פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גידול ביופילם מיקובקטריאלי כמודל לחקר עמידות מיקרוביאלית
במאמר זה
סיכום
תקציר
חיידקים רבים משגשגים בקהילות טבעיות מורכבות, ומפגינים תכונות מפתח של רב-תאיות כגון תקשורת, שיתוף פעולה ותחרות. הביטוי השכיח ביותר של התנהגות רב-תאית חיידקית הוא היווצרות ביופילמים, הקשורים לעתים קרובות לפתוגנים. ביופילמים מציעים מקלט מפני חומרים אנטי-מיקרוביאליים, ומטפחים את הופעתה של עמידות מיקרוביאלית. הפרקטיקה המקובלת של גידול חיידקים בתרביות נוזליות של בקבוקים לנער אינה מייצגת את הצמיחה הפיזיולוגית הנכונה שלהם בטבע, וכתוצאה מכך מגבילה את הבנתנו את הדינמיקה המורכבת שלהם. יש לציין כי הפרופילים המטבוליים והשעתוק של חיידקים השוכנים בביופילמים דומים מאוד לאלה של תאים הגדלים באופן טבעי. הקבלה זו מדגישה את חשיבותם של ביופילמים כמודל אידיאלי למחקר יסודי ותרגומי. מאמר זה מתמקד בשימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאורגניזם מודל כדי להדגים טכניקה לטיפוח ביופילמים כדוריים. הגישה ניתנת להתאמה לנפחי תרבית שונים, מה שמקל על יישומה למטרות ניסוי מגוונות כגון מחקרים מיקרוביאליים. יתר על כן, תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של יכולות יצירת הביופילם של מינים מיקובקטריאליים שונים עם התאמות קלות.
מבוא
חיידקים מסוגלים לשרוד כישויות חד-תאיות; עם זאת, ברוב התנאים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם מתארגנים למימטיקה קהילתית. ביופילם הוא ארגון קהילתי מוכר של חיידקים הנוצרים על ידי תאים מצטברים העטופים במטריצה1 בייצור עצמי. הרכבה כזו היא בעלת חתימות של רב-תאיות מוקדמת ומספקת עמידות גבוהה יותר ללחץ למערכות חיידקים. ביופילמים הם לעתים קרובות סובלניים לאנטי-מיקרוביאליים, ומעריכים כי הם אחראים לכמעט 80% מהזיהומים המיקרוביאליים 2,3.
שייק בקבוקים ותרביות מבוססות צלחות היו באופן מסורתי השיטות הרגילות לגידול חיידקים. ניתן לייחס את המקובלות וההצלחה העצומות שלהם לקלות הטיפול, יכולת השחזור והמדרגיות שלהם. עם זאת, היעדר הקשר פיזיולוגי מגביל את הפוטנציאל התרגומי של הידע שנוצר באמצעות מערכות כאלה4. לכן, ביופילמים הופכים למערכת מודל אטרקטיבית לחקר פתופיזיולוגיה חיידקית. ביופילמים מספקים מערכת מודל דינמית, המשקפת באופן הדוק תנאים טבעיים, ומאפשרת לחוקרים לשכפל היבטים פיזיולוגיים כגון שיפועים תזונתיים והטרוגניות מרחבית 5,6.
אורח החיים של הביופילם רלוונטי במיוחד במחקרים מיקובקטריאליים, שכן מיקובקטריה, כולל Mycobacterium tuberculosis הידוע לשמצה, הם יוצרי ביופילם מיומנים7. היכולת שלהם לשגשג בתוך ביופילמים תורמת להתמדה שלהם ברקמות המארחות במהלך זיהומים. הוא מציב אתגר עצום בטיפול במחלות מיקובקטריאליות, בהתחשב בעמידות האינהרנטית לאנטיביוטיקה הקשורה לאורח חיים של ביופילם8. ביופילמים מספקים גם מערכת מודל אידיאלית לחקר מטבוליזם מיקובקטריאלי, שכן הם מאפשרים לחקור את ההתאמות המטבוליות הייחודיות ואת אסטרטגיות ניצול החומרים המזינים המשמשות מיקובקטריה בתוך קהילות מיקרוביאליות מורכבות9.
בעוד שהביופילם מתקבל יותר ויותר כמודל טוב יותר למחקרים מיקובקטריאליים10, יש צורך בהליכי פעולה סטנדרטיים עקביים וניתנים לשחזור, במיוחד כדי ליצור הקבלה בין מחקרים שנערכו במעבדות שונות. השיטה המתוארת כאן מתארת הליכי היווצרות ביופילם עבור מין מיקובקטריאלי, M. smegmatis. M. smegmatis הוא מודל נגיש יותר לחקר ביופילמים מיקובקטריאליים, בהתחשב באי-פתוגניות שלו ובקינטיקה מהירה יותר של היווצרות ביופילם. ניתן לשנות את השיטה כך שתתאים ליישומים כמו סינון אנטי-מיקובקטריאלי, מיצוי מטבוליטים ומחקרי אומיקס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. ההכנה התקשורתית של סאוטון
- הכן 50 מ"ל של 2.5% אשלגן dihydrogen פוספט פתרון על ידי שקילה בזהירות 1.25 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט להמיס אותו ב 50 מ"ל של מים deionized.
