מאמר שיטה

טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר דינמיקה תאית בסקאלות דגי זברה

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 בינואר 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקר דינמיקה תאית באמצעות טכניקה פשוטה של תרבית חוץ גופית . הוא מספק הזדמנות לחוקרי דגי זברה ולמחנכים לחקור תהליכים תאיים, כגון אלה הקשורים להומאוסטזיס עצם ולביולוגיה בסיסית של התא, על ידי הדמיה של גרעינים פלואורסצנטיים ותאים אפופטוטיים בתוך הקשקשים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קשקשי דגי זברה מציעים מגוון יתרונות לשימוש במעבדות סטנדרטיות למטרות הוראה ומחקר. הקשקשים נאספים בקלות ללא צורך בהמתת חסד, מתחדשים תוך מספר שבועות, והם שקופים וקטנים, מה שמאפשר לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי. קשקשי דגי זברה שימושיים במיוחד בסביבות חינוכיות, מכיוון שהם מספקים הזדמנות ייחודית לתלמידים לעסוק בחוויות למידה מעשיות, במיוחד בהבנת דינמיקה תאית ושיטות גידול חוץ גופיות . מטרתו העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לאיסוף ותחזוקה של קשקשי דגי זברה בתרבית לשימוש במגוון מחקרים ביולוגיים באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. בנוסף, הפרוטוקול מפרט את השימוש בהם בהבנת הומאוסטזיס עצם על ידי בחינת הפעילות של תאי עצם המעורבים בספיגת עצם ושיקוע. הוא כולל גם פרוטוקולים נוספים לטכניקות כלליות, כגון הדמיה של גרעינים ותאים אפופטוטיים. פרוטוקול תרבית חוץ גופית מפיק תוצאות אמינות עם מינימום ריאגנטים וציוד. מאמר זה דן ביתרונות של שימוש בתרביות חוץ גופיות של קשקשי דגי זברה כדי לטפח חקירה מדעית ומתאר את המשאבים הדרושים לתמיכה בשילובם במסגרות חינוכיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, דגי זברה (Danio rerio) התגלו כאורגניזם מודל רב ערך בתחומים מדעיים שונים, כולל גנטיקה, ביולוגיה התפתחותית וטוקסיקולוגיה 1,2,3. דגי זברה הם דגי מים מתוקים טרופיים קטנים שמקורם בנהרות דרום מזרח אסיה4. הם הפכו לאורגניזם מודל פופולרי בביולוגיה בשל תחזוקתם הקלה, גודלם הקטן, מחזור הרבייה המהיר והעוברים השקופים1. זה מאפשר התבוננות קלה בהתפתחות הפנימית שלהם, מה שהופך אותם אידיאליים לחקר תהליכים ביולוגיים שונים בביולוגיה התפתחותית. דגי זברה חולקים דמיון גנטי עם בני אדם; כ -70% מהגנים האנושיים יש לפחות מקבילה אחת של דגי זברה, מה שהופך אותם למודל מצוין לחקר הפרעות גנטיות ומחלות בבני אדם 5,6. על ידי מניפולציה של גנים ספציפיים בדגי זברה, חוקרים יכולים לקבל תובנות יקרות ערך על תפקודם והתנהגותם של גנים, אשר לאחר מכן ניתן ליישם במחקר בריאות האדם6, עריכת גנים, ויצירת קווים טרנסגניים 7,8.

