מאמר שיטה

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 בספטמבר 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

תקציר

נוקלאוזומים מהווים את היחידה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי והיו במוקד של מחקרים אינפורמטיביים רבים על מולקולות בודדות בנוגע לתכונות הביופיזיקליות שלהם ולאינטראקציות שלהם עם חלבונים קושרי כרומטין. בנייה מחדש של נוקלאוזומים על דנ"א עבור מחקרים אלה כרוכה בדרך כלל בהליך דיאליזה מלח המספק שליטה מדויקת על המיקום ומספר הנוקלאוזומים הנוצרים לאורך קשירת DNA. עם זאת, פרוטוקול זה גוזל זמן רב ודורש כמות משמעותית של DNA ואוקטמרים של היסטון כתשומות. כדי להציע אסטרטגיה חלופית, מתוארת שיטת בנייה מחדש של נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המשתמש במלווה ההיסטון Nap1. שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על כל תבנית DNA ללא צורך ברצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים, להתאים את צפיפות הנוקלאוזומים לפי דרישה ולהשתמש בפחות ריאגנטים. היווצרות נוקלאוזומים באתרם מתרחשת תוך שניות, ומציעה זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למדידות של מולקולה בודדת. דוגמאות לשני מבדקים במורד הזרם לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים ולהדמיית ההתנהגות של חלבונים בודדים על הכרומטין מתוארות בהמשך.

מבוא

יחידת האריזה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי היא הנוקלאוזום, שבו ~147 זוגות בסיסים (bps) של DNA עטופים סביב אוקטמר של חלבוני היסטוני ליבה 1,2. בנוסף לאריזת הגנום, ארכיטקטורת הנוקלאוזומים משמשת כשכבה עשירה נוספת של ויסות ביופיזיקלי שניתן לרתום על ידי חלבונים קושרי כרומטין, בעת ביצוע תפקידיהם השונים 3,4. גישה ניסיונית למאפיינים פיזיקליים של נוקלאוזומים ומדידתם הייתה מאתגרת מבחינה טכנית, שכן יחידות אלה פועלות בסקאלות זעירות (למשל, אורכים ננומטריים, כוחות פיקוניוטון), ולכן, החיטוט שלהן דורש רגישות ודיוק מספיקים כדי ליידע באופן משמעותי את התפקוד. יתר על כן, חלבונים קושרי כרומטין מתקשרים לעתים קרובות עם הסובסטרטים שלהם באופן ארעי, ורוב גישות האנסמבל חסרות רזולוציה טמפורלית מתאימה כדי ליידע את הקינטיקה של אינטראקציות אלה5. למרבה המזל, הופעתן של טכניקות של מולקולות בודדות אפשרה לדמיין ולתפעל חלבונים בודדים ואת האינטראקציות שלהם בזמן אמת, ולחשוף מידע מכניסטי על אירועים מולקולריים אלה המתרחשים בקנה מידה ננומטרי6. בפרט, כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (smCFFM) רותם הן זיהוי פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה והן כלי מניפולציה של כוח כדי לפתור בו זמנית את המכניקה, ההרכב והתיאום של קומפלקסים של כרומטין וכרומטין-חלבון 7,8.

ב- smCFFM המשתמש באופן ספציפי ב"פינצטה אופטית" כשיטת מניפולציית הכוח, לייזר ממוקד היטב משמש ללכידת אובייקט דיאלקטרי, בדרך כלל חרוז פלסטיק בגודל מיקרון, בשלושה ממדים9. ביופולימר כגון פיסת דנ"א יכול להיות מצומד לחרוז (באמצעות, למשל, סטרפטווידין-ביוטין, קישור נוגדנים digoxigenin-anti-digoxigenin), והמשתמש יכול גם להפעיל כוח מכויל וגם למדוד את הכוח/תזוזה שנוצר על ידי המערכת10. מודול הפלואורסצנטיות הנוסף מאפשר הדמיה פלואורסצנטית מרובת צבעים בו זמנית כדי לעקוב אחר הרכב החלבונים והתנהגותם.

השיטה המקובלת לבנייה מחדש של תבניות נוקלאוזומים עבור smCFFM כוללת הרכבת נוקלאוזומים על תבניות DNA מותאמות אישית על ידי דיאליזה מלחית 11,12,13. בהליך זה, אוקטמרים מטוהרים של היסטון מודגרים עם תבניות דנ"א במאגר מלח גבוה (~1 M נתרן כלורי), וכאשר המלח מתרחק באיטיות, נוקלאוזומים מתאספים באופן ספונטני על הדנ"א באופן מיקום תלוי רצף14,15. ככזה, נהוג שרצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים (לדוגמה, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) משולבים בתוך תבניות הדנ"א כדי ליצור מערכי נוקלאוזומים מותאמים אישית. למרות ששיטה מבוססת זו מציעה שליטה מדויקת על מיקום ומספר הנוקלאוזומים על פני הדנ"א, היא סובלת ממספר חסרונות: (1) שילוב של רצפי DNA בעלי מיקום נוקלאוזומים חזקים עשוי ליצור נוקלאוזומים יציבים באופן מלאכותי המטים את פעילותם של חלבונים קושרי כרומטין, (2) תהליך דיאליזה מלח להיווצרות נוקלאוזומים דורש כמויות גבוהות של DNA ואוקטמרים, ו-(3) ההליך לוקח יום עד מספר ימים של עבודה, כמו גם מאמץ ניכר כדי להתאים את יחס הדנ"א לאוקטמר הנכון לקבלת צפיפות אופטימלית של מערך נוקלאוזומים.