- הכינו 50 מ"ל של תמיסת מגנזיום גופרתי 2.5% על ידי שקילת 2.56 גרם מגנזיום גופרתי והמסתו ב 50 מ"ל של מים נטולי יונים.
- הכן 10 מ"ל של תמיסת ציטראט אמוניום ברזל 5% על ידי שקילת 0.5 גרם ברזל אמוניום ציטראט והמסתו ב -10 מ"ל של מים נטולי יונים. אחסנו אותו בשפופרת ענבר.
- הכינו 100 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% על ידי שקילת 20 גרם גלוקוז והמסתו ב -100 מ"ל מים נטולי יונים. יש לסנן-לעקר באמצעות מזרק סטרילי בנפח 50 מ"ל ומסנן מזרק PVDF בגודל 0.2 מיקרומטר בצינור.
- הכן 10 מ"ל של תמיסת אבץ גופרתי סטרילית 1% על ידי שקילה זהירה של 0.1 גרם אבץ גופרתי והמסתו ב -10 מ"ל של מים נטולי יונים. יש לסנן-לעקר באמצעות מזרק סטרילי בנפח 10 מ"ל ומסנן מזרק PVDF בגודל 0.2 מיקרומטר במכסה המנוע הלמינרי.
- ערבבו את הרכיבים המוכנים ב-750 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה כמתואר בטבלה 1. מדוד את ה- pH של התמיסה והתאם אותו ל -7. לפצות את נפח ל 900 מ"ל עם מים deionized.
- Autoclave את המדיה ב 15 PSI ו 121 ° C במשך 15-20 דקות. תנו לו להתקרר. לאחר מכן, הוסף 100 μL של 1% אבץ גופרתי מעוקר במסנן. מוסיפים 100 מ"ל של 20% גלוקוז מעוקר במסנן וממיסים אותו היטב.
2. הכנת מסנן מעוקר 5% Tween-80
- להמיס 0.5 מ"ל של Tween-80 ב 9.5 מ"ל של מים deionized.
- סנן-חיטוי התמיסה באמצעות מזרק סטרילי 10 מ"ל ומסנן מזרק PVDF 0.2 מיקרומטר במכסה המנוע הלמינרי.
3. הכנת התרבות הראשונית
- במכסה המנוע הלמינרי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי לחלק 2 מ"ל של מדיה LB autoclaved לתוך שתי מבחנות סטריליות 14 מ"ל.
- הוסף 20 μL של 5% Tween-80 מעוקר מסנן למבחנות באמצעות micropipette.
- חסן את M. smegmatis לתוך אחת הצינורות על ידי הוספת מלאי ההקפאה שלה באמצעות לולאת חיסון. המבחנה השנייה משמשת כבקרת מדיה.
- לדגור את הצינורות במשך 48 שעות באינקובטור שייקר ב 300 סל"ד ו 37 ° C.
הערה: צינור בקרת המדיה לא אמור להראות גידול.
4. הכנת התרבות המשנית
- במכסה המנוע הלמינרי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי לחלק 2 מ"ל של מדיה LB autoclaved לתוך שתי מבחנות סטריליות 14 מ"ל.
- הוסף 20 μL של 5% Tween-80 מעוקר מסנן למבחנות באמצעות micropipette.
- הוסף 20 μL של התרבית הראשונית לאחד הצינורות באמצעות micropipette. שמור את הצינור השני כפקד מדיה.
- דוגרים על התרביות באינקובטור שייקר ב-300 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס עד שהן מגיעות ל-OD600 של 0.6 עד 0.8.
הערה: בדרך כלל לוקח 12 עד 14 שעות להגיע ל- OD600 של 0.6 עד 0.8. ניתן להשתמש גם בצפיפויות תאים אחרות, אך ערך OD600 מוגדר מסייע במחקרים השוואתיים.
5. הגדרת הביופילם
- במכסה המנוע הלמינרי, יש לפזר 6 מ"ל של מדיה של סאוטון בתוספת 2% גלוקוז לכל באר של צלחת 6 בארות באמצעות פיפטה סרולוגית.
- לחסן את הבארות בהתאמה עם 120 μL (כלומר, 2%) של החיסון המשני באמצעות micropipette. שמור אחד לא מחוסן היטב כמו בקרת מדיה.