קשקשי דגי הזברה מתחדשים לאחר הסרה 9,10 וניתן לגדל אותם בתרבית במשך יום עד שלושה ימים עם אינקובטור בסיסי (שאינו CO2) בזמן שהם משמשים לניסויים11. השימוש בקשקשים של דגי זברה הוא יתרון במעבדות בסיסיות מכיוון שניתן להסיר אותם מדגים מורדמים ללא צורך בהמתת חסד. קשקשי דגי זברה הם מרכיב בשלד העורי, המורכב בעיקר משתי שכבות: השכבה הפנימית, שהיא עבה ועשויה מרקמה מינרלית חלקית הנוצרת על ידי שכבות של סיבי קולגן, והשכבה החיצונית, שהיא מינרליזציה גבוהה ומכילה רשת של סיבי קולגןשזורים 12,13 (איור 1A-C). תכונות מורפולוגיות ותאיות אלה של הסולם נצפות בקלות תחת מיקרוסקופ מורכב סטנדרטי. מאפיינים אלה הופכים את קשקשי דגי הזברה למודל טוב לחקר תאים ומולקולריים. לדוגמה, קשקשי דגי זברה שימשו לחקר הומאוסטזיס עצם, כולל פעילות תאי עצם11,12. הם שימשו גם להבנת התחדשות רקמות 9,14,15, מסלולי גניםואיתות 14,16, מטבוליזם17, מחקרי מיקרוביוטה18 ועוד. דגי זברה, בדומה לטלאוסטים אחרים, רגישים מאוד גם לגורמים סביבתיים כגון מזהמים ורעלים 19,20,21,22. לכן, קשקשי דגים משמשים לחקר חשיפות לרעלים באוכלוסיות דגים. מאפיינים אלה הופכים את הסולמות למודל מצוין להוראת תלמידים על ההשפעות של גורמים סביבתיים על אורגניזמים חיים. בנוסף, סולמות מקווי דגי זברה טרנסגניים, כגון Tg (osterix:mCherry) ו-Tg (runx2a:GFP), יכולים להוסיף רמה נוספת של מורכבות לניסויי סטודנטים.

לסיכום, באמצעות שימוש בקשקשים של דגי זברה, חוקרים יכולים לתכנן ולערוך ניסויים כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה, ממנגנונים תאיים ועד שינויים סביבתיים. דגי זברה הם גם משאב יקר ערך בהשכלה הגבוהה מכיוון שהם יכולים לספק חוויות מעשיות בתכנון ניסויים, איסוף נתונים וניתוח. דגי זברה יכולים לשמש גם בקורסים מתקדמים ובתוכניות ממוקדות מחקר כדי לחקור תחומי עניין ספציפיים. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשימוש בקשקשים של דגי זברה בסביבות מחקר ולמידה בכיתה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן עוקבים אחר הנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו מדי שנה על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת סנט מרי / אוניברסיטת הר סנט וינסנט תחת פרוטוקולים מספר 20-14 ו- 21-12. לפני ביצוע פרוטוקול זה, על המשתמשים לוודא כי הנחיות פדרליות ומחוזיות לשימוש בבעלי חיים במחקר או בהוראה נשמרות23. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים לתרבות בקנה מידה

  1. הכינו מדיום DMEM עם HEPES (10 גרם אבקת DMEM, 5.95 גרם HEPES, ב 1 ליטר מים מזוקקים או dH2O, pH: 6.91), aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.
  2. הכינו את מדיום התרבית - פתרון עבודה (88% DMEM בינוני עם HEPES, 10% נסיוב בקר עוברי ו-2% פניצילין-סטרפטומיצין [5000 יחידות פניצילין ו-5 מ"ג סטרפטומיצין למ"ל] מותאם לנפח הדרוש ביום ביצוע הניסוי.
    הערה: יש להכין את פתרון העבודה טרי מדי יום ולא ניתן לאחסן אותו. יש לשמור את מדיום התרבית קר (ב 4 ° C או על קרח) עד לשימוש.
  3. Aliquot, פתרון העבודה של מדיום התרבית, לתוך המכולות שבהן יבוצע הניסוי. במקרה זה, 0.2 מ"ל צינורות או צלחת 96 באר שימשו. יש לשמור את האליציטוטים הללו על קרח עד לצורך.
    הערה: פתרון זה צריך להיות מוכן טרי ולא ניתן לאחסן אותו במשך יותר מיום אחד. עיין בטבלה 1 עבור כל הריאגנטים.

