מאמר שיטה

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

4.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66626

⸱

19 באפריל 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

תקציר

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) נמצאת בשימוש נרחב כדי להקל על הרכבה מלמטה למעלה של תאים סינתטיים. הוא משמש כמארח של מכונות הליבה של הדוגמה המרכזית, ועומד כשלדה אופטימלית לאינטגרציה והרכבה של מערכות חיקוי תאיות מלאכותיות מגוונות. למרות השימוש התכוף בייצור תאים סינתטיים, הקמת מערכת CFPS מותאמת וחזקה ליישום ספציפי נותרה אתגר לא טריוויאלי. במאמר שיטות זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור מערכת CFPS, המשמשת באופן שגרתי בבניית תאים סינתטיים. פרוטוקול זה מקיף שלבים מרכזיים בהכנת מערכת CFPS, כולל תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה שגרתית של ביטוי באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. בנוסף, אנו מציגים תוצאות מייצגות על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים שונים, כגון טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפול ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מבהירים את השלבים והתנאים הקריטיים הדרושים להרכבה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בסביבות נפרדות. אנו מצפים כי גישתנו תאפשר ביסוס שיטות עבודה טובות בין מעבדות שונות בתוך קהילת התאים הסינתטיים המתרחבת ללא הרף, ובכך תאיץ את ההתקדמות בתחום התפתחות התאים הסינתטיים.

מבוא

הסינתזה של תאים סינתטיים או מלאכותיים התפתחה כתחום בולט ביותר של מחקר בין-תחומי, ומשכה עניין רב מצד מדענים בתחומי הביולוגיה הסינתטית, הכימיה והביופיזיקה. מדענים אלה מאוחדים על ידי המטרה המשותפת של בניית תא חי מינימלי 1,2,3. הצמיחה המהירה של תחום זה באה במקביל להתקדמות משמעותית בטכנולוגיות קריטיות, כגון מניפולציה רקומביננטית של דנ"א4, חומרים ביומימטיים5, וטכניקות מיקרו-פבריקציה למידור6, כולל שיטת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS)7. מערכות CFPS מקיפות את המנגנון התאי החיוני לשעתוק ותרגום, ומספקות את המסגרת הבסיסית לפיתוח ואינטגרציה של תאים מלאכותיים רב-תכליתיים.

למרות שטכניקות CFPS משמשות לעתים קרובות בהרכבה של תאים סינתטיים, פיתוח מערכת CFPS חזקה ומותאמת אישית להרכבה של מערכות תאים סינתטיים שונות נותר אתגר מורכב. נכון לעכשיו, קיימות מערכות CFPS רבות, הנגזרות הן מאורגניזמי מודל פרוקריוטים והן מאוקריוטים8, שכל אחד מהם מתמחה ביישומים מסוימים בסינתזה של תאים סינתטיים. מעבר לתפקידיהן המרכזיים בתמלול ובתרגום, מערכות CFPS נבדלות זו מזו במרכיביהן העיקריים ובהליכי ההכנה הקשורים אליהן. שינויים אלה, הכוללים הבדלים בתמציות תאים, RNA פולימראזות, שיטות הכנת תבניות והרכבי חיץ, נובעות במידה רבה ממסלולי הפיתוח הייחודיים של קבוצות מחקר שביצעו אופטימיזציה אינטנסיבית של המערכות שלהן לתפוקת חלבון מרבית.

בין המרכיבים השונים של מערכת CFPS, תמצית התא היא מאגר אנזימטי קריטי לשעתוק ותרגום, ולכן גורם מפתח בביצועי CFPS9. CFPS מבוסס Escherichia coli (E. coli) הוא המערכת הנפוצה ביותר בשל מעמדו כאורגניזם הפרוקריוטי המובן ביותר. יתר על כן, מערכת CFPS משוחזרת במלואה הכוללת חלבונים וריבוזומים מטוהרים בנפרד, המכונה PURE10, פותחה על ידי קבוצת המחקר של Ueda, המתאימה במיוחד ליישומים הדורשים רקע ברור. כיום, אפילו מערכות CFPS מבוססות E. coli התגוונו, במיוחד במונחים של זני המקור עבור extrac11 ושיטות הכנה12,13, RNA פולימראז14,15, מקורות אנרגיה16,17, ומערכות חיץ18,19. הזנים הנפוצים ביותר כוללים נגזרות של זני K12 ו-B, כגון A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 ו-Rossetta223, לצד מקביליהם המהונדסים גנטית.

בתחילה, זני E. coli עם פעילויות RNase ופרוטאז מופחתות נבחרו כדי לשפר את יציבות mRNA ואת היציבות של חלבונים רקומביננטיים מסונתזים חדשים, מה שהוביל להגדלת תפוקת החלבון הסופי24. לאחר מכן, תמציות E. coli הונדסו כדי להקל על שינויים ספציפיים לאחר תרגום, כולל גליקוזילציה25, זרחן26, ושומנים27, פותחו כדי להשיג את השינויים שלאחר התרגום לעיל. בנוסף, שולבו מגוון תוספים כגון מלווים מולקולריים28 ומייצבים כימיים כדי לסייע בקיפול חלבוני מטרה, ולתרום לגיוון מערכות CFPS. הבקטריופאג' T7 RNA פולימראז, הידוע בתהליכיות הגבוהה שלו, משמש בעיקר לשעתוק, אם כי פולימרזות אחרות כגון SP629 שימשו גם כן. E. coli אנדוגני RNA פולימראז הותאם לאב טיפוס של מעגלים גנטיים הממנפים גורמי סיגמא30. לבסוף, מגוון של מבשרי אנרגיה 31,32,33 ומלחים שונים ורכיבי חיץ 19,34,35 עברו אופטימיזציה שיטתית כדי לשפר את הפרודוקטיביות.

