דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

Summary

כאן, אנו מספקים הליך מעשי לניתוח וביצוע ניתוחים היסטולוגיים וביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית.

Abstract

תרמוגנזה בתיווך רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד חשוב בוויסות חילוף החומרים, והמורפולוגיה והתפקוד שלה יכולים להיות מושפעים מאוד מגירויים סביבתיים בעכברים ובבני אדם. נכון לעכשיו, מורין interscapular BAT (iBAT), הממוקם בין שתי עצם השכמה באגף הגבי העליון של עכברים, הוא מחסן BAT העיקרי המשמש מעבדות מחקר לחקר תפקוד BAT. לאחרונה זוהו בעכברים כמה מחסני BAT שלא היו ידועים קודם לכן, כולל אחד המקביל לרקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית אנושית. שלא כמו iBAT, רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית (scBAT) ממוקמת בשכבת הביניים של הצוואר ולכן לא ניתן לגשת אליה בקלות.

כדי להקל על המחקר של scBAT עכבר שזוהה לאחרונה, מוצג כאן פרוטוקול המפרט את השלבים לניתוח scBAT שלם מעכברים לאחר לידה ובוגרים. בשל גודלו הקטן של scBAT ביחס למחסני שומן אחרים, הנהלים שונו והותאמו במיוחד לעיבוד scBAT. בין שינויים אלה הוא השימוש במיקרוסקופ מנתח במהלך איסוף רקמות כדי להגדיל את הדיוק וההומוגניזציה של דגימות scBAT קפואות כדי להעלות את היעילות של ניתוח qPCR לאחר מכן. בעזרת אופטימיזציות אלה, ניתן לקבוע את הזיהוי, המראה המורפולוגי והאפיון המולקולרי של scBAT בעכברים.

Introduction

השכיחות הגוברת של השמנת יתר בארה"ב ובעולם הציתה עניין רב בהבנת האטיולוגיה שלה ובזיהוי טיפולים פוטנציאליים ^1,2. רקמת השומן ממלאת תפקיד חיוני בחילוף החומרים, וחוסר ויסות של רקמת השומן יכול להוביל להתפתחות של השמנת יתר. בדרך כלל, ישנם שני סוגים של רקמות שומן, רקמת שומן לבנה וחומה. בעוד רקמת שומן לבן (WAT) יכולה לאחסן אנרגיה כימית ולהפריש גורמים אנדוקריניים, רקמת שומן חום (BAT) יכולה להשתמש באנרגיה כימית כדי לייצר חום ולשמור על טמפרטורת הגוף בקור ^3,4. בגלל יכולת ייחודית זו, הפעלת BAT יכולה גם להגדיל את הוצאת האנרגיה ולשפר את הרגישות לאינסולין⁵.

BAT מפעיל את תפקידו באמצעות תרמוגנזה שאינה רועדת, תהליך המתווך על ידי פירוק צימוד חלבון 1 (UCP1)⁶. יונקים, כולל עכברים ובני אדם, מחזיקים בכמויות משתנות של BAT. ההשקפה הקלאסית של BAT היא שרקמות שומן אלה נפוצות יותר בעכברים ובתינוקות מאשר בבני אדם בוגרים. iBAT, הממוקם באגף הגבי העליון בין עצם השכמה, הוא מחסן העטלף הנחקר ביותר בעכברים. על ידי יישום בדיקות הדמיה רדיואיזוטופית וביופסיה, מחקרים אחרונים זיהו מספר מחסני BAT בבני אדם בוגרים. חלקם, כולל המחסנים שנמצאו באזור הצוואר העמוק והסופרקלאביקולרי, לא זוהו קודם לכן בעכברים או בחיות מודל אחרות 7,8,9,10,11. מבין מחסני ה-BAT הללו, ה-scBAT הוא המחסן הנפוץ ביותר בבני אדם בוגרים. כדי להבין טוב יותר את המקור ואת התרומה המולקולרית של מחסני BAT אלה שנמצאו לאחרונה בבני אדם, חיוני לזהות מחסנים מקבילים בעכברים המאפשרים מניפולציות גנטיות ומולקולריות כדי לעקוב ולבדוק את התפקיד התפקודי של מחסנים אלה. לפיכך, אנו ואחרים זיהינו כמה מחסני BAT שלא היו ידועים קודם לכן במקומות אנטומיים שונים בעכברים, כולל scBAT^12,13, BAT פריווסקולרי בית החזה^14,15, BAT פריrenal¹⁶ ו- BAT פריאורטי¹⁷. עכבר scBAT דומה אנטומית scBAT אנושי ודומה מורפולוגית iBAT קלאסי, מבטא רמות גבוהות של UCP1¹².

