בדיקות טרומבוליזה חוץ-גופית נאבקו לעתים קרובות לשכפל תנאי in-vivo בין אם בפקקת המודל המעוכלת או בסביבה שבה מתרחשת פקקת. במאמר זה, אנו חוקרים כיצד צימוד לולאת צ'נדלר ובדיקת פיברינוליזה פלואורומטרית זורמת בזמן אמת (RT-FluFF) משמש לניטור ליזה של קרישי דם באיכות גבוהה, ex-vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מעקב אחר פיברינוליזה של קרישי דם שלמים שנוצרו בלולאה של צ'נדלר תחת זרימת גזירה במודל פקקת חוץ גופית
במאמר זה
סיכום
תקציר
טרומבואמבוליזם וסיבוכים נלווים הם גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם ובדיקות שונות פותחו כדי לבדוק את יעילות התרופה הטרומבוליטית הן במבחנה והן in vivo. יש ביקוש גובר למודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של קריש דם במבחנה לפיתוח תרופות בשל המורכבות והעלות הכרוכות במודלים של בעלי חיים, בנוסף לחוסר התרגום שלהם לעתים קרובות לפיזיולוגיה האנושית. זרימה, לחץ וקצב גזירה הם מאפיינים חשובים של מערכת הדם, כאשר קרישי דם הנוצרים תחת זרימה מציגים מורפולוגיה ומאפייני עיכול שונים מאשר קרישי דם שנוצרו באופן סטטי. גורמים אלה לעתים קרובות אינם מיוצגים בבדיקות קונבנציונליות של עיכול קרישי דם במבחנה , אשר יכולות להיות להן השלכות פרמקולוגיות המשפיעות על שיעורי ההצלחה של תרופות.
בדיקת Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) פותחה כפלטפורמת בדיקת פקקת באיכות גבוהה המשתמשת בקרישי דם מתויגים פלואורסצנטית הנוצרים תחת זרימת גזירה, אשר מתעכלים לאחר מכן באמצעות פלזמה במחזור בנוכחות או היעדר חומרים פרמצבטיים פיברינוליטיים. שינוי קצבי הזרימה הן של שלבי היווצרות קרישי הדם והן של שלבי עיכול הקריש מאפשר למערכת לחקות מצבים עורקיים, ריאתיים וורידיים על פני מערכי ניסוי מגוונים ביותר. ניתן לבצע מדידות ברציפות באמצעות פלואורומטר בתוך הקו או על ידי לקיחת נקודות זמן בדידות, כמו גם מדידת מסת קריש נקודת קצה קונבנציונלית. בדיקת RT-FluFF היא מערכת גמישה המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר עיכול קריש דם בתנאי זרימה המייצגים בצורה מדויקת יותר תנאים פיזיולוגיים in-vivo תוך שמירה על הבקרה והשחזור של מערכת בדיקות במבחנה.
מבוא
מחלות הנובעות ביסודן מאטיולוגיות טרומבו-אמבוליות מהוות מקור עיקרי לתחלואה ולתמותה בחברה של ימינו. ביטויים של פתוגנזה טרומבו-אמבולית כוללים, אך אינם מוגבלים לאוטם שריר הלב, שבץ איסכמי, פקקת ורידים עמוקים ואמבולי ריאתי1. כמות עצומה של מחקר מתמשך, המתפרש על פני דיסציפלינות רבות, סובבת סביב פיתוח שיטות בטוחות ויעילות להתמודדות עם פקקת פתוגנית. שינויים בביטויים עורקיים וורידיים של פקקת ומיקומים אנטומיים משתנים הביאו לפיתוח גישות טיפול שונות. עם זאת, טיפול אקוטי מסתמך בדרך כלל על שימוש תרומבוליזה פרמקולוגית באמצעות מפעילי פלסמינוגן עם פוטנציאל לכריתת תרומבקטומיה מכנית בנסיבות קליניות מסוימות2.