מלבד מערכת CFPS עצמה, שיטות האנקפסולציה כמו גם חומרי המידור חיוניים גם להרכבת תאים סינתטיים מוצלחת. מערכות שונות שפותחו כדי לתמצת בהצלחה את תגובת CFPS כוללות טיפות מים/שמן המיוצבות על ידי פעילי שטח, ליפידים/פולימר ושלפוחיות חד-למלריות היברידיות שלהן (בקטרים הנעים בין 50 ננומטר למספר מיקרומטר), כמו גם דו-שכבות ליפידים הנתמכות על ידי מישורים. עם זאת, בשל תכולת המולקולות המורכבות של מערכת CFPS, שיעור ההצלחה של אנקפסולציה תלוי במקרים ספציפיים, במיוחד עבור היווצרות שלפוחיות. כדי לשפר את שיעור ההצלחה והיעילות של אנקפסולציה של CFPS, שבבי microfluid שונים פותחו כדי להקל על היווצרות של טיפות ובועיות36. עם זאת, יהיה צורך להקים שבבים ומכשירים נוספים.

פרוטוקול זה מתאר מערכת E . coli CFPS המשתמשת בזן BL21(DE3), שהוא מארח נפוץ לייצור חלבונים רקומביננטיים. הפרוטוקול כולל תיאור מפורט של הכנת תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה סטנדרטית של ביטויים באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. יתר על כן, אנו מציגים תוצאות מופתיות שהושגו על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים מגוונים, כולל טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפולות ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מסבירים את המרכיבים הפרוצדורליים המרכזיים ואת התנאים ההכרחיים להקמה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בהקשרים סביבתיים נפרדים.

פרוטוקול

1. הכנת התמצית

  1. פזרו את זן E. coli BL21 (DE3) ממלאי גליצרול על צלחת אגר Luria Bertani (LB) ודגרו במשך 15 שעות לפחות בטמפרטורה של 37°C.
  2. הכינו טרום גידול לילה על ידי חיסון מושבה אחת מצלחת LB שזה עתה הוכנה לבקבוק 50 מ"ל של Luria Bertani (LB) בינוני.
  3. לחסן 5 מ"ל של preculture לתוך 500 מ"ל של 2xYTPG בינוני בבקבוק 3 L מבולבל Erlenmeyer. לגדל אותו ב 37 ° C עם רעידות נמרצות (בין 220 סל"ד ל 250 סל"ד) ולקצור את התאים כאשר הם מגיעים לשלב אמצע לוג (OD600 ~ 3). לאחר מכן, הניחו את תרביות התאים במי קרח קרים למשך 10 דקות ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 × למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: בשלב זה, ניתן להשמיט את הגלוקוז בתווך 2xYTPG עבור יישומים ספציפיים 9,12.
  4. השהה מחדש את כדורי התא המתקבלים ב- 35 מ"ל של חיץ A S30 מקורר מראש, ולאחר מכן צנטריפוגה ב- 8,000 × גרם למשך 15 דקות ב- 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
  5. חזור על שלב 1.4 פעמיים.
    הערה: ניתן לאחסן את כדורי התא בטמפרטורה של -80°C אם לא משתמשים בהם מיד.
  6. השהה מחדש את הכדוריות הסופיות בחיץ S30 B (למשל, השתמש ב-1.1 מ"ל של חיץ S30 B לכל 1 גרם של כדורי תא) ושיבש את התאים במעבר אחד דרך French Press ב-17,000 psi.
    1. לשימוש במכבש הצרפתי, עקוב אחר המדריך למשתמש והעבר את מתלה התא לתא שיבוש המתכת של העיתונות הצרפתית, תוך הקפדה על הרכבה של כל הרכיבים ועל סגירת השסתום התחתון של תא השיבוש.
    2. העבירו את תא ההפרעה המורכב לפלטפורמה הידראולית ואבטחו את מנעול הבטיחות.
    3. הפעל את המשאבה ההידראולית והתחל את ההפרעה.
    4. שלוט בשסתום היציאה כדי לאפשר למתלה התא לזרום החוצה מצינור היציאה לתוך צינור חדש של 50 מ"ל. כוונן את מהירות הזרימה כדי להבטיח הפרעה יעילה, באופן אידיאלי טיפה אחת בכל פעם. שמור על הלחץ מעל הגבול התחתון של 15,000 psi.
  7. צנטריפוגו את הליזט שנוצר ב 30,000 × גרם למשך 30 דקות ב 4 °C ולאסוף את supernatant. חזרו על הצנטריפוגה פעם אחת ואספו את הסופרנטנט. יש להוסיף 0.3 נפח של חיץ קדם-דגירה לסופרנאטנט שנאסף ולדגור בניעור עדין ב-37°C למשך 80 דקות.
    הערה: השימוש במאגר הדגירה יכול להגדיל את התשואה הסופית, אם כי דווח כי נגר ריק (ללא מאגר דגירה מראש) יכול גם לשפר את היעילות37,38, התלויה בזן המקור המתאים.
  8. יש לנטרל את תערובת הדיאליזה המתקבלת למשך שעתיים כנגד 2 ליטר של חיץ S30 C, להחליף את מאגר הדיאליזה פעם אחת ב-2 ליטר של חיץ S30 טרי C, ולדיאליזה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C39.
    הערה: ניתן לקצר את השלב השני של דיאליזה לילה לכ-3 שעות.
  9. אסוף את הדגימה והצנטריפוגה בטמפרטורה של 30,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C. אוספים את הסופרנאטנט והאליקוט לנפחים מתאימים ומקפיאים מיד בחנקן נוזלי.
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימה הקפואה בטמפרטורה של -80°C לפחות למשך 6 חודשים עד שנה ללא אובדן יעילות.