שלא כמו iBAT עכבר, אשר ניתן לנתח בקלות, scBAT ממוקם בשכבת הביניים של צוואר העכבר, מתחת לבלוטות הרוק לאורך וריד הצוואר החיצוני. בידוד של מחסן זה לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים בפירוט את ההליך לניתוח scBAT מעכברים לאחר לידה ובוגרים ועיבוד מחסן זה עבור היסטולוגיה וניתוח ביטוי גנים.

Protocol

ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכללת ביילור לרפואה. כל ההליכים בוצעו בעכברים זכרים C57BL/6J בני 3 שבועות ו-3 חודשים. לפני הנתיחה, כל העכברים הומתו באמצעות הליך המתת חסד פחמן דו חמצני מאושר. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. דיסקציה של scBAT

1. הניחו את פגר העכבר על שולחן העבודה ונקו את המספריים הכירורגיים ואת המלקחיים הנקודתיים העדינים במיוחד עם 70% אתנול.
2. רססו את צוואר הגחון של העכבר באתנול 70% כדי להרטיב את הפרווה ולמזער את זיהום הפרווה.
3. בצע חתך דו צדדי, כ -1.5 ס"מ, לאורך עצם הבריח.
4. מקצות החתך הקודם חותכים לאורכם לכיוון האוזניים, באורך של כ-1 ס"מ. זה ייצור חתך בריבוע בצורת U סביב הצוואר (איור 1A,B).
   הערה: scBAT נמצא בשכבת הביניים של הצוואר. השכבה השטחית, המורכבת מהעור, רקמת השומן התת עורית ובלוטות הרוק, נחשפת בשלב זה. שכבת הביניים, יחד עם scBAT, מכילה את הוורידים הצוואריים ואת שרירי הצוואר. השכבה העמוקה של הצוואר, המכילה עטלף עמוק בצוואר וורידים עורקיים וצוואריים, נחשפת על ידי הסרת שריר השלד.
5. הניחו את העכבר מתחת למיקרוסקופ מנתח והביאו את הצוואר החשוף למיקוד (איור 1C).
   הערה: שלב נוסף זה מגדיל מאוד את הדיוק של איסוף רקמות, הכרחי בהתחשב בגודל הקטן של scBAT.
6. יש לחשוף את בלוטות הרוק במלואן על ידי הרמת חלקי העור החתוכים בעזרת מלקחיים.
7. בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים, מנתקים את הרקמה המחברת בין בלוטות הרוק לרקמה סביב עצם הבריח וזו לזו.
8. חשוף את מחסני scBAT על ידי הרמת בלוטות הרוק. חפשו את ה-BAT לאורך הווריד הצווארי החיצוני ואולי מחובר לחלק התחתון של בלוטות הרוק. זהה אותו על ידי צבעו האורנגי, הבולט על רקע הרקמה שמסביב.
9. החזיקו את רקמת שומן המטרה במלקחיים וקילפו אותה בעדינות מבלוטות הרוק.
10. לאחר ניתוק מבלוטות הרוק, המשיכו לנתק את ה-scBAT מהווריד הצווארי החיצוני ומשרירי הצוואר עד שניתן יהיה להסיר את המחסנים משני צדי הצוואר בשלמותם.
11. בדקו כל דגימת scBAT שנותחה תחת המיקרוסקופ המנתח (איור 1D,E), תוך שימוש במלקחיים כדי להסיר את רקמת החיבור שנותרה.
12. הכניסו כל דגימה לבקבוקון זכוכית המכיל 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) והוציאו את העכבר מתחת למיקרוסקופ.

2. עיבוד וצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) של scBAT (מתואר באיור 2A)