2. הסרת קשקשים מדגים חיים

  1. הכינו מיכל או מכל לדגי הזברה בנפח מים של כ-2 ליטר עבור 4-5 דגים בוגרים.
    הערה: הפרמטרים האופייניים של המים המתאימים לדגי זברה הם pH 7.5, טמפרטורה 28.5 מעלות צלזיוס, מוליכות 640-781 μS ומחזור אור כהה של 12-12 שעות. ודא כי הטמפרטורה נשמרת כל הזמן במיכל.
  2. השתמשו ברשת דגים כדי ללכוד 4-5 דגי זברה בוגרים והניחו אותם במיכל האחיזה של דגי הזברה שהוכן למעלה.
  3. הכינו מיכל עם לפחות 60 מ"ל מים שבו הדגים יהיו מורדמים.
    הערה: הדגים חייבים להיות מסוגלים לנוע במיכל ולהיות עמוקים מספיק כדי למנוע מהם לקפוץ החוצה. מיכל זה צריך להכיל 0.01% טריקאין מתאן-סולפונט חוצץ (MS222), אשר צריך להיות מורכב ממי דגי זברה (לדלל 0.1% MS222, אשר מוכן עם 0.3 גרם של MS222, 615 μL של 1 M NaOH ב 300 מ"ל של מערכת המים של דגי זברה, עשר פעמים).
    זהירות: אנשים המבצעים ניסויים אלה חייבים לקבל את אישור המועצה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים כדי לתפוס, להרדים ולטפל בדגי זברה. באופן דומה, חומר ההרדמה המשמש הוא ריכוז נמוך של טריקאין מתאן-סולפונט (MS222), שהוא כימיקל נפוץ בביולוגיה של דגים אך כזה הדורש טיפול נאות, כגון ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה (עיין בגיליון נתוני הבטיחות של MS222 לקבלת מידע נוסף).
  4. הכינו מיכל התאוששות עם אותם מפרטים שבהם נעשה שימוש קודם לכן בשלב 1 (לפחות 2 ליטר מים) שבו הדגים יוצבו לאחר הסרת האבנית. מיכל זה צריך להיות מספיק מקום ואת הפרמטרים הנכונים מים, כפי שצוין לעיל.
  5. באמצעות רשת, העבר בזהירות דג זברה בוגר יחיד למיכל עם 0.01% MS222. המתן עד שהדג אינו נייד לחלוטין ויש לו תנועה אופרקולרית מינימלית (זה בדרך כלל לוקח פחות מ -10 דקות).
    הערה: כל השלב הזה מתבצע דג אחד בכל פעם. אין להרדים את הדג הבא עד שהקשקשים הוסרו בהצלחה מהדג המטופל ועד שהדג הועבר למיכל ההתאוששות.
  6. הניחו בנפרד את דג הזברה הבוגר על צלחת פטרי הפוכה מרופדת במגבת נייר רטובה.
  7. תחת מיקרוסקופ מנתח ובאמצעות מלקחיים עדינים, להסיר מקסימום של 10-12 קשקשים מדג בודד. הקשקשים מוסרים מהאזור הצידי של הדג, שבו הקשקשים גדולים יותר ויש להם גודל קבוע יותר בהשוואה לחלקים אחרים של הגוף (איור 2). ניתן להשתמש בשני צידי הדג.
    1. הסר את הקשקשים אחד בכל פעם על ידי משיכה עדינה בכיוון הטבעי של הסולם (כלומר, בכיוון מקדמי לאחורי). זה צריך להיעשות מהר ככל האפשר.
  8. מקם כל סולם בנפרד בצינור נפרד של 0.2 מ"ל המכיל את תרבית האבנית פתרון עבודה בינונית (שהוכן בשלב 1.1) כדי למנוע את התפרקות הקשקשים. צלחת 96 בארות יכולה לשמש כחלופה.
    הערה: בידוד של מאזניים בודדים בצינורות או בארות נפרדים מונע מהקשקשים להידבק זה לזה ומאפשר מעקב אחר מאזניים בודדים שעשויים להידרש לניסויים מרובים.
  9. אם הניסוי הספציפי דורש טיפול בקנה מידה, יישם אותו בשלב זה. לקבלת דוגמאות של פרוטוקולים מסוימים, עיין בשלבים 4 ו- 5.
  10. שים את הצינורות עם הקשקשים בתוך אינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס. מדיום התרבות צריך להיות שונה כל 24 שעות (עם פתרון מדיום תרבות עבודה). אינקובטור שאינו CO2 שימש לניסויים המתוארים כאן.
  11. לאחר הסרת האבנית, יש להחזיר בזהירות את דגי הזברה למיכל ההתאוששות ולפקח עד לחידוש התנועה. פיפטה או אבן אוורור משמש כדי לספק אוויר במיכל כדי להאיץ את ההתאוששות.
  12. לאחר חידוש התנועה, החזירו את דגי הזברה למיכל גידול רגיל. זכרו לשמור על הדגים ששימשו בנפרד מכל דג אחר, כדי שיוכלו להתאושש בנפרד ולעקוב אחר אילו דגים מחדשים באופן פעיל את הקשקשים שלהם.
  13. המתן ~ שבועיים לפני שתחזור על הסרת אבנית מאותם דגים. זה מאפשר להם זמן לחדש את הקשקשים שלהם באופן טבעי.

