Method Article

הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF

DOI:

10.3791/66581

⸱

May 17th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת גנומיקה פונקציונלית מציעה גישה רבת עוצמה לתפקוד גנים ומסתמכת על בניית ספריות פלסמיד רחבות גנום. גישות קונבנציונליות לבניית ספריית פלסמיד גוזלות זמן ומייגעות. לכן, פיתחנו לאחרונה שיטה פשוטה ויעילה, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), לבניית תפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד במעלה הזרם המפעילה רצף דנ"א משלים/מסגרת קריאה פתוחה (UAS-cDNA/ORF). כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, תוך לקיחת כדוגמה את הבנייה של ספריית פלסמיד מבוססת GAL4/UAS UAS-cDNA/ORF. הפרוטוקול כולל תגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות באופן מאסיבי ולאחריהן טרנספורמציה חיידקית. השלב הראשון הוא לינאריות של פלסמידים קיימים של DNA משלים (cDNA) או מסגרת קריאה פתוחה (ORF) cDNA או ספריית ORF על ידי חיתוך הרצפים הווקטוריים המשותפים במעלה הזרם הסמוכים לקצה 5' של cDNA או ORFs באמצעות CRISPR/Cas9 יחד עם RNA מנחה יחיד (sgRNA), והשלב השני הוא החדרת מודול UAS לתוך פלסמידים cDNA ליניארי או ORF באמצעות תגובה חד שלבית. CRISPRmass מאפשר בנייה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית של ספריות פלסמיד שונות. ספריית הפלסמיד UAS-cDNA/ORF יכולה לשמש לבדיקת רווח תפקוד בתאים בתרבית ולבניית ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סריקה גנטית בלתי משוחדת של גנום שלם היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים המעורבים בתהליך ביולוגי נתון ולהבהרת המנגנון שלו. לכן, הוא נמצא בשימוש נרחב בתחומים שונים של מחקר ביולוגי. כ-60% מהגנים של דרוזופילה נשמרים בבני אדם 1,2, ו~75% מהגנים של מחלות אנושיות מכילים הומולוגים בדרוזופילה3. בדיקות סקר גנטיות נחלקות בעיקר לשני סוגים: אובדן תפקוד (LOF) ושיפור תפקוד (GOF). המסכים הגנטיים של LOF בדרוזופילה מילאו תפקיד קריטי בהבהרת מנגנונים השולטים כמעט בכל היבט של הביולוגיה. עם זאת, לרוב הגנים של דרוזופילה אין פנוטיפים ברורים של LOF4, ולכן, בדיקת GOF היא שיטה חשובה לחקר תפקודם של גנים אלה 4,5.

המערכת הבינארית GAL4/UAS משמשת בדרך כלל לביטוי גנים ספציפיים לרקמות בדרוזופילה6. במערכת זו, הרקמה מבטאת באופן ספציפי מפעיל שעתוק שמרים GAL4 הנקשר לאלמנט המגיב GAL4 (UAS) ובכך מפעיל שעתוק של המרכיבים הגנטיים במורד הזרם (למשל, cDNA ו- ORF)6. כדי לבצע מסכי GOF רחבי גנום בדרוזופילה, עלינו לבנות ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום, ולאחר מכן ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית בדרוזופילה.

בניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום בשיטות קונבנציונליות משיבוטים cDNA/ORF הזמינים לציבור היא גוזלת זמן ומייגעת, מכיוון שכל גן דורש עיצובים אינדיבידואליים, כולל תכנון וסינתזה ראשוניים, תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טיהור ג'ל, ריצוף, הגבלת עיכול וכן הלאה 7,8. לכן, בניית ספריית פלסמיד כזו היא צעד מגביל קצב ביצירת ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה. לאחרונה, פתרנו בהצלחה בעיה זו על ידי פיתוח שיטה חדשנית, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass)9. הליבה של CRISPRmass היא לתפעל את הרצפים הווקטוריים המשותפים של ספריית פלסמיד באמצעות שילוב של טכנולוגיית עריכת גנים וטכנולוגיית שיבוט חלקה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, הכולל תגובות מבחנה מקבילות מאסיביות בשני שלבים ואחריו טרנספורמציה חיידקית. CRISPRmass היא שיטה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית, שבאופן עקרוני ניתן להשתמש בה לבניית תפוקה גבוהה של ספריות פלסמיד שונות.