הפיתוח של אסטרטגיות טיפול פרמקולוגיות חדשניות מסתמך ביסודו הן על מודלים של בעלי חיים in-vivo והן על מודלים של עיכול במבחנה לבדיקות פרה-קליניות 3,4. מודלים של In-vivo נהנים באופן טבעי מיכולתם ללכוד את האינטראקציה המורכבת של פרמטרים פיזיולוגיים שונים על יעילות הטיפול הכוללים פינוי של חומרים פרמצבטיים כמו גם אינטראקציות תאיות עם תרופות. עם זאת, אותה מורכבות הופכת לעתים קרובות מודלים כאלה ליקרים למדי ומציגה בעיות נוספות כאשר מנסים לבודד את הפרמקו-דינמיקה/קינטיקה הבסיסית בבעלי חיים השונים באופן משמעותי מהפיזיולוגיה האנושית. הפיתוח של מודלים במבחנה סייע בכך שהקל על סביבת בדיקות מזוקקות שבה ניתן לבצע פיתוח תרופות ובדיקות סקר, אך לעתים קרובות חסרה את הנאמנות הדרושה כדי לשחזר את מצב המחלה הנחקר.
פרוטוקולים במבחנה נפוצים לבדיקת טרומבוליטיקה חדשנית מסתמכים על ניצול קרישי דם שנוצרו וליזה בתנאים סטטיים שבהם מסת הקריש השיורית משמשת כנקודת הקצה העיקרית 5,6. למרבה הצער, טכניקות כאלה אינן מסתיירות בהיבטים המכניים של ליזה קרישה כגון זרימה טורבולנטית וטיפות לחץ טרנס-טרומבוס שיכולות לשנות באופן משמעותי את הפרמקודינמיקה של תרופות בדיקה. בנוסף, קרישי דם הנוצרים בתנאים סטטיים מכילים מיקרו-ארכיטקטורה השונה מקרישי דם פיזיולוגיים. נוכחות של גזירה במהלך היווצרות קריש הוכחה כמשפיעה על מאפייני הקריש המתקבלים כגון הפעלת טסיות דם וקישור פיברין. קרישי דם המיוצרים תחת זרימת גזירה מפגינים הטרוגניות מורכבת מקצה לזנב הנעדרת בקרישי דם שנוצרו סטטית 7,8. סטיות כאלה מארכיטקטורת הקריש הפיזיולוגי עשויות להשפיע על אפיון פיתוח תרופות חשוב הכולל חדירת תרופה בתוך פקקת ויעילות ליזה לאחר מכן9.
כדי להתמודד עם חלק מהמגבלות הללו הקשורות לשימוש במודלים סטטיים של קרישה / קריש דם, אימוץ לולאת צ'נדלר הן ליצירת קריש והן לליזה של קריש דם בנוכחות גזירה ראה התעוררות מחודשת10. למרות שמערכות כאלה מאפשרות ייצוג טוב יותר של דינמיקת זרימה ומייצרות קרישי דם עם ארכיטקטורה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית בהשוואה לבדיקות סטטיות יחסית, תנאי הזרימה הפשוטים שלהן עדיין מייצגים סטייה מהתנאים הפיזיולוגיים. לבסוף, גישות מיקרופלואידיות ננקטו גם בשל קלות ההדמיה ודפוסי הזרימה האחידים שלהן; עם זאת, הם עדיין מהווים הסרה משמעותית מהתנאים הפיזיולוגיים הצפויים בתוך כלי הדם הגדולים יותר המושפעים בעיקר ברוב הפרעות טרומבו-אמבוליות רלוונטיות מבחינה קלינית11,12.