3. קיבוע קשקשים

  1. שטפו את הקשקשים שלוש פעמים עם 200 μL של 1x של מלח חוצץ פוספט (PBS) מוכן מ 10x PBS (עבור 1 L, להוסיף 80 גרם של NaCl, 2 גרם של KCl, ו 11.2 גרם של Na2HPO4, להוסיף dH2O עד 1 L).
  2. הסר את PBS 1x והוסף 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) למשך הלילה ב 4 ° C. עבור 100 מ"ל של PFA, להוסיף 4 גרם של paraformaldehyde ו 0.1 גרם של NaOH, ולאחר מכן להוסיף 1x PBS עד 100 מ"ל. מערבבים על פלטה חמה המוגדרת לאש נמוכה ומערבבים עד שהתמיסה נקייה, ואז מניחים לתמיסה להתקרר ולייצב את רמת החומציות ל-7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 1).
  3. לאחר הקיבוע, לשטוף את הקשקשים שלוש פעמים עם 200 μL של 1x PBS. אחסנו את הקשקשים בטמפרטורה של 4°C.
    אזהרה: PFA מזיק. עיין בגיליון נתוני הבטיחות לקבלת מידע נוסף. כל התהליכים הללו דורשים טיפול מתאים, כגון ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה.

4. הומאוסטזיס עצם

הערה: שני הליכים הומאוסטזיס עצם מתוארים להלן. חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP) וצביעת פוספט אלקליין (AP) משמשים בדרך כלל לזיהוי אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים פעילים, בהתאמה. אוסטאוקלסטים סופחים מחדש את מטריצת העצם ואילו אוסטאובלסטים מפקידים את מטריצת העצם. AP הוא האנזים העיקרי המשתחרר על ידי אוסטאובלסטים במהלך היווצרות עצם, בעוד TRAP מופרש על ידי אוסטאוקלסטים לתוך החלל החומצי בין האוסטאוקלסטים לבין מטריצת העצם, ומסייע בפירוק עצםוספיגה 24,25,26. פרוטוקול זה זמין גם ברשת המידע של דגי הזברה27ופורסם בעבר28. פוספטאז אלקליין הוא אנזים המיוצר על ידי סוגי תאים מרובים כחלק מהתהליך המטבולי. תהליך זה אינו ספציפי לחלוטין לאוסטאובלסטים, אך ברקמת העצם הוא משמש כסמן לתפקוד אוסטאובלסטים.

