר משופר שמשכפל את המאפיינים הקליניים שנצפו במטופלים עם TBI קל. תוצאות מניתוח התנהגותי והיסטולוגי באמצעות צביעת המטוקסילין ואוזין (HE) מצביעות על כך ש-rmTBI יכול להוביל לפגיעה מצטברת שמייצרת שינויים הן בהתנהגות והן במורפולוגיה הגסה של המוח. בסך הכל, rmTBI הקשור ל-CHI שעבר שינוי מציג כלי שימושי לחוקרים לחקור את המנגנונים הבסיסיים שתורמים לשינויים פתופיזיולוגיים מוקדיים ומפוזרים ב-rmTBI.

מבוא

פגיעה מוחית טראומטית קלה, כולל זעזוע מוח ותת-זעזוע מוח, מהווה את רוב מקרי TBI (>80% מכלל הפגיעה המוחית המוחית טראומטית)¹. פגיעה מוחית טראומטית קלה נגרמת בדרך כלל מנפילות, תאונות דרכים, מעשי אלימות, ספורט מגע (למשל, כדורגל, אגרוף, הוקי) ולחימה צבאית ^2,3. פגיעה מוחית טראומטית קלה יכולה להוביל לאירועים נוירוביולוגיים המשפיעים על תפקודים נוירו-התנהגותיים לאורך חיי המטופל ולהגביר את הסיכון למחלות נוירודגנרטיביות ^4,5,6. מודלים של בעלי חיים מספקים אמצעי יעיל ומבוקר לחקר TBI קלה, בתקווה לשפר עוד יותר את האבחון והטיפול ב-TBI קלה. פותחו מודלים שונים לפגיעה מוחית טראומטית קלה, כגון פגיעה מבוקרת בקליפת המוח (CCI), ירידה במשקל (WD), פגיעה בכלי הקשה בנוזלים (FPI) ומודלים^של פיצוץ-TBI ^7,8. אין מודל ניסויי יחיד שיכול לחקות את כל המורכבות של פתולוגיה הנגרמת על ידי TBI ^9,10. ההטרוגניות של מודלים אלה מועילה לטיפול בתכונות המגוונות הקשורות לחולי TBI קלים ולחקירת המנגנונים התאיים והמולקולריים המתאימים. אולם לכל מודל של פגיעה מוחית טראומטית בבעלי חיים^{יש מגבלות 3}, המגבילות את הידע הנוכחי שלנו בנוגע לפגיעה מוחית טראומטית קלה בבעלי חיים ואת הרלוונטיות הקלינית שלהם.

המודלים של WD ו-CCI משמשים לשכפול מצבים קליניים כגון אובדן רקמה מוחית, המטומה תת-דוראלית חריפה, פגיעה אקסונלית, זעזוע מוח, תפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח ואפילו תרדמת לאחר TBI ^3,11,12. מודל WD כרוך בגרימת נזק מוחי על ידי פגיעה בדורה מאטר או בגולגולת עם משקולות הנופלות בחופשיות. ההשפעה של חפץ משוקלל על גולגולת שלמה יכולה לשכפל פציעות מוקדיות/מפוזרות מעורבות; עם זאת, שיטה זו קשורה לדיוק ירוד וחזרתיות של אתר הפציעה, פציעת ריבאונד ושיעור תמותה גבוה יותר עקב שברים בגולגולת ^3,11,12. מודל CCI כולל שימוש במתכת מונעת אוויר כדי לפגוע ישירות בדורה מאטר החשוף. בהשוואה לדגם WD, מודל CCI מדויק יותר וניתן לשחזור, אך הוא אינו מייצר פגיעה דיפוזית בשל הקוטר הקטן של קצה¹¹ הפוגע. במהלך מידול FPI, רקמת המוח נעקרת לזמן קצר ומעוותת על ידי כלי הקשה. FPI יכול לגרום לפגיעה מוקדית/מפושטת מעורבת ולשכפל דימום תוך גולגולתי, נפיחות במוח ונזק מתקדם לחומר אפור לאחר TBI. עם זאת, ל-FPI יש שיעור תמותה גבוה עקב נזק לגזע המוח ודום נשימה ממושך ^3,12. הקרניוטומיה המעורבת במודלים קונבנציונליים של WD, CCI ו- FPI עלולה להוביל לחבלה בקליפת המוח, נגעים דימומים, נזק למחסום הדם-מוח, חדירת תאי חיסון, הפעלת תאי גלייה, זמן מידול ממושך ותוצאות קטלניות אפשריות ^3,12.

TBI קלה מאופיינת בציון GCS (סולם תרדמת גלזגו, GCS) בטווח של 13 עד 15². פגיעה מוחית טראומטית קלה יכולה להיות מוקדית או מפוזרת, והיא קשורה הן לפציעות אקוטיות, כגון פירוק הומאוסטזיס תאי, אקסיטוטוקסיות, דלדול גלוקוז, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, הפרעה בזרימת הדם ונזק אקסונלי, כמו גם פציעות תת-חריפות, כולל נזק אקסונלי, דלקת עצבית וגליוזיס ^2,3. למרות התקדמות משמעותית בתיאור הפתופיזיולוגיה המורכבת של TBI, המנגנונים הבסיסיים של TBI/rmTBI קלים נותרו חמקמקים ודורשים חקירה נוספת⁹. בהתחשב בכך ש-CHI הוא הסוג הנפוץ ביותר של TBI¹², פרוטוקול זה מציג גישה חדשנית ליצירת מודל עכבר מבוקר בצורה מדויקת יותר של rmTBI באמצעות התקן FPI שונה לביצוע פגיעה בחלון גולגולת דליל¹³. על ידי הימנעות מפציעות הנגרמות על ידי קרניוטומיה, עובי גולגולת משתנה ואי דיוקים הנגרמים על ידי צורה, ופציעות ריבאונד, גישה זו שואפת להתגבר על החסרונות העיקריים הקשורים למודלים WD, CCI ו- FPI. יישום השפעת FPI על חלון הגולגולת הדק נוח להערכת נזק לכלי דם מוחיים בעקבות rmTBI ועוזר למזער שיעורי תמותה גבוהים במודלים מסוימים, וכתוצאה מכך דומה יותר למאפיינים הקליניים של חולי TBI.