בהתחשב בדיון לעיל, פיתחנו מודל תרומבוליזה במבחנה באיכות גבוהה לבדיקת תרופות תרומבוליטיות פרה-קליניות. המודל נועד לטפל בכמה מהמלכודות הנוכחיות שפורטו לעיל בתחום הסינון החדשני לטיפול תרומבוליטי ואומת לשחזור ורגישות בריכוזים משתנים של מפעיל פלסמינוגן רקמתי (tPA). המערכת המתוארת כאן מציעה זרמי גזירה פיזיולוגיים באמצעות משאבה פריסטלטית, מדכאת לחץ, מאגר מחומם, שני חיישני לחץ, פלואורומטר מובנה ואנלוג צ'נדלרי בצורת קריש גזירה עם תווית פלואורסצנטית כדי להקל על מעקב בזמן אמת אחר פיברינוליזה13. יחד, המערכת הכוללת נקראת Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 וכתב יד זה ידון במורכבויות של הקמה והפעלה מוצלחת של בדיקות במודל טרומבוליזה חוץ-גופית זה באיכות גבוהה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המוזכרות להלן הן בהתאם לפרוטוקולים של ועדת הביקורת המוסדית (IRB) וועדת האתיקה המוסדית למחקר אנושי. כל המתנדבים הבריאים נתנו הסכמה בכתב ומדעת לפני תרומת הדם. שימו לב, ניתן למצוא את כל החומרים המוזכרים בפרוטוקול בטבלת החומרים. בעוד ש-WB ופלזמה אנושיים נידונים לאורך פרוטוקול זה, ניתן לרכוש ולהחליף את השימוש בדם של חיות מחקר ובמוצרי דם מרוקנים מפקטורים.
1. איסוף דם שלם
- איסוף דם ורידי שלם (WB) ממתנדבים בריאים בהסכמה באמצעות טכניקות פלבוטומיה סטנדרטיות.
התראה: ודא כי אמצעי זהירות אוניברסליים ננקטים כדי להפחית את הסיכון למגע עם דם או חומרים אחרים שעלולים להיות זיהומיים לאורך פרוטוקול זה. יש צורך להשתמש בכפפות, מעיל מעבדה ומגן פנים. - יש לאסוף ~50 מ"ל של WB ישירות לתוך צינורות נתרן ציטראט 3.2% ומיד לאוגד לתוך צינורות 50 מ"ל לשימוש לאחר מכן.
הערה: יש צורך בצינורית השלכה לפני איסוף הדם לציטראט בנוסף להבטחת מילוי הצינורות לנפח המומלץ על ידי היצרן. WB שנאסף טרי ישחזר בצורה הטובה ביותר את דינמיקת הקרישה של המארח. אחסון לטווח קצר של WB בטמפרטורת החדר (≤4 שעות לפני השימוש) מותר. WB אינו מאוחסן בן לילה מכיוון שהוכח כי זה משפיע על דינמיקת הקרישה כאשר נבדק באמצעות טרומבואלסטוגרפיה15.
2. היווצרות קריש
- לתוך 3 מ"ל של דם שלם ציטרציה, להוסיף פלואורסצנטית (fluorescein isothiocyanate [FITC]) מתויג פיברינוגן (FITC-Fg) לריכוז סופי של 60 מיקרוגרם / מ"ל (יחס של 1:50 מתויג פלואורסצנטית פיברינוגן לפיברינוגן ללא שינוי בהנחה ריכוז פיברינוגן פלזמה אנדוגני של 3 מ"ג / מ"ל).
הערה: ניתן להגדיל יחס זה ל-1:10 עם השפעה מינימלית על המורפולוגיה של הקריש. 13,14 ניתן לרכוש או ליצור פיברינוגן מתויג פלואורסצנטית על ידי תגובה פיברינוגן עם איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC). ערבוב פיברינוגן צריך להיעשות ≤5 דקות לפני תחילת הריצה.- אם פיברינוגן היה בעבר aliquoted ו קפוא, לבדוק את FITC-Fg מופשר כדי לוודא פילמור לא התחיל מוקדם מדי ובכך להפוך אותו שמיש (להבטיח את היעדר חלקיקים או סיבים בתמיסה).
- הכינו את מערך לולאת צ'נדלר עם תוף בקוטר 120 מ"מ באמבט מים של 37°C (איור 1). ודא שהתקן הלולאה של צ'נדלר מסוגל להסתובב בקצב סיבוב קבוע של 0-90 סל"ד במהלך כל תהליך היווצרות הקריש.
הערה: ניתן למצוא הגדרות ושינויים נוספים בלולאת צ'נדלר ב- Zeng et al.16. - חותכים צינורות (קוטר פנימי 5/32 אינץ', קוטר חיצוני 7/32 אינץ') ויוצרים לולאות שמתאימות היטב אך לא בחוזקה סביב התוף. עבור גודל הצינור המומלץ שנדון כאן, חתכו צינור PCR סטנדרטי של 200 μL לשימוש כהתאמה לחיבור קצות הצינור ליצירת הלולאה הסגורה.
