אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ גרעינים באיכות גבוהה מסוגי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים בהקפאה, סטרומה/אנדותל ותאי דם שמקורם בהקפאה, לתמיכה בניתוחי ריצוף של הדור הבא של גרעין יחיד. ייצור גרעינים שלמים באיכות גבוהה הוא הכרחי לניסויים מולטיומיים, אך יכול להוות חסם כניסה לשטח עבור מעבדות מסוימות.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הם פלטפורמות מצוינות להבנת התפתחות הדם, ולתאי דם שמקורם ב- iPSC יש תועלת תרגומית כריאגנטים לבדיקה קלינית וטיפולי תאים הניתנים לטרנספוזציה. הופעתו והרחבתו של ניתוח מולטיומיקס, כולל, אך לא רק, ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNAseq) ו- Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (snATACseq), מציע את הפוטנציאל לחולל מהפכה בהבנה שלנו של התפתחות תאים. זה כולל ביולוגיה התפתחותית באמצעות מודלים hematopoietic במבחנה . עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לבודד גרעינים שלמים מתאים בתרבית או ראשוניים. סוגי תאים שונים דורשים לעתים קרובות תכשירים גרעיניים מותאמים בהתאם לנוקשות התא ותכולתו. קשיים טכניים אלה יכולים להגביל את איכות הנתונים ולשמש מחסום לחוקרים המעוניינים להמשיך במחקרים מולטיומיים. שימור בהקפאה של דגימות נחוץ לעתים קרובות בשל מגבלות באיסוף ו / או עיבוד תאים, ודגימות קפואות יכולות להציג אתגרים טכניים נוספים לבידוד גרעיני שלם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטה מפורטת לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מתאים שמקורם ב- iPSC בשלבים שונים של התפתחות המטופויטית במבחנה לשימוש בתהליכי עבודה מולטיומיים של גרעין יחיד. מיקדנו את פיתוח השיטה בבידוד גרעינים מתאי סטרומה/אנדותל דבקים שמקורם ב-iPSC ומתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, שכן אלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת זהות מבנית ותאית. שלבי פתרון הבעיות המתוארים הגבילו גושים גרעיניים ופסולת, ואפשרו התאוששות של גרעינים בכמות ובאיכות מספיקות לניתוחים במורד הזרם. שיטות דומות עשויות להיות מותאמות לבידוד גרעינים מסוגי תאים אחרים שמורים בהקפאה.
מבוא
המטופויזיס היא מערכת התפתחותית מאופיינת היטב, אך חוסר יכולת לשחזר את היווצרות תאי הדם במבחנה מדגים הבנה חלקית של גורמים קשורים. מודלים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המבוססים על המטופויזה יכולים לעזור להבהיר גורמי התפתחות מרכזיים וביולוגיה קשורה. מערכת iPSC מציעה גם מודל מצוין לחקר הפרעות דם, ותאי דם מבוססי iPSC פותחו כדי לייצר ריאגנטים רלוונטיים מבחינה תרגומית וטיפולית 1,2,3,4. מחקרים חד-תאיים שימשו באופן נרחב לחקר ביולוגיה התפתחותית מבוססת iPSC, כולל סוגי תאים המיוצרים במהלך המטופויזיס5. בהשוואה לריצוף רנ"א בתפזורת, שאינו יכול להסיק על קשרים בין תת-אוכלוסיות תאים6, מודלים חד-תאיים מאפשרים הערכה של הטרוגניות התא ויכולים להקל על זיהוי ואפיון התפתחות התא 6,7.