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה חלופית ליצירת נוקלאוזומים לאורך DNA באתרו בתוך כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מלווה היסטון רקומביננטי Nap1, הדומה למסלול הפיזיולוגי של היווצרות נוקלאוזומים in vivo 18,19,20,21,22 . שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על רצפי דנ"א לא ספציפיים, להתאים בקלות את צפיפות הנוקלאוזומים ולנצל כמויות קטנות משמעותית של ריאגנטים, כל זאת תוך דקות. בנוסף, היווצרות של קשירי DNA נוקלאוזומליים באתרם מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ואת הנוחות של הדמיה ומניפולציה מובנית של מולקולה אחת. לכן, כאשר מיקום נוקלאוזומים אחיד וספציפי אינו הכרחי, פרוטוקול זה מציע אפשרות שימושית לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים או התנהגות החלבונים על כרומטין, שעבורה אנו מתארים גם בדיקות לדוגמה.

פרוטוקול

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת DNA biotinylated

  1. הכינו תגובת נפח של 120 μL המכילה 20 מיקרוגרם של λ DNA, 33 מיקרומטר של ביוטין-dCTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dUTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dATP, 33 מיקרומטר של dGTP, 10 יחידות של אנזים קלנו, ו-1x NEB Buffer 2.
    הערה: הליך זה משתמש באופן ספציפי בדנ"א גנומי λ של בקטריופאג' ליניארי דו-גדילי (ds) נטול מתילציה (48,502 bps), המכיל 12-נוקלאוטיד (nt) 5' חד-גדילי (ss) DNA מעל23. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לשימוש בכל אורך או רצף של dsDNA ליניארי בתנאי שהוא מכיל לפחות מספר nts של ss 5' overhangs, האורך ורצף nt המכתיבים את מספר nts biotinylated מותקן בכל קצה עבור קשירה במורד הזרם בין מלכודות אופטיות. בנוסף, ניתן להקטין את התגובה. לדוגמה, 5 מיקרוגרם של דנ"א יכול לשמש בתגובת נפח של 30 μL. בנוסף, מצעי הדנ"א הנוצרים בדרך זו אינם מוגבלים פיתול. לקבלת פרוטוקולים ליצירת DNA מוגבל פיתול, עיין בדוחותשפורסמו בעבר 24,25.
  2. לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  3. הוסף 10 mM של EDTA ודגור ב 75 ° C במשך 20 דקות.
  4. בצע משקעים אתנול כדי להשיג את המוצר DNA biotinylated.
    1. הוסף נפח 0.1x של 3 M נתרן אצטט ונפח 3x של 100% אתנול קר כקרח. יש לשמור בטמפרטורה של -20°C למשך שעה לפחות עד הלילה. צנטריפוגה ב 13,500 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
    2. בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע את הגלולה ולהוסיף 1 מ"ל של 75% אתנול. צנטריפוגה ב 13,500 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C.
    3. חזור על שלבי הסרת הסופרנאטנט, הוספת אתנול וצנטריפוגה.
    4. מוציאים בזהירות את כל הסופרנאטנט ונותנים לגלולה להתייבש באוויר במשך 10 דקות. יש להמיס את הגלולה ב-100-200 מיקרוליטר של חיץ TE או ddH2O (יכול לדגור ב-37°C כדי להקל על המסה). מדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה.

2. הכנת ערוצים בתא זרימה

הערה: הליך זה מבוסס על שבב מיקרופלואידי זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), אך ניתן להתאים אותו לכל מכשיר smCFFM עם תא זרימה רב-ערוצי.

  1. תעלות פסיביות (ch.) 4 ו-5 (או כל ch. שיכיל חלבונים) (ראו סכמה של ערוצים באיור 1A). הוסף 500 μL של 0.1% BSA לכל ערוץ וזרם במהירות של 0.8 בר (~ 0.45 μL/s עבור צינורות בקוטר פנימי של 0.010 אינץ ') למשך 8 דקות. הסר את התמיסה.
  2. הוסף 500 μL של 0.05% Pluronic-F127 לכל ערוץ וזרם ב 0.8 בר במשך 8 דקות. הסר את התמיסה ושטוף את המזרקים עם 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של 1x PBS לכל ערוץ וזרם ב- 0.8 בר למשך 27 דקות.
  3. מערבלים את תמיסת המניות של חרוזים מצופים סטרפטווידין (הליך זה משתמש בחרוזים בגודל 3.13 מיקרומטר) ומוסיפים 2.15 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים ל -1 מ"ל של PBS 1x. הוסף לפרק 1.
    הערה: ניתן להתאים את הגודל והריכוז של החרוזים המצופים סטרפטווידין בהתאם להעדפת המשתמש.
  4. הוסף 30-80 ng של λ DNA biotinylated ל 1 מ"ל של 1x PBS. הוסף לפרק 2.
    הערה: ניתן להתאים את ריכוז הדנ"א הביוטינילי להעדפת המשתמש. כמויות גדולות יותר של דנ"א יגבירו את תדירות יצירת קשירת הדנ"א, אך גם יעלו את התדירות של קשירת מולקולות דנ"א מרובות בבת אחת, מה שיכול להוסיף לקושי של הניסוי.

3. Nap1-בתיווך היווצרות נוקלאוזומים באתרם

  1. הוסף 500 μL של מאגר תמונה ללא חלבון לפרק 3.
    הערה: הרכב החיץ בפרק 3 גמיש וצריך להתאים הן לנוקלאוזומים והן לחלבונים הספציפיים המעניינים. לחלופין, משתמשים יכולים לבחור להוסיף מערכות חיטוי חמצן להפחתת הלבנה של פלואורופורים ו / או DNA מתחרה כדי להסיר אוקטמרים היסטון שאינם עטופים כראוי בנוקלאוזומים.
  2. הוסף 2 nM S. cerevisiae Nap1 ו- 2-5 nM LD655-labeled H4 histone octamer (HO) ל- 500 μL של 1x HR buffer18. הוסף לפרק 4.
    הערה: ניתן לרכוש או להכין אוקטמרים של היסטון ו-Nap1 באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים). מספר הנוקלאוזומים שייווצרו לאורך כל דנ"א קשור תלוי בריכוז האוקטמר, כמו גם בזמן השהייה בתעלה זו. ניתן לווסת את צפיפות הנוקלאוזומים הרצויה והמשוערת של המשתמש לאורך כל מולקולת DNA על ידי התאמת אחד מהפרמטרים הללו או שניהם. בנוסף, המשתמש יכול לבחור לתייג אוקטמרים היסטון עם הפלואורופור המועדף עליו.
  3. אופציונלי: הוסף חלבון קושר כרומטין, או חלבון אחר בעל עניין ל - ch. 5 במאגר מתאים.
  4. זרם את כל הערוצים ב- 1.0 בר (~ 0.55 μL/s במערך הניסוי הנוכחי) במשך 30 שניות כדי לשטוף את ערוצי תאי הזרימה עם דגימות.
  5. הגדר את הזרימה ל- 0.2 בר (~ 0.16 μL/s במערך הניסוי הנוכחי). הזיזו את המלכודות האופטיות (OTs) לפרק 1 ותפסו זוג מתאים של חרוזים מצופים סטרפטווידין.
  6. העבר את ה- OTs ל - ch. 3, בצע כיול כוח עבור זוג החרוזים, הפעל את הלייזר הקונפוקלי האדום (או קו לייזר אחר לפי בחירה), וכייל את אזור ההדמיה.
  7. הגדר את הזרימה ל- 0.2 בר והעבר OTs ל - ch. 2. לתפוס DNA biotinylated.
  8. העבר את ה- OTs ל - ch. 3 ועצור את הזרימה. הגדל את המרחק בין OTs כדי למתוח את הדנ"א ולנטר את עקומת מרחק הכוח (FD) המשויכת כדי לאשר את נוכחותו של קשר DNA יחיד (בניגוד לקשירה מרובה). העקומה צריכה לעקוב אחר מודל השרשרת דמוית התולעת עבור dsDNA באורך המתאר הנתון26.
  9. התאימו את המרחק בין ה-OTs כך שמתח הדנ"א יקרא בערך 1 pN.
    הערה: pN 1 של מתח נמוך מספיק כדי לאפשר לנוקלאוזומים להישאר עטופים על ידי DNA27 , אך הוא גבוה מספיק כדי למקם את מולקולת הדנ"א כולה בתוך ציר הדימות של סריקת הקו.
  10. הפעל סריקה קווית כדי להתחיל לאסוף קימוגרף כאשר הלייזר האדום מופעל.
    הערה: ניתן להשיג קימוגרפים או סריקות דו-ממדיות של DNA קשור, בהתאם להעדפת המשתמש.
  11. העבר את ה- OTs ל - ch. 4 כאשר הזרימה כבויה. בהנחיית Nap1, HOs נטענים על DNA ונעטפים ליצירת נוקלאוזומים בזמן אמת. טעינת נוקלאוזומים מתוארת כמסלולים פלואורסצנטיים המופיעים על הדנ"א בתוך קימוגרפים. במקביל, היווצרות נוקלאוזומים על הדנ"א יכולה להיות מנוטרת על ידי עליית הכוח ככל שיותר HOs נטענים כאשר המיקומים של OTs מוחזקים קבועים.
    הערה: ניתן לכבות לייזר עירור פלואורסצנטי במהלך שלבי היווצרות הנוקלאוזומים כדי למנוע הלבנה של פלואורופורים. בנוסף, קשירה לא ספציפית של אוקטמרים היסטון לדנ"א שבה האוקטמרים אינם עטופים בנוקלאוזומים יכולה להתרחש באמצעות פרוטוקול זה. אירועי קישור אלה לא ייצרו "קרע" כאשר הדנ"א נמתח, כפי שמתואר בפרוטוקול Unwrapping Nucleosomes (שלב 4) להלן, ולפעמים הם יכולים להישטף על ידי זרימת חיץ עדינה, במיוחד אם המאגר מכיל DNA מתחרה חופשי.
  12. כאשר נוצר המספר הרצוי המשוער של נוקלאוזומים, התחל לאסוף נתונים.

4. חשיפת נוקלאוזומים

  1. השלם את שלב 2 ואת שלב 3.
  2. לאחר יצירת קשירת DNA המכילה נוקלאוזומים, העבר את ה- OTs ל - ch. 3.
  3. התכוננו לניסויי חשיפת נוקלאוזומים על ידי צמצום המרחק בין OTs עד שהכוח הוא בערך אפס. אפס את הכוח.
  4. התחל להזיז את OT 1 הרחק מ-OT 2 במהירות קבועה של 0.1 מיקרומטר לשנייה. בקימוגרף, החרוז ב-OT 1 יתרחק ויזואלית מהחרוז ב-OT 2. בעקומת FD, הכוח יעלה ככל שהמרחק יגדל. כאשר נוקלאוזומים מתפרקים, יופיעו "קרעים" או מעברים בכוח (~8-37 pN) המסמנים את חשיפת העטיפה הפנימית של נוקלאוזומים בודדים 27,28,29.
    הערה: הכוח שבו מתרחשת הסרת העטיפה תלוי בקצב המשיכה, הצפוי בתהליכים שאינם בשיווי משקל. לפעמים, נוקלאוזומים מרובים נפתחים בבת אחת, ויוצרים שינוי מרחק גדול יותר במעבר בעקומת FD. בנוסף, חשיפת העטיפה החיצונית של הנוקלאוזום, אינה נראית בקלות במסגרת ניסויית זו (ראה פרק הדיון).

5. הדמיה של קשירת חלבון לכרומטין

  1. השלם את שלב 2 ואת שלב 3.
  2. הוסף 10 ננומטר של היסטון H1.4 עד 500 μL של מאגר תמונה בפרק 5.
    הערה: ניתן להוסיף כל חלבון מעניין ל-ch. 5 בריכוז לפי בחירה (בדרך כלל מתחת ל-100 ננומטר לצורך הדמיה של מולקולה יחידה).
  3. לאחר יצירת קשירת DNA המכילה נוקלאוזומים, הפעל את הלייזר הירוק בנוסף ללייזר האדום והעבר OTs ל - ch. 5 לצורך הדמיה בזמן אמת של H1 נקשר לכרומטין.
  4. המשך לאסוף קימוגרפים או סריקות עד להשגת סטטיסטיקה מספקת (לפחות ~ 10-20 קימוגרפים בהתאם לתדירות האירועים וקושי הניסוי).

תוצאות

באמצעות ההגדרה שתוארה בשלב 3 (איור 1A), היווצרות נוקלאוזומים לאורך קשירת הדנ"א הודגמה כהופעה של מוקדים פלואורסצנטיים אדומים בסריקה דו-ממדית (איור 1B, משמאל) או מסלולים לאורך זמן בקימוגרף (איור 1B, מימין). נוקלאוזומים עטופים כראוי הניבו מסלולים פלואורסצנטיים שהיו נייחים לאורך זמן בגבול העקיפה של גילוי קונפוקלי (~300 ננומטר). יש לציין כי נוקלאוזומים מרובים הנוצרים זה ליד זה תחת מגבלת העקיפה אינם ניתנים לפתרון מרחבי ומופיעים כמוקדים או מסלולים בהירים יותר. אף על פי כן, שלבי ההלבנה של מסלולים גרעיניים בודדים נותחו, ולעתים קרובות הראו אירועי הלבנה של שלב אחד (איור 1C) או דו-שלבי (איור 1D), מה שמצביע על כך שהמוקדים הכילו בעיקר מונונוקלאוזומים בהתחשב בשיעור התיוג של כ-70% של חלבון H4 בדגימה זו. יתר על כן, בהתבסס על ספירת הפוטונים הממוצעת של פלואורופור LD655 יחיד במצב ניסוי זה, הוערך מספר עותקי H4 המסומנים בכל מסלול נוקלאוזומים והראה כי אתרי הנוקלאוזומים בעיקר (>75%) הכילו 1 או 2 עותקי H2A מסומנים (איור 1E), שוב בקנה אחד עם הרעיון שהם היו טעונים בעיקר כמונונוקלאוזומים מופרדים מרחבית. המוקדים הבהירים האחרים הכילו יותר מ-3 עותקים של H4 המסומנים, המייצגים ככל הנראה נוקלאוזומים מרובים בתוך גבול העקיפה.

היווצרות הנוקלאוזומים נוטרה גם על-ידי עלייה במתח לאורך הקשירה כאשר מיקומי ה-OTs נותרו קבועים ככל שיותר דנ"א נכרך סביב אוקטמרים של היסטון (איור 1B, למטה). בהיעדר Nap1, אוקטמרים של היסטון עדיין יכולים לקשור דנ"א אבל נשארים לרוב לא עטופים, מאחר שהמתח הנלווה כאשר עמדות ה-OT הוחזקו נשאר קבוע (איור 1F). ייתכן כי קשירה לא ספציפית של אוקטמרים היסטון לדנ"א מתרחשת אפילו בנוכחות Nap1. בניסוי אחר בוצע אותו פרוטוקול ליצירת נוקלאוזומים המכילים H2A המסומן ב-Cy3, אשר הניב תוצאות דומות לאלה שבוצעו עם H4 המסומן ב-LD655 (איור 1G), מה שמצביע על הרכבה של אוקטמרים שלמים לנוקלאוזומים.

באמצעות ההגדרה שתוארה בשלב 4 (איור 2A), הסרת עטיפת נוקלאוזומים הודגמה לאורך זמן בקימוגרף ככל שמרחק הקשירה גדל (איור 2B). בעבר דווח כי אוקטמרים של היסטון נשארים לעתים קרובות קשורים לדנ"א לאחר הסרת העטיפה30,31, ולכן מסלולים פלואורסצנטיים נמשכים לעתים קרובות גם במתח גבוה. חשיפת נוקלאוזומים נוטרה גם בעקומת FD הקשורה (איור 2C). מאפיינים הניתנים לכימות של עקומת FD כוללים את הכוח שבו נוקלאוזומים נפתחים (ראו "מעבר F" בכניסה באיור 2C), כמו גם את אורך הדנ"א שהשתחרר מאוקטמר ההיסטון (ראו "ΔL" בכניסה לאיור 2C), שקיים בכפולות של ~24 ננומטר, בהתאם לפתיחה עצמאית של הסיבובים הפנימיים של הדנ"א של נוקלאוזומים בודדים27, 30. ניתן להשתמש בפרמטרים אלה כדי להעריך את מספר הנוקלאוזומים הנוצרים בכל קשירה או לניתוח נוסף במורד הזרם של מכניקת הנוקלאוזומים. לפיכך, מספר הקרעים בסיבוב הפנימי שהתקבלו מניסויי משיכה מכניים הושווה למספר המשוער של עותקי H4 המסומנים בכל מסלול נוקלאוזומים בהתבסס על עוצמת המונומר, מה שהראה שהמספרים עקביים במידה רבה (דוגמאות המוצגות באיורים 2D-G). עם זאת, צוין כי הם אינם תואמים באופן מושלם בשל ~70% יעילות מסומנת של חלבון H4 בדגימה וכל שארית של היסטון בלתי תלוי Nap1 שנקשר לדנ"א, כפי שמוצג באיור 1F. לבסוף, כצפוי, מתיחת קשירת דנ"א חשופה הקשורה ל-Nap1 (ללא היסטונים) אינה יוצרת מעברים הנגרמים בכוח (איור 2H), מה שמצביע על כך ש-Nap1 לבדו אינו מעוות באופן משמעותי את הדנ"א.

תוך שימוש במערך המתואר בשלב 5 (איור 3A), הקישור של היסטון H1 לכרומטין הודגם כהופעה של מוקדים פלואורסצנטיים ירוקים לאורך קשירת הכרומטין (איור 3B). יש לציין שנוקלאוזומים הקשורים ל-H1 יצרו מסלולים של צבע כפול (ראו חיצים לבנים באיור 3B) שנראו נייחים לאורך זמן. נוסף על כך, נצפו מסלולי H1 מפוזרים על פני אזורי דנ"א נטולי נוקלאוזומים (ראו כוכבים ירוקים באיור 3B).

figure-results-1
איור 1: היווצרות נוקלאוזומים בתיווך Nap1. (A) סכמה של מערך הניסוי המתואר בפרוטוקול היווצרות נוקלאוזומים בתיווך Nap1 באתרו (שלב 3). זוג חרוזים נלכדו אופטית ב-ch. 1, ומולקולת λ DNA אחת נקשרה בין החרוזים באמצעות קישור ביוטין-סטרפטאבידין ב-ch. 2. לאחר מכן הועבר הקשר לפרק 4, המכיל אוקטמרים היסטון המסומנים בתווית LD655 (אדום) ו-Nap1 ליצירת נוקלאוזומים בזמן אמת על פני הדנ"א. (B) סריקה דו-ממדית מייצגת (משמאל) וקימוגרף (מימין) של קשירת DNA המכילה נוקלאוזומים עם תווית LD655-H4. קריאת הכוח המשויכת (למטה) מראה עלייה בכוח מיד כאשר הקשירה מועברת לפרק 4 כאשר מיקומי ה-OT מוחזקים קבועים, מה שמצביע על עטיפת נוקלאוזומים. מסלולים בהירים יותר מסמלים מספר נוקלאוזומים סמוכים הממוקמים בתוך גבול העקיפה של ~300 ננומטר. (C) קימוגרף לדוגמה המציג אירוע פוטו-הלבנה חד-שלבי (חץ לבן) של נוקלאוזום, המכיל LD655-H4. (D) קימוגרף לדוגמה המראה אירוע פוטו-הלבנה דו-שלבי (חיצים לבנים) של נוקלאוזום, המכיל LD655-H4. (E) תדירות יחסית של מספר H4 המסומן בתווית LD655 לכל מסלול המוערך מעוצמת הפלואורסצנטיות שלהם. (F) קימוגרף מייצג של קשירה הקשורה באוקטמרים היסטון בהיעדר Nap1. קריאת הכוח הנלווית (למטה) נשארת ללא שינוי גם כאשר אוקטמרים של היסטון קושרים את הדנ"א. (G) קימוגרף מייצג של קשירת DNA המכילה נוקלאוזומים עם תווית Cy3-H2A. קריאת הכוח המשויכת (למטה) מראה עלייה בכוח מיד כאשר הקשירה מועברת ל-ch. 4 (המכיל אוקטמרים ו-Nap1), כאשר נוקלאוזומים נוצרים כאשר עמדות ה-OT מוחזקות קבועות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת הסרת עטיפות נוקלאוזומים. (A) סכמה של מערך הניסוי המתואר בפרוטוקול פירוק נוקלאוזומים (שלב 4). קשירת הדנ"א המכילה נוקלאוזומים הועברה לפרק 3 המכיל מאגר תמונה נטול חלבון, שבו המרחק בין החרוזים גדל והנוקלאוזומים הוסרו. (B) קימוגרף מייצג של קשירת דנ"א המכילה נוקלאוזומים הנמשכת לכוחות גבוהים על-ידי הגדלה הדרגתית של המרחק בין החרוזים. הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות לכיוון החרוז התחתון נבעה ככל הנראה מכך שהדנ"א נטה מעט מחוץ למיקוד הסריקה. (C) עקומת ה-FD המשויכת המציגה מעברים הנגרמים בכוח של הסרת סיבובים פנימיים המתרחשים בין 8-37 pN. הכניסה מציגה תצוגת זום אין של מעבר לדוגמה שעבורו ניתן לרשום ולנתח את המרחק (ΔL = ~ 24 ננומטר עבור הסיבוב הפנימי של הדנ"א של נוקלאוזומים בודדים) ואת כוח המעבר (מעבר F). עבור קשירה זו, 26 נוקלאוזומים הוסרו, והקשירה נקרעה ב~ 65 pN, כפי שמסומן על ידי הקו המקווקו הלבן בקימוגרף. (ד,ה) דוגמה LD655-H4 קשירה המכילה נוקלאוזומים הנמשכת לכוחות גבוהים כאשר מספר H4 לכל מסלול מוערך באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות (מצוין בקימוגרף, D) ומספר הנוקלאוזומים העטופים נאמד באמצעות גודל שינוי המרחק המושרה בכוח (מצוין בעקומת מרחק הכוח המשויכת, E). (ו,ז) דוגמה נוספת כמו (D,E). (H) קשירת דנ"א (n = 5) נמשכת לכוחות גבוהים לאחר שהיא מודגרת בתעלה המכילה Nap1 בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הדמיה של אינטראקציה חלבון-כרומטין. (A) סכמה של מערך הניסוי המתואר בהדמיה של קישור חלבון לפרוטוקול כרומטין (שלב 5). קשירת הדנ"א המכילה נוקלאוזומים הועברה לפרק 5, המכיל 10 ננומטר של היסטון H1 (ירוק) המסומן בתווית Cy3. (B) קימוגרף מייצג בשני צבעים של H1 הנקשר לקשירת DNA המכילה נוקלאוזומים. אירועי קולוקליזציה של נוקלאוזומים H1 מסומנים בחצים לבנים. מסלול נוקלאוזומים לא מאוגדים מסומן בחץ מג'נטה. מולקולות H1 המתפזרות על דנ"א חשוף מסומנות בכוכבים ירוקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר מספק מספר יתרונות לבנייה מחדש של נוקלאוזומים, כולל מזעור ריאגנטים וזמן, כמו גם מאפשר היווצרות נוקלאוזומים תלויי מלווה לאורך כל רצף DNA (פוטנציאלי ילידי). יתר על כן, שיטת in situ מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למבחני מולקולות בודדות של מכניקת הנוקלאוזומים ואינטראקציה חלבון-כרומטין. מצד שני, מגבלות של גישה זו כוללות את חוסר היכולת לכוון מיקום נוקלאוזומים לאורך הדנ"א (אפילו עם שילוב של רצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים) ולשלוט במדויק במספר הנוקלאוזומים הנוצרים לכל קשירת DNA (אם כי ניתן לכוונן זאת אמפירית על ידי סטנדרטיזציה של זרימת העבודה הניסויית). למעשה, אלה שבוחרים בשיטה זו סוחרים בשליטה מדויקת על מיקום וצפיפות הנוקלאוזומים עבור קלות זרימת עבודה גדולה יותר ודרישת ריאגנטים נמוכה, שבחירתה תלויה בכל ניסוי ספציפי. כמו כן צוין כי הסיבוב החיצוני של הדנ"א אינו נפתר בפרוטוקול הנוכחי בשל אורכה הארוך של הקשירה (~ 48.5 kbps) ותנאי חיץ32. כדי לקבל מידע על הסיבוב החיצוני של הדנ"א כמו גם על הערמה בין נוקלאוזומים, המשתמש יכול לבחור לקצר את אורך הדנ"א ולטעון צפיפות גבוהה יותר של נוקלאוזומים על הדנ"א ו / או להשתמש בשיטת דיאליזה מלח כדי למקם נוקלאוזומים על רצפי מיקום חזקים המופרדים על ידי אורכי קישור רגילים. לבסוף, קשירה לא ספציפית של אוקטמרים היסטון לדנ"א עשויה להתרחש; לכן, חשוב לקחת בחשבון הן אותות פלואורסצנטיים והן אותות כוח בעת פירוש התוצאות.

היבט קריטי אחד של הפרוטוקול הנוכחי הוא להבטיח שהמשתמש השיג שיעור תיוג פלואורסצנטי גבוה עבור אוקטמרים של היסטון (אם נדרשת ויזואליזציה), כך שניתן יהיה לזהות חזותית את רוב, אם לא את כל, הנוקלאוזומים. היבט קריטי נוסף הוא אישור שהמשתמש בחר חיץ מתאים לערוץ ההדמיה התואם לנוקלאוזומים ולכל חלבונים מעניינים אחרים. שינויים ספציפיים למשתמש בפרוטוקול עשויים לכלול צימוד פלואורופור להיסטון אחר (ראה דוחות33,34 לדוגמאות המשתמשות בשיטה זו ליצירת נוקלאוזומים המסומנים H3 או H2B), בחירת פלואורופור חלופי, שילוב קשירת DNA ברצפים ובאורכים שונים, הוספת מערכת לאיתור חמצן להארכת חיי הפלואורופורים, בחירת גודל חרוזים שונה, ושימוש במערכת צימוד DNA-חרוזים חלופית (למשל, קישור נוגדנים digoxigenin-anti-digoxigenin).

לסיכום, השיטה המתוארת מספקת ל-smCFFM גישה נוחה ורב-תכליתית ליצירת קשירה המכילה נוקלאוזומים שניתן להשתמש בהם בקלות כדי לחקור מגוון רחב של שאלות ממוקדות כרומטין, בביולוגיה. תחומי מחקר ישימים כוללים מכניקת כרומטין כפי שהיא מוסדרת על ידי גרסאות היסטון ושינויים לאחר תרגום, מעורבות ביופיזית וקינטיקה של חלבונים קושרי כרומטין, ותהליכי הרכבה מכווני נוקלאוזומים מסדר גבוה יותר כגון עיבוי ביומולקולרי 35,36,37,38.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