- מערבבים את המדיה והתרבות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל. מכסים את המכסה ואוטמים בזהירות את הצלחת בסרט פרפין.
- לדגור את הצלחת ללא הפרעה באינקובטור סטטי ב 37 ° C במשך 7 ימים.
6. הגדרת ביופילמים לתצפיות תלויות שלב
הערה: הגדרת הביופילם הכוללת זהה לזו המתוארת בשלב 5. כדי לקצור או לצלם ביופילם בנקודות זמן שונות, מוצע שאותו ביופילם יוצב במספר סטים על לוחות נפרדים.
- כדי לצפות בביופילמים בין היום השלישי ליום השישי, הכינו ארבע צלחות בתנאים זהים והשתמשו בצלחת אחת ביום להדמיה.
הערה: שכבת הביופילם מתחילה להופיע בממשק אוויר-תווך החל מהיום השלישי של הגדרת הלוחות.
7. הערכת התפתחות הביופילם
- הערכה חזותית
- דמיינו את הלוחות באמצעות מערכת תיעוד ג'ל עם תאורת אור אפי-לבן (איור 1).
הערה: הדמיה נותנת הערכה איכותית וכמותית של הביופילם שנוצר. כל מצלמה באיכות טובה יכולה לשמש כחלופה.
- דמיינו את הלוחות באמצעות מערכת תיעוד ג'ל עם תאורת אור אפי-לבן (איור 1).
- הערכת משקל יבש
- בצע מדידת משקל יבש לכימות מדויק יותר.
- כדי למדוד משקל יבש, התחל בשקילת נייר ניקוי.
הערה: ניתן להשתמש גם בנייר סינון במקום נייר ניקוי. - חלצו את הביופילם מצלחת 6 הקידוחים והעבירו אותו לנייר בעזרת מרית.
- אספו בזהירות את רוב הביופילם מהתרבות, והיזהרו שלא להעביר כמויות מוגזמות של המדיה לעיתון.
- הניחו את הביופילם על נייר הניקוי.
- מניחים אותו באינקובטור ב 50 ° C למשך 0.5-1 שעות עד שהביופילם מתייבש לחלוטין.
- מדוד את המשקל המשולב של הנייר והביופילם.
הערה: משקל יבש של ביופילם=(משקל ביופילם + נייר)-(משקל נייר)
8. בדיקת סבילות לאנטיביוטיקה בביופילמים
- העריכו את MIC90 של ריפמפיצין בתרבית הפלנקטונית של M. smegmatis בהתאם לפרוטוקול שתואר על ידי אירית ויגנד ואחרים באמצעות המדיה של סאוטון11. מוסיפים את האנטיביוטיקה כאשר התרביות מגיעות ל-OD600 של 0.2.
- הגדר את הלוחות לגידול ביופילם כמתואר בשלב 5 של הפרוטוקול.
- ביום הרביעי של הדגירה מוסיפים ריפמפיצין לתרביות בריכוז MIC90 (64 מק"ג/מ"ל) מצידי הבאר באמצעות מיקרופיפטה במכסה המנוע הלמינרי.
הערה: עשו זאת בזהירות מבלי להפריע יותר מדי לביופילם. השאירו את אחת הבארות עם ביופילם ללא טיפול. - מערבלים לאט את הצלחות כדי לערבב את האנטיביוטיקה.
- מכסים את דפנות הצלחות בסרט פרפין ושומרים אותם באינקובטור להמשך צמיחה.
- לאחר 24 שעות, הסירו את הלוחות ממכסה המנוע הלמינרי והוסיפו את Tween-80 לריכוז סופי של 0.2% בכל הבארות המכילות ביופילם.
- שוב, לכסות את הצלחות עם סרט פרפין ולשמור אותם ב 4 ° C ו 100 סל"ד במשך 12 שעות.
- הוציאו את הצלחות במכסה מנוע למינרי והומוגניזציה של המרכיבים עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל.
- שטפו את המרכיבים במדיה של סאוטון באמצעות הפרוטוקול המתואר ב-Anand et al.12.
- לבסוף, להשעות מחדש את התאים במדיה של 6 מ"ל סאוטון ולדלל לריכוזים סופיים של 10-4, 10-5, 10-6 ו-10-7.
- מורחים 100 μL מכל דילול על לוחות LB-agar באמצעות חרוזי זכוכית אוטוקלאביים.
- אוטמים את כל הצלחות באמצעות סרט פרפין ושומרים אותם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר 3 ימי דגירה, ספרו מושבות על כל צלחת. קחו בחשבון רק את הצלחות עם ספירת מושבות בין 30 ל -300.
- חשב CFU/מ"ל ואת הירידה היחסית ב- CFU/מ"ל באמצעות הנוסחאות שסופקו13.