פרוטוקול

כל ההליכים המעורבים בפרוטוקול זה בוצעו תחת אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אוניברסיטת ג'ג'יאנג הרגילה, מספר היתר, dw2019005) ובהתאם ל- ARRIVE ולמדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. מפרט טכני ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. נוהל טיפול בבעלי חיים

1. לשכן עכברים בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס, לחות הנעה בין 40%-60%, מחזור אור/חושך של 12 שעות, ולספק גישה אד ליביטטום למים וצ'או עכבר סטנדרטי. לצורך ניסוי זה נעשה שימוש ב-25 עכברי ICR זכרים (בני 25-30 גרם, בני 8 שבועות).
2. הקצו את העכברים באופן אקראי לקבוצת הביקורת (n=12) או לקבוצת rmTBI (n=13). כדי למנוע תוקפנות פוטנציאלית מעכברי דמה כלפי עכברים שעברו rmTBI, הפרידו אותם בכלובים נפרדים.
3. תנו לעכברים לפחות שבוע להתאקלם בסביבת הכלוב שלהם לפני תחילת הניסוי. תקופת הסתגלות זו מבטיחה שהעכברים יכירו את סביבתם וממזערת את ההשפעות האפשריות של לחץ או חרדה על תגובות פיזיולוגיות או התנהגותיות במהלך המחקר.

2. הכנת מכשיר TBI

1. ייצור מודל rmTBI בעכברים באמצעות התקן FPI שונה (ראה טבלת חומרים; איור 1A) ¹³. לפני השימוש במכשיר FPI, בדוק היטב את כל החיבורים לאיתור סימני דליפה או סדיקה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לצמתים שבין הצילינדר לצינור, ובין המחבר התלת-כיווני לצינור. כדי לקבוע את לחצי הפגיעה במדויק, הותקן מתמר לחץ עד לנקודת הפגיעה במכשיר הפגיעה בנוזל^{הקשה 13}.
2. ערכו בדיקה קפדנית של התקן ה-FPI כדי לוודא שהבוכנה נעה בצורה חלקה בתוך הצילינדר ושההשפעות יכולות להתבצע ביעילות (איור 1B). ודא שאין בועות אוויר בתוך המערכת. אם מזוהות בועות אוויר, יש להוסיף בזהירות מים מזוקקים למערכת באמצעות מזרק 50 מ"ל ולסלק את בועות האוויר על ידי דחיפה מהירה של מוט הצילינדר דרך מחבר תלת כיווני סמוך ו/או דרך המזרק.
   הערה: מערכת FPI מורכבת ממים מזוקקים בתוך הגליל וצינורות מחוברים. חיוני לכייל את המכשיר לפני הפעולה כדי להבטיח דיוק ואמינות של התוצאות.

3. הכנת גולגולת מדוללת

הערה: אין לבצע ניתוח בעלי חיים והכנת גולגולת מדוללת לאור עכברים אחרים. חלון הגולגולת הדליל שימושי להערכת נזק לכלי דם מוחיים לאחר הליך FPI.

1. לעמוד בדרישות מרכז החי על ידי הנחיית מפעיל הניסוי ללבוש חלוק סטרילי ומסכה במהלך כל הליכי הטיפול בבעלי חיים.
2. יש לחטא את משטח ספסל המעבדה, מכשיר ה-FPI, צינורות ההרדמה והחלל הנגדי הסמוך לפני תחילת הניסוי באמצעות תרסיס אתנול 70%.
3. שקלו את העכברים הן בקבוצת הדמה והן בקבוצת ה-rmTBI לפני הניתוח והשוו את משקלם לאלה שתועדו שבוע לפני הניסוי. אל תכלול במחקר כל עכבר המציג בריאות לקויה כגון פרווה גסה, שלשולים, ירידה במשקל או עייפות. בנוסף, אין לכלול עכברים ששוקלים פחות מ-20 גרם כדי להבטיח את יכולתם לסבול פגיעות חוזרות. אמצעים אלה חיוניים לשמירה על רווחת בעלי החיים ולהבטחת תוצאות ניסוי אמינות.
4. מרדימים עכברים עם איזופלורן 4%-5% (ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה) למשך 3-4 דקות בתא זירוז. יש לתת חומר סיכה אופתלמי (ראו טבלת חומרים) לעיני בעל החיים כדי לשמור על שימון לאורך כל הניתוח. כדי להקל על הכאב, יש לתת בופרנורפין תת עורית (0.05 מ"ג/ק"ג) בנקודת האמצע בין האוזניים 20 דקות לפני ההרדמה ולאחר מכן כל 6 שעות למשך 24 שעות. יתר על כן, בתום ההרדמה, יש לתת מנה תת עורית אחת של 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן לכל בעל חיים.
5. יש לחטא את הראש לאחר שהעכבר איבד את רפלקסי הנסיגה הימניים והדוושות. חותכים את הפרווה על ראש העכבר באמצעות מספריים כירורגיים ומשתמשים במכונת גילוח כדי להסיר את הפרווה שנותרה. יש לחטא את הקרקפת בשלושה מריחה רציפה של 2% כלורהקסידין, בשילוב עם 75% פילינג אתנול.
6. הניחו כרית כירורגית סטרילית חד פעמית מתחת לבעל החיים וסביבתו כדי להבטיח היגיינה נאותה. בצעו חתך בקוטר 1.5 ס"מ בעזרת מספריים כירורגיים קטנים לאורך קו האמצע של קרקפת העכבר כדי לחשוף באופן מלא את אתר הניתוח (איור 2A).
7. אבטחו את העכבר באמצעות מוטות אוזניים לא טרמינליים במסגרת סטריאוטקסית קונבנציונלית (ראו טבלת חומרים). התאם את מיקום ראש העכבר במסגרת סטריאוטקסית ברמה שטוחה או בזווית הטיה קלה בהתאם לאזור המטרה הספציפי שייחקר. יש לנקות את הפרווה מאזור הניתוח כדי למנוע דלקת בהמשך.
8. שמור על טמפרטורת הגוף של העכבר על 37 ° C באמצעות כרית חימום איזותרמית קונבנציונלית (ראה טבלה של חומרים).
9. במהלך תהליך ההתקנה של מרכז הניתוח והאימפקט (Luer Lock נשי), יש לשמור על הרדמת עכבר (ללא תגובה לצביטת הבוהן או הזנב) עם חרוט אף המספק ריכוז איזופלורן רציף של 2%, המווסת על ידי וופורייזר מכויל.
10. נקו את אזור הניתוח סביב חלון הגולגולת הדק בזהירות באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח.
11. צרו חלון גולגולת דק, בקוטר של כ-2.5 מ"מ ובעובי של 20 מיקרומטר, בקליפת המוח המוטורית הקדמית הימנית באמצעות מקדח מיקרו שטוח (ראו טבלת חומרים, איור 2B) ולהב מיקרו-כירורגי. מקמו את אתר הניתוח בקוטר 1.5 מ"מ קדמי לברגמה ו-1.3-2.0 מ"מ רוחבי לקו האמצע (איור 2C).
    1. כדי למנוע ממקדח המיקרו לחדור לגולגולת במהלך יצירת חלון הגולגולת הדליל, יש להרטיב לסירוגין את הגולגולת במי מלח תוך כדי שחיקה עם מקדחת המיקרו.
    2. אשרו את עובי הגולגולת על ידי חיטוט עדין בגולגולת הדקה עם הקצה השטוח של מחט מזרק עדינה והערכת רכותה. להעריך את הבהירות של micro-vessels קליפת המוח חשופים חזותית כדי לקבוע את עובי הגולגולת.
    3. כדי לוודא את עובי הגולגולת, יש למרוח מי מלח סטריליים על האזור הדליל ולבדוק ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ נתיחה קונבנציונלי (ראו טבלת חומרים). טכניקה זו יכולה לעזור להבטיח כי הגולגולת היתה מדוללת כראוי.
       הערה: יש לשמן את עין העכבר לאורך כל תהליך הכנת הגולגולת הדקה ומידול rmTBI כדי למנוע התייבשות. דילול הגולגולת לפחות מ-15 מיקרומטר טומן סיכון לטראומה קלה בקליפת המוח, שעלולה לגרום לדלקת קלה בקליפת המוח¹⁴.
12. חברו מנעול Luer נקבי מותאם (בקוטר פנימי של 2.2 מ"מ, שנוצר ממרכז מחטים של 19G, כפי שמוצג באיור 2D) לאתר הגולגולת הדלילה. אבטחו את מנעול Luer באמצעות דבק וצמנט דנטלי (איור 2E).
    הערה: כאשר משתמשים בדבק כדי לאבטח את מנעול הלואר הנשי לאזור שמסביב לחלון הגולגולת הדלילה, חשוב לייבש היטב את אזור הגולגולת, ולמנוע מהדבק להיכנס לחלון עצמו. דבק בתוך החלון יכול להפחית באופן משמעותי את כוח ההשפעה של FPI.