הערה: ניתן להשתמש בצינורות בגדלים שונים כדי לייצר קרישי דם בגדלים שונים16. - להתחיל קרישת דם על ידי הוספת 200 mM תמיסת סידן כלוריד ביחס של 1:17 תמיסת סידן לדם שלם. טען את הדם לתוך הצינור (מלא ~ 50% מנפח הצינור) באמצעות מזרק 3 מ"ל. הניחו מיד את הלולאה על תוף הלולאה של צ'נדלר המחבר בין הקצוות והתחילו בסיבוב.
- ודא ערבוב נכון עם היפוך עדין לפני הטעינה כדי למנוע בעיות הנובעות מהתגבשות רכיבי WB.
- ודא כי כמות שווה של דם מתווספת לכל צינור בכל ריצה, שכן זה יכול להשפיע על גודל הקריש אם לא נשמר עקבי.
- מכיוון שבועות בתוך עמוד הדם יכולות להשפיע גם על קרישת הדם, הסר אותן על ידי הזזת הצינור בעדינות באופן דמוי "נדנדה" כדי להקל על בריחת הבועות לפני העמסתן על התוף.
- סובב את התוף השקוע חלקית באמבט המים בקצב סיבוב של 40 סל"ד כדי להשיג קצב גזירה מחושב של ~450 s-1.
הערה: עיין ב- Zeng et al. לקבלת מידע על גזירות מחושבות בהתבסס על גודל הצינור ומהירות הסיבוב (20 עד 60 סל"ד)16. שיעורי גזירה ורידיים ועורקיים אופייניים הם 20-200 s-1 ו- 300-1,000 s-1, בהתאמה, כאשר ~ 400-500 s-1 מייצג את עורק הריאה. - אפשרו להיווצרות קרישי דם במשך 40-60 דקות בתנאי תאורה חלשה כדי למזער את ההלבנה של הפיברינוגן המתויג באופן פלואורסצנטי.
- לאחר שהגיע זמן הקרישה הרצוי, הוציאו את הקרישים מהצינורית והשתמשו בהם מיד. כדי להבטיח הסרה עדינה של הקרישים מבלי לפגוע במבנה, הפכו בעדינות את הצינור כדי לאפשר לקריש להחליק באיטיות החוצה מהצינור לתוך מיכל קטן.
הערה: אחסון קרישי דם שנוצרו בפלזמה ציטרלית או PBS למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עשוי להשפיע על ניתוח מאוחר יותר של עיכול קריש דם בלולאת הזרימה.
3. הגדרת מכשיר RT-FluFF
- ודא שמנגנון לולאת הזרימה מחובר כפי שניתן לראות באיור 2 ושכל החיבורים מאובטחים. בקיצור, מנגנון לולאת הזרימה כולל, לפי סדר כיוון הזרימה: משאבה > שיכוך > חיישן לחץ כניסה > חיישן לחץ > קריש > פלואורומטר > משאבת > מאגר מחומם. התאם את בחירת קיבולת המשאבה, קצב זרימת הניסוי, קוטר ואורך הצינורות, הטמפרטורה, נפח המאגר וגודל / גיאומטריה של קריש כדי להתאים לצרכים הניסיוניים הייחודיים לכל מחקר.
הערה: עבור דוגמה זו, אותו צינור בקוטר המשמש בלולאת צ'נדלר שימש עבור RT-FluFF. ניתן להשתמש בצנרת למספר ריצות באותו היום, אך יש לעקוב אחריה לאיתור התפרקות או דליפה ולהחליף/לשטוף לפי הצורך. מומלץ לשטוף במים מזוקקים חמים בין המסלולים. בהתאם לתכנון הניסוי, ייתכן שיהיה צורך להחליף את הצינור לאחר כל ריצה. - לאחר שכל הצינוריות מאובטחות, הפעל את צג הלחץ. בדוק שצג הלחץ קורא 0 מ"מ כספית הן עבור חיישני הכניסה והן עבור חיישני היציאה. אם לא, פתח את השסתומים כדי לוודא שחיישני הלחץ פתוחים ללחץ אטמוספרי ואפס את החיישנים.