  1. צביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP)
    1. מניחים כל אבנית קבועה לתוך צינור 0.2 מ"ל או צלחת 96 באר עם 200 μL של dH2O. שטפו את הקשקשים על ידי הוספה והסרה של כ-150 μL של dH2O למשך 15 דקות שלוש פעמים. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 2).
    2. הסר את הקשקשים מצינור 0.2 מ"ל או באר והנח אותם בצינור חדש המכיל 200 μL של חיץ טרטרט 50 mM. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      1. עבור 100 mM של חיץ טרטרט, להכין מיכל זכוכית, להוסיף 2.3 גרם של חומצה טרטרית, ומערבבים אותו עם 0.2 M אצטט חיץ (pH 5.5) עד 100 מ"ל של פתרון. יש לערבב היטב ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. כדי להכין מאגר טרטרט של 50 mM, הוסף נפחים שווים של dH2O ו- 100 mM tartrate buffer. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 3 וטבלה 4).
    3. הסר את חיץ הטרטרט מהצינור והוסף 200 μL של תמיסת מצע TRAP. לדגור על הדגימות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודא שהדגימות נשארות בחושך.
      1. הכינו מיכל זכוכית כהה והוסיפו 30 מ"ל של 100 מ"ל חיץ טרטרט 100 מ"ל, 1 מ"ל של PRS הקסאזוטי (תמיסת הידרוכלוריד פאררוזאנילין) ו-2 מ"ל של תמיסת מצע אנזים. מערבבים היטב.
        הערה: לא ניתן לאחסן פתרון זה; יש לשמור אותו בחושך בטמפרטורת החדר בזמן השימוש. לקבלת הפתרונות הדרושים להכנת פתרון מצע TRAP, ראה קובץ משלים 1 (טבלאות 5-9).
    4. הסר את תמיסת מצע TRAP ושטוף את הקשקשים על ידי הוספה והסרה של כ- 150 μL של dH2O למשך 15 דקות, שלוש פעמים.
    5. הסר את הקשקשים מן הצינור ומניחים אותם לתוך צינור חדש או באר עם 200 μL של 80% גליצרול (עבור 100 מ"ל, לערבב 80 מ"ל של גליצרול עם 20 מ"ל של dH2O) עטוף ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה ולאחסן אותם ב 4 ° C.
    6. כדי לדמיין את הקשקשים מתחת למיקרוסקופ, השתמש שקע או שקופית קעורה.
  2. צביעת פוספט אלקליין (AP)
    1. מניחים כל אבנית קבועה בצינור 0.2 מ"ל או צלחת 96 בארות עם 200 μL של dH2O ושוטפים אותם על ידי הוספה והסרה של כ -150 μL של dH2O למשך 15 דקות, שלוש פעמים. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 2).
    2. הסר את הקשקשים מהצינורות או הבארות של 0.2 מ"ל והכנס אותם לצינור חדש המכיל 200 מיקרוליטר של חיץ tris-maleate ודגור עליו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      1. עבור מאגר זה, להכין מיכל זכוכית ולהוסיף 0.605 גרם של חיץ tris ו 0.55 גרם של חומצה maleic. מוסיפים dH2O עד 25 מ"ל ומערבבים היטב. התייצב ל- pH 8.3. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 10).
    3. הסר את חיץ tris-maleate מהצינור והוסף 200 μL של תמיסת מצע AP. דוגרים עליו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודא שהדגימות נשארות בחושך.
      1. עבור פתרון זה, להכין מיכל זכוכית כהה, להוסיף 8 מ"ג של מלח diazonium, ומערבבים אותו עם 0.1 מ"ל של napthol-AS-TR-פוספט ב N,N-dimethylformamide, ו 10 מ"ל של חיץ tris-maleate (pH 8.3), מערבבים היטב. הכינו פתרון זה טרי. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 11).
    4. הסר את תמיסת מצע AP ושטוף את הקשקשים על-ידי הוספה והסרה של 200 μL של dH2O למשך 15 דקות, שלוש פעמים.
    5. הסר את הקשקשים מהצינור והכנס אותם לצינור חדש או לבאר עם 200 μL של 80% גליצרול עטוף ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
    6. כדי לדמיין את הקשקשים באמצעות מיקרוסקופ, מקם את הקשקשים על שקופית קעורה או שקע.
      זהירות: רוב הריאגנטים המשמשים בצביעת TRAP ו-AP עלולים להזיק. עיין בגיליון נתוני הבטיחות עבור כל כימיקל. כל ההליכים הללו דורשים טיפול מתאים, כגון ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה.

5. הדמיה של דינמיקה תאית בקשקשים של דגי זברה

הערה: ניתן להשתמש במגוון שיטות צביעה כדי להמחיש הבדלים בין קני מידה ולתייג תאים בתוך הסולם (איור 3B). לדוגמה, שיטות להכתמת גרעינים וליזוזומים בתוך תאי הסולם מתוארות להלן.