4. הליך מידול rmTBI הקשור ל- CHI

1. הציגו את rmTBI באמצעות שיטת כלי ההקשה של הנוזל הצידי עם התקן FPI שונה כפי שתואר קודם לכן^13,15.
2. לאחר השלמת חלון הגולגולת הדק ונהלי רכזת ההשפעה, העבר את העכבר מהמנגנון הסטריאוטקסי לפלטפורמת המשפיעה.
3. בהתחשב בהשפעות האפשריות של הרדמה על זמן רפלקס התיקון של בעלי חיים וחומרת הפציעה לאחר הקשה ^9,16, עקבו אחר עומק ההרדמה על-ידי הערכת רפלקסי הנסיגה של המישוש והכפות (איור 2F).
4. חברו את נקבת Luer Lock, שהודבקה על חלון הגולגולת הדלילה, לזכר Luer Lock בקצה צינורות מכשיר ה-FPI (איור 2G).
   הערה: במידול rmTBI, ההרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן בעכברים הייתה ממושכת עקב השראת דום נשימה וחוסר הכרה על ידי כלי הקשה.
5. הציגו שתי TBI קלות (מרווח של 48 שעות) עם ההתקן שהשתנה. יש לבצע את פגיעת ה-FPI הראשונה מיד לאחר השלמת ניתוח חלון גולגולת דליל והתקנת מנעול Luer. בצעו את השפעת ה-FPI רק לאחר שהעכבר מראה חזרה של רפלקס נסיגה לצביטה בכפה בכל פעם (איור 2H). החלת השפעת FPI בעכברים מורדמים עמוקות עלולה לגרום לדום נשימה ממושך ולמוות.
   1. כדי להחיל את השפעת FPI, הרם את המטוטלת לדרגה המיועדת לאורך המושך במכשיר ושחרר את המטוטלת באמצעות בקרת תוכנה^13,15. ההשפעה צריכה להגיע לעוצמת הקשה של 2.0 ± 0.1 אטמוספרה, בהתאם לפרוטוקולים מבוססים המשמשים במחקרי מכרסמים 10,17,18. אין לכלול בעלי חיים בבדיקות נוספות אם הפגיעה לא נרשמה בין 1.9-2.1 אטמוספירה או אם שבר בגולגולת התרחש במהלך FPI.
   2. עבור עכברי הדמה, קבע אותם על המנגנון, אך אל תעביר את הפגיעה.
6. לאחר הפגיעה, נתקו מיד את חיבור Luer Lock והעבירו עכברים לכרית חימום איזותרמית לצורך התאוששות. לאחר שהעכבר חוזר לערנות ולהכרה, החזירו אותו לכלוב הביתי שלו מבלי להסיר את מנעול הלואר הנקבי. נהל את השפעת ה- FPI השנייה, באותו אופן, 48 שעות מאוחר יותר.
7. לאחר בדיקת ה-rmTBI, הסירו בזהירות את מנעול הלואר הנשי ואת מלט השיניים. תפרו את הקרקפת באמצעות דבק רקמות והשתמשו במלקחיים שטוחים כדי לצבוט את הקרקפת כדי להקל על תהליך ההדבקה (ראו טבלת חומרים; איור 2I).
8. כדי למנוע דלקת, זיהום ולהקל על כאבים ואי נוחות לאחר הניתוח, יש למרוח תערובת של משחה אריתרומיצין ונתרן דיקלופנק ביחס של 1:1 (ראו טבלת חומרים) על הפצע. מעבירים עכברים לכרית חימום איזותרמית להתאוששות.
9. רשום את משך הזמן של רפלקס הימין, שמתחיל כאשר העכבר מוסר מהמנגנון הסטריאוטקסי ומונח לרוחב על פלטפורמת ההשפעה עבור FPI וממשיך עד שהעכבר יכול לעמוד זקוף באופן עצמאי.
10. לאחר שהעכבר חוזר לערנות ולהכרה, החזירו אותו לכלוב הביתי שלו. עכברים בדרך כלל נמצאים בהכרה מלאה ומסוגלים ללכת תוך שעה וחצי לאחר הפציעה.
11. בימים שלאחר מידול TBI יש לבחון בעכברים סימנים שונים, כולל דפוסי נשימה, נוכחות של ריר סביב האף והפה, ואדמומיות, נפיחות, הפרשה או פתיחה מחדש של אזור הפצע. אין לכלול בעלי חיים במחקר עם אחד או יותר מהתסמינים החריגים לעיל.
    הערה: קדם-מיקרו-הזרקה של AAV-GCaMP6s מאפשרת תצפית על הומאוסטזיס עצבי Ca2+ בסיסי ועוררות בקליפת המוח הפגועה דרך חלון הגולגולת הדק באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני¹⁵.