2. T7 RNA פולימראז

  1. הפוך פלסמיד pAR1219 לכוכב BL21(DE3) E . coli תאים מוכשרים40.
  2. יש לחסן 10 מ"ל של תרבית לילה לתוך 1 ליטר של LB בינוני (המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין). גדל את התאים ב 37 ° C עד OD600 מגיע 0.6-0.8.
  3. התחל את האינדוקציה על ידי הוספת ריכוז סופי של 1 mM IPTG. השרית התאים במשך 5 שעות נוספות וקציר על ידי צנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. אחסנו את כדורי התא בטמפרטורה של -80°C למשך עד מספר שבועות.
  4. להשהות מחדש את כדורי התא ב 30 מ"ל של T7 חיץ A ולשבש את התאים על ידי מעבר אחד דרך העיתונות הצרפתית ב 15,000 psi. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20,000 × גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  5. מוסיפים סטרפטומיצין סולפט טיפה אחר טיפה לסופרנאטנט מהשלב הקודם, ומגיעים לריכוז סופי של 4% (w/v). לאחר דגירה קצרה על קרח, צנטריפוגה ב 20,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (75 °F).
  6. סננו את הסופרנאטנט דרך קרום מסנן של 0.45 מיקרומטר וטענו את הדגימה המסוננת על עמודת חילופי אניון חזקה (נפח עמודה של 40 מ"ל), אשר שוקלה מראש עם נפחי 10 טורים של חיץ T7 B, באמצעות מערכת כרומטוגרף נוזלי אוטומטית.
  7. שטף את העמודה הטעונה עם 50 נפחי עמודות של T7 חיץ B ומחק את הדגימה עם 10 נפחי עמודות של תערובות מלח נמוך (50 מ"מ NaCl) ומלח גבוה (500 מ"מ) T7 חיץ C, תוך יצירת שיפוע ריכוז ליניארי של NaCl בין 50 ל 500 מילימטר בקצב זרימה של ~ 3 מ"ל / דקה41.
  8. אסוף את שברי השיא ונתח באמצעות SDS-PAGE.
    הערה: T7 פולימראז מציג פס דומיננטי ב~100 kDa, בעוד כמויות משמעותיות של זיהומים עדיין מופיעות על ג'ל SDS-PAGE.
  9. אגרו את השברים המכילים T7 פולימראז והדיאליזה כנגד 2 ליטר של חיץ T7 C למשך הלילה.
  10. מוסיפים גליצרול כדי להגיע לריכוז סופי של 10% ומרכזים את התערובת המתקבלת לריכוז סופי של 3-4 מ"ג/מ"ל על ידי אולטרה-סינון42.
    הערה: אם משקעים מופיעים במהלך תהליך הריכוז, עצור מיד והסר את המשקעים באמצעות צנטריפוגה.
  11. התאם את ריכוז הגליצרול ל -50%. Aliquot ו פלאש להקפיא את הדגימה עם חנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לתקופה ארוכה יותר.
    הערה: aliquot קטן יכול גם להיות מאוחסן ב -20 ° C לפחות 1 חודש ללא אובדן יעילות.

3. הכנת חיץ

  1. הכינו מאגרים כמצוין בטבלה 1 יום לפני השימוש.

4. עיצוב והכנת תבניות

  1. לשכפל את הגן המעניין לווקטור מבוסס מקדם T7 או ליצור מוצר PCR ליניארי המכיל את הגן המעניין.
    הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת עקרונות עיצוב.
  2. הכינו את הפלסמיד מתרבית לילה באמצעות ערכת מיצוי פלסמיד.
    הערה: אנו ממליצים לבחור ערכת פלסמיד הכוללת שלב משקעים איזופרופנול ואחריו הליך שטיפה עם אתנול 70%.
  3. ממיסים את הדנ"א המיובש בנפח קטן של מים אולטרה-טהורים לריכוז שבין 200 מיקרוגרם/מ"ל ל-500 מק"ג/מ"ל, כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
  4. אופציונלי: לבטא ישירות חלבונים ממוצרי PCR ליניאריים.
    הערה: במקרה זה, יש צורך בשלב טיהור PCR.