אסטרטגיית CRISPRmass
ההליך של CRISPRmass מתחיל בתגובות מבחנה מקבילות בשני שלבים לפני טרנספורמציית Escherichia coli (E. coli) (איור 1). שלב 1 הוא הפיצול של עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF על ידי Cas9/sgRNA. אתר מחשוף אידיאלי צמוד לקצה 5′ של cDNA/ORF. מוצרי המחשוף אינם חייבים להיות מטוהרים. שלב 2 הוא החדרת מודול כטב"ם ספציפי לווקטור לתוך פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9/sgRNA על ידי הרכבת גיבסון (להלן תגובה חד-שלבית), וכתוצאה מכך פלסמידים של UAS-cDNA/ORF. רצפי הטרמינלים 5′ ו-3′ של מודול כטב"ם חופפים לאלה של פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים, ומאפשרים תגובה חד-שלבית.

תוצרי התגובה החד-שלבית נתונים ישירות לטרנספורמציה של E. coli . תיאורטית, רק מושבות UAS-cDNA/ORF הרצויות יכולות לגדול על לוחות לוריא-ברטאני (LB) המכילים אנטיביוטיקה ברירה המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה של מודול הכטב"ם. מודול הכטב"ם מורכב ממודול ליבה של כטב"מים, גן עמידות לאנטיביוטיקה הנבדל מזה של פלסמידים cDNA או ORF, ורצפים טרמינליים 5′ ו-3′. מודול ליבה של כטב"ם כולל 10 עותקים של כטב"ם, מקדם מינימלי Hsp70, רצף attB לאינטגרציה גנומית בתיווך phiC31, וסמן טרנספורמציה מיני לבן עבור דרוזופילה7.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קביעת אתר מחשוף Cas9/sgRNA אופטימלי במעלה הזרם של cDNA/ORF