5. בדיקת מבוך מים מוריס (MWM)

הערה: MWM (ראו טבלת חומרים) היא שיטה מוכרת להערכת למידה מרחבית וליקויי זיכרון בעכברים לאחר TBI.

1. בצע את בדיקת MWM החל מ-7 ימים לאחר הפציעה (DPI). הבריכה העגולה של MWM הייתה בקוטר של 120 ס"מ וגובה של 50 ס"מ, כאשר טמפרטורת המים נשמרה על 25 מעלות צלזיוס. מפרידים את הבריכה המעגלית לארבעה רבעים, כאשר משטח המילוט, משטח עגול בקוטר 6 ס"מ וגובה 30 ס"מ, שקוע 1 ס"מ מתחת לפני המים ברביע הצפוני-מזרחי.
2. מקם מצלמה ישירות מעל הבריכה המעגלית כדי לתעד את מסלול התנועה של העכברים. סמן את העכברים עם סרט שחור על גבם כדי להקל על זיהוי על ידי תוכנת רכישת התמונה ולהקלטת נתונים, כולל השהיה, מרחק השחייה ומסלול התנועה.
3. הכניסו את העכברים למים, כשפניהם לקיר הפנימי של כל אחד מארבעת הרבעים, פעם אחת לכל רביע. ברגע שהעכברים מוצאים את הרציף, הרשו להם לנוח שם במשך 10 שניות. אם עכבר לא מצליח למצוא את הפלטפורמה תוך 60 שניות, בקש מהמפעיל להנחות את העכבר לפלטפורמה, לאפשר לו לנוח על הפלטפורמה במשך 10 שניות, ולאחר מכן להחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו למנוחה.
4. חזור על כל עכבר על גירסת הניסיון לרכישה 4 פעמים ביום. לאחר ניסויי הרכישה, ב-12 DPI, ערכו ניסוי גשושית מרחבית של 60 שניות ותיעדו את מספר הפעמים שהעכברים חצו את אזור הפלטפורמה המקורי ואת משך השהייה של העכבר ברביע שבו נמצאה הפלטפורמה.
5. לאחר כל ניסוי, יבשו במהירות את העכברים עם מגבת או הניחו מתחת למנורה מחממת כדי לשמור על טמפרטורת גופם ולמנוע היפותרמיה במהלך ניסוי הרכישה של שנות ה-60 מ-DPI 7 ל-DPI 11.
6. לאחר השלמת הליכי הניסוי המתוארים לעיל, מרדימים את העכברים עם pentobarbital (45 מ"ג / ק"ג, כלומר p.) ב 13 DPI. תמיסת מלח איזוטונית טרנסקרדילית, ואחריה זילוח עם 4% פרפורמאלדהיד במי מלח חוצצים פוספט (pH 7.2). אחזר את המוח עבור צביעת HE קונבנציונלית כדי להעריך שינויים גס במורפולוגיה של קליפת המוח וההיפוקמפוס. תיאור מפורט של פרוטוקול הצביעה של HE ניתן למצוא בפרסומים קודמים^13,15.
7. לאחר השלמת כל הניסויים, יש להרדים עכבר על ידי הזרקת מנת יתר של פנטוברביטל (≥100 מ"ג/ק"ג, כלומר אם אין צורך בדגימות עכבר. לפני קצירת רקמות או להיפטר הפגר, לפקח על העכבר עד שאין פעימות לב לפחות 60 שניות.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מתאר שיטה להשראת rmTBI דרך חלון גולגולת דליל, אשר מציעה פתרון לפגיעה המוחית הנגרמת על ידי הכנת קרניוטומיה במהלך מידול TBI קונבנציונלי של כלי הקשה. על ידי שימוש בהליך הקשה נוזלי שונה זה עם המכשיר ששונה, הושגו דיוק משופר ויכולת שחזור של השפעת FPI¹³. למשפיע השונה יש את הרבגוניות לשימוש הן במידול CHI והן במידול FPI, עם או בלי קרניוטומיה של הגולגולת. יתר על כן, חומרת הפציעה מווסתת על ידי התאמת פרמטרים לפציעה, כגון זווית הנפילה של מטוטלת הפגיעה, או על ידי הוספת רפידות קצף אתילן-ויניל אצטט סגורות נוספות בקשיות משתנה ללוחית הקצה של מוט הבוכנה.

מודל rmTBI השונה מספק יתרונות משמעותיים, כגון יצירת פתולוגיה מוקדית ומפוזרת מבלי לחשוף את הדוראל קליפת המוח, אשר ממזער דלקת מחשיפה לקרום המוח ו / או FPI ישיר על פרנכימה. יתר על כן, מודל זה מפחית שינויים בעובי עצם הגולגולת וצורתה כדי לייצר תוצאות פציעה אמינות. לכן, מודל rmTBI המותאם יעיל ואמין בהדמיית ליקויים נוירופתולוגיים והתנהגותיים רלוונטיים מבחינה קלינית (PCS) הקשורים לסימפטומים נוירופתולוגיים והתנהגותיים בדרגות פציעה שונות. בפרט, מודל זה שימושי לחקר מנגנונים פתולוגיים של TBI המסתמכים על דיוק ויכולת השחזור של מודלים של TBI בבעלי חיים, במיוחד לחקר מנגנונים קלים הקשורים ל-TBI.

הענף הצידי הקדמי של עורק המוח האמצעי של העכבר ווריד הרינל הקאודלי¹⁹, הממוקם מתחת לגולגולת הדקה, איפשר הדמיה ברורה מתחת למצלמה. לאחר שתי בדיקות הקשה של rmTBI, כל אחת בלחץ של כ-2.0 אטמוספירה, כל העכברים הציגו המטומות תת-דוראליות ב-0 DPI. למרות שנראה כי שלמות הגולגולת הדקה לא נפגעה; עם זאת, נצפתה ירידה במספר כלי הדם הזעירים לצד שינויים במורפולוגיה של כלי הדם הזעירים (איור 2H), כפי שדווח קודם לכן¹⁵. על ידי 2 DPI, המטומות נפתרו במידה רבה. התמותה נובעת בעיקר מפגיעה בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה, מה שעלול להאריך משמעותית את דום הנשימה. הערכה קבועה של עומק ההרדמה לפני הפגיעה דרך רפלקסי הנסיגה של המישוש והכפות יכולה להפחית באופן משמעותי את התמותה. גורמים נוספים שיכולים להשפיע על שיעורי התמותה לאחר הקשה נוזלית כוללים מתח עכבר, קשיות הגולגולת, מין וגיל. במחקר קודם שהשתמש באותו פרוטוקול rmTBI, עכבר C57BL/6J אחד מת^{בגיל 15}. בפרוטוקול זה, רק עכברי ICR זכרים נוצלו כדי להציג את כל ההליכים.