הערה: CFU/מ"ל = (מס' מושבות × גורם דילול) / (מצופה נפח (במ"ל))
ירידה יחסית ב- CFU/mL = (CFU/mL ב- Untreated - CFU/mL ב- Tréated)) / ((CFU/mL ב- Untreated)) × 100
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדורי ביופילם הופכים גלויים לעין בלתי מהיום השלישי ואילך. למרות שביופילם גדל על המדיה של סאוטון ללא 2% גלוקוז, נצפה שיפור ברטיקולציה כאשר הוא הוסף. השגנו 10.48 מ"ג ± 3.13 מ"ג (n = 4) של משקל יבש של ביופילם מכל באר של צלחת 24 בארות עם 1.5 מ"ל של מדיה של סאוטון (בתוספת 2% גלוקוז) גדל במשך ארבעה ימים. באיור 2, התפתחות הביופילם נראתה מהיום השלישי עד היום השישי. הוא מתחיל ליצור סרט עם רטיקולציה קלה ביום 3, וביום 5 הוא כבר בשל לחלוטין. מהיום השישי ואילך, הביופילם מתחיל להתפורר. MIC90 של ריפמפיצין ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אורח החיים הרב-תאי של מיקרובים תואר לפני כמעט מאה שנה; עם זאת, המחקרים הקליניים נותרו דלילים, בעיקר בשל היעדר שיטות חזקות14. שיטות המתוארות בעבודות על ביולוגיה של ביופילם הן לעתים קרובות קשות להסתגלות. כאן, המתודולוגיה המפורטת, בסיוע הדגמות של צעדים קריטיים, צפויה לשפר את יכולת השחזור של הפרוטוקולים.
שיטת ייצור הביופילם המתוארת במאמר זה ניתנת להרחבה, ודורשת גידול פרופורציונלי בנפח בינוני ובגודל החיסון. יישומים כמו מיצוי מטבוליטים דורשים...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת DBT-Ramalingaswami שהוענקה לעמית אנאנד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 ומיקרו; מסנן מזרק M PVDF | Axiva | SFNY04 R | |
| 1 מ"ל טיפים | Genetix | GXM-611000 C | |
| 10 ומיקרו; טיפים | L Genetix | GXM-6110 C | |
| 200 ומיקרו; L טיפים | Genetix | GXM-61200C | |
| 6 בארות לוחות פוליפרופילן | Tarsons | 980010 | |
| צינורות ענבר | Tarsons | 546051 | |
| Autoclave | Hospharma | ||
| Biosafety Cabinet A II | MSET | ||
| נייר ספיגה | כל ספק | ||
| צנטריפוגה | Eppendorf | ||
| חומצת לימון | Sigma | 251275 | |
| Cuvettes | Bio-Rad | 2239955 | |
| ברזל אמוניום ציטראט | |||
| תיעוד ג'ל | Bio-Rad | ||
| חרוזי זכוכית | סיגמא | G8772 | |
| גלוקוז | סיגמא | 49139 | |
| גליצרול | Sigma | G5516 | |
| לולאות חיסון | Genaxy | HS81121C | |
| L-Aspargine | Sigma | A0884 | |
| LB-agar | Himedia | M1151 | |
| LB-media | Himedia | M575 | |
| M. smegmatis mc2155 מלאי קריו | ATCC | 700084 | |
| מגנזיום גופרתי | סיגמא | M2643 | |
| מיקרופיפטות | גילסון | ||
| פרפילם | טרסונס | ||
| צלחת פטרי | טרסונס | 460020 | |
| מד pH | Labman Scientific Instruments | ||
| קורא צלחות | מבחנות Tecan | ||
| פוליפרופילן | Genaxy | GEN-14100-PS | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא | P5379 | |
| ריפמפיצין | MedchemExpress | HY-B0272 | |
| פיפטה סרולוגית | SPL מדעי החיים | 95210 | |
| חממת שייקר | אפנדורף | ||
| מרית | |||
| ספקטרופוטומטר | תרמו סיינטיפיק | ||
| חממה סטטית | CARON | ||
| מזרק סטרילי 10 מ"ל בקטון | דיקינסון | 309642 | |
| סטרילי 50 מ"ל | בקטון דיקינסון | 309653 | |
| Tween-80 | Sigma | P1754 | |
| איזון שקילה | Sartorius | ||
| אבץ גופרתי | Sigma | Z0251 |
מקורות
- Davey, M. E., O'toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).
- Hernández-Jiménez, E., et al. Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer. Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
- Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).
- Keating, T., et al. Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation. Cell Surf. 7, 100065(2021).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).
- Dietrich, L. E. P., et al. Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state. J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).
- Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms. J Vis Exp. (60), e3820(2012).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Anand, A., et al. Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches. Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).
- Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements (2019).
- Høiby, N. A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections. Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).
- Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482. bioRxiv. , (2023).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. (47), e2437(2011).
- Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