- הפעל את בלוק החימום או אמבט המים הנמצאים בשימוש ועקוב אחר הטמפרטורה במהלך הניסוי. שמור על הטמפרטורה קרוב ל 37 ° C כדי לחקות את טמפרטורת גוף האדם פיזיולוגית.
- הפעל את המשאבה לקצב הזרימה הרצוי כדי לבדוק אם יש נזילות ולוודא שחיישני הלחץ פועלים.
הערה: קצב זרימה של ~160 מ"ל/דקה בגודל צינורות זה ייצג קצב גזירה של ~500 s-1. - כבה את המשאבה כדי להקל על העמסת קרישי דם.
4. העמסת הקריש לתוך לולאת הזרימה
- אם נעשה שימוש בקריש דם שיוצר בעבר ואוחסן, הקפד להביא את הקריש לטמפרטורת החדר לפני העמסתו למערכת לולאת הזרימה.
- אובדן מסת קריש הוא מדד נקודת קצה חשוב עבור בדיקות פקקת. מומלץ למדוד מסת קריש דם רגע לפני העמסתו ללולאת הזרימה במקום להסתמך על מדידות קודמות.
- מדידות מסת קריש צריכות תמיד להיעשות באותה צורה בכל פעם כדי להבטיח עקביות בין דגימות ועל פני ימי בדיקה, שכן תוכן נוזלי בתוך ועל הקרישים יכול להשפיע באופן משמעותי על המסה שלהם. השיטה המומלצת היא להדביק בעדינות קרישי דם על מגבוני מעבדה עד שהם כבר לא משחררים כמות משמעותית של נוזלים על המגבון, תוך זהירות שלא לדחוס את הקריש לאורך כל תהליך המדידה.
- השקיעו את הקריש בפלזמה (אוטולוגית או תואמת סוג), או פתרון פאזה נייד אחר המשמש בלולאת הזרימה (כגון PBS או מדיה מוגדרת) במיכל רדוד כגון צלחת שקילה. יש לקחת את פתרון הפאזה הנייד ישירות ממאגר המערכת של 50 מ"ל כדי לשלוט בנפח המערכת הכולל. אין צורך בחומר בדיקה תרופתי או תרופתי במהלך שלב העמסת הקריש. הנפח הכולל של השלב הנייד להפעלת לולאת הזרימה מומלץ להיות ≥50 מ"ל וצריך להיות עקבי בכל הדגימות.
- הסר את החלק המרכזי של צינור לולאת הזרימה (בין חיישני כניסה ויציאה) וחבר מזרק 10 מ"ל לקצה אחד של הצינור.
- באמצעות הקצה החופשי של הצינור, מניחים אותו בשלב הפלזמה (או הנייד) ותופסים נפח קטן של התמיסה כדי להקדים את הצינור. לאחר מכן הניחו את פתח הצינור ליד הקריש ובחנו בקפידה את הקריש כדי לזהות את הראש (בדרך כלל הקצה העבה מעט יותר של הקריש) ואת הזנב (הקצה מול הראש). ראש הקריש צריך להיות ממוקם לכיוון חיישן לחץ הכניסה והרחק מהשקע. מניחים את הצינור בקצה ה"זנב" של הקריש ושאפו אותו לתוך הצינור עם המזרק.
הערה: במקרים בהם לא ניתן לקבוע חזותית את כיווניות ראש הקריש/זנב, ניתן להקצות כיווניות בצורה הטובה ביותר על סמך ידיעת כיוון הסיבוב מלולאת צ'נדלר - ראש הקריש פונה לכיוון ההפוך לסיבוב התוף. - חבר את הצינור בחזרה למנגנון הראשי כך שהקריש יהיה הקרוב ביותר לחיישן לחץ היציאה (ראש הקריש צריך להיות פונה הרחק מחיישן היציאה). אבטח את הקריש במקומו על ידי ניקוב הצינורית וראש הקריש בשתי מחטים של 30 G בתבנית "X". השאירו את המחטים האלה למשך כל הריצה.
הערה: בהתאם להגדרות המשככים והמשאבה, ייתכן שיהיה צורך במחטים נוספות כדי להבטיח שהקריש לא יתפרק בטרם עת. במידת הצורך, ניתן להוסיף מסך לצינורות במורד הזרם של הקריש כדי למנוע מרסיסי קריש הדם במערכת. לאחר שנקבע מספר מוגדר של מחטים שיחזיקו את הקריש, שמרו על עקביות בכל התנאים. - קח את שארית פתרון הפאזה הנייד והכנס אותו לצינור של 50 מ"ל כמאגר.
- מניחים את המאגר באמבט המים ומכניסים את צינורות הכניסה והיציאה (המוצא הוא מהפלואורומטר והכניסה נכנסת לראש המשאבה).
- בדוק שהפלואורומטר שבו נעשה שימוש מחובר ומנוטר. בדוק שהערך ההתחלתי מתאים בהשוואה לבסיס של מערכת פאזה בלבד ניידת בתחילת הניסוי.
הערה: אם פלואורומטר בתוך השורה אינו זמין, ניתן לבצע דגימה מחזורית סדרתית של המאגר בפרקי זמן מוגדרים לאורך תקופת ניתוח לולאת הזרימה. ניתן לקרוא שברים שנאספו באמצעות צלחת של 96 בארות מיד לאחר השלמת הניסוי בכל ספקטרופוטומטר זמין מסחרית. - הוסף 500 μL של 100,000 ng/mL tPA ישירות לנפח המאגר כדי להשיג ריכוז סופי של 1,000 ng/mL tPA ב- 50 מ"ל. הנפח, הריכוז והתרופה הספציפית שתתווסף יהיו תלויים בריכוז היעד הרצוי ובנפח מאגר המערכת.
- בדוק את הדברים הבאים לפני הפעלת המשאבה:
- כל הצמתים מאובטחים.
- שני השסתומים מעל חיישני הלחץ נמצאים במצב סגור מתאים.
- כל שארית פלזמה (או נוזל) הוחלפה במאגר.
- הטרומבוליטי נוסף למאגר ומעורבב כראוי.
- צינורות הכניסה נמצאים בסמוך לתחתית המאגר (זה מבטיח בועות מינימליות).
- צינורות היציאה מאובטחים ובגובה המתאים ללחץ הרצוי (תלוי באיזה מיקום כלי נבחן).
- כיוון סיבוב המשאבה נכון (סדר זרימה: משאבה > דמפנר > קריש > פלואורומטר > מאגר > משאבה).
- אם סל"ד המשאבה מוגדר גבוה מאוד (>150 סל"ד), התחל במהירות איטית יותר והגבר כדי להבטיח שהשינוי המהיר בלחץ לא ישבור את הקריש או יגרום לדליפת צינור.
- ודא שהמערכת רושמת את הנתונים כראוי מהפלואורומטר ו / או חומרים מתכלים מוכנים לדגימה תקופתית של השלב הנייד לקריאות נקודת זמן לאחר הניסוי.
- הפעל את המשאבה והגדר אותה להשגת קצב הזרימה הנפחי הרצוי של 160 מ"ל/דקה או הגדל את קצב הזרימה עד להשגת הלחץ הרצוי. המערכת תתמלא בנוזלים ובועות. הבועות יעלו באופן מלאכותי את הקריאות הפלואורומטריות, לכן שימו לב שהבועות יתבהרו. ברגע שהם עושים זאת, כבו את האורות והתחילו באיסוף נתונים.
- השאירו את המשאבה פועלת עד שהקריש יתפרק משמעותית או עד שחלף זמן הניסוי הרצוי (≥60 דקות). הוספת ריאגנטים, לפי הצורך, למערכת לאורך כל הניסוי דרך המאגר כדי ליצור תנאי ניסוי ייחודיים הבודקים מגוון וריאציות טרומבוליטיות.
הערה: זמן הניסוי יהיה תלוי בקצב זרימת המשאבה (רמת הגזירה) ובריכוז הטרומבוליטי. - לאחר השלמת הבדיקה, הפחיתו את קצב הזרימה הנפחית, והוציאו את צינור הכניסה בזמן שהמשאבה עדיין פועלת כדי לדחוף את רוב הנוזל במערכת לתוך המאגר (שלב נייד כלשהו יישאר בצינורות). נתק את קטע הצינור המכיל קריש בצד חיישן לחץ היציאה של הצינור והורד אותו לסירת שקילה.
- הסר את המחטים המחזיקות את הקריש במקומו כדי לאסוף את שאריות הנוזל מתוך המערכת ושברי קריש/קריש. השתמש במזרק כדי לסייע בניקוי המערכת לפי הצורך.
- לשקול ולעבד את הקריש הנותר לניתוח נוסף כגון חישוב אחוז המסה שאבדה או עבור היסטולוגיה.
5. ניקוי המערכת
- בין הדגימות, שוטפים את כל המערכת במים חמים בסל"ד גבוה (>150 סל"ד). יש להעמיס את המים לתוך המכל ולרוץ דרך המערכת במשך 2 דקות לפחות, ריק, ולרוץ שוב במשך שתי שטיפות מערכת מלאות. לאחר שטיפות אלה, אם קריאת הפלואורומטר אינה חוזרת לקו הבסיס, חזור על תהליך השטיפה למשך מחזור נוסף. אם הוא עדיין לא חזר לקו הבסיס, שנה לחלוטין את הצינורית לפני בדיקת הדגימה הבאה.
הערה: במהלך הניסויים, ניתן לעשות שימוש חוזר בצינורות בין דגימות; עם זאת, בשל הנקב עם מחטים המשמשות להחזקת הקריש במקומו, יש להחליף את קטע הצינור בין חיישני לחץ הכניסה והמוצא לאחר כל ריצה. בתנאים ניסיוניים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להחליף את כל ערכת הצינוריות לאחר כל ריצה או בדיקות אשכולות כדי למנוע כל זיהום צולב דגימה. - לאחר שכל הדגימות הופעלו לניסוי של אותו יום, הסר את כל הצינוריות והשליך. יש לקרצף את צמתי ה-T במים חמים ובמברשת זיפים עד לנקיון ולהשאיר לייבוש ולשטוף את משככי המזרקים במים חמים. השתמש 70% EtOH כדי לעזור עם סטריליות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
היווצרות קריש לולאת צ'נדלר
ביצירת קרישי דם, כיוונו בדרך כלל למרובעים כדי להבטיח שאם קיימים חריגים כלשהם של קריש דם (בהתבסס על מורפולוגיה גסה ומסה), עדיין תהיה לנו היכולת להריץ בדיקות תרומבוליזה משולשות. בהנחה של תנאי העמסה אופטימליים, קרישי הדם צריכים להיות אחידים למדי באורך (~3.3 ס"מ), במשקל (~100 מ"ג) ובמראה כפי שמיוצג באיור 3. כאשר השתמשנו ב- FITC-Fg, כיוונו גם לבחון קרישי דם תחת אור UV כדי להבטיח פיזור אחיד יחסית של פלואורסצנטיות בניגוד לאזורים לא סדירים של תיוג היפר-...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היווצרות קריש דם ותיוג
לולאת צ'נדלר הוכחה כמספקת אמצעי קל ויעיל ליצירת קרישי דם המחקים תרומבי 16 in-vivo. פרמטרים של כוונון עדין כגון גודל צינורות, מהירויות סיבוב, קוטר תוף וזמן קרישה מאפשרים יצירה מהירה של קרישי דם בתנאי גזירה שונים שיכולים ללכוד תכונות אדריכליות המוערכות במגוון תרומבי המחקה מקורות עורקיים וורידיים כאחד. הגמישות הנוספת של היכולת להציג סמנים כגון FITC-Fg מרחיבה את השימושים הפוטנציאליים של טרומבי אלה כפי שהדגמנו במערכת RT-FluFF. עד כמה שהעקרונות הבסיסיי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01HL167877. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 30 גרם מחטים היפודרמיות חד פעמיות | Exel International | 26439 | חומרים מתכלים אחרים |
| 6 מ"מ HSS מחרטת בר כלי מלאי 150 מ"מ ארוך | uxcell | B07SXGSQ82 | לולאת צ'נדלר, |
| 96-Well ברור שטוח תחתון UV-שקוף מיקרופלייט | קורנינג | 3635 | חומרים מתכלים אחרים, קופולימר אקרילי לא מטופל, לא סטרילי |
| Air-Tite Luer-lock לא סטרילי 60 מ"ל | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF מכשיר, מנגנון שיכוך |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water | System Sartorius | NA | DI מקור מים |
| סידן כלוריד | Millipore Sigma | C5670 | חומרים מתכלים אחרים |
| מתמרי BP חד פעמיים | מכשירי AD MLT0670 | מכשירי RT-FluFF | |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | מכשירי RT-FluFF Drager |
| Siemans מוניטור מטופל | Drager | SC 7000 | RT-FluFF תוף מכשיר |
| (צילינדר, קוטר 120 מ"מ, רוחב 85 מ"מ) | לולאת צ'נדלר, | ||
| מגן פנים | Moxe | SHIELDS10 | לולאת צ'נדלר, |
| פיברינוגן מפלזמה אנושית, Alexa Fluor 488 מצומד | Thermo Scientific | F13191 | חומרים מתכלים אחרים |
| , פוליקרבונט, תא עצירה לארבעה כיוונים, מנעול לואר זכר, | Masterflex | 30600-04 | מכשיר RT-FluFF |
| פלואורסצאין (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | חומרים מתכלים אחרים |
| אמבט מים לשימוש כללי | Thermo Scientific | 2839 | לולאת צ'נדלר, |
| פלטה חמה 4 ופעמים; 4 | פישר סיינטיפיק | 1152016H | מכשיר RT-FluFF |
| מקור אנושי פלזמה טרי קפוא | Zen-Bio | SER-SPL | חומרים מתכלים אחרים, CPDA-1 נוגד קרישה |
| דם מלא אנושי | Zen-Bio | SER-WB-SDS | חומרים מתכלים אחרים, נוגד קרישה CPDA-1 |
| ראש משאבה L/S Easy-Load II לצינורות דיוק בעלי ביצועים גבוהים, בית PPS, מנגנון SS רוטור | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF, ראש משאבה |
| L/S משאבת הנעה דיגיטלית במהירות משתנה עם קלט/פלט מרחוק, 6 עד 600 סל"ד; 90 עד 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | מכשיר RT-FluFF, |
| בקר מהירות מנוע | משאבה CoCocina | ZK-MG | לולאת צ'נדלר, |
| צינורות Nalgene מחברים מסוג | T Thermo Scientific | 6151-0312 | מכשירי RT-FluFF |
| צינורות משאבה פריסטלטית | מאסטרפלקס | 06424-15 | חומרים מתכלים אחרים |
| פוספט חוצץ | מלח Millipore Sigma | P3813 | חומרים מתכלים אחרים, אבקה, pH 7.4, להכנת פתרונות 1 ליטר |
| מיתוג ספק כוח | SoulBay | UC03U | לולאת צ'נדלר, |
| Thermo Scientific National Target מזרקים חד פעמיים מפלסטיק 10 מ"ל | Thermo Scientific | S751010 | מתכלים אחרים |
| מפעיל פלסמינוגן רקמות, | Millipore Sigma | T0831 | מתכלים אחרים |
| מזהה צינורות 1/4 אינץ', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | מתכלים אחרים, חתוכים לחלקים של 1.5 ס"מ המשמשים לחיבור צינורות למחברים |
| מסוג Tמזהה צינורות "5/32, קוטר חיצוני "7/32 | Tygon | ND-100-65, מזין מסמכים אוטומטי 00009 | חומרים מתכלים אחרים |
| V3 365 ננומטר מיני - אור שחור פנס UV | uvBeast | uvBeast uvB-V3-365-MINI | לולאת צ'נדלר, המשמשת לבדיקת קרישים שהושלמו |
| ZGA37RG ZYTD520 מנוע DC, 12 וולט, 100 סל"ד | Pangyoo | ZGA37RG | לולאת צ'נדלר, |
מקורות
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684(2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14(2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833(2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