מחקרים בבני אדם ובבעלי חיים כאחד הראו כי אפילו פגיעות ראש תת-זעזועיות חוזרות ונשנות יכולות לגרום לפציעות מיקרו-מבניות נרחבות של חומר לבן^20,21,22, אשר קשורות לביצועים קוגניטיביים גרועים יותר^21,22. ב-7-12 DPI, rmTBI יכול לייצר ליקויים בלמידה מרחבית ובזיכרון, שנבחנו באמצעות פרדיגמת MWM. איור 4 ממחיש את התוצאות שהתקבלו מהערכה זו.

ניתוח ניסוי הרכישה האחרון ב-MWM הראה עלייה משמעותית (p< 0.05) בהשהיה של עכברי rmTBI להגיע לפלטפורמה השקועה, בהשוואה לקבוצת הביקורת. בניסוי הבדיקה, ניתוח אחוז הזמן שבילה ברביע הפלטפורמה המקורי הראה ירידה משמעותית (p<0.01) בקבוצת rmTBI ביחס לקבוצת הביקורת, מה שמצביע על ירידה ביכולות למידת הייחוס המרחבי והזיכרון בעכברים עם rmTBI.

השיטה המתוארת כאן שימשה בפרסום מוקדם יותר¹⁵ באמצעות עכברי C57BL/6J. מלבד MWM נערכו שלושה ניתוחים נוספים כמתואר להלן.

ה-OFT שימש להערכת יכולות תנועה וחקר על ידי מדידת מהירות הנסיעה הממוצעת, המרחק הכולל שעבר ואחוז המרחק שעבר באזורי המרכז. ערוך מבחן שדה פתוח (OFT) ב- 6 DPI כדי להעריך תנועה, חקירה וחרדה בעכברים. מכשיר הבדיקה בגודל 40 x 40 x 40 ס"מ, אשר חולק ל -16 אזורים (כל אחד בגודל 18 x 18 ס"מ). העכבר הוצב במרכז המכשיר והורשה לחקור בחופשיות במשך 5 דקות. תיעוד המרחק שעבר במרכז 4 האזורים, המרחק הכולל שנסע, מהירות התנועה הממוצעת והזמן שבילה באזורי הגבול נעשה. רמות החרדה הוערכו בהתבסס על אחוז המרחק שנסעו באזורים המרכזיים והזמן שבילו מכרסמים באזורים הגובלים במהלך תקופת תצפית של 5 דקות. ב-6 DPI, ייתכן של-rmTBI לא תהיה השפעה משמעותית על יכולות הקטר הכלליות של העכברים, הוא יכול לעורר חרדה משמעותית ולשנות התנהגות חקרנית, כפי שמוצג באיור 4¹⁵. יתר על כן, מודל rmTBI השונה גורם לפציעות אקסונליות מפוזרות, אשר ניתן להעריך באמצעות מבחנים התנהגותיים נוספים, כגון מבחן היכולת הקוגנטיבית המתואר בפרוטוקול זה.

הוכח כי RmTBI פוגע בעבודה מרחבית ובזיכרון ייחוס בעכברים, כפי שמודגם באיור 5¹⁵. תפקודים קוגניטיביים אלה הוערכו באמצעות מבחן מבוך Y. הבדיקה בוצעה ב 8 DPI כדי למדוד ליקויים בזיכרון עבודה לטווח קצר בעכברים. להתנהגות חלופית ספונטנית: נעשה שימוש במכשיר מבוך Y אקרילי (20 ס"מ גובה, 50 ס"מ אורך ו-10 ס"מ רוחב בתחתית). לאחר הנחת העכבר במרכז המכשיר ולאפשר לו לחקור במשך 8 דקות, נרשמו ערכי הזרוע. התנהגות החלפה ספונטנית מוגדרת ככניסה רצופה של העכבר לשלוש הזרועות בשלישיות. חשב את קצב ההחלפה הספונטנית (%) כ- (שלישיות עוקבות / המספר הכולל של ערכי זרוע פחות 2) x 100. עבור זיכרון ייחוס מרחבי, במהלך אימון של 8 דקות, סגור באופן אקראי זרוע אחת של מכשיר מבוך Y. לאחר שעה לאחר החשיפה הראשונית, העכבר מוכנס מחדש למבוך עם כל שלוש הזרועות פתוחות ומאפשר לו לחקור בחופשיות במשך 3 דקות. הזמן המושקע בחקירת הזרוע החדשה לעומת שתי הזרועות האחרות מתועד. חשב את מדד ההעדפות כזמן שהוקדש בזרוע הרומן לעומת הזמן שהוקדש בכל שלוש הזרועות.

יתר על כן, אנו מציעים להעריך נגעים מבניים גסים במוח באמצעות צביעת HE פשוטה (איור 6)¹⁵ לאחר השלמת כל המבחנים ההתנהגותיים. השתמש באזור קליפת המוח בחתך קורונלית מ-1 מ"מ קדמי לאתר הנגע עד השוליים האחוריים של הנגע, ובאזור ההיפוקמפוס בחתך קורונלי באזור בצורת חצי סהר טיפוסי (ברגמה: -1.7 עד -2.2 מ"מ). ספירת תאי עצב בכל שקופית משישה שדות אקראיים באמצעות רשת עינית (הגדלה של 400x) וממוצע המספר העצבי סיפקו את צפיפות המספרים לכל שדה ראייה (צפיפות מספרית). נמצא כי אזורי המוח המושפעים מ-rmTBI מפגינים דרגות שונות של פגיעות נוירונים¹⁵. באופן ספציפי, קליפת המוח המוטורית הדגימה כמות חזקה ומגוונת יותר של פגיעות כאלה מאשר ההיפוקמפוס. צביעת HE הראתה שינוי ניכר לכיוון מורפולוגיה פיקנוטית מתאי עצב רגילים (איור 6A,B,E,F). יתר על כן, המטריצה החוץ-תאית נצפתה משתחררת במיוחד באזור הנגע (איור 6F). מלבד האזורים שנצפו משוחררים במטריצה, עכברי rmTBI הראו גם עלייה משמעותית בכתמים היפרכרומיים, הנראים כצבע אדום כהה יותר, במספר משמעותי של נוירונים תת-גרעיניים בבליטה המשוננת ובכמה נוירונים בקליפת המוח ו-CA1. באופן מסקרן, דפוסי הצביעה האלה לא הציגו סימנים נלווים להתכווצות ציטופלזמית או לגרעין פיקנוטי (איור 6C,D,G,H,K⁾¹⁵. שיטות הצביעה ההתנהגותיות (למעט בדיקת WMM) ושיטות הצביעה של HE שהוזכרו לעיל פורטו בפרסום שנערך לאחרונה, אשר הציג את מודל rmTBI¹⁵ שונה.

