מאמר שיטה

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

DOI:

10.3791/66590

⸱

7 ביוני 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים ברשתית (ROs) הם מערכת תרבית תלת ממדית המחקה תכונות רשתית אנושיות שהתמיינו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) בתנאים ספציפיים. התפתחות סינפסה והבשלה ב-ROs נחקרו מבחינה אימונוציטוכימית ותפקודית. עם זאת, העדות הישירה לאולטרה-מבנה המגע הסינפטי מוגבלת, ומכילה הן סינפסות סרט מיוחדות והן סינפסות כימיות קונבנציונליות. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה והיסטוריה מכובדת המבהירה התפתחות רשתית והבשלת סינפסות בבני אדם ומינים שונים. זהו כלי רב עוצמה לחקור מבנה סינפטי ROs והוא נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של ROs. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המבנה של מגעים סינפטיים RO בקנה מידה ננומטרי ולקבל ראיות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה, פיתחנו שיטה פשוטה וחוזרת להכנת דגימות RO TEM. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל הכנת קיבוע RO, קיבוע לאחר קיבוע, הטבעה והדמיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרשתית, איבר חישה חזותי חיוני בבני אדם וביונקים, מציגה מבנה למינציה מובהק המאופיין בשלוש שכבות גרעיניות המאחסנות סומות נוירונים ושתי שכבות פרספקס שנוצרו על ידי קשרים סינפטיים1, כולל סינפסות קונבנציונליות וסינפסת הסרט המיוחדת 2,3. סינפסת הסרט ממלאת תפקיד מכריע בהעברת דחפים שלפוחית באופן מדורג 2,3. תהליך הראייה כולל העברת אותות אלקטרו-אופטיים על פני רמות שונות של נוירונים וסינפסות, ובסופו של דבר מגיע לקליפת המוח הראייתית 4,5.

אורגנואידים ברשתית (ROs) מייצגים מערכת תרבית תלת-ממדית (תלת-ממדית) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), המחקים את המצבים הפיזיולוגיים של רקמת הרשתית במבחנה 1,6,7. גישה זו טומנת בחובה הבטחה לחקר מחלות רשתית8, בדיקות סקר תרופתיות9, ומשמשת כטיפול פוטנציאלי למצבים ניווניים בלתי הפיכים ברשתית כגון רטיניטיס פיגמנטוזה10 וגלאוקומה11. כמערכת הולכה אופטית עוצמתית במבחנה, הסינפסה בתוך ROs היא מבנה חיוני המאפשר טרנספורמציה והעברה יעילה של אותות5.

ניתן לחלק את התפתחות RO באופן גס לשלושה שלבים על פי תכונותיהם המורפולוגיות ופרופילי הביטוי המולקולרישלהם 6,12. ROs בשלב 1 (סביב D21-D60) כוללים תאי אב עצביים של הרשתית, תאי גנגליון רשתית רבים (RGCs), וכמה תאים אמקריניים מתפוצצים כוכבים (SACs), המתאימים לתקופה הראשונה של התפתחות עוברית אנושית. בשלב 2 (בסביבות D50-D150), ROs מבטאים כמה מבשרי פוטורצפטור, נוירונים בין-עצביים וגנים הקשורים לסינפטוגנזה, מה שמייצג שלב של מעבר. פוטורצפטורים מפתחים בשלות בשלב 3 ROs (בערך אחרי D100-D150), המתאים לשלב השלישי של התפתחות העובר האנושי 6,12,13. יש לציין כי בהשוואה ל-ROs בשלב 1 ובשלב 2, ל-ROs בשלב 3 יש מבנה למלרי מובהק שהסינפסות שלו הבשילו12, כולל נוכחות של סינפסות סרט14. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה אישר כי סינפסות בוגרות קיימות העברת אותות אור, המציין שהם פונקציונליים13. לכן, ROs בשלב 3 נבחרים לעתים קרובות לחקור את המבנה הסינפטי.