1. החלף את PBS (שלב 1.12) עם 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde קר (PFA) ולהניח את הבקבוקון על nutator, מתנדנד ב 4 ° C במשך הלילה כדי לתקן את scBAT.
   הערה: קיבוע זילוח עשוי להיות מיושם לאחר הלידה, במיוחד עכברים בוגרים, כאשר עיבוד נוסף עבור ניתוח immunohistochemistry נדרש.
2. למחרת, להסיר את הפתרון PFA מן הבקבוקון עם פיפטה העברה סטרילית ולהחליף אותו עם 10-15 מ"ל של PBS. מניחים את הבקבוקון על נוטטור וסלע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. החליפו PBS בתמיסת מלח 0.85% והמשיכו להתנדנד במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
   הערה: תמיסת המלח היא 0.85% מלוחים (NaCl) w/v במים שטופלו ב-DEPC (ללא RNase). PBS יכול להיות מוחלף בתמיסת מלח בשלב זה ובשלב הבא.
3. הסר את 0.85% מלוחים עם פיפטה העברה ולהוסיף 10 מ"ל של 70% אתנול / 0.85% תמיסת מלח לבקבוקון. אחסנו את הבקבוקון במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה או עד שהוא מוכן להטמעת פרפין.
   הערה: ניתן להשתמש ב-PBS אם 0.85% מלוחים אינם זמינים. יש לעבד scBAT בהקדם האפשרי לצורך חתך קל יותר ומורפולוגיה של רקמות שהשתמרה טוב יותר.
4. לפני הטמעת פרפין, יש לייבש את scBAT באמצעות סדרה של חילופי אתנול כדי להסיר מים מהרקמה.
   1. כדי להתחיל, להסיר 70% אתנול / 0.85% מלוחים מן הבקבוקון עם פיפטה העברה ולהוסיף 10-15 מ"ל של 95% אלכוהול מיובש, נדנוד בקבוקון על nutator בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. חזור על שלב זה פעם אחת.
      הערה: ניתן להשתמש באתנול במקום תמיסות אלכוהול מיובשות.
   2. לאחר מכן, להחליף 95% אלכוהול מיובש עם 10-15 מ"ל של 100% אלכוהול מייבש ולהמשיך להתנדנד על nutator במשך 1 שעות. מלאו מחדש באלכוהול 100% מייבש חדש והמשיכו להתנדנד במשך מספר שעות או לילה, תלוי בכמות ה-scBAT שבבקבוקון.
5. כדי לנקות scBAT להטמעה, להוסיף 10 מ"ל של טולואן לבקבוקון ולהמשיך נדנוד על nutator עד scBAT שקוף, בערך 6-8 שעות.
   הערה: משך הזמן הדרוש להשגת סליקה משביעת רצון תלוי בגודל ה-scBAT. מומלץ להתחיל בפינוי מיד בבוקר כדי שניתן יהיה לבצע חלחול והטמעה בשעות אחר הצהריים.
6. כדי להטמיע scBAT בשעוות פרפין, להסיר toluene ולהוסיף 10 מ"ל של שעוות פרפין חדירה מומסת לבקבוקון. מכניסים את הבקבוקון לתנור ב-65°C למשך שעה. חזור על שלב זה עם שעווה חדשה.
   הערה: התחילו להמיס כדורי שעווה בתנור למשך לילה לפני תחילת ההטבעה כדי להבטיח שהשעווה נוזלית לחלוטין.
7. החליפו את שעוות הפרפין המסתננת בשעוות פרפין מוטמעת והניחו את הבקבוקון באותה טמפרטורה למשך שעה. חזור על שלב זה פעם אחת.
   הערה: ניתן לקטוע את שלב החדירה ולהמשיך אותו מאוחר יותר. מוציאים את הבקבוקון מהתנור ומאחסנים אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מוכן להמשיך.
8. הטמיעו את הרקמה על ידי הנחתה תחילה בתבנית הטבעה של רקמה, הוסיפו שעווה מומסת לתבנית, וכוונו מחדש את הרקמה תחת סטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן, מניחים קסטת הטבעה על גבי השעווה וממשיכים לשפוך את שעוות ההטבעה מעליה עד שהיא מלאה ומכסה ההטבעה מהודק לגוש השעווה. מעבירים את הבלוק למקרר ב-4°C למשך הלילה כדי לאפשר לשעווה להתקשות ולהתכווץ לפני הסרת תבנית המתכת.
9. חתכו את ה- scBAT עם מיקרוטום לעובי של 5-6 מיקרומטר¹⁸, שלושה עד ארבעה חלקים לכל שקופית מיקרוסקופ, והניחו באמבט ציפה חם של חתך פרפין ב~ 42 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחלקי הרקמה להחליק.
10. העבירו את המקטעים לשקופיות והניחו את המגלשות זקופות כנגד אמבט הציפה כדי לאפשר למים לטפטף מהמגלשות.
11. העבירו את המגלשות למתלה לצביעת אל-חלד והניחו את המדף על ספסל לייבוש מגלשה לייבוש למשך הלילה.
    הערה: ניתן לאחסן את שקופיות הפרפין לטווח ארוך בטמפרטורת החדר לפני שיושג עיבוד נוסף.
12. בצע את צביעת H&E¹⁹. כדי להתחיל, הניחו את המגלשות במדף צביעה, ולאחר מכן הניחו את המדף בצנצנת צביעה עם קסילן למשך 40 שניות. חזור על שלב זה פעם אחת.
    הערה: אם פרפין עדיין נראה לאחר שני השלבים, המתן עד שהוא יתמוסס לחלוטין לפני שתמשיך.
13. כדי להחזיר לחות לרקמה, הניחו את מתלה השקופיות בצנצנת מכתים מלאה ב-100% אלכוהול מייבש במשך שני שלבים של 20 שניות, לאחר מכן שלב של 15 שניות ב-95% אלכוהול מיובש, ושטיפה אחרונה של 15 שניות ב-ddH₂O.
14. הניחו את המגלשות בכלי מכתים מלא בתמיסת המטוקסילין למשך 75 שניות להשגת צביעה גרעינית, ולאחר מכן שטפו את המגלשות בכלי צביעה עם ddH₂O למשך 45 שניות.
    הערה: ניתן לכוונן את הזמן בהתאם לצבע הכתם הרצוי.
15. להבדיל את הצביעה על ידי טבילת שקופיות בכלי צביעה מלא בתמיסת HCl-אתנול במשך 15 שניות, ולאחר מכן להעביר שקופיות לשטיפה נוספת ddH₂O במשך 15 שניות.
    הערה: תמיסת HCl-אתנול מוכנה על פי שיטה¹⁹ שפורסמה.
16. עבור צביעה ציטופלזמית, הניחו את השקופית בתמיסת כתם נגדי Eosin Y למשך 15 שניות.
17. יש לייבש את הרקמה על ידי טבילת המגלשות במשך 15 שניות כל אחת בשלושה שלבים רציפים של תמיסת אלכוהול מיובש 95%, ולאחר מכן שתי אמבטיות אלכוהול 100% מיובשות רציפות - הראשונה למשך 15 שניות והשנייה למשך 45 שניות - כדי לסיים את ההתייבשות.
18. לבסוף, העבירו את המגלשות לאמבט קסילן למשך 45 שניות כדי לאקלם מחדש את הרקמה לממיסים אורגניים. לאחר שלב זה, הצביעה הושלמה; הסר את הרקמה מהפתרון.
19. יש למרוח אמצעי הרכבה על כל מגלשה ולכסות אותה בתוך מכסה אדים כימי. יבש לילה לפני ההדמיה. תוצאות הדמיה מוצגות באיור 2B.