איור 1: מכשיר ה-FPI שהשתנה וצילום המסך של התוכנה. (א) התקן ה-FPI שהשתנה. (B) צילום המסך מציג את צורת הגל של לחץ FPI ואת המדידה והייצוא האוטומטיים של פרמטרים של לחץ השפעה בזמן אמת כגון זמן עלייה, זמן נפילה ומשך חצי רוחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מודל העכבר שעבר שינוי של rmTBI בעכברי ICR. (A) חתך בקו האמצע נעשה כדי לחשוף את אזור הניתוח. (B) חלון גולגולת דק יוצר על קליפת המוח המוטורית. הבהירות של micro-vessels קליפת המוח חשופים משמש כדי לקבוע את עובי הגולגולת. (C) ניתן לאמת את עובי הגולגולת גם על ידי בדיקה עדינה של הגולגולת הדקה עם הקצה השטוח של מחט מזרק עדינה והערכת רכותה. (D) נקבת מנעול הלואר הודבקה לחלון הגולגולת הדלילה. (ה) מנעול הלואר הצמוד אובטח על ידי מריחת מלט דנטלי. (F) עומק ההרדמה נוטר על ידי בדיקת רפלקסי הנסיגה של המישוש והכפה. (G) השפעת ה-FPI נמסרה לאחר החזרת רפלקס נסיגה לצביטת כפה. (H) תמונת פוסט-rmTBI של חלון גולגולת דליל ב-0 DPI. (I) הקרקפת נתפרה בדבק רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ההשפעות של rmTBI על למידת ייחוס מרחבית וזיכרון בעכברי ICR. (A) מעקב הניווט של עכברים במהלך ניסוי הרכישה האחרון שתועד ב-11 DPI, (B) מסלול הגשושית המרחבי בניסוי הגשושית שתועד ב-12 DPI, ו-(C) זמן הבריחה שלקח לעכברים לאתר את הפלטפורמה במהלך ניסוי הרכישה האחרון. התוצאות הראו שלקבוצת rmTBI לקח זמן רב יותר להגיע לפלטפורמה הנסתרת מאשר לקבוצת הביקורת (p<0.05). (D) אחוז הזמן שהעכברים שהו ברביע הפלטפורמה המקורי ביחס לזמן הניווט הכולל במהלך ניסוי הגשושית היה נמוך משמעותית בקבוצת rmTBI מאשר בקבוצת הביקורת (p<0.01). n=8. *p<0.05, **p<0.01 לעומת בקרה על ידי מבחן t לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ההשפעות של rmTBI על תנועה, חקירה וחרדה בעכברי C57BL/6J. (A) עקבות מייצגים של בקרת שליטה ותנועת עכברי rmTBI במהלך 5 דקות OFT. (ב-ה) הנתונים המסוכמים מראים את מרחק הנסיעה באזורי המרכז, סך מרחק הנסיעה, מהירות הנסיעה הממוצעת וזמן השהייה באזורי הפריפריה, בהתאמה. שליטה, n=13; rmTBI, n = 12. עמ<. 01 לעומת שליטה על ידי מבחן t לא מזווג. נתון זה שונה^מ-15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ההשפעות של rmTBI על זיכרון עבודה מרחבי וזיכרון ייחוס בעכברי C57BL/6J. (א, ב) עקבות מייצגים של בקרת שליטה ותנועת עכברי rmTBI במהלך העבודה המרחבית והערכות זיכרון הייחוס במבוך Y. מבחן ההחלפה הספונטנית של מבוך Y הוא שיטה נפוצה להערכת זיכרון לטווח קצר במודלים של מכרסמים¹⁵. (C) סיכום של שיעורי החלפה ספונטניים של עכברי בקרה ו-rmTBI במהלך הערכת עבודה מרחבית. מכרסמים בדרך כלל מעדיפים לחקור זרוע חדשה של המבוך מאשר לבקר מחדש בזרוע שהם כבר חקרו. מדד העדפות מחושב על סמך הזמן שהמכרסם שהה בזרוע החדשה לעומת הזמן שבילה בכל שלוש הזרועות, ולאחר מכן מנתחים מדד זה. (D) סיכום מדד ההעדפות של עכברי בקרה ו-rmTBI במהלך הערכת העבודה המרחבית. שליטה, n=13; rmTBI, n=12. עמ<. 01 לעומת שליטה על ידי מבחן t לא מזווג. נתון זה שונה^מ-15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השוואה בין צביעת HE של קליפת המוח המוטורית הפגועה איפסילטרלית ותת-אזור הפיתול המשונן בהיפוקמפוס בין בקרה ל-rmTBI בעכברי C57BL/6J. (א, ב) קליפת המוח המוטורית הרגילה; ו-(C, D) אזור ההיפוקמפוס של עכברי ביקורת בהגדלות שונות. (ה, ו) קליפת המוח המוטורית הפגועה ואזורי ההיפוקמפוס (G, H) של עכברי rmTBI. נוירונים היפרכרומיים בקליפת המוח וב-CA1 עשויים להיות מושפעים מעט מהכנה לניתוח או מ-rmTBI מתמשך; עם זאת, נוירונים היפוכרומיים (אולי פצועים בינוניים) ופיקנוטיים (נוירונים אפופטוטיים) נצפו בקליפת המוח המוטורית של עכברי RMTBI בהשוואה לנוירונים רגילים בעכברי הביקורת. תכונות אפופטוזיס עצביות אלה כללו ציטופלזמה עצבית והתכווצות גרעין, מלווה בהתוודקות לכאורה. יש לציין כי הקו הלבן התיחום ב-(E) מייצג את הגבול בין הנגע לבין הרקמה הסובבת אותו. בנוסף, תאי העצב ההיפרכרומיים בתת-אזור DG (H) התייחסו ככל הנראה לנוירונים גרגיריים לא בוגרים ובוגרים שנוצרו לאחרונה. גרפי העמודות שלהלן מראים את ההתפלגות של תאי עצב נורמליים ומושפעי rmTBI בתת-אזורים (I) של קליפת המוח המוטורית וההיפוקמפוס (J), CA1 ו-(K) DG. שליטה, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 לעומת שליטה על ידי מבחן t לא מזווג. נתון זה שונה^מ-15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