  1. צביעת DAPI לתצוגה חזותית של גרעיני תאים
    הערה: DAPI משמש לסימון הגרעינים של כל התאים על-ידי תיוג הדנ"א. DAPI הוא סמן פלואורסצנטי שנקשר בחוזקה לאזורים מועשרים באדנין ותימין ברצפי DNA.
    1. לפני השימוש ב- DAPI, ודא שהקשקשים קבועים ב- 4% paraformaldehyde (שלב 3). שטפו את הקשקשים עם 200 μL 1x PBS במשך 5 דקות לאחר התיקון.
    2. הכן פתרון עבודה DAPI בדילול 1:10 כדלקמן. ערבבו 1 μL של DAPI עם 9 μL של 1x PBS לקבלת נפח כולל של 10 μL.
    3. לאחר הכנת תמיסת DAPI, השתמש במלקחיים או פיפטה מפלסטיק כדי להניח את האבנית על שקופית קעורה, להסיר PBS עודף, ולהוסיף סביב 10 μL של תמיסת DAPI מוכנה.
      הערה: DAPI יכתים את הסולם באופן מיידי, כך שניתן יהיה להמחיש אותו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אורך גל עירור של 352-402 ננומטר ואורך גל פליטה של 417-477 ננומטר. DAPI יכתים את כל גרעיני התא בצבע כחול בוהק. כדי לראות את כל קנה המידה בשדה הראייה, נעשה שימוש במטרה 4x. גרעינים מוכתמים בודדים נראים באמצעות המטרה 20x.
    4. ספור את מספר הגרעינים המוכתמים ב- DAPI כדי לקבוע את מספר התאים בסולם.
  2. צביעה אפופטוטית להדמיית מוות תאי בדגימות חיות
    הערה: ניתן להשתמש בכתמים פלואורסצנטיים כדי לסמן תאים אפופטוטיים. לדוגמה, פרוטוקול סמן הפלואורסצנטי המשמש כאן הוא עבור סביבות חומציות וניתן להשתמש בו לתיוג ומעקב אחר אברונים חומציים כמו ליזוזומים. עלייה במספר האברונים הללו מתואמת עם מוות מוגבר של תאים. כתם זה צריך להיות מיושם על קשקשים לא קבועים כי הם נמשכו טרי או כבר תרבית עד 2 ימים.
    1. הכינו תמיסה של הכתם הפלואורסצנטי למעקב אפופטוזיס בהתאם להוראות היצרן על ידי שימוש במדיום התרבית כמדלל.
      הערה: ריכוז הכתם הפלואורסצנטי יכול להשתנות באופן דרסטי בהתאם לשיטת האפופטוזיס בה משתמשים. עיין בפרוטוקול המסחרי של הכתם המועדף לקבלת פרטים ספציפיים על הריכוזים המומלצים.
    2. בזהירות להסיר את המדיום תרבית מכל צינור 0.2 מ"ל או גם צלחת 96 באר אם הקשקשים היו תרבית בעבר.
    3. הוסף מספיק תמיסת צביעה פלואורסצנטית כדי לכסות את כל קנה המידה (סביב 50 μL).
    4. מכסים את כל הצינורות ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה ומשאירים למשך 30 דקות.
    5. הסר את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית מהצינורות או הבארות.
    6. לשטוף דגימות על ידי הוספת 200 μL של 1x PBS לצינורות או בארות במשך 5 דקות.
    7. הסר את PBS והוסף 200 μL של 4% PFA לצינורות או בארות כדי לתקן את הדגימות במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    8. שטפו דגימות על ידי הוספת 200 μL 1x PBS לצינורות או לבארות למשך 5 דקות.
    9. מעבירים את הקשקשים לתוך צינור חדש של 0.2 מ"ל או באר, ומוסיפים 200 μL של PBS 1x טרי. כסו צינורות/בארות אלה ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
    10. כדי להמחיש את הקשקשים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, השתמש בשקופית קעורה או שקע, ואת המסנן הנכון. לאות הפלואורסצנטי המשמש כאן יש מקסימום עירור ופליטה של 577-590 ננומטר. הכתם הפלואורסצנטי מראה תאים אפופטוטיים המכילים ליזוזומים באדום.
    11. ספרו את מספר התאים המוכתמים על מנת לקבוע את מספר התאים שעוברים אפופטוזיס.
      הערה: רדיד אלומיניום משמש במהלך צביעה ואחסון כדי למנוע דהייה. דגימות ניתן לאחסן בחושך במשך כמה שעות או אפילו ימים, תלוי איזה כתם פלואורסצנטי משמש. כדי לאחסן דגימות פלורסנט לפרקי זמן ארוכים יותר, השתמש בפרוטוקול קיבוע והרכבה התואם לכתם הפלואורסצנטי. כל הכתמים הפלואורסצנטיים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה של לפחות פי 20. המסנן ששימש היה כדלקמן: עבור DAPI 417-477 ננומטר; למעקב אפופטוזיס 577-590 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה, פרוטוקול תרבית בקנה מידה זה שימש לחקר הומאוסטזיסעצם 11. מאזניים יכולים לשרוד במדיום התרבות לפחות יומיים. מספרי התאים האפופטוטיים נותחו בכל יום של תרבית, עד שלושה ימים לכל היותר, על ידי ספירת התאים המסומנים. תוצאות אלה הראו כי תאים אפופטוטיים גדלו באופן משמעותי ביום השלישי של התרבית, דבר המצביע על כך שיש להגביל את זמן התרבית ליומיים בשיטה המתוארת כאן.