3. ניתוח ביטוי גנים של scBAT

1. איסוף רקמות (שחיקה)
   1. לאחר ניתוח scBAT, מיד לשים את הרקמה לתוך צינור microcentrifuge, לדקור חור בחלק העליון של הצינור עם מחט סטרילית, להצמיד להקפיא בחנקן נוזלי.
      הערה: השלבים העיקריים של הפרוטוקול המתוארים כאן מתוארים באיור 3A. ניקוב חור בחלק העליון של הצינור לפני השלכתו לחנקן נוזלי מונע מהצינור להתפוצץ עקב שינוי הלחץ הפתאומי.
   2. ממלאים פלסטיק בחנקן נוזלי ומשאירים גרגר ומרית דקה להשריה.
      הערה: חשוב לשמור על הטמפרטורה של כל הכלים ודגימות הרקמה קרה ככל האפשר, קרוב לטמפרטורת החנקן הנוזלי, במהלך כל ההליך כדי למנוע את הפשרת הרקמה. רקמת שומן מופשרת דבקת מאוד והופכת את האבקה למאתגרת יותר. יש להסיר כלים ודגימות מאמבטיות חנקן נוזלי רק מיד לפני השימוש.
   3. קח דגימת רקמה קפואה אחת בכל פעם ושפך אותה מצינור המיקרוצנטריפוגה שלה לתוך הטיט.
   4. מוסיפים כמות קטנה של חנקן נוזלי למכתש, ולאחר מכן משתמשים בחומר המליטה כדי לטחון את הרקמה הקפואה עד שהיא כתושה לחלוטין.
      הערה: אם הרקמה מתחילה להיות רכה או דביקה בשלב כלשהו, היא מפשירה; יוצקים עוד חנקן נוזלי לתוך המכה.
   5. השתמש במרית הדקה כדי לגרד בזהירות ולהעביר את הרקמה המרוסקת בחזרה לתוך צינור microcentrifuge. יוצקים חנקן נוזלי לתוך המכתש תוך כדי גירוד כדי לאסוף שאריות של רקמה לפני העברה עם מרית. חזור על שלבי ההעברה עד שכל הרקמה מוסרת מהטיט.
   6. נקו את המכתש עם מגב רקמה קל ואתנול 70% לפני שאתם זורקים את הדגימה הבאה לטחינה. אחסנו את אבקת הרקמה במקפיא בטמפרטורה של -80°C לטווח ארוך.
2. בידוד RNA מוחלט
   1. הכנה
      1. נקו את שולחן העבודה, פיפטה, מחזיקי קצה ומדפי צינורות עם אתנול 70% ומזהמים משטחים כדי להסיר RNase.
      2. הפעל את מכונת הצנטריפוגות כדי להגיע ל -4 מעלות צלזיוס.
      3. מחממים את תמיסת האלוציה ל-70 מעלות צלזיוס.
      4. לדלל את DNase I על ידי ערבוב 5 μL של DNase I משוחזר עם 75 μL של תמיסת דילול DNase לכל דגימה. הניחו את תמיסת DNase I על קרח עד לשימוש.
   2. פרוצדורה
      1. עבור כל דגימה, תייגו שני צינורות מיקרוצנטריפוגה, שני צינורות אחיזת עמודות (שני צינורות מיקרוצנטריפוגות מדורגים ללא מכסה), ומיני עמוד קשירה אחד.
      2. הוסף 500 μL של תמיסת בידוד RNA לכל דגימה וסוניקט באמצעות מנוע מזיק גלולתי למשך 30 שניות.
      3. קבל מזרק עבור כל דגימה צינור למעלה ולמטה 10x כדי להמשיך lyse הרקמה. יש לוודא כי לא נראים מוצקים לאחר המזרק.
      4. מוסיפים 250 μL של כלורופורם ומערבולת מדי פעם תוך המתנה של 5 דקות עד שהדגימות ידגרו בטמפרטורת החדר.
      5. צנטריפוגה ב-21,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4°C (75 °F).
      6. מעבירים את החלק המימי העליון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ומוסיפים כמות שווה ערך של 70% אתנול (~500 μL).
         הערה: החלק המימי העליון צריך להיות ברור, התחתון צריך להיות תמיסת בידוד RNA אדום, ובין שתי השכבות צריך להיות כמה מוצקים לא רצויים.
      7. מעבירים 500 μL של הליזט החדש לעמודת הקשירה. צנטריפוגה ב 18,000 × גרם במשך 60 שניות ולאחר מכן להשליך את התסנין.
      8. חזור על השלב הקודם עם הליזט הנותר כדי להכניס את כל הרנ"א לעמודת הקשירה.
      9. הוסיפו 700 μL של כביסה בחומרה נמוכה לעמוד הקשירה, צנטריפוגה למשך 30 שניות והשליכו את התסנין.
      10. הוסף 80 μL של DNase I מדולל לכל עמודת קשירה. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      11. מוסיפים 700 μL של שטיפה מחמירה, צנטריפוגה למשך 30 שניות, ומשליכים את התסנין.
      12. מוסיפים 700 μL של שטיפה בחומרה נמוכה, צנטריפוגה למשך 60 שניות ומשליכים את הסנין.
      13. העבר את עמודות הקשירה לצינור החזקת העמוד השני ללא מכסה ולצנטריפוגה למשך 2 דקות כדי להבטיח שכל הנוזלים יוסרו מעמודת הקשירה.
      14. העבר את עמודי הקישור לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוסף 30 μL של תמיסת אלוציה מחוממת. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך דקה.