היווצרות תאים המטופויטיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים דורשת התמיינות רציפה באמצעות פסים פרימיטיביים, מזודרם ומצבי אנדותל ליצירת תאי אנדותל המוגניים. תאי אנדותל המוגניים הם מבשרים ישירים לתאי גזע ותאי אב המטופויטיים8. לסוגי תאים אלה יש תכונות מורפולוגיות ותאיות שונות להפליא. קיימת הבנה מוגבלת של הנוף האפיגנטי והדינמיקה ההתפתחותית של מודלים של תאים המטופויטיים שמקורם במבחנה, אם כי זהו ידע חיוני כדי לשחרר את מלוא הפוטנציאל הטיפולי של מערכת iPSC. במקרים רבים, רק שיטות אנליזה של תאים בודדים מאפשרות זיהוי אוכלוסיות תאים, פעילויות שעתוק, נופי כרומטינים ומנגנוני בקרה השולטים בהתפתחות בקרב תכשירים הטרוגניים של תאים.
שתי מתודולוגיות, ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) וריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNAseq), יכולות לחשוף תובנות שעתוק ברמת התא הבודד9. גורם עיקרי המכתיב את תוקף הנתונים ומהימנותם הוא הצורך הבלתי מתפשר בדגימות העומדות בקריטריוני איכות מחמירים. אלה כוללים דרישות מדויקות לצפיפות התא / הגרעין, כדאיות אופטימלית ומינימום גושים. הכנת גרעינים בודדים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. ייתכנו אתגרים נוספים הקשורים לשימוש בתאים שנשמרו בעבר בהקפאה.
אנו מציינים ארבע מגבלות פוטנציאליות חשובות לגישות scRNAseq סטנדרטיות. ראשית, פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת תרחיפים של תאים מתייחסים לעתים קרובות לתכשירים מתאים או רקמות טריים, ולא לאלה שנשלפו לאחר שימור בהקפאה10. זה יכול לצמצם את התועלת של משאבים בעלי ערך פוטנציאלי. שנית, יעילות הדיסוציאציה של סוגי תאים מגוונים משתנה. לדוגמה, סוגים רבים של תאי מערכת החיסון עוברים דיסוציאציה בקלות יחסית. לעומת זאת, תאי סטרומה, פיברובלסטים ותאי אנדותל, אשר בדרך כלל מוטמעים במטריצה החוץ תאית ובקרום המרתף, הם בעלי תכונות תאיות ייחודיות שיכולות לסבך בידוד גרעינים11,12. תכונות אלה יכולות לדרוש פרוטוקולי דיסוציאציה אגרסיביים, אשר עלולים לסכן את השלמות המבנית של אוכלוסיות תאים עדינות יותר. שלישית, תאים מסוימים (למשל, מגה-קריוציטים) יכולים לעבור את הקוטר של 100 מיקרומטר ולהציב קשיים עבור מספר פלטפורמות מסחריות קיימות של תא בודד13. בנוסף, טיפול לא נכון יכול להוביל לנזק תאי ולתגובות עקה במהלך השלבים הראשונים של בידוד התא, הכוללים הידרוליזה אנזימטית ודיסוציאציה מכנית, אשר יכולים להשפיע על פרופילי ביטוי גנים11,14.
מסיבות אלה ואחרות, גישת גרעין יחיד עשויה להיות חלופה עדיפה על שיטות תא בודד15. בהתחשב ביציבות העדיפה של קרום הגרעין בהשוואה לקרום התא, מעטפת הגרעין עשויה להישאר שלמה גם לאחר שימור רקמתיבהקפאה 16. זה יכול להקל על מיצוי גרעיני ולשפר את מגוון סוגי הדגימות המתאימים לשיטות ריצוף של הדור הבא. שנית, גרעינים מפגינים התנגדות מוגברת להפרעות מכניות ונוטים להפגין פחות שינויי שעתוק במהלך דיסוציאציה14. לכן, גרעינים יכולים לספק יציבות RNA גדולה יותר ופרופילי שעתוק הניתנים לשכפול רבים יותר. יתרון בולט שלישי של שיטות גרעינים בודדים הוא היעדר אילוצים של גודל התא ויישום עבור תאים גדולים יותר, כמו קרדיומיוציטים או מגה-קריוציטים12. רביעית, גרעינים משמשים כמצע מתאים לאנליזות מולטיומיקס, המציעות תובנות מורחבות מניתוח משולב של ביטוי גנים, אזורי כרומטין נגישים ופרמטרים אחרים17, המאפשרים הבנה עמוקה יותר של הטרוגניות התא, התפתחותה ומצבים תפקודיים18.
