מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
דג הזברה הבוגר (Danio rerio), שהוא נגיש גנטית, משמש כמודל בעל ערך לבעלי חוליות לחקר הפרעות אנושיות כגון קרדיומיופתיה. הזרקה תוך צפקית (IP) היא שיטה חשובה המספקת תרכובות לגוף לבדיקת השפעות טיפוליות או ליצירת מודלים של מחלות כגון קרדיומיופתיה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין (DIC). נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות של הזרקת IP. לשתי השיטות יש מגבלות בטיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הגורמות לתופעות לוואי המתבטאות בפגיעה חמורה בצורת הגוף ובמוות של דגים. בעוד שניתן להתגבר על חסרונות אלה על ידי הכשרה מקיפה של החוקרים, שיטת הזרקת IP חדשה בעלת תופעות לוואי מינימליות רצויה. כאן, שיטת הזרקת IP ייחודית המסוגלת להתמודד עם תרכובות רעילות מדווחת. ירידה עקבית בתפקוד הלב עלולה לגרום ללא מוות משמעותי של דגים. ניתן לשלוט בטכניקה בקלות על ידי חוקרים שיש להם ניסיון מינימלי עם דגי זברה בוגרים.
מבוא
דג זברה (Danio rerio) זכה לתשומת לב כמודל ניסיוני לחקר מחלות אנושיות מכיוון שבעל חיים זה כולל הומולוגיה גבוהה של גנים ואיברים לבני אדם, הפריה חיצונית, קלות מניפולציה גנטית ושקיפות הגוף לבגרות מוקדמת, המאפשרת מספר עצום של יישומי הדמיה1. בניגוד לתהליך הפשוט של העברת תרופות ישירות למים עבור עוברים וזחלים של דגי זברה, מתן תרופות לדגי זברה בוגרים מציג מאמץ מורכב ומאתגר יותר2.
בדגים בוגרים, תרכובות יכולות להיות מועברות באמצעות טכניקות פסיביות של העברת סמים, כגון מתן ישיר למים, או באמצעות שיטות העברת תרופות דרך הפה כמו gavaging2. גישות אחרות כוללות ציפוי מזון דגים בתרכובות ולאחר מכן הזנת הדגים3, ומתן ישיר של תרופות בלתי מסיסות במים בריכוז קבוע מראש, כולל זריקות רטרו-אורביטליות או תוך צפקיות 4,5. מתן תוך צפקי מועדף למחקרי in vivo של מודלים של מחלות בשל היתרונות הפרמקוקינטיים המובהקים שלו6. שיטה זו מספקת ריכוז גבוה של תרופות וזמן מחצית חיים מורחב בתוך חלל הצפק, ומציעה מסלול יעיל לאספקת תרופות 7,8. הגישה משמשת בדרך כלל במסגרות מחקר כדי להבטיח ספיגה והפצה אופטימלית של תרופות 9. בעוד שיטות מבוססות הזרקה הוכיחו יעילות עבור משלוח יחיד, זריקות ממושכות וחוזרות לעיתים קרובות להוביל נזק לגוף זיהום כרוני2.
נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות של הזרקת IP ב zerbafishבוגר 4,10. עם זאת, לשתי השיטות יש מגבלות כאשר הן מספקות תרכובות רעילות כמו דוקסורוביצין, מה שמוביל לנזק חמור לצורת הגוף ולתמותת דגים. תופעות הלוואי יכולות לסבך באופן משמעותי את פירוש הנתונים. למרות שניתן להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות הכשרה מקיפה10, יש צורך ברור בשיטת הזרקת IP חדשה הממזערת את תופעות הלוואי.
כאן, המטרה שלנו היא לפתח שיטה חדשה של הזרקת IP המותאמת להעברה יעילה של דוקסורוביצין לדגי זברה בוגרים, ולהקל על יצירת מודלים אמינים של קרדיומיופתיה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין (DIC) עם נזק גוף מינימלי ותמותה נלווית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים שנערכו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק, תוך שמירה על הסטנדרטים המפורטים ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" (National Academies Press, 2011). כל דגי הזברה במחקר שייכים לזן הקריוטיפ ההודי הפראי (WIK). פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנה ואחסון של תמיסת מלאי דוקסורוביצין
- השג את מלאי doxorubicin ממקור מסחרי.
הערה: דוקסורוביצין רגיש לאור, לכן רכשו אותו בצורת אבקה ואחסנו אותו במיכלים אטומים כדי להגן עליו מפני חשיפה לאור. בצעו את כל השלבים להכנת אבקת Dox בתוך מכסה מנוע כימי. - ממיסים לחלוטין את אבקת Dox במים מזוקקים ומכינים תמיסת ציר בריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל.
- Aliquot את המניה על ידי חלוקתו צינורות 1.5 מ"ל.
- עטפו את הצינורות ברדיד אלומיניום כדי להגן עליהם מפני חשיפה לאור.
- אחסן את תמיסת aliquot Dox ב- 4 ° C לאחסון לטווח קצר (< חודש), או -20 ° C לאחסון לטווח ארוך10.
2. קיבוץ הדגים לפי משקל גופם
- קבצו את הדגים עם הפרש BW של פחות מ-10% יחד להזרקה לאחר מכן.
הערה: כדי לחסוך מאמץ בשלב זה, דגים עם שונות BW של פחות מ-10% מסווגים באותו גודל. - יש לאפשר לדגים לצום במשך 24 שעות לפני ההזרקה.
- מרדימים את הדג באמצעות מי עובר המכילים 0.16 מ"ג/מ"ל טריקאין למשך דקה אחת.
- הוציאו את הדג מהמים עם טריקאין וטפחו את שני צידי גוף הדג בנייר סינון נקי כדי להסיר עודפי מים.
- מדוד ורשום את BW של כל דג, ולאחר מכן החזר מיד את הדג למיכל התאוששות מלא במי מערכת מתוקים.
הערה: הזרקת דוקס בוצעה על דגים לאחר שהגיעו לגיל 3 חודשים. במחקר זה, החוקרים השתמשו בדגים בני 3 חודשים עד 10 חודשים. ה-BWs של דגי זברה בוגרים, מזן WIK, עשויים לנוע בין 0.2 גרם ל-0.5 גרם. הרדמה ממושכת שנמשכה יותר מ-5 דקות, ולאחריה זריקת דוקס, הובילה לתמותה גבוהה של דגים.
3. הכנת המחט והתחנה להזרקה
- קבע את נפח ההזרקה של תמיסת ציר Dox (למשל, 5 מ"ג/מ"ל) הדרוש לכל דג בהתבסס על משקל הגוף הממוצע כדי להשיג את המינון המיועד של 20 מיקרוגרם/גרם.
- השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפח ההזרקה:
- הוסף 1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) כדי לדלל את תמיסת Dox המחושבת בשלב 1 להזרקה, ולהגיע לנפח כולל של 5 μL.
הערה: השתמש בתמיסת תפזורת עבור כל קבוצת דגים בהתבסס על BW שלהם וכלול 3 דגים נוספים בכל קבוצה כדי להבטיח שלא יהיה מחסור בתמיסה להזרקה במהלך הניסוי. - הקש בעדינות על הצינור ולאחר מכן מיקרוצנטריפוגה קצרה במהירות שיא כדי לאסוף את התמיסה בטמפרטורת החדר במשך 10 שניות.
- הניחו את התמיסה המוכנה על קרח והגנו עליה מפני חשיפה לאור.
- הניחו צלחת פטרי נקייה בקוטר 100 מ"מ עם ספוג מתחת למיקרוסקופ ניתוח, ולאחר מכן התאימו את המיקוד.
הערה: הספוג מכיל חריץ באורך 4 ס"מ. הנסיגה האלסטית של הספוג תספק לדג תמיכה ותשמור על גוף הדג במקומו. ניתן לעשות שימוש חוזר בספוג. - צייד מזרק מיקרו 10 μL עם מחט משופעת 34 G.
- שטפו את המחט עם חיץ HBSS 1x כדי לסלק בועות ולנקות חסימות פוטנציאליות מהמזרק.
- למדוד 5 μL של הפתרון מוכן בשלב 4 עבור ההזרקה.
4. הליך הזרקת IP Dox
- שים את הדג הבוגר במים עם 0.16 מ"ג / מ"ל טריקאין למשך דקה אחת כדי לגרום למצב של חוסר הכרה.
- מקמו את הדג בחריץ של הספוג המשובץ כשהבטן פונה כלפי מעלה (איור 1A).
- הכניסו את המחט בזווית הקרובה ל-0°, החל מנקודת האמצע של סנפיר החזה לכיוון הצד האחורי של חלל הלב (איור 1B).
הערה: הימנע מכל מגע עם הלב במהלך ההליך. - כוונו את המחט לכיוון הזנב והיכנסו מתחת לעור הכסוף.
הערה: מקם את המחט קרוב לעור הכסוף, תוך הקפדה על מניעת שריטות או פירסינג. - עקבו אחר קצה המחט בתוך חלל הבטן לאורך כל הניתוח (איור 1C).
הערה: הימנע מפגיעה בכבד, במעיים, בשלפוחית השחייה ובאיברים אחרים. ודא כי המחט מגיעה לסוף המעי, ליד פתח cloacal. - שחררו בהדרגה ובאופן שווה את תמיסת 5 μL Dox, ואז משכו באיטיות את המחט לאורך הנתיב המקורי כדי למנוע דליפה (איור 1D).
- עקבו אחר נוכחות של Dox בחלל הבטן על-ידי התבוננות בצבע אדום של תמיסת Dox (איור 1E).
- העבירו במהירות את הדגים המוזרקים למיכל מעבר נקי מלא במי מערכת מתוקים כדי לעזור לדגים להתאושש.
הערה: בין הזרקות, יש לשטוף את המחט פעם אחת עם חיץ HBSS אחד.
5. טיפול בדגים לאחר הזרקה
- החזירו את הדג למערכת עם מחזור הדם לאחר ההזרקה.
- צום את כל הדגים המוזרקים במשך 24 שעות נוספות כדי להקל על החלמתם.
- במהלך השבוע הראשון, השגיחו מקרוב על הדגים. הסר את הדגים המתים בהקדם האפשרי כדי למנוע הדבקה של הדגים האחרים.
הערה: מקרי מוות של דגים במהלך 24 השעות הראשונות נובעים ככל הנראה מפציעות פיזיות מהזריקה או מהרדמה ממושכת. רשום מספרי דגים כדי ליצור עקומת הישרדות. - בצע אקוקרדיוגרפיה לפנוטיפ של הדג המוזרק Dox ב 56 ימים לאחר ההזרקה11.
הערה: ודא אחידות בתנאים ובנהלים עבור קבוצת הביקורת המתאימה המוזרקת עם תמיסת HBSS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעבר, שתי שיטות intraperitoneal (IP) שימשו לניהול doxorubicin בדגי זברה בוגרים 4,10. בשיטה I, הידועה גם כשיטת הזרקת IP קלאסית כפי שתוארה על ידי Kinkel et al.4, המחט הוחדרה בזווית של 45° לקו האמצע בין סנפירי האגן כאשר הבטן פונה כלפי מעלה. בשיטה II, או שיטת הזרקת IP חלופית כפי שתוארה על-ידי Ma et al.10, המחט הוחדרה דרך הצד הגבי של הדג (איור 2A(i,ii)). לעומת זאת, בשיטה השל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בשונה משתישיטות הזרקת IP 4,10 הקיימות, שיטת הזרקת ה- IP החדשה מאופיינת בתכונות השונות הבאות. ראשית, נעשה שימוש בזווית חדירה ייחודית של מחט (קרוב לאפס); שנית, המחט חודרת לדג דרך מיקום ייחודי, כלומר חור טבעי על פני השטח הגחוני של הדג, שיקל על ההזרקה; ולבסוף, תנועת המחט היא מהקדמי לאחורי. התאמות אלה מפחיתות ביעילות את הפגיעה באיברים, הנובעת מדליפה מינימלית של Dox במהלך תהליך החדירה. נתיב המחט נמצא ממש מתחת לעור הכסוף, אשר ניתן למעקב רציף על ידי החוקר. כתוצא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי ה- NIH (HL107304 ו- HL081753) וקרן מאיו (המרכז לגילוי ביו-רפואי ומרכז מחקר לב וכלי דם) ל- X.X. J.L. ממומן על ידי קרנות המחקר הבסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות של אוניברסיטת מרכז דרום, מס '56021702. תודה מיוחדת לבניניו גור וקוונטין סטיבנס על ניהול מתקן דגי הזברה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10 μ L NanoFil-seringe | World Precision Instruments, Inc | NANOFIL | הזרקת |
| כלי 34 G מחט | מכשירי דיוק עולמיים, Inc | NI34BV-2 | כלי injcetion |
| 60 מ"מ צלחת פטרי | פישר מדעי/פישרברנד | FB0875713A | הנחת הספוג |
| ניתוח מיקרוסקופ | ניקון | SMZ800 | משלב את |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | ליצירת מודל DIC |
| אקו לב | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | מדידת תפקוד הלב |
| ספוג קצף | Jaece Industries | L800-D | הנחת הדג |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | רכב |
| למיקרוצנטריפוגה Dox | southernlabware | MyFuge/C1012 | אוספים את תמיסת Dox |
| משקל איזון מדויק | Torbal | AD60 | מאזניים דיגיטליים |
| Tricaine | Argent | MS-222 | דגים מרדים |
| Eppendorf | 1.5 מ"ל | אחסון | |
| VEVO LAB&NBSP; תוכנה | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | כימות הלב |
מקורות
- Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
- Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies. Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio). Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
- Liu, J., et al. Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells. Front Immunol. 13, 853894(2022).
- De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent. The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).
- Dakwar, G. R., et al. Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible. Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).
- Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish. J Vis Exp. (136), e57567(2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Christidi, E., Brunham, L. R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician. Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).
- Chaoul, V., et al. Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease. Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).
- Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models. Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