      15. צנטריפוגה למשך 2 דקות כדי לאסוף את הרנ"א המדולל בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה.
      16. למדוד את ריכוז הרנ"א הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר.
          הערה: אם טוהר הרנ"א הכולל נמוך, מצוין על ידי ערך 260/280 מתחת ל-2.0 או ערך 260/230 מתחת ל-1.8, לאחר שלב 3.2.2.12., ניתן לשטוף את הדגימות פעם נוספת עם שטיפה בחומרה נמוכה ואחריה שטיפה עם 80% אתנול לפני שתמשיך עם שלב 3.2.2.13.
      17. אחסנו את הרנ"א במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
   3. תעתיק הפוך (RT)
      1. ברצועת צינור PCR, יש להוסיף 0.5-1 מיקרוגרם מסך הרנ"א המדולל במים שטופלו ב-DEPC לסך של 8 מיקרוליטר עבור כל דגימת RNA לבאר אחרת.
         הערה: ניתן להגדיל או להקטין את כמות הרנ"א המשמשת לשעתוק לאחור בהתאם להוראות היצרן.
      2. הוסף 1 μL Oligo dT ו- 1 μL של dNTPs לכל דגימה בצינור ה- PCR. ודא שהנפח הכולל הוא 10 μL לדגימה.
      3. מניחים את רצועת צינור ה- PCR ב- thermocycler ומכוונים אותה ל- 65 °C למשך 5 דקות ואחריה 4 °C ללא הגבלת זמן.
      4. לאחר 5 דקות ב 65 ° C, להוציא את רצועת צינור PCR ולהניח את הצינור על קרח לפחות 2 דקות. לאחר הדגירה על קרח, הוסף חמישה ריאגנטים: 4 μL של 5x חיץ גדיל ראשון, 2 μL של 25 mM MgCl₂, 2 μL של 0.1 M DTT, 1 μL של מעכב RNase, ו 1 μL של transcriptase הפוך לכל דגימה. ודא שהנפח הכולל הוא כעת 20 μL לדגימה.
      5. מקם את רצועת צינור ה- PCR בחזרה ל- thermocycler והגדר את התוכנית ל- 50 ° C למשך 50 דקות, ואז 85 ° C למשך 5 דקות, ואז 4 ° C ללא הגבלת זמן.
      6. ברגע שהתוכנית מגיעה ל -4 מעלות צלזיוס, מוציאים את הרצועה ומוסיפים 1 מיקרוליטר של ריבונוקלאז H (RNase H).
         הערה: RNase H משמש להסרת כל תבנית RNA שנותרה בתגובת RT; בשלב זה, הרנ"א הרצוי כבר אמור להיות מומר ל-cDNA.
      7. הניחו את הרצועה בחזרה לתוך thermocycler ולרוץ 37 ° C במשך 20 דקות ולאחר מכן 4 ° C ללא הגבלת זמן.
      8. התמלול ההפוך הושלם; למדוד ריכוז cDNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
      9. לדלל את cDNA ל 250 ng / μL; אחסנו את ה-cDNA במקפיא בטמפרטורה של -80°C או -20°C.
   4. PCR כמותי (qPCR)
      1. צור גיליון אלקטרוני כדי לארגן את המיקום של כל פריימר ומדגם על צלחת qPCR 96-well.
         הערה: אחד הפריימרים צריך להיות גן ייחוס כדי לנרמל את הביטוי של כל הגנים האחרים המעניינים, כגון 36B4.
      2. הכינו תערובת מאסטר פריימר לכל שילוב של "פריימר + מדגם". לכל תגובת qPCR היטב, הוסף 3 μL של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, 5 μL של תערובת מאסטר אנזים qPCR, 0.5 μL של פריימר קדימה, ו 0.5 μL של פריימר הפוך, אשר מוסיף עד 9 μL לכל תגובה. הוסף 1 μL של cDNA לכל תגובה כדי לקבל סך של 10 μL לכל תגובה היטב.
         הערה: התקן הוא שיהיו שלושה עותקים טכניים משוכפלים עבור כל שילוב "פריימר + מדגם", כך שכל תערובת מאסטר צריכה להיות פי 4 מהכמויות לעיל.
      3. הוסף 1 μL של cDNA עבור כל משוכפל לכל תערובת מאסטר פריימר. אם כל תערובת אב היא 4x, אז צינור 4 μL של כל cDNA דגימה לתוך צינור מסומן משלהם.
      4. לבסוף, צינור 10 μL של כל תגובה לערבב לתוך צלחת qPCR 96-well במיקומים שנקבעו על ידי הגיליון האלקטרוני.
      5. אטמו את הצלחת עם אטם דבק עבה, ולאחר מכן צנטריפוגו את הצלחת 96 בארות ב 450 × גרם ב 20 ° C במשך 2 דקות.
         הערה: חשוב מאוד שהצלחת תהיה אטומה לחלוטין כדי למנוע אידוי של דגימות במהלך רכיבה על אופניים. השתמשו במגבי רקמות קלים כדי ללחוץ את האטם כלפי מטה על הצלחת, במיוחד על הקצוות.
      6. הפעל את הצלחת במכשיר PCR בזמן אמת. תכנת את תגובת ה- PCR בהתאם להוראות היצרן: 2 דקות ב- 50 ° C, ואחריו עוד 2 דקות ב- 95 ° C, ולבסוף 40 מחזורים של 15 שניות ב- 95 ° C ו- 30 s ב- 60 ° C. התוצאות של ניתוח ביטוי גנים qPCR מוצגות באיור 3B.