TBI מתייחס לשני סוגים עיקריים, סגורים וחודרים, כאשר האחרון מאופיין בהפרעה בגולגולת ובדורה מאטר. נתונים קליניים מצביעים על כך ש- CHIs שכיחים יותר מפציעות חודרות ^1,2. לאחר פגיעה מוחית טראומטית קלה אחת, רוב החולים חווים תסמיני PCS שבדרך כלל חולפים תוך פרק זמן קצר, ויש מחלוקת לגבי שיעור החולים שה-PCS שלהם מתפתח ל-sequelae לטווח ארוך^23,24. כתוצאה מכך, החוקרים העבירו את המיקוד שלהם למודלים חוזרים ונשנים של CHI כדי להבין טוב יותר את ההשפעות המצטברות של זעזועי מוח מרובים²⁵, המתרחשים בדרך כלל בנפילות, תאונות דרכים וספורט מגע. השפעות חוזרות ונשנות אלה עלולות להוביל להשפעות חמורות וארוכות טווח יותר^26,27. על ידי שימוש במודלים חוזרים של CHI, חוקרים יכולים לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של זעזועי מוח מרובים ולהשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים התורמים ל- PCS. מודלים כאלה עשויים להקל על פיתוח התערבויות טיפוליות ממוקדות כדי למתן את ההשלכות ארוכות הטווח של פגיעות ראש חוזרות ונשנות.

למרות שחלק מדגמי CHI מנסים לדמות הן כוח בודד מוקד והן RMTBI על ידי שילוב כוחות ליניאריים וסיבוביים, מודלים אלה יכולים לגרום לפציעה חוזרת ואי דיוקים בחומרת הפציעה עקב גורמים כגון שבר בגולגולת, מורפולוגיה ועובי הגולגולת, דום נשימה מורחב של בעלי חיים¹⁰, ושונות בפרמטרים מכניים של קלט, במיוחד כאשר תנועת ראש סיבובית משולבת⁹. שיטות השפעה מבוקרות בוכנה וירידה במשקל משמשות בדרך כלל להשראת rmTBI במודלים של בעלי חיים של CHI²⁵. פגיעה מבוקרת בוכנה מאפשרת הגדרה מדויקת ומתכווננת של פרמטרי פגיעה באמצעות שימוש בהתקני השפעה אלקטרומגנטיים או פנאומטיים, ובכך מאפשרת שחזור השפעה גבוהה. עם זאת, השימוש בפגיעה מבוקרת בוכנה, בין אם על קליפת המוח החשופה כמו ב-CCI או על הגולגולת הסגורה, עדיין דורש השתקה קפדנית של ראש החיה במסגרת סטריאוטקסית במהלך הפגיעה. לעומת זאת, שיטות ירידה במשקל דורשות חומרים פשוטים וחסכוניים וקלים להתקנה, אך התמורה היא שונות גבוהה למדי בחומרת הפציעה²⁵.

מודל ה-FPI גורם בדרך כלל לפציעות מוקדיות ומפוזרות מעורבות, ומאפשר ייצור של TBI בדרגות חומרה שונות. למרות יתרונותיו, למודל ה-FPI יש גם מגבלות פוטנציאליות. בדומה למודל CCI, FPI עדיין דורש קרניוטומיה, הליך כירורגי שעלול לגרום לדלקת ברקמת המוח¹⁷. יתר על כן, אפילו FPI מתון חודר לעתים קרובות לדורה בעומקים משתנים, מה שיכול להכניס בלבולים בפרשנות הנתונים. לפיכך, למודלים של CCI ו-FPI יש מגבלות בשכפול המאפיינים הקליניים שנצפו בחולי TBI קלים⁹. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול המשלב את חלון הגולגולת הדק ושיטות FPI, שניתן להשתמש בהן כדי לייצר מודל עכבר מדויק יותר של rmTBI הקשור ל- CHI. מטרת פרוטוקול זה היא לשקף מקרוב את המאפיינים הקליניים של חולי TBI קלים. מודל בעל יכולת שחזור גבוהה יהיה כלי רב ערך לחקר המנגנונים העומדים בבסיס הפתופיזיולוגיה של פגיעה מוחית טראומטית קלה ולהערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

ממצאי המחקר שלנו על rmTBI תואמים לפרסומים קודמים שהשתמשו בחלונות גולגולת דקים לחקירות TBI קלות^28,29. לדוגמה, רן ועמיתיו יצרו חלון גולגולת דליל בעובי של כ-30 מיקרומטר בקליפת המוח הקודקודית השמאלית, וגרמו לפגיעה מוחית טראומטית קלה על-ידי לחיצה עדינה על החלון באמצעות קצה קהה בקוטר של 1 מ"מ ממכשיר סטריאוטקסי כירורגי²⁹. המחקר שלהם הראה התרחבות ניכרת של מוות תאי וביטוי מינים חמצוניים תגובתיים (ROS) בקליפת המוח הפגועה²⁹. כדי לחקור את rmTBI, נגוין ועמיתיו יישמו שלושה CCIs עם קצה השפעה שונה (קצה סיליקון עגול בקוטר 3 מ"מ בעובי 1.5 מ"מ) על חלון גולגולת דק עכבר (20-40 מיקרומטר עובי) בקליפת המוח של הקשר הקודקודי²⁸. כדי להגן ולשמור על שקיפות אזור הגולגולת הדק לצורך הדמיה ארוכת טווח, הם כיסו את חלון הגולגולת הדק בשכבה דקה של דבק ציאנואקרילט. שלושת ה-CCIs בוצעו אחת לשבוע במשך 3 שבועות, עם פרמטרי פגיעה של 4 מטר לשנייה במהירות ו-2 מ"מ עומק. כתוצאה משלושת CCIs, העכברים הראו אסטרוגליוזיס ניכר והפעלת מיקרוגליה²⁸. בהתחשב בכך שהשימוש בחלון גולגולת דליל כמודל לפגיעה מוחית טראומטית/rmTBI קלה הוא חדש יחסית, נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את הקשר בין חומרת / התקדמות הפציעה לבין טכניקות השפעה שונות. לדוגמה, במחקר קודם, הצלחנו להבחין בשינויים ברורים במורפולוגיה של התא לאחר שני FPIs שניתנו במרווח של^{יומיים 15}. בינתיים, במחקרים אחרים, דחיסה עדינה אחת לחלון הגולגולת הדק גרמה לפגיעה מוחית טראומטית קלה עם מוות תאי ברור וביטוי מינים חמצוני תגובתי²⁹, ושלושה CCIs שבועיים הביאו לאסטרוגליוזיס חזק ולהפעלת מיקרוגליה²⁸.