  1. הכנת פלסמידים cDNA או ORF עם עמוד שדרה וקטורי זהה
    1. רכוש שיבוטים של cDNA/ORF הזמינים במשאבים ציבוריים, כגון מרכז המשאבים לגנום דרוזופילה (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, אוסף הגנים של יונקים עכבריים (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/), וספריית הביטוי הלנטיוויראלי הרחבה של CCSB האנושי12. בפרוטוקול זה, אנו לוקחים כדוגמה את שיבוטי cDNA/ORF מבוססי וקטור pOT2, הזמינים באוסף הזהב של DGRC.
    2. חילוץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת הכנה קטנה פלסמיד. למדוד את הריכוז של פלסמידים עם ספקטרופוטומטר.
  2. תכנון sgRNA
    1. בקר באתר האינטרנט של CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). לחץ על הלחצן הדבק יעד ולאחר מכן הזן את רצף ה- DNA המעניין. רצף העניין הוא אזור של 20-100 bp הממוקם בעמוד השדרה הווקטורי pOT2 במעלה הזרם של קצה cDNA/ORF 5'.
    2. בחר את המין Drosophila melanogaster. לחץ על הלחצן חפש אתרי יעד. בחר מועמדים sgRNA עם יעילות חזויה גבוהה מ 80%.
  3. הכנת sgRNA
    1. הזמנת אוליגוס מטוהר PAGE, פריימר קדמי (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′) כאשר (N)20 הוא רצף המטרה של sgRNA, ושל פיגום sgRNA פריימר הפוך sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      הערה: מומלץ להשתמש באוליגונוקלאוטידים באיכות גבוהה מטוהרים PAGE.
    2. הכן תבנית DNA על ידי PCR עבור שעתוק חוץ גופי (IVT) של sgRNA. הגדר תגובת PCR של 100 μL באופן הבא: 5 μL של תבנית pX330 (פלסמיד Addgene 42230, מתנה מפנג ז'אנג; 0.1 ng/μL), 5 μL של פריימר קדמי (10 μM), 5 μL של sgRNA-REV (10 μM), 50 μL של 2x תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה, ו- 35 μL של מים מטופלים דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) בצינור PCR.
    3. בצע PCR באמצעות התנאים הבאים thermocycling: 1 מחזור של 98 ° C במשך 30 שניות; 5 מחזורים של 98 °C עבור 10 שניות, 51 °C עבור 10 s, 72 °C עבור 5 שניות; 30 מחזורים של 98 °C עבור 10 שניות, 72 °C עבור 15 שניות; מחזור אחד של 72°C למשך 2 דקות. לדגור תגובות במחזור תרמי.
    4. להפריד מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 0.8%. מקטע DNA ~ 120-bp צריך להיות גלוי על הג'ל תחת UV. לטהר את מקטע ה- DNA ~ 120-bp באמצעות ערכת מיצוי ג'ל. מקטע הדנ"א המטוהר משמש כתבנית ל-IVT של sgRNA.
    5. הגדר תגובת IVT של 5 μL באופן הבא: 165 ng של ~ 120-bp מקטע DNA ג'ל מטוהר, 1.65 μL של תערובת חיץ NTP, 0.33 μL של תערובת T7 RNA פולימראז, ומים מטופלים DEPC. לדגור תגובות ב 37 ° C במשך 4 שעות. בצע את ההוראות הידניות של ערכת תמלול חוץ גופית .
    6. יש להוסיף 45 μL של מים שטופלו ב-DEPC למוצר עם תגובת IVT. התייחסו למוצרי תגובת IVT כאל RNA והשתמשו במים שטופלו ב-DEPC כבקרה ריקה. למדוד את הריכוז של sgRNA עם ספקטרופוטומטר. הריכוז של sgRNA מדולל הוא סביב 870 ng/μL.
    7. יש לדלל את מוצר תגובת ה-IVT ל-20 ננוגרם/מיקרוליטר במים שטופלו ב-DEPC. Aliquot ולאחסן sgRNA ישירות ב -80 ° C.
      הערה: לאחר תגובת IVT, הסרת תבנית הדנ"א על ידי עיכול DNase אינה הכרחית למדידת הריכוז המדויק של sgRNA, מכיוון שכמות תבנית הדנ"א נמוכה מ-0.4% מזו של sgRNA ותבנית הדנ"א אינה משפיעה על תגובת CRISPRmass שלאחר מכן. לכן, טיהור sgRNA אינו הכרחי.
  4. הערכה של sgRNAs
    1. לעכל פלסמיד cDNA/ORF הנושא עמוד שדרה וקטורי pOT2 עם אנזים הגבלה. להפריד את קטעי ה- DNA המתקבלים על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose 0.8%. לטהר את מצע ה- DNA עם ערכת מיצוי ג'ל.
      הערה: מקטע DNA שנוצר המכיל את רצפי מיקוד sgRNA של עמוד השדרה הווקטורי pOT2 משמש כמצע ה- DNA של Cas9/sgRNAs. אתרי המחשוף של Cas9/sgRNA ממוקמים באופן א-סימטרי במצע הדנ"א, וכך פיצול מצע הדנ"א על ידי Cas9/sgRNA מניב שני מקטעי דנ"א בגדלים שונים, מה שמקל על ההבחנה בינם לבין מצע הדנ"א הלא תקין בתגובת העיכול.
    2. הגדר תגובת מחשוף של 5 μL Cas9 באופן הבא: 0.2 μL של 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.5 μL של 20 ng/μL sgRNA, 0.015 pmol של מצע DNA, 0.5 μL של 10x Cas9 Buffer, ומים מטופלים DEPC. לדגור תגובות ב 37 ° C במשך 1 שעות.
    3. להפריד את מוצרי המחשוף על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose 0.8%. טען את מצע ה- DNA השלם כבקרה שלילית על מצע ה- DNA המעוכל.
      הערה: כאן, מצע DNA שלם מתייחס למצע DNA שאינו נתון לתגובות עיכול על ידי Cas9/sgRNAs. פיצול מצע הדנ"א על ידי Cas9/sgRNA מניב שני מקטעי דנ"א בגדלים שונים, מה שמקל על ההבחנה בינם לבין מצע הדנ"א הלא תקין בתגובת העיכול.
    4. נתחו דפוסי מחשוף באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית (איור 2). בחר את sgRNA היעיל ביותר עבור ניסויי CRISPRmass הבאים. איור 2 מראה שכל ארבעת ה-sgRNA מפגינים יעילות גבוהה של המחשוף, וניתן להשתמש בהם עבור CRISPRmass. בחר את sgRNA המסומן בקו תחתון עבור הניסויים הבאים.
      הערה: ככל שמצע הדנ"א הפנוי קטן יותר, כך ה-sgRNA יעיל יותר לעיכול Cas9/sgRNA של מצע DNA.