5. אופטימיזציה של Mg2+ ו- K+

  1. הכינו תערובת אב לבדיקת ריכוז Mg2+ כמצוין בטבלה 2, או לבדיקת ריכוז K+ כמצוין בטבלה 3.
  2. העבירו את תערובת האב לצינורות מיקרופוגה בודדים או לצלחת בצורת V בעלת 96 בארות.
  3. פיפטה את הנפח המדויק של תמיסות מלאי Mg2+ או K+ לתוך צינורות מיקרופוגה בודדים או צלחת בצורת V בצורת 96 בארות והשלם את תגובות CFPS עם מים טהורים במיוחד. לדגור על התגובות במשך שעתיים לפחות.
    הערה: אם אתם משתמשים בפלטה בצורת V עם 96 בארות, אטמו את הצלחת עם כיסוי פלסטיק כדי למנוע אידוי.
  4. מוציאים 2 מיקרוליטר מתערובת התגובה ומעבירים לצלחת שחורה בת 96 בארות למדידות פלואורסצנטיות על ידי קורא לוחות.
    הערה: אנו משתמשים בקורא לוחות פלואורסצנטי עם ההגדרה הבאה: עירור/פליטה: 485/528, רווח: 50, גובה קריאה: 7.00 מ"מ. עם זאת, יהיה צורך לכוונן את קורא הלוחות שלהם כדי ליצור עקומת כיול ספציפית באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים מטוהרים.

6. אנקפסולציה

  1. טיפה
    1. הכינו שמן מופלר המכיל חומרים פעילי שטח (2% PFPE-PEG ב-HFE7500) או תמיסת שמן שומנים-מינרליים על ידי המסת שומנים בשמן מינרלי (עיין בשלב 6.2.1)
    2. הכן נפח כולל של 100 μL של תגובת CFPS על ידי שילוב ריאגנטים 2-18 המתאימים מטבלה 4. הוסף תגובת CFPS ל- 500 μL של השמן שהוכן בעבר בצינור של 1.5 מ"ל ולאחר מכן, שפשף את הצינור במרץ על מדף הצינור 50x כדי ליצור טיפות עדינות (מים בשמן). לדגור על הצינור ב 30 ° C כדי לבצע את התגובה.
      הערה: שבבי מיקרופלואידיקה פשוטים יכולים לשמש גם ליצירת טיפות הומוגניות43.
  2. שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs)
    1. הכנת תמיסת שמן שומנים-מינרליים
      1. הוסף 57 μL של כלורופורם לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 18 μL של 25 מ"ג / מ"ל 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycerol-3-phosphocholine (POPC) שומנים כדי ליצור את תמיסת השומנים כלורופורם, השגת ריכוז סופי של 8 mM (להשתמש שומנים אחרים עם ריכוזים סופיים דומים).
        הערה: שלב ערבוב זה נועד להבטיח ערבוב הומוגני של שומנים שונים.
      2. אידוי הכלורופורם תחת זרימת ארגון למשך 15 דקות, ולאחר מכן, אידוי נוסף תחת ואקום למשך שעה אחת.
      3. ממיסים את השומנים היבשים המתקבלים ב-1,500 מיקרוליטר שמן מינרלי, ומגיעים לריכוז סופי של 400 מיקרומטר. דוגרים על התערובת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    2. יצירת שכבת שומנים בין פנים
      1. הוסף 500 μL של התמיסה החיצונית (ראה טבלה 5) לצינור של 1.5 מ"ל, ושכבה איטית של 250 μL של תמיסת שמן שומני-מינרלי על גבי התמיסה החיצונית. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ליצירת שכבת שומנים יציבה בין הפנים.
    3. הכנת הפתרון הפנימי
      1. ערבבו את כל הריאגנטים בטבלה 6 ליצירת התמיסה הפרה-פנימית ושמרו אותה על קרח עד לשימוש. השלם את הפתרון הפנימי על-ידי הוספת T7RNAP, תמצית S30 ותבנית DNA לתמיסה הפרה-פנימית כריאגנטים 16-18 המפורטים בטבלה 4.
        הערה: הגדלת ריכוז הסוכרוז בכמוסה מעל 250 מילימטר עלולה לעכב תרגום ללא תאים44.
    4. היווצרות של GUVs
      1. הוסף 50 μL של תמיסה פנימית לצינור חדש של 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של שמן שומנים-מינרלים, פיפטה למעלה ולמטה במהירות, ומערבולת במרץ.
      2. השאירו את הצינור על קרח למשך 10 דקות והוסיפו באיטיות 20 מיקרוליטר של תערובת התחליב לחלק העליון של שלב השמן בצינור 1.5 מ"ל משלב 6.2.2.
      3. צנטריפוגה ב 800 × גרם (להשתמש במהירות צנטריפוגה הנעה בין 100 × גרם ל 1000 × גרם) במשך 10 דקות ב 4 ° C ולצפות היווצרות של GUV בתחתית הצינור.
        הערה: ניתן להשתמש במהירות צנטריפוגה ספציפית גבוהה יותר; עם זאת, ניתן לקחת בחשבון כי מהירות הצנטריפוגה יכולה להשפיע על גודלם של GUV45 שנוצרו.
      4. מוציאים את שלב השמן העליון.
      5. יש לשאוף בזהירות 30 μL של GUV בתחתית הצינור. לדגור את GUV שנאספו ב 30 ° C.
        הערה: טמפרטורת הדגירה האופטימלית משתנה עבור חלבונים שונים.
      6. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (LSM) כדי לפקח על ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים.
  3. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLB)
    1. הכנת תאי SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 מ"מ #1.5 מכסה על ידי הוספת שבע טיפות של חומצה גופרתית ושתי טיפות של 50% מי חמצן למרכז כל שקופית כיסוי. לדגור על המגיבים על הכיסויים במשך 45 דקות לפחות; יש לשטוף היטב במים טהורים במיוחד.
      2. הרכיבו את תא ההרכבה מחדש על ידי חיבור צינור מיקרופוגה חתוך בנפח 0.5 מ"ל על הכיסויים המנוקים באמצעות דבק אופטי שנרפא תחת מנורה אולטרה סגולה (365 ננומטר) למשך 10 דקות ליצירת תא תגובה.
    2. היווצרות SLB
      1. להמיס 80 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (DOPC), 19.95 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phospho-L-serine (DOPS), ו 0.05 mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine = DOPE), לערבב כלורופורם, יבש תחת זרימת חנקן קלה ואקום במשך 1 שעה כדי להסיר את הממס לחלוטין.
      2. יש לייבש מחדש את שכבת השומנים המיובשת בחיץ SLB A, והתוצאה היא ריכוז שומנים סופי של 4 מ"ג/מ"ל.
      3. מערבלים ומפעילים את הדגימות המתקבלות עד שהן מתבהרות.
      4. לדלל 4 מ"ג / מ"ל של רכבי שטח עם 130 μL של חיץ SLB A, להעביר 75 μL של המתלים לתאי התגובה שהוכנו מראש, ולדגור אותו על בלוק חום ב 37 ° C במשך 1 דקות. הוסף 150 μL של חיץ SLB A לתא התגובה לדגירה נוספת למשך 2 דקות.
      5. שטף את התא עם 2 מ"ל של חיץ SLB B (חיץ SLB A ללא MgCl2) לפני החלפת חיץ למאגר C S30 עם BSA של 0.4% (w/v) עבור תגובות CFPS, תוך השארת 100 μL של חיץ בתוך התא כדי למנוע מה-SLB שנוצר להתייבש.
      6. הסר את שארית חיץ C S30 והוסף בזהירות את תערובת התגובה CFPS לתא SLB. יש לדגור על התא בטמפרטורה של 30°C ולנטר את הביטוי תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

תוצאות

עבור כל אצווה חדשה של תמצית תאים ו- T7 RNA פולימראז, מומלץ לבצע סינון בסיסי של ריכוזי Mg2+ ו- K+ כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של מערכת CFPS. הפלואורסצנטיות של GFP של תיקיות העל יכולה לשמש אינדיקטור לתשואה הכוללת של מערכת CFPS בתנאים משתנים, כפי שמודגם באיור 1A,B. בנוסף, השוואת תפוקה מקבילה של מערכת CFPS בין תאים שונים מוצגת באיור 1C, המדגימה ביצועים עקביים במערכות CFPS עטופות, אם כי עם ירידה קלה ב- GUVs, אולי בגלל ההשפעה של סוכרוז46. יתר על כן, תגובות CFPS היו עטופות בהצלחה בטיפות (איור 2), ב-GUV (איור 3) ועל גבי SLB (איור 4).

איור 2A מדגיש את היווצרותן של טיפות תחליב, כפי שניתן לראות כאשר תמיסת השמן נעשתה סוערת. הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים/אדומים (GFP ו-mCherry) נלכד באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. איור 3 הראה את ההצלחה של אנקפסולציה של תגובת CFPS בתוך GUV באמצעות תהליך העברת תחליב פשוט. התעלה האדומה הצביעה על השומנים המסומנים; הערוץ הירוק הראה את הביטוי של תיקיית העל GFP; והתעלה הצהובה ייצגה צבע פלואורסצנטי אינרטי. איור 4A מראה את תא ה-SLB שבו תגובת CFPS יכולה להיות מופקדת. בתוך תא זה, SLB נוצר על גבי כיסוי הזכוכית, כאשר תערובת התגובה CFPS הונחה על גבי SLB המוכן מראש, ואפשרה הדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. כפי שניתן לראות באיור 4B, SLB הודגם על-ידי ליפידים מסומנים, שהוצגו בירוק, בעוד ש-GTPase Cdc42 הקטן שהתמזג עם mCherry הוצג במגנטה. ניתן היה להבחין בביטוי באתרו של mCherry-Cdc42, יחד עם תהליך מיקוד הממברנה ההפיך, תחת המיקרוסקופ. עם זאת, למערכת CFPS שנעשה בה שימוש נוספה מכונת prenylation, כמפורט בפרסום אחרון47.

figure-results-1
איור 1: אופטימיזציה והשוואה של מערכת CFPS. סינון של (A) ריכוז Mg2+ ו- (B) ריכוזי K+ עבור מערכת CFPS בכמויות גדולות. (C) תרשים עמודות המציג תפוקות ביטוי חלבונים בתאים שונים. הפלואורסצנטיות של GFP של תיקיות העל שימשה לקביעת התפוקה של מערכת CFPS, שנמדדה על ידי קורא לוחות או מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. קיצורים: CFPS = סינתזת חלבון ללא תאים; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; sfGFP = תיקיית העל GFP; GUV = שלפוחית חד-למלרית ענקית; SLB = דו-שכבתי שומנים נתמכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סינתזת חלבון ללא תאים בטיפות. (A) תמונה של תגובות CFPS עטופות בטיפות מים בשמן המיוצבות על ידי פעילי שטח. (B) תמונות פלואורסצנטיות של Brightfield ו-(C,D) של CFPS של (C) mCherry ו-(D) של תיקיית העל GFP העטופות בטיפות שהודמיינו במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. Superfolder GFP מסומן בירוק; mCherry מצוין מגנטה. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: CFPS = סינתזת חלבון ללא תאים; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: סינתזת חלבונים נטולי תאים ב-GUVs. (A) תמונה של תגובות CFPS עטופות ב-GUV. (ב-ד) תמונה פלואורסצנטית של CFPS עטוף בתוך GUV POPC, המבטא GFP של תיקיית על. (B) דו-שכבת השומנים סומנה ב-0.05% עם השומנים Atto647N-DOPE, מסומנת באדום, (C) צבע אינרטי מסומן בצהוב, ו-(D) סופר-תיקייה GFP מסומנת בירוק. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: CFPS = סינתזת חלבון ללא תאים; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; GUV = שלפוחית חד-למלרית ענקית; POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycerol-3-phosphocholine; DOPE = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: סינתזת חלבון ללא תאים של חלבון GTPase קטן-Cdc42 על גבי SLBs. (A) המחשה סכמטית של המבנה מחדש של מיקוד הממברנה של Cdc42 ומיצוי קרום תלוי RhoGDI על SLBs, כפי שהודגם במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. מנגנון הפרנילציה יושם באמצעות תמצית מועשרת בפרניטרנספראז, המתוארת בפירוט במקום אחר. 47. (B) מבט אורתוגונלי על הקדם-פרנילציה ואחריה של תערובת התגובה על גבי SLB. (ג,ד) סדרת זמן של עוצמת mCherry-Cdc42 על הממברנה (ורוד) ובתמיסה (שחורה) במהלך (C) מיקוד הממברנה ו-(D) מיצוי הממברנה. מוטות קנה מידה = 10 מיקרומטר. (A-D) הותאמו מ Kai et al.47. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת חוצצים. הערה: יש להוסיף β-מרקפטואתנול ו-DTT ממש לפני השימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: סכימת פיפטינג לבדיקת ריכוז Mg2+ . אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: סכימת פיפטינג לבדיקת ריכוז K+ . אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: הרכב הפתרון הפנימי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 5: הרכב הפתרון החיצוני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 6: הרכב תמיסות קדם-פנימיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

כתב יד זה מתאר מערכת שונה של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) המיועדת לשימוש במיקרו-תאים שונים על פני פלטפורמות תאים סינתטיים, כולל טיפות מים בשמן, GUV ו- SLBs. השתמשנו בזן המארח הסטנדרטי של E. coli recombinant protein expression host, BL21(DE3), כתמצית המקור לבניית מערכות תאים סינתטיים הממוקדות בחלבון. גישה זו הניבה כ-0.5 מ"ג/מ"ל חלבון בתאים שונים. בעוד שניתן להשתמש בזני מקור תמצית מותאמים אישית אחרים, מערכות אלה עברו אופטימיזציה בעיקר לסוג מסוים של חלבון או פעילות מטבולית, אשר עשויה להיות תת-אופטימלית לביטוי חלבון כללי. ההתקדמות האחרונה בניתוח ספקטרומטריית מסות כמותית אפשרה מחקרי פיילוט על אנליזה פרוטאומית של ליזט התא48,49, במיוחד בתנאי הכנה שונים.

למרות קבלת תובנות ממחקרים אלה, ביסוס מתאם כמותי בין גורמי חלבון מזוהים אלה לבין הביצועים הכוללים של מערכות CFPS נותר מאתגר. פער זה הותיר שאלות ללא מענה כיצד להעריך כמותית את הביצועים של אצווה נתונה של תמצית. בנוסף, לא דווח על השוואה שיטתית ומקבילה בין זני מקור שונים. במחקר זה, השתמשנו בתווך 2xYPTG כדי להגביר את ייצור הביומסה, אסטרטגיה המומלצת למעבר ל-2xYPT בעת שימוש ב-RNA פולימראז אנדוגני לשעתוק. למרות ההצעות כי T7 פולימראז יכול להיות משולב בהליך הכנת תמצית45, בחרנו פרוטוקול הכנה נפרד עבור תמצית S30 ו T7 RNA פולימראז כדי להפחית שינויים גבוהים אצווה לאצווה.

ייצור חלבון המטרה קשור באופן מהותי לתהליך השעתוק / התרגום המרכזי. עיצוב נכון של תבנית וטוהר הם חיוניים לביטוי מוצלח ללא תאים. בנוסף לתבנית הפלסמיד, ניתן להשתמש גם בדנ"א דו-גדילי ליניארי שנוצר על ידי PCR, המציע התאמה ליישומי סינון ותפוקה גבוהה. שלא כמו עיצוב תבניות קונבנציונלי עבור ביטוי in vivo ב- E. coli, עיצוב תבנית במערכת נטולת תאי E. coli הוא פשוט יותר ללא צורך בשיקולי השראה לביטוי. המרכיב החיוני היחיד בתבנית ביטוי ללא תאים הוא רצף תקינה T7. עם זאת, במקרים מסוימים, רצף 5' של גן המטרה יכול להשפיע על התחלת התרגום, בהתאם למבנה המשני שנוצר על ידי mRNA משועתק המתאים. אם אתר קשירת הריבוזום ממוקם בתוך לולאת גזע יציבה של ה-mRNA המשועתק, התחלת התרגום עלולה להיפגע באופן משמעותי, מה שיוביל לביטוי כללי גרוע. באופן דומה, קודונים נדירים רצופים יכולים לעכב ביטוי ויש לייעל אותם, בדומה למחקרי in vivo . ניתן להשיג זאת באמצעות שרתי קוד פתוח המוקדשים לאופטימיזציה של קודון50 וחיזוי מבנה משניmRNA 51.

בנוגע למערכת החיץ, השתמשנו במאגר אצטט בתוספת קריאטין פוספט וקריאטין קינאז כמקורות להתחדשות אנרגיה במערך הניסויי שלנו. מערך זה הניב רמת ביטוי מתונה וקינטית מהירה יחסית, המיוחסת לתגובת התחדשות האנרגיה החד-שלבית המזורזת על ידי קריאטין קינאז באמצעות קריאטין פוספט. בעוד שחלק מהחוקרים עברו למערכת חיץ גלוטמט, תוך ציון הדמיון הקרוב יותר שלה לסביבה התאית52, לא ראינו הבדלים משמעותיים בתפוקת ביטוי החלבונים עם הפרוטוקולים הנוכחיים שלנו. עם זאת, ניתוח פרוטאומי שנערך לאחרונה הצביע על כך שמערכות חיץ שונות בשילוב עם שיטות עיבוד תמצית יכולות להשפיע על תפוקת הביטוי הסופית19. לגבי מבשרי אנרגיה, מצעים מגוונים נחקרו על ידי קבוצות מחקר רבות כדי להשיג עלות תועלת ותשואות ביטוי מוגברות53,54. בהקשר של מערכת CFPS המוצגת, קריאטין פוספט וקריאטין קינאז נבחרו בכוונה. בחירה זו הונעה על ידי יעילות התחדשות האנרגיה הניתנת להשגה באמצעות תגובה חד-שלבית והיעדר הפרעה לאנזימים אנדוגניים שעברו בירושה מהתמצית. כתוצאה מכך, תצורה זו יוצרת מערכת פשוטה אך חזקה המתאימה היטב לסביבות מיקרו-תאים שונות.

כפי שניתן לראות בתוצאות המיוצגות, הדגמנו ביטוי חלבון מוצלח בשלושה מיקרו-תאים נפרדים: טיפות מים בשמן המיוצבות על ידי שמן מופלר למחצה, GUV שנוצרו באמצעות העברת תחליב, ועל גבי דו-שכבה דו-שכבתית שומנית נתמכת. הרבגוניות של ביטוי חלבונים במיקרו-תאים שונים מדגישה את החוסן של מערכת CFPS שלנו לבניית תאים סינתטיים. בין שיטות האנקפסולציה הללו, טכניקת טיפת האמולסיה הייתה גישה פשוטה במיוחד לעטוף את מערכת CFPS, שדרשה רק תסיסה או מערבולות. עם זאת, טיפות אלה נוטות להיות לא יציבות בגלל ממשק מים רעוע, מגבלה שניתן לטפל בה על ידי הוספת שומנים או חומרים פעילי שטח לשלב השמן. למרות המעשיות של טיפות מים בשמן מיוצבות, הן אינן משכפלות במלואן את סביבת התא הטבעית, המורכבת משני תאים מימיים המופרדים על ידי קרום התא. במקום טיפות, הוקמו שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs) בגדלים העולים על 1 מיקרון כדי לחקות תאים בצורה קרובה יותר. מערכת CFPS הייתה עטופה בתוך דו-שכבת השומנים של שלפוחיות אלה, וסיפקה מכונות שעתוק ותרגום למערכות תאים סינתטיים מגוונות55.

העברת תחליב, הידועה גם בשם תחליב כפול, בולטת כטכניקה האופיינית לעטוף תגובות CFPS, בשל תהליך ההכנה המתון שלה ויעילות אנקפסולציה גבוהה יחסית בהשוואה לשיטות נטולות ממסים. עם זאת, הדור של שלפוחיות תחליב כפול יכול לנוע בין שלבי צנטריפוגה פשוטים לשימוש בהעברת תחליב בסיוע מיקרופלואיד, כל שיטה עם היתרונות והחסרונות הקשורים אליה, כפי שסוכם במקום אחר36. האנקפסולציה המוצלחת של מערכת CFPS בתוך GUV מסתמכת על כוונון האוסמולריות והפעלת הכוח המתאים כדי לחצות את ממשק שמן-מים. למרות ששיטת העברת האמולסיה המתוארת כאן היא הפשוטה ביותר ואינה דורשת ציוד מעבדה ספציפי, היעילות וההומוגניות של GUV שנוצרו עשויות להשתנות בין אצוות שונות. יתר על כן, כל שיטות העברת התחליב חייבות להתמודד עם שאריות שמן בלומן של הממשק הדו-שכבתי שנוצר, מה שמחייב שלב הסרת שמן נוסף56, שעלול להציב אתגרים בפרויקטים קינטיים.

לבסוף, הראינו את הביטוי המוצלח של CFPS על גבי שכבה דו-שכבתית ליפידית נתמכת (SLB), המציעה גישה רבת ערך לפרויקטים הדורשים סינתזת חלבונים בקרבת סביבת הביוממברנה השומנית. באמצעות השימוש במערכת CFPS המוצגת, הדגמנו את יישומה המוצלח באפיון תהליך מיקוד הממברנה ההפיך של Cdc4247, מולקולת חלבון מרכזית החיונית לקוטביות התא. לסיכום, תפוקות הביטוי הבינוניות העקביות והחוסן האינהרנטי שנצפה במיקרו-תאים שונים מדגישים את הפוטנציאל של מערכת CFPS זו בבניית מערכות תאים סינתטיים מגוונות. יכולת זו יכולה להיות מורחבת עוד יותר כדי לכלול מודלים שונים ממוקדי-חלבון, בסופו של דבר להתקדם לקראת מימוש של תאים מינימליים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

מ 'י' מכיר במימון מתוכנית המחקר והחדשנות לתארים מתקדמים של מחוז ג'יאנגסו, סין (מענק מס '. KYCX22_2803). L.K. אסירת תודה על התמיכה במחקר מדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו בסין, סין (מענק מס '17KJB180003), הקרן למדעי הטבע של אוניברסיטת ג'יאנגסו נורמל, סין (מענק מס '17XLR037), פיתוח תוכנית אקדמית מועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו, סין, ותוכנית הפרופסור המיוחדת של ג'יאנגסו, סין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (מלח נתרן)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 מ"ל צינורותEppendorfEppendorf Tubes BioBased
50% מי חמצןSigma-Aldrich516813
אצטטSigma-AldrichA6283
אבקת אגרSigma-Aldrich05040
אלניןסיגמא-אולדריץ'A4349
אמיקון תאים מעורבביםMerckMilliporeUFSC05001
אמוניום אצטט (NH4OAc)סיגמא-אולדריץ'A7262
ארגיניןסיגמא-אולדריץ'A4474
אספרגיןסיגמא-אולדריץ'A0884
אספרטטסיגמא-אולדריץ'A5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
בקבוק Erlenmeyer מבולבלShuniu250 מ"ל, 1000 מ"ל
סרום בקר אלבומין (BSA)Roche10711454001
CentrifugetubeEppendorfEppendorf Tubes 3810X
מתלה צנטריפוגהEppendorf0030119819
מערכת הדמיה כימילומינסנציה ואפיפלואורסצנציהUvitecAlliance Q9 מתקדם
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'288306
מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית (LSM)ZEISSLSM 780
שקופיות תא ספירת תאים רוזנתתרמו פישר סיינטיפיקC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
קריאטין קינאז (CK)Roche10127566001
קריאטין פוספט (CP)10621714001סיגמא-אולדריץ
Huanqiu90 מ"מ
ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'C5360
ציטידין 5'-מלח דיסודיום טריפוספט (CTP)אלאדיןC101487
קרום דיאליזהספקטרוםצינורות RC סטנדרטיים MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. מחזור ערכה טהורהאומגה ביו-טקD6492-01
מטפח טמפרטורה עומדת לחימום אלקטרוYiheng DHP-9602
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)Biosharp
קורא צלחות פלואורסצנטיותBioTekSynergy 2
שמן פלואורSuzhou CChip מכשיר מדעי2%HFE7500
חומצה פוליניתSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
גלוקוזSigma-AldrichG7021
גלוטמטסיגמא-אולדריץG5667
גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G5792
גליצרולסיגמא-אולדריץG5516
גליציןסיגמא-אולדריץ'G7126
גואנוזין 5'-טריפוספט נתרן מלח הידרט (GTP)Roche10106399001
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
מגנזיום אצטט טטרהידרט (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
מגנזיום כלוריד (MgCl2)סיגמא-אולדריץ'M2670
מתיוניןסיגמא-אולדריץ'M8439
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף5424 R
שמן מינרליסיגמא-אולדריץ'M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
צנטריפוגה רב תכליתיתEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
חומצת גרעין & מדידות בדיקת UV חלבוןIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi ערכת לפלסמיד בדרגת טרנספקציה DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 באר לוחות פוליסטירןSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
פניללניןסיגמא-אולדריץ'P8740
פוספואנולפירובט (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFסיגמא-אולדריץ' PMSF-RO
פוליאתילן גליקול 8000 (PEG 8000)סיגמא-אולדריץ'89510
אשלגן אצטט(KOAc)סיגמא-אולדריץ'P5708
אשלגן כלורי( KCl)סיגמא-אולדריץ'P9541
אשלגן גלוטמט (K-גלוטמט)סיגמא-אולדריץG1501
אשלגן הידרוקסיד (KOH)סיגמא-אולדריץ221473
פרוליןסיגמא-אולדריץ'P8865
פירובט קינאז (PK)סיגמא-אולדריץ'P9136
סריןסיגמא-אולדריץ'S4311
שייקרZhichushakersZQZY-AF8
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץS5886
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'S5881
סוכרוזאלאדיןS112226
חומצה גופרתית339741סיגמא-אולדריץ
ג'ינטנג0.45 μ m
מבחנהShuniu20 מ"ל
TGX FastCast ערכת אקרילאמיד, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
טריפטוןסיגמא-אולדריץ'T7293
טריפטופןסיגמא-אולדריץ'T8941
טירוזיןסיגמא-אולדריץ'T8566
UTP מלח טריסודיום (UTP)אלאדיןU100365
משאבת ואקום עם מערכת מים במחזורZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
מערבלי מערבולתKylin-BellVortex QL-861
מערכת טיהור מיםMerckMilliporeDirect Ultrapure (סוג 1)
תמצית שמריםSigma-Aldrich70161
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich444203
צלחת תרבית ' מכשיר 1100027' ' ' ' ' מסנני מזרק '

מקורות

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187(2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663(2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882(2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8(2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045(2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580(2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686(2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637(2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, Pt B 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, Web Server issue W126-W131 (2007).
  51. RNAfold WebServer. Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna. , Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (2024).
  52. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495(2019).
  53. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  54. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  55. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  56. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113(2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.