על ידי אפיון iPSCs במהלך התפתחות hematopoietic, גישות multiomics יכול לעזור להגדיר תהליכים התפתחותיים במודלים נורמליים או פתולוגיים של מחלות. השוואות של תאים שמקורם ב-iPSC לתאים ראשוניים או רקמות יכולות גם לספק הערכה של נאמנות מודל iPSC לביולוגיה in vivo , להקל על שיפור מודל iPSC וגילוי אוכלוסיות תאים חדשות וגורמים המניעים את היווצרות הדם.
למרות שקבוצות רבות ניווטו בהצלחה את הבידוד הגרעיני ואת ניתוח ריצוף הדור הבא, בידוד גרעינים באיכות גבוהה נותר מחסום בפני מעבדות מסוימות המעוניינות לבצע ניתוחים מבוססי גרעין יחיד. כתב יד זה מפרט פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מתאים שבעבר נשמרו בהקפאה iPSC. התמקדנו בתאי סטרומה/אנדותל דבקים ובתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, מכיוון שאלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת מבנה ותוכן הדורשים שינויים מותאמים אישית ופתרון בעיות כדי להגביר את ההתאוששות של גרעינים באיכות גבוהה הניתנים לריצוף הדור הבא או לניסויים אחרים.
פרוטוקול
1. cryopreservation של תאים
- יש להקפיא >1 x 106 תאים מבודדים שמקורם ב-iPSC לכל מ"ל ב-1 מ"ל של 90% FBS ו-10% DMSO. הכניסו את ההקפאה למיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C כדי להפחית את מהירות ההקפאה ולמטב את התאוששות התאים בת קיימא (Table of Materials). צפו אובדן תאים משמעותי, אשר יכול להשתנות בהתאם לתנאי התרבית ולזהות התא.
- עבור מ- -80°C לאחסון חנקן נוזלי תוך 24 שעות.
2. הפשרת תאים
- יש לאחזר קריוביאל מאחסון חנקן נוזלי ולהפשיר באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. הסר מאמבט המים בעוד גבישי קרח קטנים עדיין גלויים.
- מעבירים את התאים מהקריוביאל לצינור ריק של 15 מ"ל ומוסיפים לאט 10 מ"ל של מדיום מחומם מראש (RPMI 1640 + 10% FBS) תוך ערבוב זהיר. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 3 דקות ב 25 ° C.
- לשאוף את supernatant ולבנות מחדש ב 1 מ"ל של DPBS בתוספת 2% FBS ו 1 mM CaCl2 (טבלה של חומרים). בזהירות לערבב על ידי pipetting 3x עם micropipette 1000 μL. מעבירים לצינור תחתון עגול פוליסטירן 5 מ"ל.
3. הסרת תאים מתים
- הוסף 50 μL של קוקטייל להסרת תאים מתים (טבלה של חומרים) ל 1 מ"ל של תרחיף התא. הוסיפו 50 מיקרוליטר של קוקטייל לבחירת ביוטין לתערובת התאים. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. שלבים אלה מסמנים את התאים המתים Annexin V+ הכלולים בתרחיף התא עם ביוטין.
- מערבלים במרץ במשך 30 שניות, חרוזי דקסטרן המיועדים לדלדול סוגי תאים לא רצויים המסומנים בביוטין (רשימת חומרים). יש להוסיף 100 μL של חרוזי דקסטרן לתרחיף התאים ולערבב על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה 2x עם מיקרופיפטה של 1000 μL (טבלת חומרים).
- הוסף 1.3 מ"ל של DPBS המכיל 2% FBS ו- 1 mM CaCl2 לתרחיף התא וערבב על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה 2x עם מיקרופיפטה של 1000 μL. מכניסים את הצינור למגנט (טבלת חומרים) ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
- הפוך את המגנט והצינור כדי לשפוך את תרחיף התא החי המועשר לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C. הסר את רוב supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של DPBS + 0.04% BSA. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג 3x עם מיקרופיפטה 1000 μL.
4. בידוד גרעינים
- צנטריפוגה מתלה תאים חיים ב 460 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן לשאוף supernatant, להבטיח שום הפרעה של כדור התא.
- יש להוסיף 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס טרי 0.5x מקורר על קרח (טבלה 1) ולערבב בעדינות על ידי פיפטוף 10x עם מיקרופיפטה של 100 μL. יש לדגור 3 דקות על קרח.
- הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה צונן (טבלה 2) לצינור ללא ערבוב. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
5. שטיפה והערכה של גרעינים
- יש לשאוף סופרנאטנט ולהוסיף 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה צונן כדי להמיס את הגלולה השלמה שנותרה ללא ערבוב. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. מוציאים את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית הגרעינים.
- השהה מחדש ב-120 מיקרוליטר של חיץ גרעינים מדולל מקורר (טבלה 3). סנן את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר (רשימת חומרים).
- צביעה עם 0.4% טריפאן כחול והערכה חזותית של איכות גרעינים מבודדים תחת מיקרוסקופ 10x (טבלה של חומרים).
6. עיבוד גרעינים מבודדים
- שמור גרעינים על קרח. המשך לעיבוד נוסף באופן מיידי, מכיוון שגושים גרעיניים יכולים להתרחש לאורך זמן ומחייבים שלבי סינון נוספים.
תוצאות
השתמשנו בפרוטוקול הנ"ל כדי לחלץ גרעינים מתאי סטרומה/אנדותל נצמדים שמקורם ב-iPSC בהקפאה ומתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים (צפים). ייצוג סכמטי מפורט של הליך הבידוד הגרעיני ניתן למצוא באיור 1.
לצורך בדיקה מורפולוגית, גרעינים מבודדים הוכתמו בכחול טריפאן והודמיינו תחת מיקרוסקופ. בדיקה מורפולוגית גרעינית היא קריטית מיד לפני העיבוד, שכן פסולת או גרעינים גושים יכולים להפחית או למנוע יצירת נתונים איכותיים עקב סתימות במכשירים מיקרופלואידים מדויקים. בדיקה מיקרוסקופית של גרעינים שבודדו מדגימה שהוכנה באמצעות פרוטוקול קיט קונבנציונלי הראתה נוכחות של פסולת וצבר גרעיני ≥1 לכל שדה דמיוני (איור 2A-B). דגימות אלה הושלכו בשל איכות נחותה.
גרעינים באיכות גבוהה הם עגולים ושלמים, עם גושים מינימליים או ללא גושים כלל, כמו אלה שראינו לאחר אופטימיזציה של השיטה (איור 2C-D). לא ראינו אגרגטים או גושים בדגימות אלה. גרעינים אלה היו באיכות ובכמות מספיקות כדי לתמוך בעיבוד ובניתוח במורד הזרם. פתרון בעיות דומה ומיטוב פרוטוקולים עשויים להתרחב לסוגי תאים אחרים שמורים בהקפאה.
איור 1: דיאגרמה שמדגימה מיצוי גרעינים מתאים שמורים בהקפאה. תיאור חזותי המפרט את השלבים הכרוכים בבידוד גרעיני מתאים שמורים בהקפאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: גרעינים שבודדו מתאים אנושיים שמקורם בתאי iPSC אנושיים שמורים בהקפאה. גרעינים מבודדים מתאי סטרומה/אנדותל דבקים המוכתמים בכחול טריפאן מראים פסולת משמעותית (A) חלקיקים קטנים ו-(B) אגרגטים גרעיניים (חלקיקים גדולים) שמנעו ניתוחים במורד הזרם. לאחר ביצוע שינויים טכניים שהוצגו כאן, גרעינים באיכות גבוהה בודדו מ-(C) תאי אב המטופויטיים אנושיים שמקורם ב-iPSC בהקפאה או (D) מאוכלוסיות תאי סטרומה/אנדותל בכמויות מספיקות כדי לתמוך בניתוחים במורד הזרם. לשם השוואה, תאי אב המטופויטיים לא דבקים אלה נאספו ביום 9 + 8 ותאי סטרומה / אנדותל דבקים ביום 9 + 7 של התמיינות hematopoietic כמתואר ב4. שימו לב שמורפולוגיה גרעינית יכולה להיות שונה בין סוגי תאים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| הכנת חיץ | |||
| חיץ ליזיס 0.5X | מניות | הסופי | 2 מ"ל |
| 1X חיץ ליזיס | פי 1 | פי 0.5 | 1 מ"ל |
| חיץ דילול ליזיס | 1 מ"ל | ||
| חיץ ליזיס | מניות | הסופי | 2 מ"ל |
| BSA | 10% | 1% | 200 מיקרוליטר |
| דיגיטונין | 5% | 0.01% | 4 μL |
| DTT | 1000 מילימטר | 1 מ"מ | 2 μL |
| MgCl2 | 1 מטר | 3 מ"מ | 6 μl |
| NaCl | 5 מטר | 10 מ"מ | 4 μL |
| תחליף Nonidet P40 | 10% | 0.10% | 20 מיקרוליטר |
| מים ללא Nuclease | 1.67 מ"ל | ||
| מעכב RNase | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH7.4) | 1 מטר | 10 מ"מ | 20 מיקרוליטר |
| טווין-20 | 10% | 0.10% | 20 מיקרוליטר |
| חיץ דילול ליזיס | מניות | הסופי | 2 מ"ל |
| BSA | 10% | 1% | 200 מיקרוליטר |
| DTT | 1000 מילימטר | 1 מ"מ | 2 μL |
| MgCl2 | 1 מטר | 3 מ"מ | 6 μL |
| NaCl | 5 מטר | 10 מ"מ | 4 μL |
| מים ללא Nuclease | 1.72 מ"ל | ||
| מעכב RNase | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH7.4) | 1 מטר | 10 מ"מ | 20 μl |
טבלה 1: הכנת חיץ ליזיס 0.5x. פתרון זה מיועד להליך בידוד גרעינים בשלב 4.2. חיץ ליזיס וחיץ דילול ליזיס מעורבבים להכנת חיץ ליזיס 0.5x. חובה להכין חיץ טרי מיד לפני כל ניסוי ולשמור על קרח. שים לב שפתרון בעיות עבור סוגי תאים מסוימים עשוי לכלול דילול של 1x, 0.5x או דילול נמוך יותר של מאגר ליזה כדי להקל על בידוד גרעין שלם.
| הכנת חיץ | |||
| חיץ כביסה | מניות | הסופי | 4 מ"ל |
| BSA | 10% | 1% | 400 מיקרוליטר |
| DTT | 1000 מילימטר | 1 מ"מ | 4 μL |
| MgCl2 | 1 מטר | 3 מ"מ | 12 מיקרוליטר |
| NaCl | 5 מטר | 10 מ"מ | 8 מיקרוליטר |
| מים ללא Nuclease | 3.40 מ"ל | ||
| מעכב RNase | 40 U/μl | 1 U/μl | 100 מיקרוליטר |
| Tris-HCl (pH7.4) | 1 מטר | 10 מ"מ | 40 מיקרוליטר |
| טווין-20 | 10% | 0.10% | 40 מיקרוליטר |
טבלה 2: הכנת חיץ שטיפה. פתרון זה משמש במהלך בידוד גרעינים. זה צריך להיות מוכן טרי לפני כל ניסוי ולשמור על קרח.
| הכנת חיץ | |||
| מאגר גרעינים מדולל | מניות | הסופי | 1 מ"ל |
| DTT | 1000 מילימטר | 1 מ"מ | 1 μL |
| מים ללא Nuclease | 924 מיקרוליטר | ||
| מאגר גרעינים | פי 20 | פי 1 | 50 מיקרוליטר |
| מעכב RNase | 40 U/μL | 1 U/μL | 25 מיקרוליטר |
טבלה 3: הכנת חיץ גרעינים מדולל. פתרון זה משמש בשלב 5.2. יש להכין אותו טרי לפני כל ניסוי ולשמור אותו על קרח.
דיון
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
בידוד גרעינים באיכות גבוהה חיוני ליישום מוצלח של שיטות ריצוף הדור הבא המבוססות על גרעין יחיד, המתפתחות במהירות. מתוך הכרה בחסמים הקיימים עבור מעבדות המעוניינות בגישות אלה, במיוחד עבור דגימות שמורות בהקפאה, כוונתנו הייתה לעצב טכניקת בידוד גרעיני המותאמת לתאים שהוקפאו בעבר. בידוד גרעינים מדגימות שמורות בהקפאה נחוץ לעתים קרובות עבור דגימות קליניות ועבור אוכלוסיות תאים נדירות שמקורן ב- iPSC.
חשוב להתאים את דילול חיץ הליזיס, זמן הליזה ותדירות הסינון לאוכלוסיות תאים ספציפיות. ראינו סוגי תאים רגישים במיוחד, כגון תאי אב המטופויטיים אנושיים שמקורם ב-iPSC בהקפאה, הופכים לליזה מוגזמת תוך פחות מדקה עם חיץ ליזיס 1x. ליזה יתר כזו אינה רק תקלה טכנית או תפעולית. במקום זאת, ליזה מוגזמת וגושים יכולים להצביע על דליפה של חומרים גרעיניים דביקים. עבור תאי סטרומה ואנדותל דבקים עם ארכיטקטורה ציטו-שלד חזקה וממברנות עם נטייה ליצור הידבקויות תאים חזקות, היה צורך בסינון כפול כדי להסיר גרעינים גושיים. אגרגטים גרעיניים יכולים לחסום ערוצים מיקרופלואידים, להציג סיכונים מוחשיים לשלמות הניסוי ולמנוע כל פלט נתונים.
מצאנו גם כי שילוב שלב הסרת תאים מתים הגביר באופן דרמטי את ההתאוששות של גרעינים שלמים תוך הגבלת גושים ופסולת. היה צורך לעבד דגימות המכילות >70% תאים קיימא בהתבסס על צביעה כחולה טריפאן בתחילת הניסוי. שמירה על כל החוצצים על קרח יכולה גם לעזור לשמור על כדאיות.
מגבלות הטכניקה
השיטה המתוארת נועדה לייעל את ההתאוששות הגרעינית מסוגי תאים שמקורם בתאי iPSC בתרבית4. ייתכן שהליכי פתרון בעיות דומים יתרחבו מעבר לתאים הנגרמים על ידי iPSC ויכללו סוגי תאים אחרים שמורים בהקפאה, אך מעט קשה לחזות צרכים ספציפיים עבור דגימות בודדות או סוגי תאים ללא בדיקה. ללא קשר לדגימה או לסוג התא, שאיפה להכנות גרעיניות עם <5% תאים שלמים בני קיימא שנותרו, מזעור הצבירה והפחתת גרעינים שעברו ליזה יתר על המידה צריכה להיות בקורלציה ישירה עם הצלחת הניסוי.
משמעויות ביחס לשיטות הקיימות
מערכות התמיינות מבוססות iPSC רלוונטיות מבחינה תרגומית יכולות לייצר מספר רב של סוגי תאים ואבות. פרוטוקול זה מתמקד בתאי סטרומה/אנדותל דבקים שמקורם ב-iPSC ובתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים כסוגי תאים לדוגמה שהיו להם דרישות מתודולוגיות שונות כדי לייעל את הבידוד הגרעיני. אנו צופים שניתן יהיה להתאים פרוטוקול זה וליישם אותו על סוגי תאים אחרים שמקורם ב-iPSC כדי לחקור שלבים התפתחותיים מרכזיים, מתוך הכרה בכך שיש צורך לכוונן שיטות בידוד בהתאם לתכולת החלבון, מבנה הממברנה וקשיחות התא. עם זאת, המתודולוגיה המתוארת כאן עשויה לאפשר התאוששות של גרעינים באיכות גבוהה ממגוון רחב של סוגי תאים שמורים בהקפאה.
גילויים
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
המחברים מודים לג'ייסון הטקיאמה (10x Genomics) ודיאנה סלייטר (בית החולים לילדים במרכז פילדלפיה לגנומיקה יישומית) על ההדרכה וההצעות. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (HL156052 ל- CST).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <>ריאגנטים חזקים לתרבית תאים | |||
| תמיסת דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| <תאים חזקים> | |||
| תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים | N/A | N/A N/A | IPSCs ששימשו במחקר זה הושגו באמצעות מתקן ליבת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים של CHOP |
| <ריאגנטים לצביעה >תאים חזקים | |||
| טריפן תמיסה כחולה | קורנינג | 25900CI | |
| חזקים | |||
| סידן כלורי (CaCl<תת>2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep הסרת תאים מתים (נספח V) ערכת | StemCell Technologies | 17899 | ערכה זו מיועדת לדלדול סוגי תאים לא רצויים המסומנים בביוטין. הערכה כוללת קוקטייל להסרת תאים מתים (נספח V), קוקטייל בחירת ביוטין וחרוזי דקסטרן. ערכה זו מכוונת לפוספטידילסרין על העלון החיצוני של קרום התא של תאים אפופטוטיים באמצעות Annexin V. תאים לא רצויים מסומנים ב-Annexin V, נוגדנים ביוטיניים וחלקיקים מגנטיים, ומופרדים ללא עמודות באמצעות מגנט EasySep. תאים רצויים פשוט נשפכים לצינור חדש. |
| <חזק>חומרים | |||
| 10 ומיקרו; l מחלקות מיקרופיפטות | מדע | 470231606 | |
| 100 ומיקרו; l מחלקות | מיקרופיפטות מדע | 470231598 | |
| 1000 ומיקרו; l טיפ אוניברסלי מורחב | מוצרי מעבדת אוקספורד | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 ומיקרו; l מחלקות מיקרופיפטות | מדע | 470231602 | |
| 2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגניים | קורנינג | 431386 | |
| 20 ומיקרו; l מחלקות מיקרופיפטות | מדע | 470231608 | |
| 200 ומיקרו; l | מחלקות מיקרופיפטות מדע | 470231600 | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול | פלקון | 352063 | |
| קורנינג סיפון עבודה 0.1-10 ומיקרו; l תחנת קצה פיפט | קורנינג | 4143 | |
| קורנינג סיפון 1-200 ומיקרו; l תחנת קצה פיפט | קורנינג | 4144 | |
| תא ספירה | CytoSMART | 699910591 | |
| מסננת תאים Flowmi, 40 ומיקרו; מ | Bel-Art | H136800040 | |
| מגנט | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° מיכל הקפאה C | Nalgene | 51000001 | |
| ריאגנטים לבידוד גרעינים <חזקים> | גרעינים כוללים מאגר ליזה, מאגר כביסה, ומאגר גרעינים מדולל, ומאגר דילול ליזה. המבנה של מאגרים אלה נמצא בטבלה 1, 2 ו-3. שיטת בידוד הגרעינים שלנו שיפרה את הבידוד מפרוטוקולי הערכה הסטנדרטיים (למשל, מדריך למשתמש של 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression [CG000338]). ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מספר ערכות מסחריות, כולל Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| ערכת הסרת תאים מתים | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol Solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| מסננת תאים Flowmi, 40 ומיקרו; m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS תמיסת מלאי אלבומין בקר בקר (BSA) | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| מגנזיום כלוריד (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| תמיסת מגנזיום כלוריד, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 תחליף | סיגמא | 74385 | |
| ללא נוקלאז Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector מעכב RNase | Sigma | 3335399001 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| תמיסת נתרן כלוריד, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| <חזק>ציוד אחר | |||
| מונה תאים אוטומטי | CytoSMART | 699910591 | |
| מיקרוסקופ | Zeiss | Primostar 3 |
מקורות
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