2. בניית מודול כטב"ם

הערה: מודול כטב"ם מורכב מכטב"ם ליבה וכ-20-40 bp של רצפי הטרמינלים 5′ ו-3′ החופפים לקצוות 5′ ו-3′ של אתר המחשוף בעמוד השדרה, בהתאמה (איור 1). רצפי הטרמינל 5′ ו-3′ של מודול המל"ט נקבעים על ידי אתר המחשוף בעמוד השדרה של וקטור pOT2.

  1. שכפל את מודול הכטב"ם הספציפי לווקטור pOT2 לאתר EcoRI של וקטור pCR8GW, וכתוצאה מכך pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 פלסמיד (קובץ משלים 1). שחרר את מודול הכטב"ם הספציפי לווקטור pOT2 על ידי עיכול פלסמיד pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 עם EcoRI ב-37°C למשך שעה אחת.
  2. להפריד את מוצרי המחשוף על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 0.7%. טהרו את מודול הכטב"ם 6178-bp באמצעות ערכת מיצוי ג'ל. דללו את מודול הכטב"ם ל-23 ננוגרם/מיקרוליטר לניסויים הבאים. מקטע 6178-bp זה משמש כמודול כטב"ם לבניית פלסמידים מבוססי UAS-cDNA/ORF משיבוטים מבוססי cDNA/ORF מבוססי וקטור pOT2.

3. בנייה בקנה מידה גדול של פלסמידים UAS-cDNA/ORF על ידי CRISPRmass

הערה: CRISPRmass מתוקנן כתגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות באופן מאסיבי לפני טרנספורמציית E. coli (איור 1).