Results

שלא כמו iBAT, אשר ממוקם בשכבה התת-עורית של הגב בין שתי השכמה, scBAT ממוקם בשכבת הביניים של הצוואר, המשתרעת עמוק בין שכבות שרירי השלד ובלוטת הרוק כשהיא גדלה לאורך וריד הצוואר החיצוני (איור 1A). ניתוח scBAT אינו פשוט כמו iBAT. במאמר זה אנו מספקים הליך מפורט הכולל שלבים חיוניים לניתוח SCBAT שלם מעכברים בוגרים ואחרי לידה (איור 1B,C). לאחר פתיחת הצוואר באמצעות הפרוטוקול שסופק, ניתן לזהות שכבה דקה של scBAT תחת מיקרוסקופ מנתח ולקלף מבלוטת הרוק המחוברת ומווריד הצוואר החיצוני באמצעות זוג מלקחיים (איור 1D,E). כדי להעריך את המורפולוגיה של המחסן, scBAT מבודד טרי עובד באמצעות הליך העיבוד שסופק בשילוב עם הליך צביעת H&E^{שפורסם בעבר 19} (איור 2A). כפי שניתן לראות באיור 2B, ל-scBAT יש מבני רקמות האופייניים למחסני BAT, והוא מורכב מהרבה אדיפוציטים קטנים ורב-לוקולריים בעכברים בריאים לאחר לידה ובעכברים בוגרים. כדי להעריך את רמות ביטוי הגנים ב-scBAT, רנ"א הופק ממחסני scBAT מבודדים באמצעות ההליכים שסופקו (איור 3A). לאחר מכן ניתן להעריך את רמות הביטוי של גנים מעניינים באמצעות שיטות RT-qPCR סטנדרטיות (איור 3A). כפי שניתן לראות באיור 3B, רמות הביטוי הדיפרנציאלי של גנים המעורבים בתיווך תפקוד scBAT, כולל Pparg, הרגולטור הראשי של התפתחות BAT; Fabp4 ו-Glut4, שני מובילי חומרים מזינים; ו-Ucp1 ו-Ppargc1a, שני גנים המעורבים בתרמוגנזה, ניתנים לקביעה בקלות. לשם השוואה, רנ"א הופק מ-iBAT מבודד, והביטוי של הגנים שצוינו לעיל הוערך גם באמצעות ההליכים שסופקו (איור 3A). רמות הביטוי של גנים אלה דומות יחסית בין שני המחסנים הללו. (איור 3B).