בהשוואה בין צורת קנה המידה לבין התפלגות התא, נראה כי לקשקשים יש צורה סימטרית והתפלגות סדירה של תאים עם ריכוז גבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קשקשי דגי זברה הם מודל נגיש במבחנה לחקר מגוון תהליכים ביולוגיים שונים שניתן לשמור עליהם עד יומיים בשיטת תרבית ואינקובטור המדמה את סביבתם הטבעית11. למאזניים יש התפלגות קבועה ופרופורציונלית של תאים נוכחים, המאפשרת לחוקרים לצפות, לספור ולתייג תאים ולבצע ניסויים פשוטים בביולוגיה של התא באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. יתר על כן, הסולם כולו נראה בקלות עם מטרה 4x, מה שמקל על מדידה וכימות תאים במהלך ניסויים. פרוטוקול נגיש זה לחקר תאים במבחנה מאפשר להשתמש בסולם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לצוות מתקן המים של אוניברסיטת מאונט סנט וינסנט ולכל חברי מעבדת פיתוח העצם ע"ש פרנץ-אודנדאל על מתן הטיפול הדרוש בדגים. תודה ספציפית לאלישה מקניל, קיילי א. מקללן ושירין ג'ראדי על הסיוע באופטימיזציה של פרוטוקולים מסוימים. מחקר זה נתמך על ידי מימון של סוכנות החלל הקנדית (CSA) [19HLSRM01] והמועצה למחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות 0.2 מ"לn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4לייצוב pH והכנה של שקופית קעורה PRS
n/an/a
DAPIVectashieldH-1200להדמיית גרעיני תאים
מלח דיאזוניום (כחול מהיר B)SigmaD9805לתמיסת מצע AP
אבקת מדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco סיגמא D5523למדיית תרבית קנה מידה 
אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט (MS222) סיגמא E105210.1% MS222
 סיגמא F4135למדיית תרבות קנה מידה 
מיקרוסקופ פלואורסצנטיn/an/a
חומצה אצטית קרחונית  פישר A38 212למאגר אצטט
גליצרולVWRBDH1172-4LPל-80% גליצרול - מאזני אחסון
HEPES תרמו-פישר 15630106למדיה של תרבות קנה מידה 
פלטה חמהn/an/a
KCl SigmaP217-10להכנת PBS
LysotrackerThermoFisherL7528עבור ליזוזומים  הדמיה
חומצה מאליתSigmaM0375עבור Tris-Maleate buffer 
מיקרופיפטהn/an/a
N,N-dimethylformamideSigma319937לתמיסת מצע AP
N,N-dimethylformamide 319937 סיגמאלתמיסת מצע אנזים
Na2HPO4 EMDSX0720-1להכנת PBS
NaCl סיגמא S9888להכנת PBS
NaNO2SigmaS-2252עבור 4% NaNO2
NaOH סיגמאS5881להכנת 4% PFA
NaOH סיגמא S5881לקיבוע אבנית וייצוב pH
Napthol-AS-TR-phosphateSigmaN6125לתמיסת מצע AP
Napthol-AS-TR-phosphate SigmaN6125לתמיסת מצע אנזים
Pararosaniline hydrochloride SigmaP3750עבור PRS
פניצילין-סטרפטומיצין 5000 יחידות פניצילין ו-5 מ"ג סטרפטומיוצין/מ"לThermoFisher 15140122למדיית תרבות קנה מידה 
ציוד מגן אישי (PPE): כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה.n/an/a
PFA סיגמא P6148לקיבוע קנה מידה
נתרן אצטט סיגמא S2889עבור מאגר אצטט
מיקרוסקופ תרכובת סטנדרטיn/an/a
צלחת ערבובn/an/a
חומצה טרטריתSigmaT6521עבור מאגר טרטרט
בסיסTris Roche03 118 142 001עבור מאגר Tris-Maleate 
להכנת סרום בקר עוברי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים