מאמר שיטה

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

24 במאי 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

תקציר

התגובה החיסונית הנרכשת מסתמכת על יכולתו של תא T לנדוד דרך דם, לימפה ורקמות בתגובה לפתוגנים ולגופים זרים. נדידת תאי T היא תהליך מורכב הדורש תיאום של קלטי אותות רבים מהסביבה ומתאי מערכת החיסון המקומית, כולל כימוקינים, קולטני כימוקין ומולקולות הידבקות. יתר על כן, תנועתיות תאי T מושפעת מרמזים סביבתיים דינמיים, שיכולים לשנות את מצב ההפעלה, נוף השעתוק, ביטוי מולקולות ההיצמדות ועוד. In vivo, המורכבות של גורמים אלה השלובים לכאורה זה בזה מקשה להבחין באותות בודדים התורמים לנדידת תאי T. פרוטוקול זה מספק שורה של שיטות מבידוד תאי T ועד ניתוח בעזרת מחשב כדי להעריך נדידת תאי T בזמן אמת בתנאים סביבתיים ספציפיים ביותר. תנאים אלה עשויים לעזור להבהיר מנגנונים המווסתים את הנדידה, לשפר את הבנתנו את הקינטיקה של תאי T ולספק ראיות מכניסטיות חזקות שקשה להשיג באמצעות ניסויים בבעלי חיים. הבנה עמוקה יותר של האינטראקציות המולקולריות המשפיעות על נדידת תאים חשובה לפיתוח טיפולים משופרים.

מבוא

תאי T הם הגורמים העיקריים לתגובה חיסונית נרכשת, ספציפית לאנטיגן. ברמת האוכלוסייה, תאי T הם הטרוגניים, המורכבים מתת-קבוצות תאיות בעלות פונקציות מיוחדות שונות. חשוב לציין, תאי CD8+ T הם המשפיעים הציטוליטיים העיקריים של המערכת החיסונית, אשר מבטלים ישירות תאים נגועים או לא מתפקדים1.

תאי T בוגרים מסוג CD8+ שוכנים ברקמה וזורמים דרך הדם והלימפה בחיפוש אחר אנטיגנים. במהלך ההדבקה, תאי T מוצגים עם אנטיגנים בדם או ברקמה ומתנקזים במהירות לטחול או לבלוטת הלימפה המתנקזת הקרובה ביותר כדי להתחיל תגובה חיסונית פרודוקטיבית. בכל מקרה, תאי T מופעלים, עוברים הרחבה שבטית ועוזבים את מערכת הלימפה כדי להיכנס לדם, אם עדיין לא שם. במהלך תהליך זה, איתות תוך-תאי מעניק את הירידה בוויסות של קולטני הביות הלימפטיים ואת ה-upregulation של קולטני אינטגרין וכימוקין רבים החיוניים לנדידה ספציפית לרקמה2. בסופו של דבר, ההגירה המכוונת של תאי T לאתרי זיהום מונעת על ידי אותות סביבתיים מתכנסים הכוללים איתות אינטגרין וכימוקין.

ניתן לסווג כימוקינים באופן כללי לשני סוגים עיקריים: (1) אותות הומיאוסטטים, החיוניים להתמיינות, הישרדות ותפקוד בסיסי, ו-(2) אותות דלקתיים, כגון CXCL9, CXCL10 ו-CCL3, הנדרשים לכימוטקסיס. באופן כללי, כימוקינים יוצרים שיפוע אות המניע נדידה כיוונית, המכונה כימוטקסיס, בנוסף להפעלת ביטוי אינטגרין1. כימוטקסיס מווסתת היטב ורגישה מאוד, עם תאי T המסוגלים להגיב לשינויים זעירים בשיפוע שיכולים להוביל אותם לכיוון או מיקום מסוים.

בנוסף לגורמים אלה הקשורים לתאי T, ההגירה מושפעת גם מההרכב והצפיפות של המטריצה החוץ תאית (ECM). ה-ECM מורכב מרשת צפופה של חלבונים, כולל קולגן ופרוטאוגליקנים, המספקים את הפיגום לקולטני אינטגרין דביקים על תאי T. אינטגרינים הם משפחה מגוונת של חלבונים טרנסממברנליים, שלכל אחד מהם תחומי קישור מיוחדים מאוד והשפעות איתות במורד הזרם. ביטוי דינמי של קולטני אינטגרין על פני תא T מאפשר הסתגלות מהירה לסביבתם המשתנה3. חשוב לציין, אינטגרינים מחברים את רשתות האקטין ECM והאקטין הציטו-שלד התוך-תאי שפועלות יחד כדי ליצור את כוח ההנעה הדרוש לתנועת תאי T.

לסיכום, דפוסי ההגירה משתנים בהתאם לפנוטיפ של תא החיסון או לאותות סביבתיים. תהליכים ביולוגיים מורכבים אלה מווסתים היטב על ידי ביטוי של ציטוקינים, כימוקינים ואינטגרינים על פני השטח של תא T, התאים הסובבים אותו, והרקמה המקומית הנגועה. In vivo, מנגנוני נדידה אלה יכולים להיות מורכבים ועשויים לנבוע ממספר אותות מוספים4. בשל מורכבות זו, זה יכול להיות בלתי אפשרי לקבוע קשר סיבתי בין משתנים שלובים לכאורה. כדי להתגבר על כך, ישנן מספר גישות במבחנה לחקר היבטים ספציפיים של נדידת תאי T כגון תגובה לאותות כימוקינים ספציפיים והאינטראקציה בין אינטגרינים של תאי T וחלבונים קושרי ECM. פרוטוקול זה מטפל בשיטות לבידוד והפעלה של תאי T מסוג +CD8, עם מבחני נדידת מבחנה במרחב דו-ממדי וכלי ניתוח חישוביים לניתוח נדידת תאי T שצוינו. שיטות אלה מועילות למשתמש מכיוון שהן אינן דורשות חומרים או התקנים מתוחכמים, כמו בכמה מבחני נדידת תאים אחרים המתוארים בספרות. נתוני נדידת תאים הנוצרים בשיטות אלה יכולים לספק ראיות לתגובות חיסוניות באופן פשטני המאפשר חקירה נוספת ומושכלת in vivo.

פרוטוקול

הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה האוניברסיטאית למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. העכברים במחקר זה הוחזקו בחלל נטול הפתוגנים של מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברי C57BL/6 זכרים/נקבות, בגילאי 6-12 שבועות (15-30 גרם), שימשו במחקר הנוכחי. בידוד רקמות עכבר יכול להתבצע על ספסל עם כפפות לכיסוי ידיים ומסכת פנים לכיסוי האף והפה, או בתוך ארון בטיחות ביולוגית. כל תרבית התאים והכנת הצלחת חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיהור והפעלה של תאי CD8+ T

  1. הכנת חומרים
    1. לברירה שלילית של תאי CD8+ T: הכינו מדיום ברירה שלילי מהסופרנאטנט של קווי תאי היברידיומה GK1.5 ונוגדנים M5/114, המייצרים נוגדנים נגד CD4 ואנטי MHCII, בהתאמה. מערבבים את הסופרנאטנט ביחס של 1:1, מסננים אותו ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי (>0.5 מיקרוגרם מכל נוגדן למיליון תאים בסך הכל). לחלופין, קיימות ערכות מסחריות לבידוד תאי CD8+ T.
    2. להפעלת תאי T: יש להוסיף 500 μL של נוגדני CD3 (10 מיקרוגרם/מ"ל) ו-CD28 (16 מיקרוגרם/מ"ל) ב-1x DPBS (ללא סידן ומגנזיום) לתרבית שאינה רקמה (TC) שטופלה בצלחת 24 בארות ולאחסן למשך הלילה ב-4°C כדי להבטיח קשירת צלחת.
      הערה: נוגדנים וחלבונים מצפים צלחות/צלחות תרבית שאינן מטופלות ב-TC טוב יותר מאשר צלחות תרבית רגילות שטופלו ב-TC, כך שצלחות תרבית שאינן מטופלות ב-TC משמשות לייצור תאי T.
  2. הכינו צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ (או שווה ערך) על ידי הכנסת מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך המנה והזריקו 2 מ"ל של מדיום R9 לתוך המסנן (מדיום R9: RPMI 1640x בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי, 20 mM HEPES buffer, 1% MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול).
  3. השג עכבר עם רקע גנטי מתאים, מין, גיל ומשקל כפי שנקבע על ידי תכנון הניסוי.
  4. יש להרדים את העכבר באמצעות CO2 ולאחר מכן לבצע פריקת צוואר הרחם, או אסטרטגיות המתת חסד מתאימות כפי שהוגדרו על ידי פרוטוקולים מקומיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי המוסד.
  5. הניחו את העכבר בתנוחת שכיבה, מתחו את כל ארבעת הגפיים בניצב לגוף והצמידו את כריות הרגליים ללוח דיסקציה באמצעות סיכות T לנתיחת עכבר, או שווה ערך. בצע חתך שטחי ומרכזי דרך השכבה העורית בבטן התחתונה הגחונית בעזרת מספריים כירורגיים של עכבר וחתך ישר עד הסנטר (~8 ס"מ). יש להפריד את העור מרירית הצפק כדי לחשוף את בלוטות הלימפה. מתחו את העור בניצב הרחק מתא המטען ונעצו אותו כלפי מטה5.
    1. יש לכרות בעדינות את בלוטות הלימפה הצוואריות, הציריות, הברכיאליות והמפשעות באופן דו-צדדי באמצעות מלקחיים קהים (או מהסוג המועדף מערכת דיסקציה כירורגית סטנדרטית של עכבר). העברה למסננת התא שהוכנה בשלב 1.2.
    2. פתח את הצפק והסר את הטחול. העברה למסננת התא שהוכנה בשלב 1.2.
    3. יש להשליך את פגר העכבר בכלי הקיבול המתאים לסיכון ביולוגי.
  6. הכינו תרחיף חד-תאי של רקמות הלימפה המשניות על ידי הפרעה מכנית מעל מסננת התאים של 70 מיקרומטר עם 2 מ"ל של מדיום R9 משלב 1.2 על ידי סיבוב כלי שיבוש הרקמות, חצי סיבוב בכיוון השעון ונגד כיוון השעון שוב ושוב.
    הערה: קצה הבוכנה של מזרק luer-lock, או 3 מ"ל או 10 מ"ל, עובד היטב כדי למחוץ הומוגניזציה של הרקמה. ניתן להשתמש בחומרים חלופיים לפי שיקול דעתו של המשתמש.
  7. שטפו את התאים, קצה המזרק, המסננת וכלי התרבית עם 7 מ"ל של מדיום, וודאו שהמסננת נשארת זקופה כדי למנוע העברה של חתיכות גדולות יותר של רקמה או אגרגטים תאיים שעשויים להימצא בתרחיף החד-תאי.
  8. מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  9. משחררים את התאים ב 270 x גרם בטמפרטורת החדר (20 ° C) במשך 5 דקות ומרוקנים את supernatant.
  10. הוסף 500 μL של חיץ שוכב למשך דקה אחת כדי להסיר תאי דם אדומים. לדלל עם 9.5 מ"ל של R9 בינוני ולהסתובב ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות. דקנט את הסופר-נטנט.
  11. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ"ל של מדיום הבחירה השלילית שהוכן בעבר המכיל אנטי MHCII ואנטי CD4 (שלב 1.1.1). רוק בטמפרטורת החדר (20 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
  12. משחררים את התאים ב 270 x גרם במשך 5 דקות ומרוקנים את הסופרנטנט. יש לשטוף 3x עם 10 מ"ל של R9 בינוני.
  13. במקביל, בצינור חרוטי של 15 מ"ל, לשטוף 200 μL של חרוזי IgG נגד חולדות כבשים ב 7 מ"ל של בינוני. הניחו את הצינור על מגנט, הסירו את המדיום וחזרו על שלב השטיפה פעמיים. להשעות את החרוזים ב 7 מ"ל של R9 בינוני.
  14. גלולה את התאים ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות, decant את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 7 מ"ל של השעיית חרוזים משלב 1.13. רוק בטמפרטורת החדר (20 מעלות צלזיוס) במשך 45 דקות.
  15. העשרת תאי CD8+ T על ידי דלדול חרוזים מגנטי. הניחו את הצינורית החרוטית ישירות על המגנט ללא מכסה למשך 3 דקות כדי להסיר תאים הקשורים לנוגדנים/חרוזים. יש לשמור תאי CD8+ . כאשר הצינור עדיין בתוך המגנט, אספו את תרחיף התא באמצעות צינור סרולוגי או שווה ערך והעבירו אותו לצינור חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 270 x גרם (20°C) למשך 5 דקות וכביסה של 3 פעמים בטמפרטורה בינונית.
  16. שטפו את צלחת ההפעלה המצופה מראש (שלב 1.1.2) עם DPBS אחד פעמיים מבלי לשפשף ישירות על המשטח התחתון של הצלחת.
  17. אופציונלי: בצע הפרדת לימפוציטים חיים/מתים כדי להסיר תאים מתים.
    1. העברת תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף בעדינות 2 מ"ל של אמצעי הפרדת לימפוציטים לתחתית השעיית התא. צנטריפוגה במהירות 900 x גרם למשך 10 דקות (בטמפרטורת החדר) בתאוצה והאטה נמוכות.
      הערה: תאים חיים ייפרדו בממשק של מדיה בינונית ומדיה הפרדה (שכבה לבנה אמצעית). תאים מתים יכדורו בתחתית הצינור ועשויים להיות מושלכים בקצהו.
    2. מעבירים את השכבה האמצעית המכילה לימפוציטים חיים לצינור וצנטריפוגה חדשים במהירות 270 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דקנט את הסופר-נטנט.
  18. השהה מחדש את הגלולה ב 12 מ"ל של בינוני עם 10 U/mL עכבר רקומביננטי IL-2. צלחת 1 מ"ל לכל באר בצלחת שאינה TC מטופלת 24 בארות ולהעביר ל 37 ° C בן לילה.

2. הרמת תאי CD8+ T מופעלים

  1. דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי, באמצעות המטרה 4x או 10x.
    הערה: תאי T פעילים ייראו גדולים יותר, עגולים או מוארכים בהשוואה לתאי T בלתי פעילים, וצריכים להיות להם אשכולות צפופים של תאים ברחבי הבאר.
  2. כדי להרים את התאים המופעלים, לשבש את התאים עם פיפטה 1 מ"ל, הקפד לערבב היטב בשולי הצלחת. העברת תאים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל.
    הערה: תאים פעילים הם דביקים יותר ודורשים פיפטינג נמרץ יותר.
  3. לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של מדיום R9 כדי להסיר את כל התאים שנותרו. חזור על הפעולה פעם נוספת במידת הצורך. צנטריפוגה את התאים ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  4. בצע הפרדת לימפוציטים חיים/מתים כדי להסיר תאים מתים כמו בשלבים 1.17-1.18.
  5. שמור על תאי T על ידי הסרת תאים חיים/מתים כל 3-4 ימים בתווך R9 עם IL-2 בצלחת 6 בארות שאינה TC.
    הערה: תאי T מתרבים טוב יותר בבארות בעלות ממדים קטנים במהלך ההפעלה המוקדמת, אולי בשל מגעים בין תאי T לתאי T או גורמים מסיסים שמקורם בתאי T המסייעים להפעלתם. התפשטות מהירה של תאי T גורמת לתרבית להצהיב תוך 24-48 שעות לאחר התרבית. בשלב זה, הרימו את התאים והעבירו אותם לבאר גדולה יותר (צלחת לא מצופה, לא TC 6 בארות) עם מספיק תרבית טרייה כדי להזין את התאים (בדרך כלל 5 מ"ל לבאר). החלף מדיום מדולדל בטרי בכל פעם שמצוין בשינוי צבע בינוני צהוב, או כל 3-4 ימים.

3. הכנת צלחת זכוכית

  1. הכינו תאי נדידת תאי זכוכית או צלחות על ידי ציפוי ב-300 מיקרוליטר/ס"מ2 חלבון A (0.1 מ"ג/מ"ל) למשך הלילה ב-4°C, שטפו פעמיים עם DPBS אחד על ידי ניפוק על הכלי וניקוי לפני המעבר לשלב הבא.
  2. צפו את תא הנדידה או הצלחת בכימרה של300 μL/cm 2 עכבר רקומביננטי ICAM-1 או VCAM-1 Fc כימרה (0.1-2.75 מ"ג/מ"ל) יחד עם כימוקין עכבר רקומביננטי (0.1-10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר. ליגנדות אינטגרין אחרות כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן IV של עכבר ו-E-cadherin של עכבר ניתנות לציפוי ישיר של התא ב-2.5-10 מיקרוגרם/מ"ל למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    1. יש לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS אחד על ידי ניפוק על הצלחת וניקוי מיד לאחר מכן לפני הוספת תאים.
      הערה: תאי T יכולים לנדוד באופן שונה בריכוזים שונים של ליגנדות אינטגרין וכימוקינים בהתאם למצב ההפעלה, ההתמיינות, הרגישות והפריימינג. מומלץ מאוד לבצע נדידת תאים במספר ריכוזים שונים.
  3. לוחית את התאים הדבקים על לוחות מצופים זכוכית 24 שעות לפני תחילת ההדמיה אם תרבית תאי T יחד עם תאים אחרים, כגון תאים סרטניים, כדי למדוד הרג תאי T של תאים סרטניים בזמן אמת.

4. הכנת תאים

  1. אופציונלי: צביעת תאי T ותאים דבקים עם צבע מעקב תאים לבחירה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל לכל 1 x 107 תאים ב 1x DPBS למשך 15 דקות ב 37 ° C, או על פי פרוטוקול היצרן.
  2. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או שווה ערך.
  3. צלחת 1 x 105 CD8+ תאי T (או כמות רצויה) בתווך L-15 של לייבוביץ בתוספת 1-5 גרם / ליטר גלוקוז בתא 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: L-15 בינוני מיוצר לשימוש ללא מערכת CO2-נתרן ביקרבונט. הוא נאגר באמצעות חומצות אמינו בסיסיות חופשיות, מאגרי פוספט וגלקטוז כדי לשמור על רמות pH.
  4. אופציונלי: ביצוע חסימת אינטגרין.
    1. קדם-דגירה של תאי T עם נוגדן חוסם לאינטגרין (1-10 מיקרוגרם/מ"ל, CD11a נגד עכבר (M17/4), CD18 נגד עכבר (M18/2), VLA-4 נגד עכבר (9C10) למשך 10 דקות ולאפשר לזחול בנוכחות אותו נוגדן.

5. מיקרוסקופ קיטועי זמן

  1. בצע מיקרוסקופ וידאו.
  2. עבור תאי T, קבל תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי כל 10-60 שניות למשך 10-60 דקות, או הגדרות רכישה רצויות.
    הערה: נדידת תאי T רגישה לטמפרטורה, והטמפרטורה האופטימלית לנדידת תאי T של עכבר היא 37°C. מערכת בקרת הטמפרטורה בה משתמש פרוטוקול זה מורכבת מסיפון מיקרוסקופ סגור ומבודד עם מערכת חימום מחוברת. תא ההדמיה יושב על סיפון ההדמיה. היקף החדר הזה יש באר מלאה מים מזוקקים המאפשר חום ולחות עקביים במהלך ההדמיה. המיקרווול ממוקם במרכז תא ההדמיה.

6. ניתוח בעזרת תוכנה של נדידת תאי T

  1. השתמש בתוכנת Volocity כדי להעריך נדידת תאי T.
    1. פתח את Volocity וצור רצף תמונות חדש.
    2. בחר והזז את כל סרטי מיקרוסקופ הווידאו עם קיטועי זמן לאזור הכחול בוולוסיטי.
    3. התאם את הבהירות והניגודיות באמצעות כלי שיפור הניגודיות להגדרות הרצויות של החוקר.
    4. בדוק גדלי תמונה: 0.325 מיקרומטר עבור 20x, 0.65 מיקרומטר עבור 10x.
    5. רצף: הגדר נקודות זמן (לדוגמה: 81 תמונות אם מצלמים תמונה כל 15 שניות למשך 20 דקות, 4 תמונות לדקה).
    6. בטל את הסימון של כל נקודות הזמן בכרטיסיה מדידה.
    7. מצא אובייקטים באמצעות עוצמה - החלק את הסרגל כך שיהיה בדיוק מימין לפסגה.
    8. אל תכלול עצמים לפי גודל: כל התאים שקוטרם קטן מ-10 מיקרומטר וגדול מ-100 מיקרומטר, כדי לא לכלול פסולת תאים או חלקיקים שאינם תאיים. אל תכלול תאי T שנודדים פחות מ- 20% מזמן ההקלטה (דבר שיכול להשתנות בהתאם להגדרה של כל חוקר).
    9. התעלם מאובייקטים סטטיים (תיבת סימון).
    10. צירוף אוטומטי של אסופות מנותקות (תיבת סימון).
    11. הגדר את הנתיב הקצר ביותר ללא יותר מ -20 מיקרומטר.
    12. המסלול של נדידת תאים הוא הקו המחבר את המיקום של אותו תא לאורך זמן. ודא שאלגוריתם המעקב עוקב על-ידי זיהוי היכן אובייקטים בודדים מזוהים לפי סגמנטציה בכל מסגרת, והאובייקטים מותאמים בין מסגרות.
    13. שמור פרוטוקול חדש על-ידי בחירה באפשרות מדידות > שמור פרוטוקול > תן שם לפרוטוקול חדש.
    14. לחץ על מדידת כל נקודות הזמן בכרטיסיה מדידה.
    15. מיין רצועות לפי טווח זמן, מגבוה לנמוך.
    16. רשום מספרי זיהוי של רצועות עבור כל התאים עם מסלולים טובים כפי שהוגדרו על-ידי החוקר. לאחר מעקב אוטומטי אחר תאים, יש צורך בהערכה ידנית של כל מסלול תא כדי לא לכלול מסלולים שזוהו באופן שגוי או שבורו. אל תכלול תאים עם רצועות פגומות.
    17. ייצא את הקובץ כטקסט מופרד באמצעות פסיקים והעבר נתונים לתוכנת הניתוח הרצויה.
      הערה: פרמטרים בסיסיים: מהירות (מיקרומטר לדקה), תזוזה (תנועה נטו, מיקרומטר), אורך מסלול (אורך נתיב כולל, מיקרומטר) ואינדקס מתפתל (MI; תזוזה נטו/אורך מסלול. MI = 1 מציין מסלול ליניארי ישר לחלוטין).
  2. בצע מעקב ידני באמצעות תמונה J.
    1. פתח תוספים ובחר מעקב ומעקב ידני. הגדר את הפרמטרים - מרווחי זמן, כיול x/y (גודל פיקסל) וכיול z (במצב מעקב ידני). התחל מעקב אחר תאים בודדים על-ידי לחיצה על הוסף מסלול, בחירת תא אחד בנקודת הזמן הראשונה והמשכו לאורך כל נקודות הזמן. לאחר מכן, לחץ על סיום מסלול. חזור על כך עבור כל התאים המעניינים.
      הערה: Trackmate, כלי נוסף למעקב אחר תאים, הוא תוכנת מעקב אוטומטית הזמינה דרך תוסף ImageJ.

תוצאות

אישור להפעלת תאי T יכול להיות מושג על ידי ציטומטריית זרימה, המחפשת ביטוי מוגבר של CD69 ו- CD44, שהם סמנים קנוניים של הפעלה בתאי T מורין6. בנוסף, ניתן לקבוע את טוהר אוכלוסיית תאי T על ידי ציטומטריית זרימה עבור תאי CD3+ CD8+ T. שיטה זו מניבה >90% אוכלוסיית תאי CD8+ T.

ניתן להעריך את נדידת תאי T באמצעות תוכנות מעקב אחר תאים בסיוע תוכנה הניתנות לשחזור ואינן מתאימות לצרכי החוקר. כמה פרמטרים בסיסיים המשמשים לקביעת השפעות הניסוי כוללים מהירות תאית (אורך נדידה לזמן נתון כדי לקבוע כמה מהר תא נע), תזוזה (מרחק נדידה, קו ישר מנקודת ההתחלה לנקודת הקצה, כדי לקבוע כמה רחוק תא נודד), אורך מסלול (מרחק נדידה, האורך הכולל של נתיב הנדידה, כדי לקבוע כמה רחוק תא נודד), ואינדקס מתפתל (MI הוא בין 0 ל-1 כדי לקבוע את ישרות ההגירה, 1 = ישר). פרמטרים אלה משמשים להערכת הבדלים נודדים בתאי T נאיביים ומופעלים CD8+ הזוחלים לאורך זכוכית מצופה ICAM-1 עם CXCL12 (איור 1). מהירות ממוצעת מוגברת, תזוזה ואינדקס התפתלות נצפו בתאי CD8+ T מופעלים בהשוואה לנאיביות, מה שמצביע על כך שלתאי T מופעלים יש יכולת הגירה מוגברת. באופן דומה, ניתן להבהיר את ההשפעה של כימוקינים שונים על דפוסי נדידת תאים באמצעות שיטות אלה. לדוגמה, תאי CD8+ T פעילים מציגים הגירה מוגברת בנוכחות CXCL12, אך לא CCL2 או CCL22, והנדידה גדלה באופן תלוי מינון לריכוז רווי (איור 2). יתר על כן, מעקב תאים בעזרת תוכנה מאפשר אפיון של נדידת תאים בודדים, המאפשר הבנה של ההשפעות של ליגנדות בודדות על התנהגות תאי T. ניתן לראות עקבות תאים מייצגים באיור 3.

יחד, נתונים אלה תומכים ביעילות של השיטות הנוכחיות בכך שהם מאשרים שאנו יכולים (1) לעקוב אחר נדידת תאים על בסיס תא בודד, ו (2) להבחין בהבדלים בנדידה של תאי CD8+ T בהתבסס על מצב ההפעלה ובנוכחות כימוקינים שונים ומולקולות הידבקות. בדיקה זו היא צעד קריטי בניתוח מנגנוני איתות מורכבים ויידוע ניסויים ממוקדים in vivo שיכולים לטפל עוד יותר בתרומות הביולוגיות של אותות ספציפיים באופן ספציפי לסוג התא.

figure-results-1
איור 1: בדיקות במבחנה עבור נדידת תאי CD8+ T נאיבית ומופעלת. תאי T נאיביים או CD3/CD28 המופעלים על ידי עכבר CD8+ הורשו לנדוד על ICAM-1 בתוספת CXCL12 במשך 10 דקות. מהירות, תזוזה ואינדקס התפתלות של נדידת התאים נותחו באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר ו-Volocity. לכל קבוצה יש 36 תאי T נפרדים (ממוצע ± SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקות במבחנה עבור הגירה תלוית כימוקין של תאי T CD8+ פעילים. תאי CD8+ T של עכבר המופעלים על ידי CD3/CD28 הורשו לנדוד על ICAM-1 בתוספת כימוקין מצוין. היחסים בין מספר התאים שזוחלים יותר מ-50 מיקרומטר במשך 20 דקות (אחוז מכלל התאים) נקבעו בשדה ראייה. בדיקה אחת ניתחה >10 תאים (n = 3 בדיקות לקבוצה בממוצע ± SEM). מבחן t לא מזווג, *p< 0.05 בהשוואה לביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מסלולים נודדים של תאי CD8+ T מופעלים ב-ICAM-1 בתוספת CXCL12 למשך 20 דקות. כל קו צבעוני מציין את מסלול הנדידה של כל תא T בכיוון מנקודת התא לנקודה הפוכה. בניסוי הספציפי הזה, 24 מתוך 38 תאים נדדו באורך משמעותי (לפחות המרחק של רוחב התא שלהם לפי ההגדרה שלנו). תאי T נדדו באורכים שונים של מרחקים, מה שמצביע על כך שכל תא היה במצב שונה של הפעלה או פריימינג. כל התאים הנודדים נעו בכיוונים שונים בתנאי שהמשטח היה מצופה באופן אחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הבנת ההשפעה הביולוגית של התכנסות אותות in vivo היא מאתגרת ולא קלה לפרשנות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מספקים שיטה סבירה להבנת נדידת תאי T בתנאים מוגדרים מאוד ורלוונטיים ביולוגית. תנאים אלה יכולים להיות מוגדרים על פי שיקול דעתו של החוקר, וניתן לשנות את הפרוטוקולים כך שיתאימו לצרכים של אוכלוסיות תאי T שונות, מצב ההפעלה ופנוטיפ התא. יתר על כן, ליגנדים וקולטנים רבים יכולים להיחקר באמצעות הליכים מוגדרים אלה של חסימת נוגדנים 7,8 והליכים מצופים ליגנדזכוכית 8,9,10. טכניקה זו הייתה גם פלטפורמה קריטית לפיתוח תאים חיסוניים מהונדסים11,12.

שלבים חשובים בפרוטוקול כוללים בידוד רקמת לימפה משנית, הפעלת תאי T, ציפוי צלחות הדמיה מזכוכית וניתוח נתונים. לעין חסרת ניסיון, בלוטות הלימפה המוטבעות ברקמה יכולות להיות קשות לזיהוי ולחילוץ. ניתן להתגבר על כך באמצעות תרגול. לאחר שתאי T בודדו וטוהרו, שלב ההפעלה גורם לתאים דביקים, שאם לא מרימים אותם כראוי, הם עלולים לגרום לתנובה נמוכה. ניתן להימנע מכך על ידי שטיפה נדיבה וזהירה של הבארות. כלי זכוכית חייב להיות מצופה כראוי עם ליגנד של עניין ושטף לפני תוספת של תאים. זה יבטיח כי שכבה חזקה של חלבון זמין עבור תאים לדבוק, תוך גם להבטיח כי מגיב עודף אינו משבש את הביולוגיה. קשירת פני השטח של חלבון A-glass וקשירת Fc-Protein A ב-pH הפיזיולוגי ובריכוז המלח חזקים מספיק כדי להתנגד להישטף בעת מזיגה עדינה וכריתת חיץ. חלבונים שיורית, אם בכלל, בתווך אינם גורמים לרעילות כלשהי, למרות שהם עלולים להפריע לאינטראקציה התאית עם ליגנדים קשורים אם אלה שאינם קשורים נמצאים בריכוזים גבוהים. אנו שוללים אפשרות זו על ידי שטיפת הזכוכית המצופה מספר פעמים. לבסוף, קיימות תוכנות מסחריות ולא מסחריות ידידותיות למשתמש רבות המאפשרות לחוקרים לזהות אפילו הבדלים עדינים בהתנהגויות ובמורפולוגיות תאיות. לא ניתן להפריז בחשיבות של הרגעת התוצאות המנותחות באופן ידני כדי למנוע שגיאות שהתוכנה יכולה לעשות.

ניתן לשנות שיטות לטיהור והפעלה של תאי T כך שיתאימו לצרכיו של החוקר, כדי להשיג את מצב התא הנכון ואת הפנוטיפ כדי לשחזר תצפיות in vivo. ניתן להשתמש בסוגים ובמצבים שונים של תאים כדי לטפל במנגנונים שונים של זיהום ותגובה חיסונית 7,8,9,10,11,13, כולל התייחסות להתנהגות תאי T נאיבית וזיכרון ולהיבטים שונים של תגובת הזיכרון, כגון פריימינג וגיוס, בתנאים ספציפיים לרקמות14. שיטה זו יכולה לשמש לתרבית משותפת עם סוגי תאים שונים כדי להבין אינטראקציות תאיות לעומק, כולל זמני מגע ומשך מגע בין תאים 7,9, הצגת אנטיגן 9,13 והריגת תאי מטרה6. כתבים ותוויות נוספים יכולים לשמש להערכת מבנים תת-תאיים7, גרגירים15, אפופטוזיס6 ועוד.

הפרוטוקול הוא כלי מצוין להנחיית ניסויים נוספים in vivo המבוססים על תצפיות בתנאים פשוטים ומוגדרים מאוד. בעוד הערכה חוץ גופית של תנועתיות התא יכולה להיות רדוקטיבית מאוד, זהו צעד חשוב בפירוק פעילויות ביולוגיות מורכבות. עם התוצאות של ניסויים אלה, חוקרים יכולים לגשת לעבודה in vivo בצורה רלוונטית וממוקדת יותר מבחינה פיזיולוגית.

פשטותה של שיטה זו מייצגת גם את מגבלתה העיקרית; למרות שהן מייצגות פעילויות in vivo, ניתן לאשר את כל התוצאות באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון תוך חיוני, למשל. השיטה המתוארת כאן היא אחת הפשוטות הזמינות במלואן למעבדות מחקר עם מיקרוסקופ שדה בהיר ו/או מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מצלמה דיגיטלית המשולבת במערכת המיקרוסקופ או מונחת בנפרד על מטרת ההיקף. מצד שני, ישנן אפשרויות נוספות לניתוח מתקדם של נדידת תאי מערכת החיסון במבחנה. ראשית, תאי מערכת החיסון מונעים לעתים קרובות על ידי שיפועים כימוקינים במערכת הביולוגית. ניתוח של התנהגויות תאי חיסון תחת שיפועים כימוקינים יכול להיות מושג במספר דרכים. שיטה פשוטה אחת היא להשתמש בשקופית שתוכננה במיוחד (ראה טבלת חומרים). מערכת באר מתועלת זו, כאשר תחתיתה מצופה בליגנדות אינטגרין, מאפשרת ניתוח נדידת תאי מערכת החיסון תחת שיפוע כימוקין סטטי. בדיקות פשוטות אחרות לכימוטקסיס של תאי מערכת החיסון כוללות מיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאים לקצה מיקרופיפטה המשחרר כימוקינים16, תחת בדיקת אגרוז17, ותא זיגמונד18. לבדיקת העברה מתוחכמת יותר תחת שיפועים כימוקינים מבוקרים, נדרשות שקופיות מותאמות אישית עם מחוללי שיפוע מיקרופלואידים19,20. שנית, תאי מערכת החיסון יכולים לנדוד בתנאים פיזיקליים ייחודיים באמצעות מנגנונים שונים, לעיתים ללא שימוש בהידבקות תלוית אינטגרין לליגנדות. בדיקת נדידת מבחנה בממד אחד יכולה להיעשות עם או בלי ציפוי ליגנד אינטגרין ומשחזרת תנועתיות של תאי מערכת החיסון בכלי דם נימיים21,22. אפשרות נוספת היא בדיקת נדידת תאים במרחב תלת-ממדי23,24 כדי לחקור מנגנונים העומדים בבסיס נדידת תאים25,26. בסך הכל, תיארנו שיטות פשוטות, ניתנות לשחזור ואמינות לחקר אירועי נדידת תאים דינמיים.

גילויים

המחברים מצהירים כי כל המחקר והכנת כתבי היד נעשו בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

אנו מודים לחברים קודמים ונוכחיים במעבדת קים שתרמו לפיתוח פרוטוקולים אלה לאורך זמן. הנתונים המייצגים התאפשרו על ידי P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States ו-P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States. פרסום זה התאפשר בחלקו הודות למענק מספר T32 GM135134 מטעם פרס שירות המחקר הלאומי ע"ש רות ל. קירששטיין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 10 ס"מקורנינג353003או שווה ערך
15 מ"ל צינור חרוטיThermoFisher339650או שווה ערך
1x DPBSGibco14190144ללא סידן וללא מגנזיום
צלחת 6 בארות לא מטופלתTC קורנינג3736או שווה ערך
70 ומיקרו; מסננת תאיםm FisherScientific352350או שווה ערך
ACK lysing bufferThermoFisherA1049201או שווה ערך
Allegra 6KR צנטריפוגהThermoScientificsorvall 16R עם רוטור ודלי tx400 3655או שווה ערך
בטא מרקפטואתנולSigmaM3148או שווה ערך
CellTrace VioletThermoFisherC34571או שווה ערך
צנטריפוגהThermoScientificSorvall ST 16Rאו שווה ערך
קולגן (IV)קורנינג354233או שווה ערך
צלחת תרבית DeltaT בעובי .17 מ"מ זכוכית שקופהBioptechs04200417C
Dynabeads כבשים נגד חולדות IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 מגנטThermoFisher מדעי12301Dאו שווה ערך
ערכת בידוד תאי T עכבר קל sep תאגזע19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLאו שווה ערך
פיברונקטיןSigmaAldrich10838039001או שווה ערך
פיג'יhttp://fiji.sc/weblink
קוביות מסנן ניקוןאו אולימפוס
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080או שווה ערך
HQ CCD מצלמהCoolSNAPאו שווה ערך
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ תקע מעקב אוטומטי http://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ מעקב ידני חבר https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15שוניםראה חומריםמתכון בינוני: לייבוביץ' s L-15 בינוני ללא פנול אדום (Gibco) בתוספת 1-5 גרם/ליטר גלוקוז
מדיום L-15 של ליבוביץ, ללא פנול אדוםThermoFisher21083027
Luer Lok מזרק חד פעמיFisher Scientific14-955-459או שווה ערך
מדיום הפרדת לימפוציטיםCorning25-072-CIאו שווה ערך
M5/114ATCCTIB-120
MEM חומצות אמינו לא חיוניותThermoFisher11140050או שווה ערך
מערכת חימום מיקרוסקופOkolabokolab.comעיצובים מותאמים אישית זמינים
שקופית Millicell EZ שקופיתMilliporeC86024
Mojosort עכבר CD8+ Naï ערכת בידוד תאי TBiolegend480043
Mouse E-cadherinR& D systems8875-EC-050או שווה ערך
ערכת דיסקציה כירורגית לעכברFisher Scientific13-820-096או שווה ערך
רכיבי NISNikonSoftware
שאינו TC 24wpCorning353047או שווה ערך
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher15140122או שווה ערך
חלבון AThermoFisher Scientificאו שווה ערך
R9מגוון ראה חומריםמתכון בינוני: RPMI 1640x בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (Gibco), 20 מ"מ חוצץ HEPES (Gibco), 1% MEM חומצות אמינו לא חיוניות (Gibco), 50 μ M &-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
עכבר רקומביננטי ICAM-1 Fc כימרהR& מערכות D796-IC-050או שווה ערך
עכבר רקומביננטי IL2Biolegend575410או שווה ערך
RPMI 1640xThermoFisher11875093 או שווה ערך
T pinsFisher ScientificS99385או שווה ערך
TE2000-U מיקרוסקופניקוןאו שווה ערך
כימוקין עכבר רקומביננטי שונה& מערכותאו שווה ערך
VCAM-1 Fc chimeraR& מערכות D643-VM-050או שווה ערך
VolocityPerkinElmerSoftware
R D

מקורות

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TT CD8Time Lapse
בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.