  1. תגובת מבחנה שלב 1
    1. לבקע את עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF על ידי Cas9/sgRNA. סדרו צינורות 0.2 מ"ל בבלוק קירור אלומיניום על קרח ותייגו את הצינורות בזהירות. הכינו את תערובת המאסטר באופן הבא.
      1. לתגובה יחידה, יש להוסיף 0.16 μL של 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.4 μL של 20 ng/μL sgRNA, 0.24 μL של 10x Cas9 buffer, 1.2 μL של מים שטופלו ב-DEPC. עבור N תגובות, הוסף (N+1) x 0.16 μL של 1.22 מיקרומטר S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0.4 μL של 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0.24 μL של 10x Cas9 buffer, (N+1) x 1.2 μL של מים שטופלו ב-DEPC.
    2. מערבלים, מערבבים היטב, ומסתחררים. Aliquot 2 μL של תערובת מאסטר לכל צינור. הוסף 0.4 μL של 0.019 מיקרומטר של פלסמיד cDNA/ORF לכל צינור. יש לדגור על תגובות מחשוף בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
      הערה: יש לדלל כל פלסמיד ל-0.019 מיקרומטר במים שטופלו ב-DEPC. אם ריכוז הפלסמיד נמוך מ-0.019 מיקרומטר, יש להוסיף DNA פלסמיד ישירות לתגובת המחשוף. השתמש בצינורות נטולי RNase ובמים שטופלו ב- DEPC. ביצוע שלבים אלה בקנה מידה גדול ייקח מספר שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור ריאגנטים ותגובות על קרח.
  2. תגובת מבחנה שלב 2
    1. הכנס מודול UAS ספציפי לווקטור משלב 2 לתוך פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9 על ידי הרכבת תגובה חד-שלבית. הגדר תגובה של 1.4 μL בצעד אחד עבור כל דגימה. סדרו את צינורות ה-0.2 מ"ל בבלוק קירור מאלומיניום על קרח ותייגו את הצינורות בזהירות.
      1. הכינו את תערובת המאסטר באופן הבא. עבור תגובה יחידה, הוסף 0.07 μL של מודול UAS 0.006 μM ו- 0.7 μL של תערובת מאסטר להרכבה של תגובה חד-שלבית. עבור N תגובות, הוסף (N+1) x 0.07 μL של מודול UAS של 0.006 μM ו- (N+1) x 0.7 μL של תערובת מאסטר להרכבת תגובה חד-שלבית.
    2. מערבלים, מערבבים היטב, ומסתחררים. Aliquot 0.77 μL של תערובת המאסטר לכל צינור. הוסף 0.7 μL של פלסמיד cDNA/ORF ליניארי Cas9 לכל צינור. לדגור תגובות ב 50 ° C במשך 1 שעה.
      הערה: אין צורך בטיהור של מוצרי תגובת הרכבה חד-שלבית. ביצוע שלבים אלה בקנה מידה גדול לוקח כמה שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור ריאגנטים ותגובות על קרח.
  3. הפוך מוצרי תגובת הרכבה חד-שלבית ל-E. coli בקנה מידה גדול.
    1. Prechill 10 μL טיפים ב 4 °C. צינורות Prechill 1.5 מ"ל בבלוק קירור אלומיניום על קרח.
    2. הפשירו תאי E. coli מוכשרים על קרח במשך 5 דקות. Aliquot 10 μL של תאים מוסמכים לכל צינור precooled 1.5 מ"ל.
      הערה: השתמש בתאי E. coli מוכשרים הזמינים מסחרית עם יעילות טרנספורמציה של לפחות 1 x 108 CFU/μg של pUC19 DNA.
    3. יש להוסיף 1 μL של מוצר תגובת הרכבה בצעד אחד ל-10 μL של תאים מתאימים, לערבב בעדינות ולהניחו על קרח למשך 30 דקות.
    4. לדגור את הצינורות באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן מיד לצנן על קרח במשך 2 דקות.
    5. יש להוסיף 100 μL של SOC בינוני (שחומם מראש ל-37°C) לכל צינור בטמפרטורת החדר, ולדגור באינקובטור רועד (250 סל"ד) ב-37°C למשך שעה אחת.
    6. חממו עד 37 מעלות צלזיוס את לוחות LB המכילים אנטיביוטיקה המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה של מודול המל"ט. פזרו תאים על הצלחות ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
      הערה: ביצוע שלבים אלה בקנה מידה גדול אורך מספר שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור ריאגנטים ותגובות על קרח.
  4. אימות פלסמידים מסוג UAS-cDNA/ORF שנבנו על ידי CRISPRmass
    1. בחר מושבה אחת וחסן אותה ב 4.5 מ"ל של מדיום נוזלי LB בתוספת הבחירה המתאימה של אנטיביוטיקה המתאימה לגן עמידות לאנטיביוטיקה של מודול UAS. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C תוך רעידות ב-250 סל"ד.
    2. לחלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלסמיד מיני. הגדר תגובת עיכול הגבלה של 20 μL באופן הבא: 300-500 ng/μL של פלסמיד, אנזים הגבלה מתאים, חיץ הגבלת עיכול ומים טהורים במיוחד. לדגור תגובות ב 37 ° C במשך 1 שעות.
    3. הפרידו מקטעי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ב-0.8% ונתחו באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית (איור 3).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישמנו את CRISPRmass כדי ליצור ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום באמצעות 3402 שיבוטים של cDNA/ORF הנושאים עמוד שדרה וקטורי pOT2 מאוסף הזהב של DGRC. ניתחנו באופן אקראי רק מושבה אחת עבור כל מבנה UAS-cDNA/ORF, וניתוח הגבלות עוקב עם PstI הצביע על כך ש-98.6% ממבני UAS-cDNA/ORF נוצרו בהצלחה9. הרציונל לשימוש ב- PstI לניתוח הגבלה של מבני UAS-cDNA/ORF הנושאים עמוד שדרה וקטורי pOT2 הוא כדלקמן. ישנם שני אתרי PstI במודול UAS עבור שיבוטים מבוססי cDNA/ORF מבוססי וקטור pOT2, ויש אתר PstI בעמוד השדרה הווקטורי pOT2. לפיכך, עיכול של מבנה UAS-cDNA/ORF מבוסס וקטור pOT2 עם PstI מניב מקטע ספציפי למודול UAS של 408 bp ומקטע ספציפי להרכבה וקטורית של 5649 bp UAS. מקטעי PstI של 408 bp ו-5649 bp מצביעים על כך שמבנים של UAS-cDNA/ORF עבור שיבוטים מבוססי cDNA/ORF מבוססי וקטור pOT2 נוצרים בהצלחה, והתוצאות המייצגות מוצגות באיור 3.

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה של בניית ספריות UAS-cDNA/ORF באמצעות CRISPRmass. צינור CRISPRmass לבניית ספריית UAS-cDNA/ORF. (1) תגובת המבחנה בשלב הראשון. עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF נבקע על ידי Cas9/sgRNA. אתר המחשוף נמצא בעמוד השדרה הווקטורי הסמוך במעלה הזרם של קצה cDNA/ORF 5′. מוצרי המחשוף, ללא טיהור, כפופים ישירות לשלב השני של תגובת המבחנה. ה- sgRNA המשמשים בתגובות מחשוף מוכנים על ידי שעתוק חוץ גופי וניתן להשתמש בהם ישירות ללא טיהור. לאחר מכן, 28-40 bp מהקצה 5′ של אתר המחשוף (תיבה צהובה) מוגדר כחפיפת קצה 5′ ו-28-40 bp מהקצה 3′ של אתר המחשוף (תיבה אדומה) מוגדר כחפיפת קצה 3′. עמוד השדרה הווקטורי נושא את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה A (קופסה ירוקה). (2) השלב השני הוא תגובת המבחנה. מודול UAS ספציפי לווקטור מחובר לפלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9 ממש במעלה הזרם של קצה cDNA/ORF5′ באמצעות הרכבת תגובה חד-שלבית, וכתוצאה מכך נוצרים מבני UAS-cDNA/ORF. מוצרי הרכבת תגובה בצעד אחד נתונים ישירות לטרנספורמציה של E. coli . טרנספורמנטים נבחרים על לוחות אגר LB המכילים אנטיביוטיקה B המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה B (קופסה חומה) של מודול המל"ט הספציפי לווקטור. רק מושבות UAS-cDNA/ORF הרצויות יכולות לגדול. מודול כטב"ם כולל 10 עותקים של כטב"ם, מקדם מינימלי Hsp70, רצף attB לאינטגרציה גנומית בתיווך phiC31, סמן טרנספורמציה מיני-לבן עבור טרנסגנזה של דרוזופילה , גן עמידות B לאנטיביוטיקה הניתן לבחירה לברירה חיובית, וחפיפת קצה 5′ וחפיפת קצה 3′ המאפשרת הרכבת תגובה בצעד יחיד. מכלול תגובה חד-שלבי מסנן כל שסע DNA פוטנציאלי מחוץ למטרה הנגרם על ידי CRISPR/Cas9. נתון זה שונהמ-9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הערכה של sgRNA המכוון לאזורים ספציפיים בעמוד השדרה הווקטורי pOT2 על-ידי ניתוח מחשוף Cas9 במבחנה . sgRNA המסומנים בקו תחתון נבחרים עבור CRISPRmass. M הוא סמן הדנ"א. נתון זה שונהמ-9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח הגבלה של 20 מבני UAS-cDNA/ORF שנוצרו על-ידי CRISPRmass. המבנים נותחו על ידי עיכול PstI. נצפו דפוסי ההגבלה הצפויים עבור כל מבני UAS-cDNA/ORF. M הוא סמן הדנ"א. נתון זה שונהמ-9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: בניית פלסמיד pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-HSP70. מודול הכטב"ם הספציפי לווקטור pOT2 המכיל פלסמיד pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 בנוי על בסיס שלושה פלסמידים, pMartini-Amp, pBS-attB-UAS-Hsp70 ו-pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר של CRISPRmass הם תכנון של sgRNA והערכה של sgRNAs. בחירה של sgRNA יעיל במיוחד עבור Cas9 היא המפתח להצלחה של CRISPRmass. אם מעט מאוד מושבות או בכלל לא נצפות על רוב לוחות LB המכילים אנטיביוטיקה לאחר השינוי של E. coli עם מוצרי הרכבה תגובה בצעד אחד, לבדוק עיכול פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. אם פלסמידים אינם מתעכלים היטב, לבדוק פעילות Cas9, השפלת sgRNA ואיכות פלסמיד; אם פלסמידים מתעכלים היטב, בדוק ריאגנטים להרכבת תגובה בצעד אחד וודא שיעילות הטרנספורמציה של תאים מוכשרים היא לפחות 1 x 108 cfu/μg של pUC19 DNA. ראוי לציין כי שימוש בבלוק קירור אלומיניום יכול להקל על טרנספורמציה חיידקית בקנה מידה גדול.

המגבלות של CRISPRmass נובעות מהמניפולציה והשילוב של רצפי עמוד השדרה הווקטוריים, מה שמגביל את האפשרות לתייג את cDNA ו-ORFs בקצה 5' או 3'.

שלא כמו כל השיטות הקיימות האחרות 7,8, CRISPRmass מתפעל ומשלב רצפי עמוד השדרה הווקטורי9. לכן, ברגע שמודולי כטב"ם מתוכננים ומוכנים, CRISPRmass אינו זקוק לתכנון או מניפולציה אינדיבידואליים עבור כל פלסמיד בודד, אלא מקביל באופן מאסיבי לתגובות מבחנה דו-שלביות לפני טרנספורמציה חיידקית, המייתרת את ה-PCR והמניפולציות הקשורות אליו. יתר על כן, הן sgRNA משועתק במבחנה והן מוצרי הרכבת תגובה בצעד אחד אינם צריכים להיות מטוהרים עבור הניסויים הבאים. בהשוואה לטכנולוגיית שיבוט Gateway, CRISPRmass מתאים יותר ליצירת מבני UAS-cDNA/ORF, במיוחד מ-cDNA/ORF ארוכים או עשירים ב-GC, מכיוון ש-CRISPRmass אינו מגביר PCR את cDNA או ORFs עצמם9.

CRISPRmass יכול לשמש לבניית תפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF וכן לעריכת ספריות פלסמיד שונות ברחבי הגנום. ניתן ליישם CRISPRmass על בניית ספריית פלסמיד ביטוי על ידי החדרת מקדם CMV לרצפים הווקטוריים המשותפים הסמוכים לקצה 5' של cDNA או ORFs. CRISPRmass מבטיחה להאיץ את הפיתוח של גנומיקה פונקציונלית.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071135 ו 31471010), תוכנית שנגחאי פוג'יאנג (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנחאי (19ZR1446400).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בלוק קירור אלומיניוםAikbbioADMK-0296לביצוע טרנספורמציה חיידקית
ג'ל במים מטופלים DEPCInvitrogenAM9906
OmegaD2500לטיהור DNA מג'ל אגרוז
מערכת הדמיית ג'לTanon2500B
HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA מהירה בתפוקה גבוההNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA הרכבה מאסטר מיקסNEBE2621
פלסמיד מיני ערכתאומגהD6943לבידוד DNA פלסמיד מתאי חיידקים
Q5 התחלה חמה נאמנות גבוהה 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
חממת טלטולשנחאי Zhichu ZQLY-180V
T סדרת Multi-Block Thermal CyclerLongGeneT20לביצוע PCR 
Trans10 תא מוכשר כימיתTranGen BioTechCD101
ספקטרופוטומטר אולטרה סגולShimadzuBioSpec-nanoלמדידת ריכוז DNA או RNA
ערכת מיצוי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).">Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  2. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).">Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  3. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).">Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  4. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).">Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
  5. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).">St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).">Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  7. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).">Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  8. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).">Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
  9. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).">Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  10. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).">Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
  11. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).">Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
  12. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).">Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Modular AssemblyPlasmid Library ConstructionUAS cDNA ORF LibraryFunctional Genomics ScreeningCRISPR Cas9 EditingHigh Throughput CloningBacterial TransformationSingle Guide RNAGenome Wide LibraryGain Of Function Screening

Related Articles