אימונוהיסטוכימיה מיושמת באופן נרחב לחקר הביטוי של חלבונים מולקולריים שונים. עם זאת, המגבלה של המיקרוסקופ האופטי טמונה ביכולתו לצפות רק במספר מוגבל של תאים ומולקולות ספציפיים בו זמנית, וכתוצאה מכך חוסר ניתוח מקיף של היחסים בין תאים לסביבתם. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה, עם רזולוציה מוגבלת של 0.1-0.2 ננומטר, עולה על מיקרוסקופ האור על ידי ~ 10-20 פעמים15. הוא מפצה על הפגמים של מיקרוסקופיה אופטית ומשמש להבהרת התפתחות הרשתית והבשלת סינפסות בבני אדם16,17 ומינים שונים18,19,20,21. TEM מאפשר הבחנה ישירה בין רכיבים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים18,20, ואף מאפשר תצפית מקיפה על מבנים תת-תאיים כגון סרטים 2,3, שלפוחיות22 ומיטוכונדריה23. לכן, TEM הוא כלי חיוני לזיהוי סוגי סינפסות וחקירת מבנה העל של מגעים סינפטיים ב- ROs בקנה מידה ננומטרי.

חשוב לציין כי להכנת הדגימה חשיבות רבה לרכישת מיקרוגרפים אלקטרונים איכותיים. למרות שמחקרים מסוימים ביצעו EM על ROs 12,13,24, ההליכים המפורטים אינם ברורים. מכיוון שאיכות תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים תלויה במידה רבה בהשפעה של קיבוע RO וחדירת מגיב, יש לקחת בחשבון גורמים חשובים שונים במהלך ההכנה. כתוצאה מכך, כדי לחקור טוב יותר מגעים סינפטיים ב-ROs, אנו מציגים שיטה עם יכולת שחזור טובה שמראה את נקודות הפעולה של קיבוע RO, הטבעה וזיהוי של אתרי תצפית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קבלת ROs מ- iPSCs25

הערה: ROs נגזרו מ- iPSCs על-ידי שינוי ההליך שדווח בעבר.

  1. נתק iPSCs במפגש ~90% באמצעות פרוטאז חיידקי (ראה טבלת חומרים). קוצצים את המושבות לחתיכות ומגרדים אותן עם מרים תאים.
  2. לאחר האיסוף, להשעות מחדש את אשכולות התאים ב 0.25 מ"ל של Matrigel קר כקרח. לאחר 20 דקות דגירה ב-37°C, פזרו את הג'ל המוצק עם מדיום DMEM/F12 (תוסף N2 0.5%, תוסף B27 1%, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 0.2 mM L-תחליף גלוטמין, 100 U/mL פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין). הגדירו זמן זה כיום 0 של בידול.
  3. לאחר 5 ימים של תרבית צפה, תאים מתקבצים ליצירת ציסטות תאים. העבירו את ציסטות התאים הללו לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, שם הן יידבקו ויגדלו.
  4. ביום ה-15, השתמשו בפרוטאז חיידקי כדי לנתק את התאים הדבקים ולגדל אותם בתרבית במדיום DMEM/F12 (תוסף B27 2%, 0.1 מילימול חומצות אמינו לא חיוניות).
  5. ביום ה-21, יש להחליף את המדיום ב-20 מ"ל מדיום המכיל סרום (DMEM/F12 בינוני, 8% FBS, 2% תוסף B27, 100 מ"מ טאורין ו-2 מ"מ L-תחליף גלוטמין), ולהחליף את המדיום מדי שבוע.

2. קיבוע קדמי של ROs

  1. העבר בעדינות את אחד מ- ROs בתרבית (~D180, גודל של כ -1 ~ 2 מ"מ קוטר אופטימלי) מצלחת פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל עם פיפטה וסמן את המידע הרלוונטי על ROs.
    הערה: חתכו את ROs לשניים או חתכו את הרקמה בעלת המבנה הגרוע עם סכין גילוח מתחת למיקרוסקופ בצלחת המכילה קיבוע אם ROs גדולים מדי.
  2. הסר את המדיום תרבית מ 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge עם פיפטה. הוסף 1.5 מ"ל של 2% paraformaldehyde-2% glutaraldehyde fixative מדולל ב 0.1 M פוספט buffer (PB), pH 7.4, ולתקן בטמפרטורת החדר (RT) במשך 4 שעות. אחסנו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    הערה: ניתן להשהות שלב זה למשך שבוע אחד, אך מומלץ להפעיל מחדש מוקדם ככל האפשר. אם ROs נשארים למשך זמן רב יותר, זה עלול לגרום לאוטוליזה של תאים המוביל להרס של מבנה העל של ROs. בשל השבריריות של ROs, הימנע סיבוב, תנודה, היפוך, או פעולות קשות.