איור 1: מיקום אנטומי של scBAT ותהליך הדיסקציה שלו. (A) מיקום scBAT בשכבת הביניים של הצוואר. (B) השכבה השטחית של הצוואר לפני ואחרי הסרת העור. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. קווים צהובים מנוקדים מתארים את האזור שיש לחשוף לאחר ביצוע החתך בצורת U. (C) תמונה של פגר עכבר המונח מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להגביר את בהירות הראייה במהלך נתיחה. (ד,ה) תמונות מייצגות של שכבת הביניים של הצוואר לפני ואחרי הסרת scBAT מעכברים בני 3 שבועות ו -3 חודשים. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. קווים צהובים מנוקדים מתארים מחסני scBAT דו-צדדיים חשופים; n = 2. קיצורים: scBAT = רקמת שומן חומה supraclavicular; SFI = שכבה שטחית; sg = בלוטת הרוק; tr = קנה הנשימה; jv = וריד ג'וגולרי חיצוני; SM = שריר השלד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: עיבוד scBAT עבור צביעת H&E. (A) תרשים זרימה הממחיש את השלבים העיקריים של עיבוד scBAT עבור צביעת H&E. לאחר ניתוח הרקמה, היא קבועה ברצף, מיובשת, מוטמעת, חתוכה ומוכתמת. (B) תמונות מייצגות של scBAT מוכתם ב-H&E מעכברים בני 3 שבועות ו-3 חודשים; n = 3 עבור כל שלב התפתחותי; סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר לתמונות בהגדלה נמוכה יותר; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר לתמונות בהגדלה גבוהה יותר. קיצורים: scBAT = רקמת שומן חומה supraclavicular; PFA = paraformaldehyde; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הכנת רנ"א מ-scBAT לניתוח ביטוי גנים. (A) תרשים זרימה המדגים את שלבי בידוד ה-RNA וניתוח RT-qPCR של ביטוי גנים scBAT. בשל גודלו הקטן ומרקמו הרך, הקפאת מחסן scBAT וטחינתו בחנקן נוזלי חיונית לבידוד מוצלח של RNA. (B) ביטוי יחסי של גנים בסמן, כולל Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 ו-Ppargc1a, ב-scBAT וב-iBAT שבודדו מעכברים זכרים בני 3 חודשים, n = 5. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. 36B4 שימש כגן משק בית לנורמליזציה. קיצורים: scBAT = רקמת שומן חומה supraclavicular; RT-qPCR = PCR שעתוק הפוך-כמותי; LN₂ = חנקן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מציגים בפירוט את ההליכים לניתוח ועיבוד scBAT עבור H&E וניתוח ביטוי גנים. מכיוון ש- scBAT שוכן בשכבת הביניים של הצוואר ונמצא לאורך הוורידים הגדולים, הבידוד של מחסן זה דורש טכניקה מדויקת. באופן ספציפי, כדי לקבל תצוגה ברורה של המחסן, אנו ממליצים למקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח לאחר פתיחת הצוואר. באמצעות זוג מלקחיים נקודתיים עדינים במיוחד כדי לקלף scBAT מבלוטת הרוק והוורידים שמסביב, יש להקפיד להימנע מניקוב הוורידים. דימום יתר יכול להקשות על איתור scBAT. כדי לעבד scBAT לצביעת H&E, התאמנו את השימוש בפרוטוקול¹⁹ שפורסם עם שינויים קלים כדי לכלול שימוש ב-4% PFA, אלכוהול מיובש, וממס אורגני, טולואן, לעיבוד רקמות כפי שמוצג בסעיף הפרוטוקול. ההליך כולו לוקח ~ 6 ימים כדי להשלים, ואת שקופיות מוכתמות H&E ניתן לצלם למחרת לאחר השלמת הצביעה.

RT-qPCR באמצעות RNA כחומר מוצא הוא השיטה הנפוצה ביותר לניתוח ביטוי גנים בתחום הביולוגיה של רקמת השומן. מכיוון ש-scBAT הוא מחסן BAT קטן יחסית בהשוואה ל-iBAT, השגת מספיק RNA לביטוי גנים יכולה להיות קשה. כדי להגדיל את תפוקת ה-RNA, אנו ממליצים לבצע שלבי הכנה רציפים לליזט כמפורט בסעיף הפרוטוקול, החל מאבקת הרקמה באמצעות מזיק וטיט בזמן ההקפאה. באמצעות שיטת הכנת ליזט זו, השגנו בהצלחה דגימת RNA באיכות גבוהה ובעלת תפוקה גבוהה לניתוח ביטוי גנים של scBAT מעכבר בוגר אחד. שיטת הכנת ליזט זו יכולה להיות מיושמת גם כדי להשיג ליזטים חלבונים באיכות גבוהה מ scBAT עבור כתמים מערביים עם שימוש במאגר ליזה חלבון.