G. N. L. C. מודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות הנפש של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת פרס מספר F31MH132306. S. L. נתמך על ידי קרן רוברטסון, הקרן הבינלאומית לתסמונת רט, ואת NIH (פרס מספר R01GM149862).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x מאגר דופקN/AN/A30 mM  טריס  אצטט pH 7.5, 20 מ"מ מגנזיום אצטט, 50 מ"מ אשלגן כלורי, 0.1 מ"ג/מ"ל BSA 
1x PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט)N/AN/A137 מ"מ נתרן כלורי, 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ"מ נתרן פוספט דו-בסיסי, 1.8 מ"מ אשלגן פופט מונו-בסיסי 
חומצה אצטית, קרחוןMillipore SigmaAX0074-6שימוש להכנת טריס אצטט
ביוטין-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
ביוטין-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
ביוטין-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
סרום בקר אלבומיןMillipore SigmaA9418-50Gלהתמוסס ב- H2O ולרוץ דרך מסנן 0.22 um
Cy3 Maleimide מונו-תגובתי צבעCytivaPA23031Maleimide פונקציונליזציה Cy3 fluorophore
dGTPניו אינגלנד BiolabsN0442S
צנטריפוגה אפנדורף 5425 RFisher Scientific05-414-051צנטריפוגה ספסלית עם
אלכוהול אתילי קירור,Pure Millipore Sigma459844
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)Millipore SigmaE9884מתמוסס ב-H2O עד 0.5 M
אוקטמר היסטון אנושי (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/Aחלבוני היסטון רקומביננטיים ואלה המכילים מוטציות תיוג טוהרו בתוך הבית כפי שתואר קודם לכן (ראה הפניות 33, 34, 35, 36). בקצרה, היסטונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי בתאי BL21 (De3) pLySS (Promega). גופי הכללה בודדו לאחר סוניקציה, והיסטונים חולצו בתנאי דנטורציה. היסטונים עברו דיאליזה למאגר A (7 מ"מ אוריאה, 10 מ"מ טריס הידרוכלוריד pH 8.0, 100 מ"מ נתרן כלורי, 1 מ"מ EDTA ו-5 מ"מ 2-מרקפטואתנול), והתמיסה נוספה לעמודת כבידה עמוסה בזרימה מהירה של Q Sepharose (Cytiva). לאחר מכן הזרימה דרכה נוספה לעמודת כבידה טעונה SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), וההיסטונים הוסרו מהעמודה על ידי הוספת חיץ A בתוספת 600 מ"מ נתרן כלורי. היסטונים המכילים מוטציות תיוג (H4, L50C; H2A, K119C) טוהרו ולאחר מכן הוצמדו לפלואורופור הרצוי באמצעות צבעים פונקציונליים של מלימיד (Cytiva, Lumidyne) תוך שימוש ביחס טוחנת צבע לחלבון של 20:1 (ראה הפניות 33, 34). אוקטמרים של היסטון הורכבו על ידי הוספת יחס מולארי שווה של כל היסטון מסוג בר או פלואורופור בתנאי דנטורציה, דיאליזה למאגר עתיר מלח המכיל 2 M נתרן כלורי, ולאחר מכן טוהר על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כפי שתואר קודם לכן (ראה הפניות 36, 37). לחלופין, ניתן לרכוש באופן מסחרי חלבוני היסטון בודדים ואוקטמרים מוכנים של היסטון (למשל, Epicypher).
מאגר תמונהN/AN/A20 מ"מ טריס הידרוכלוריד pH 8.0, 100 מ"מ נתרן כלורי
שבר קלנוב (3' עד 5' exo-)ניו אינגלנד BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021ללא מתילציה ולמבדה; DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimide פונקציונליזציה LD655 פלואורופור
לינקר היסטון H1.4 (A4C)N/AN/Aחלבון רקומביננטי מטוהר המיוצר בבית (ראה אסמכתא 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/Aתצורת מלכודת כפולה; חומרים סטנדרטיים למכשיר המסופקים על ידי היצרן
תמיסת מגנזיום אצטטMillipore Sigma63052-100MLהשתמש להכנת מאגר HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002Sכלול בערכת שבר Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250Gהתמוסס ב-H2O והעביר דרך מסנן 0.22 um
אשלגן כלוריMillipore SigmaP3911השתמש לייצור PBS ומאגר HR
אשלגן פוספט מונו-בסיסיMillipore SigmaP0662השתמש לייצור PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 טוהר בתוך הבית כפי שתואר קודם לכן (ראה הפניות 33, 34). לחלופין, ניתן לרכוש את Nap1 באופן מסחרי (למשל, Active Motif).
נתרן אצטטMillipore Sigma241245להתמוסס ב-H2O עד 3 M
נתרן כלוריMillipore SigmaS9888השתמש לייצור PBS ומאגר תמונה
נתרן פוספט דו-בסיסיMillipore SigmaS9763השתמש לייצור חלקיקים
מצופים ביוטין PBS SPHERO (3.0-3.4 µ מ)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרפישר סיינטיפיקND2000NanoDrop ספקטרופוטומטר
TrisBase Fisher ScientificBP152-500מתמוסס ב-H2O ומתאים ל-pH מתאים; השתמש כדי ליצור מאגר תמונה ותריס אצטט

מקורות

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Situ Reconstitutionaper Nap1DNA

מאמרים קשורים