3. לאחר קיבוע ROs

  1. יש להסיר את קיבוע ה-2% פרפורמאלדהיד-2% גלוטראלדהיד ולשטוף עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 0.01M (PBS) ב-pH 7.4 למשך 3 x 10 דקות. השהה בעדינות את ROs בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל במהלך תהליך הכביסה לשטיפה מלאה. עבור כל יום נוסף של קיבוע, להגדיל את מספר הכביסה על ידי שניים כדי להסיר את שאריות קיבוע ככל האפשר.
  2. הסר את כל PBS שנותרו באמצעות פיפטה והחלף אותה ב~ 150 μL של 1% חומצה אוסמית (OsO4) עד שבלוקי הרקמה שקועים. הניחו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בקופסה חשוכה כדי להגן עליהם מפני אור וחדרו ל-RT למשך שעה אחת.
    הערה: OsO4 הוא מחמצן חזק ויש לטפל בו במכסה אדים.

4. כתמים והתייבשות

הערה: יש להפעיל את מסיר הלחות כדי לייבש את הסביבה משלב זה.

  1. יש להסיר את OsO4 באמצעות פיפטה, לשטוף עם 0.01 M PBS (pH 7.4) 3 x 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף 3 x 10 דקות עם מים נטולי יונים.
    הערה: כדי להבטיח שטיפה מלאה של ROs, אנו ממליצים להשעות את ROs. שאפו את OsO4 לבקבוק פינוי ייעודי.
  2. הסר את שטיפת המים האחרונה שעברה דה-יוניזציה והחלף ב~ 150 μL לכל צינור (להבטיח חדירה מלאה של בלוקי רקמות) של אורניום אצטט וכתם למשך 1-2 שעות ב- RT. הגן על צינורות המיקרוצנטריפוגות מפני אור.
  3. הסר את האורניום אצטט והחלף אותו עם 1 מ"ל של 50% אצטון במכסה האדים, מתייבש במשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמשו ב-70%, 80%, 90%, 100% ו-100% אצטון להתייבשות הדרגתית של ROs ברצף. כל התייבשות נמשכת 10 דקות.
    הערה: השאירו מעט נוזלים כדי להשרות את ROs עבור כל החלפה כדי למנוע חשיפה לאוויר וללחות. בנוסף, לפעול במהירות בהקדם האפשרי כי אצטון הוא נדיף. שאפו אורניום אצטט לבקבוק סילוק ייעודי.

5. הסתננות

  1. השליכו את האצטון והוסיפו ~150 μL של התערובת המורכבת מאצטון ושרף Epon-812 ביחס של 1:1. מכניסים לתנור בטמפרטורה של 18 מעלות למשך שעה.
  2. הסר את התערובת לעיל והחלף אותה בתערובת המורכבת מאצטון ושרף אפון-812 ביחס של 1:4. הכניסו לתנור של 37°C למשך הלילה.
  3. העבירו את ROs לתוך צינורות חדשים המכילים ~ 500 μL של שרף אפוקסי טהור בזהירות ומניחים אותם בתנור 45 ° C למשך 1 שעה.

6. הטבעה

  1. הכן את 30-50 מ"ל של שרף אפוקסי טהור בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל על ידי ערבוב ערכת מגיב על פי הוראות היצרן מראש. סובבו את שרף האפוקסי הטהור באיטיות למשך 30 דקות כדי להפחית את בועות האוויר שמכניס המיקסר. לאחר מכן, השאירו אותו בתנור 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסיפו 2/3 נפח של שרף אפוקסי טהור לחריץ של תבנית ההטבעה.
  2. השתמש קיסם כדי לבחור ROs לתוך תבנית הטבעה מצויד שרף אפוקסי טהור.
  3. ממלאים את החריץ בשרף אפוקסי טהור עד שהוא בולט מעט או בולט.
  4. התאם את מיקום ROs בשני הקצוות של תבנית ההטבעה להטמעה כיוונית. מניחים את תבנית ההטבעה בתנור 45 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות ולאחר מכן מכניסים לתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות.