באמצעות iBAT עכברי, חוקרים צברו ידע משמעותי לגבי תפקוד BAT בתרמוגנזה ובמטבוליזם. הזיהוי האחרון של כמה מחסני BAT שלא היו מוכרים בעבר בעכברים ובבני אדם, כולל scBAT, חשף את הצורך במחקרים נוספים לפני שנוכל להבין באופן מלא את התרומה הפיזיולוגית של BAT בעכברים ובבני אדם בוגרים. בפרט, מחקרים המאירים את מקורותיהם, תפקודיהם ומעורבותם של מחסני BAT חדשים אלה שנמצאו לאחרונה בתרמוגנזה ובמטבוליזם אזורי או של כל הגוף מוצדקים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% אלכוהול מייבש (Flex 95)	Epredia	8201
100% אלכוהול מייבש (Flex 100)	Epredia	8101
צלחת PCR 96 בארות	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Strict Wash	Bio-Rad	7326803-Aurum
Low Strictency Wash	תבניות בסיס Bio-Rad	7326804
(להטמעה)	Tissue-Tek	4122
BD מחט PrecisionGlide 21 גרם x 1 1/2 אינץ'	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא מכסה 2 מ"ל	Fisherbrand	02-681-453
צנטריפוגה	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 מכשיר PCR בזמן אמת	Bio-Rad	12011319
כלורופורם	תרמו מדעי	כימיקלים 383760010
ציטוזיל 60 בינוני הרכבה בעל צמיגות נמוכה	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
ניתוח מיקרוסקופ	ניקון
תמיסת דילול DNase	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	תמיסת Invitrogen	18427013
Elution	Bio-Rad	7326801
EM 400 הטמעת פרפין בינוני	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
פורמולה R הסננה פרפין בינוני	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (עבור HCL-אתנול)	Fisher Chemical	A142212
IP VI הטמעת קלטות	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
אתנול טהור של קופטק - 200 הוכחה (עבור 70% אתנול)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 מ"מ	Thermo Fisher Scientific	R0971
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל	Avantor	87003-294
אטמי מיקרו-סיל 'B' (אטמים אדהיים)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
ביולוגיה מולקולרית כיתה	קורנינג	46-000-CM
מרגמה Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (עבור 0.85% מלח)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop ספקטרופוטומטר	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
פרפין מדור ציפה אמבט	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR רצועת צינור	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
מלח מאגר פוספט (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
דיוק דגם 19 תנור ואקום	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
: 36B4  (קדימה) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			חן מסד נתונים Oligo
פריימר: 36B4 (גב) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo database Primer
: Fabp4 (קדימה) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen lab Oligo
database Primer: Fabp4 (גב) 10 μ M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'			Chen lab Oligo
database Primer: Glut 4 (פריימר קדימה) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen lab Oligo
database Primer: Glut 4 (הפוך) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			חן מסד נתונים Oligo
פריימר: PPARg (קדימה) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Chen lab Oligo
database Primer: PPARg (reserve) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen lab Oligo
database Primer: Ppargc1a (גב) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo
database Primer: Ppargc1a (קדימה) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA CA 3'			Chen lab Oligo database Primer
: Ucp1 (קדימה) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			חן מסד נתונים Oligo
פריימר: Ucp1 (הפוך) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			מעבדת חן
תמיסת בידוד RNA של מסד נתונים Oligo (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (מטהר פני השטח)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
מעכב Rnase (RNase Out)	בקבוקון נצנוץ Invitrogen	10777019
(זכוכית)	מיקרוסקופ אלקטרונים מדעים	72632
ספסל לייבוש שקופיות	אלקטרותרמי (Cole-Parmer)	MH6616
מתלה צביעה אל חלד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	70312-54
מיקרוסקופ סטריאו (להטמעה)	Olympus	SZ51
מספריים סוגיות	McKesson	43-1-104
מלקחיים מוכשרים ישרים לניתוח	Avantor	82027-402
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות	פישר סיינטיפיק	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (כולל 5x מאגר גדיל ראשון ו-0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET עם מחט 25 גרם x 5/8 אינץ', 1 מ"ל	Terumo	100281
SYBR Green (תערובת מאסטר של אנזים qPCR)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek סט צביעת שקופיות ידני (צנצנות)	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	מק"ט: 62540-01
טולואן	פישר כימיקל	T324-1
העברת פיפטה	Avantor	414004-005
קסילן	פישר כימיקל	X3P-1GAL