יש לנקוט בזהירות מספר צעדים כדי לייצר מודל פציעה עקבי בשיטה המתוארת. במהלך ניתוח חלון גולגולת דליל, בהתבסס על אזורי מטרה שונים (למשל, התמקדנו בקליפת המוח המוטורית), ראש העכבר צריך להיות מקובע במסגרת סטריאוטקטית ברמה אופקית או בזווית רוחבית קלה לכיוון הצד הנגדי של חלון הגולגולת הדליל בפרוטוקול זה. מיקום ספציפי זה יכול להקל על יצירת חלון הגולגולת הדליל באזור המתאים לקליפת המוח המוטורית. מיקום מדויק של מוטות האוזניים הוא אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הליך זה, וזה יכול לקחת זמן ותרגול כדי לשלוט. לפני שתנסה את ניתוח חלון הגולגולת הדק או השראת CHI, חיוני לוודא שהגולגולת ישרה. אם הגולגולת אינה ממוקמת כראוי, יש לכוונן את הראש בהתאם. בשל הצורה והעובי הלא אחידים של עצם הגולגולת, צמיחת הגולגולת משתנה אפילו בתוך עצם^{ספציפית 30}, חשוב להתאים את מיקום הראש לפני ביצוע הליך חלון גולגולת דליל או CHI. כישלון לעשות זאת מגביר את הסיכון לשברים בגולגולת, אשר יכולים להשפיע באופן משמעותי על דיוק CHI ואמינות. לקבלת הדרכה מקיפה יותר על הליך חלון גולגולת דליל, עיין בפרוטוקול המתואר על ידי Guang et ^al.14.

הבחירה באזור המידול של TBI משתנה בין חוקרים בהתבסס על מיקוד המחקר שלהם. בהתחשב בשונות המשמעותית במיקום בפועל של הפגיעה ב- CHI, למרות שרוב המחקרים דיווחו כי אתר הפגיעה נמצא במיקום מרכזי בין ברגמה ללמדא, מומלץ לשנות את מיקום הפגיעה במחקרים ניסיוניים עתידיים, כפי שצוין בסקירה של מודלים של בעלי חיים CHI²⁵. כדי לאמת את מודל הפגיעה בגולגולת הדקה של CHI שהשתנה, אנו ממליצים להתחיל עם קליפת המוח המוטורית, כמתואר בפרוטוקול זה. ה-rmTBI יכול לגרום לפגיעות מוקדיות בקליפת המוח, אשר ניתן להעריך בקלות באמצעות גישות הערכה לוקומוטוריות כגון OFT בפרוטוקול זה. החתך שנעשה במהלך הליך זה דורש זמן להחלים, וזה עלול לעורר תגובה חיסונית היקפית, ובסופו של דבר להכניס שונות לניסוי. כדי למזער את הסיכון לדלקת, זיהום, כאב ואי נוחות לאחר ניתוח, אנו ממליצים למרוח משחה מקומית המכילה שילוב של אריתרומיצין ונתרן דיקלופנק על הפצע. גישה זו הוכחה כיעילה בהפחתת דלקת וכאב הקשורים להליכים כירורגיים בבעלי חיים.

פרוטוקול כלי הקשה נוזלי מבוסס גולגולת דלילה הוא שיטה מבטיחה למידול rmTBI במכרסמים מכיוון שהוא מפחית את הדלקת הנגרמת בדרך כלל על ידי חשיפת קרומי המוח ל- FPI. טכניקה זו, המוצגת בחלון הגולגולת הדליל, יכולה ליצור ביעילות PCS רלוונטי מבחינה קלינית בדרגות שונות, ולספק חלופה פוטנציאלית לחוקרים החוקרים rmTBI. יתר על כן, חלון הגולגולת הדק מאפשר תצפית של הומאוסטזיס^{Ca 2+} ורגישות יתר עצבית בקליפת המוח in vivo¹⁵. שימוש בטכניקה זו יכול לשפר את הבנתנו את המנגנונים הבסיסיים של התקדמות PCS בטווח הקצר/בינוני/ארוך, ובכך לשפר את היכולת לחזות את התפתחותו ולפתח טיפולים טיפוליים יעילים יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
75% אתנול	שאנדונג XieKang טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ
בופרנורפין הידרוכלוריד	טיאנג'ין מכון מחקר פרמצבטי פרמצבטי ושות', בע"מ		H12020272 פתרון, משכך כאבים
קרפרופן	שנחאי Guchen ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	53716-49-7	אבקה, משכך כאבים
כלורהקסידין דיגלוקונאט	שנחאי מקלין ביוכימיה ושות', בע"מ	18472-51-0	תמיסה מימית 19%-21%,
ערכת מלט וממס דנטלי	שנחאי New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3 #	אבקה הורכבה מחדש במיקרוסקופ ניתוח ממס תואם
	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ.	77019
משחת אריתרומיצין	ווהאן Mayinglong פרמצבטיקה גרופ ושות 'בע"מ	220412	אנטיביוטיקה
סיבים אופטיים מקור אור קר	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ	F-150C
מקדח מיקרו שטוח	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ	HM31008	2 מ"מ,
תוכנת מכשיר FPI	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	עכברי Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR	מרכז חיות מעבדה Jinhua	מלאי#2023091	25 עכברים זכרים, 25-30 גרם, בני 8 שבועות
Isoflurane	Shandong Ante Animal Farmry Technology Co., Ltd.
כרית חימום איזותרמית	Wenzhou Repshop מוצרי חיות מחמד ושות', בע"מ
Luer Loc hup			בהתאמה אישית מיוצר באמצעות רכזת מחט 19G
מקדחת גולגולת כף יד מיקרו	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ.	78001	מקסימום: 38,000 סל"ד
מכשיר FPI שונה	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
מבוך המים של מוריס שנזן	RWD Life Science Inc.	63031	הערכת יכולות למידה וזיכרון מרחביות של עכברים
שדה פתוח	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ.	63008	הערכת קטר עכברים וחרדה
חומר סיכה עיניים	סוג'ואו טיאנלונג פרמצבטיקה ושות', בע"מ
משחת סודיום דיקלופנק	ווהאן Mayinglong פרמצבטיקה גרופ ושות 'בע"מ	221207	תרופה אנטי דלקתית לא סטרואידית
מערכת הרדמה לבעלי חיים קטנים-משופרת	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ	חכמה R530IP
	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, ארה"ב	V3.0	מעקב וניתוח בעלי חיים
מסגרת סטריאוטקטית	שנזן RWD מדעי החיים בע"מ	68043
דבק רקמות Vetbond	3M, סנט פול, מינסוטה, ארה"ב	202402AX	לתפור את פצע החיה
Y מבוך	שנזן RWD Life Science Inc.	63005	הערכת זיכרון עבודה מרחבי של עכבר