7. מיקום חצי דק

  1. חולחים את שרף האפוקסי העודף סביב הרקמה מקצות ארבעת הצדדים הארוכים יותר של גוש ההטבעה ליצירת פנים טרפזיות. התקן את בלוק ההטבעה במעמד ההרכבה לדוגמה והברג את הבורג באמצעות מברג L. לאחר מכן, התקן סכיני זכוכית על מעמד הסכין והדק את האגוז באופן ידני.
  2. חותכים את עודפי השרף עד לחשיפת האזור הרצוי.
  3. ממלאים את שוקת סכין הזכוכית במים. חותכים פרוסות דקות למחצה לעובי של 1 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום דק למחצה ומניחים אותן על מגלשת מיקרוסקופ עם מחט.
  4. הוסיפו 50 μL של 1% toluidine blue לצביעת פרוסות דקות למחצה ודגרו במשך דקה אחת ב-95°C על פלטת החימום. יש לשטוף במים מזוקקים במשך 2 דקות. השתמש במיקרוסקופ אופטי רגיל פי 20 כדי לבחון את מבנה המקטעים.

8. חתך דק במיוחד

  1. התקן את בלוקי ההטבעה וסכיני הזכוכית כמתואר בשלב 7.1. התאימו את המרחק בין הסכין לבלוק הרקמות, את רמת הנוזל של הכיור ואת מהירות החיתוך. חותכים את החלקים הדקים במיוחד בעובי של ~70-100 ננומטר עם מיקרוטום דק במיוחד וגורפים את הפרוסות על רשת הנחושת (200 רשת) עם הסרט התומך.
  2. יש לצבוע חלקים דקים במיוחד עם 3% עופרת ציטראט למשך 15 דקות כדי לשפר את הניגודיות בהליך צביעה כפול.

9. ROs הדמיה על ידי TEM

  1. הפעל את התוכנה (ראה טבלת חומרים).
  2. לחץ על כפתור מצב הזיכרון וסמן כל קטע דק במיוחד באופן גס.
  3. חפש מבנים סינפטיים.
    1. להבחין במבנה הלמינציה של ROs בהגדלה נמוכה.
    2. אתר את השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), המראה מבנה גרעיני עם צפיפות אלקטרונים עמוקה יותר. לאחר מכן, לנווט אל המסוף של photoreceptor שבו שלפוחיות רבות מצטברות. חפש את הדקי המוטות עם סרט סינפטי יחיד ואת מסופי החרוט עם סרטים סינפטיים מרובים.
    3. עבור לשכבת הפרספקס הפנימית (IPL) וחפש מבנה דומה עם סרט קטן.
  4. צלם את התמונה המיקרוסקופית.
    1. לחץ על התחל והזן את עוצמת ההגדלה המתאימה.
    2. שמור את התמונות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמת ROs תלת-ממדיים באמצעות התמיינות iPSC מספקת כלי רב עוצמה לחקר מנגנונים של מחלות רשתית וטיפול בתחליפי תאי גזע. למרות שאחרים הדגימו את הקשרים הסינפטיים ב-ROs מבחינה תפקודית ואימונוציטוכימית, עדויות ישירות לסינפסות קונבנציונליות וסרטיות מוגבלות מאוד. כאן אנו מציגים שיטה לחקר מבנה העל של שני סוגים של סינפסות ב- ROs על ידי TEM. לאחר 180 ימי תרבית, ROs תוקנו, הוכתמו, הוטמעו ונפרסו דק במיוחד. תצפית TEM חשפה סינפסות סרט בהדקים האקסונליים של פוטורצפטורים (איור 1 ואיור 2), אשר מפוזרים ב-OPL. תחת TEM, סרטים של מוטות מסתובבים סביב הפלישה הסינפטית, ויוצרים פרופיל בצורת פרסה עם תאים אופקיים (איור 1). למוטות יש בדרך כלל רק סרט אחד, אולם לקונוסים יש סרטים מרובים (איור 2). נוסף על כך, נצפו סינפסות כימיות קלאסיות בין תאים אמקריניים ב-IPL (איור 3). תחת TEM, הסינפסה הכימית מורכבת משלושה חלקים: הקדם-סינפטי, השסע הסינפטי והפוסט-סינפטי. קרומי התא המתאימים לחלקים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים עבים מעט יותר משאר החלקים, והמרווח הצר בין שני הקרומים נקרא שסע סינפטי. ישנן שלפוחיות סינפטיות רבות בציטופלסמה של אתר הממברנה הקדם-סינפטית. מחקר זה מאשר את נוכחותם של קשרים סינפטיים מלאים ב- ROs תלת-ממדיים הנגזרים מ- iPSC. עם זאת, יש לציין כי שטיפה חלקית בין השלבים תוביל למשקעים של חלקיקים שחורים במהלך תהליך הכנת הדגימה (איור 4).

figure-results-1
איור 1: תמונות TEM של סינפסות סרט מוט ב-ROs. (A,B) מוט ותאים אופקיים יוצרים פרופיל בצורת פרסה. סרט יחיד (ראשי חץ) נצפה בכל מוט ב-OPL של ROs, מוקף בשלפוחיות רבות. פסי קנה מידה = 0.2 מיקרומטר. קיצורים: ROs = אורגנואידים ברשתית; HC = תא אופקי; OPL = שכבת פרספקס חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות TEM של סינפסות סרט חרוט ב-ROs. שלוש סינפסות סרט (ראשי חץ) היו ברורות בפדיקור חרוט ב- OPL של ROs. סרגל קנה מידה = 0.2 מיקרומטר. קיצורים: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת; ROs = אורגנואידים ברשתית; OPL = שכבת פרספקס חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תמונת TEM של סינפסות כימיות ב-ROs. סינפסה כימית קונבנציונלית נצפתה בין תאים אמקריניים בשכבת IPL של ROs. הסינפסה הכימית מורכבת משלושה חלקים: הקדם-סינפטי, השסע הסינפטי והבתר-סינפטי. ישנן שלפוחיות סינפטיות רבות בציטופלסמה של אתר הממברנה הקדם-סינפטית. חץ מציין את כיוון השידור הסינפטי, המציין העברה של שלפוחיות רבות מתהליך AC1 אחד לפרופיל AC2 אחר. סרגל קנה מידה = 0.2 מיקרומטר. קיצורים: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת; ROs = אורגנואידים ברשתית; IPL = שכבת פרספקס פנימית; ACs = תאים אמקריניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: דוגמה לבעיה שיכולה להתרחש במהלך תהליך הכנת הדגימה. יש הרבה חלקיקים שחורים (עיגולים) בפדיקור החרוט בגלל שטיפה לא שלמה בין השלבים. חצים: סינפסת רצועת הכלים. סרגל קנה מידה = 0.2 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול מפורט לצפייה באולטרה-מבנה קונבנציונלי וסינפטי של הסרט ב-ROs על ידי TEM. פרוטוקול זה מבוסס על שיטות הכנת הרשתית שתוארו לעיל עם כמה שינויים20. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הטיפול בדגימה ואת האיכות של מיקרוגרפים TEM, שקול את נקודות המפתח הבאות. ראשית, חשוב להכיר בכך שתאי RO מתפתחים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ויוצרים מסת תאים חסרת כלי דם 6,26 ותאי גלייה26. היעדר זה עלול להוביל לארגון פחות קומפקטי בהשוואה לרשתית in vivo. לכן, חיוני לטפל ברוס בעדינות לשמירה על המבנה והשלמות שלהם. הוסיפו נוזלים לאורך דופן הצינור כדי למזער הפרעות.

חשוב להקפיד על התייבשות יסודית של הרקמה בפרוטוקול שלב 4 ולהפעיל את מסיר הלחות כדי להפחית את לחות החדר לפני תחילת שלב ההתייבשות. בעת החלפת אצטון, לפעול במהירות ולהשאיר קצת נוזל כדי לטבול את הרקמה, מניעת הרס חמור של מבנה רקמת RO. רקמה לא מיובשת מתכווצת בחדות בגובה EM גבוה, ומים ברקמה מעכבים את חדירת חומר ההטבעה.

מכיוון ש- ROs קיימים ככדורים שקופים, ודא את הכיוון הנכון בעת חיתוך פרוסות דקות למחצה כדי להשיג מבנים למלריים שלמים. לבסוף, ROs בשלב 3 (בערך אחרי D100-D150) נחשבים בוגרים ובעלי סינפסות אינטגרליות12, וכתוצאה מכך, מומלץ לבצע חקירה של מגעים סינפטיים, כולל סינפסות סרט וסינפסות כימיות, באותם ROs.

למרות הוכחה אולטרה-מבנית מוגבלת של סינפסות RO סופקה במחקרים קודמים, אין פירוט על ההליך המלא של הכנת דגימת RO, כמו גם זיהוי של סוגים שונים של מבנים סינפטיים 12,13,24. קפובסקי ועמיתיו השתמשו בטכניקות שונות כדי לחקור את המאפיינים של ROs המושרים על ידי קווי hPSC שונים בשלבים שונים, כולל מיקרוגרפים אלקטרונים המראים את קיומן של סינפסות סרט עמוסות שלפוחית בפדיקור החרוט, אשר גילו כי ROs בשלב 3 המושרה על ידי קווי hPSC שונים הם בוגרים ופונקציונליים12. באמצעות TEM והדמיית שני פוטונים, Cowan et al. אישרו את היווצרותם של מבנים סינפטיים פונקציונליים ב-ROs13 בוגרים, אך סוג הסינפסה לא צוין (סינפסות חרוט או מוט). עם זאת, מספר קבוצות של תוצאות מיקרוגרף הראו את מבנה הממברנה של סינפסות הסרט עם בהירות וניגודיות אידיאליות, מה שממחיש כי השיטה שלנו אפשרית וניתנת לשחזור. בנוסף, זיהינו סוגים שונים של סינפסות על פי המאפיינים המורפולוגיים השונים שלהן: סינפסות חרוט הן בדרך כלל גדולות יותר ויש להן כמה סרטים, בעוד שסינפסות מוט הן בדרך כלל קטנות יותר, ומציגות רק סרט אחד; בסינפסות כימיות, שלפוחיות מצטברות במבנים הפרה-סינפטיים, וצפיפות האלקטרונים של השסע הסינפטי משופרת.

השלמות האולטרה-מבנית של המגעים הסינפטיים ב- ROs חיונית לתפקודם. העסקת TEM לחקירת מגעים אלה מציעה יתרונות רחבים ומשמעותיים בתחומים שונים, כגון חקר הפתוגנזה של הרשתית במבחנה, ביצוע בדיקות סקר תרופתיות ב- ROs, והערכת טכניקות התמיינות של ROs, בין יישומים אחרים. מוגבל על ידי הדמיה TEM דו-ממדית, רק היבט ספציפי של מבנה העל ROs ניתן לצפייה, מה שהופך את זה מאתגר לנתח את כל המבנה של הסינפסה באופן סטריאוסקופי. בנוסף, גבולות ההתמיינות תורמים לתאים שאינם במקומם13,26, מה שמסבך עוד יותר את תהליך התצפית. לפיכך, שילוב של נפח EM עם שחזור תלת ממדי עשוי להתגבר על חסרונות אלה בעתיד.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019), הקרן למדעי הטבע של סין (82070981).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 מ"מ צלחת פטריקורנינג430167
אצטוןאלקטרונים מיקרוסקופיה מדע10000
B27 תוסףGibcoA3582801
מרים תאיםסנטה קרוזsc-395251
רשתות נחושתבייג'ינג Zhongjingkeyi טכנולוגיה ושות', בע"מ
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.תוכנה
DispaseStemCell Technologies#07913פרוטאז חיידקי
DMEM/F12 בינוניGibco#11320033
עובש הטמעהבייג'ינג Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Epon-812 שרףמיקרוסקופיה אלקטרונית מדע#14900
סרום בקר עוברי (FBS)תעשיות ביולוגיות#04-0021A
גלוטרלדהידמיקרוסקופיה אלקטרונית מדע16020
hiPSCShownin ביוטכנולוגיה ושות 'בע"מRC01001-A
עופרת ציטראטבייג'ינג Zhongjingkeyi טכנולוגיה ושות', בע"מ
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061תחליף L-גלוטמין
מטריג'לקורנינג356234
מיקרוסקופ שקופיתCITOTEST80312-3161
תוסף N2Gibco
Na2HPO4· 12H2OSigma71650רכיב של PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507רכיב של PB/PBS
חומצות אמינו לא חיוניותסיגמא#M7145
מיקרוסקופאופטי מיקרוסקופ ביולוגי משקפתXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
תנורBluepardBPG9040A
מדעמיקרוסקופיה אלקטרונית157-8
פניצילין-סטרפטומיציןGibco#15140-122
מיקרוטום חצי / אולטרה-דקReichert-Jung396649
סיגמא טאורין#T0625
כחול טולואידיןסנגון ביוטקE670105-0100
מיקרוסקופי אלקטרוניםשידורהיטאצ'יH-7500
אורניל אצטטטד פלהCA96049
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמא444203
AZH400HHGZ10592GZ02618 17502048 מעבדת Paraformaldehyde

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Webvision: The organization of the retina and visual. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388(2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746 (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502(2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391(2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482(2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).
  26. Afanasyeva, T. aV., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ribbon Synapses

מאמרים קשורים