עיצוב מחדש תלוי ניסיון של נוירון חושי חושי הריח של המוח הצעיר קישוריות סינפטית בתקופה קריטית לחיים מוקדמים

סיכום

אנו מתארים כאן שיטות להשראת וניתוח שיפוץ תלוי חוויית ריח של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה במוח הצעיר של דרוזופילה .

תקציר

חוויה חושית של חוש הריח בשלב מוקדם גורמת לעיצוב מחדש דרמטי של גלומרולי סינפטי במוח הצעיר של דרוזופילה , שהוא תלוי מינון חווייתי, מוגבל זמנית והפיך באופן זמני רק בתקופה קריטית קצרה ומוגדרת היטב. הכיווניות של עיצוב מחדש של קישוריות סינפטית במעגל המוח נקבעת על ידי הריח הספציפי הפועל על קבוצת קולטני המשיב של נוירונים חושי ריח. באופן כללי, כל סוג נוירונים מבטא רק קולטן ריח יחיד ומעצבב גלומרולוס סינפטי ריח יחיד. במודל הגנטי של דרוזופילה , המערך המלא של גלומרולי חוש הריח מופה במדויק על ידי היענות ריחנית ותפוקות התנהגותיות. ריח אתיל בוטיראט (EB) מפעיל נוירונים קולטן Or42a המעצבבים את גלומרולוס VM7. במהלך התקופה הקריטית המוקדמת בחיים, חוויית EB מניעה סילוק סינפסות תלויות מינון בנוירונים חושי הריח Or42a. פרקי זמן מתוזמנים של חשיפה לריח EB במינון מאפשרים חקירה של גיזום קישוריות מעגלים תלויי ניסיון במוח צעיר. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה נעשית עם סמנים טרנסגניים מונעי קולטן Or42a המספקים כימות של מספר הסינפסה ונפח העצבוב. ערכת הכלים הגנטית המתוחכמת של דרוזופילה מאפשרת דיסקציה שיטתית של המנגנונים התאיים והמולקולריים המתווכים את עיצוב מחדש של מעגלי המוח.

מבוא

העיצוב מחדש של מעגלי מוח צעירים במהלך החיים המוקדמים מייצג את ההזדמנות האחרונה לשינויי קישוריות סינפטיים בקנה מידה גדול כדי להתאים לסביבה המשתנה מאוד והבלתי צפויה שאליה נולד בעל חיים. כקבוצה הנפוצה ביותר של בעלי חיים, חרקים חולקים את מנגנון השימור האבולוציוני הזה, היסודי של התקופה הקריטית¹. פרקי זמן קריטיים נפתחים עם תחילת הקלט החושי, מציגים שינויים הפיכים במעגל כדי לייעל את הקישוריות, ואז נסגרים כאשר כוחות הייצוב מתנגדים לשיפוץ נוסף². חרקים מסתמכים במיוחד על מידע חושי ריח ומראים תקופה קריטית מוגדרת היטב של חוש הריח. דרוזופילה מספקת מודל גנטי מצוין לחקר תקופה קריטית תלוית ניסיון זו במוח הצעיר. חוויית הריח בימים הראשונים שלאחר האקלוסיה מניעה שינויים מרשימים בקישוריות המעגלים בגלומרולי^{סינפטי 3,4} המזוהה בנפרד. כיוון השיפוץ תלוי בחוויית הקלט הספציפית של הריח. ריחות מסוימים גורמים לעלייה בנפח הגלומרולוס הסינפטי במשך מספר ימים לאחר האקלוסיה (dpe)3,5,6,7, בעוד שריחות אחרים גורמים לחיסול מהיר של סינפסות במהלך התקופה הקריטית של 0-2 dpe, וכתוצאה מכך נפח העצבוב ^8,9,10 ירד. באופן ספציפי, חוויית הריח של אתיל בוטיראט (EB) מניעה גיזום סינפטי תלוי מינון של נוירוני קולטן הריח Or42a רק במהלך תקופה קריטית זו של תחילת החיים⁸. סילוק הסינפסה הפיך לחלוטין על ידי ויסות קלט ריח EB בתקופה הקריטית, אך הופך לקבוע לאחר סגירת התקופה הקריטית. גיזום סינפטי תלוי ניסיון ריח זה מספק מערכת ניסיונית רבת ערך כדי להבהיר את המנגנונים המוגבלים זמנית העומדים בבסיס עיצוב מחדש של מעגלי מוח צעירים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המשמש להשראת וניתוח גיזום סינפטי תלוי ניסיון EB של נוירונים חושי חוש הריח של קולטן Or42a במהלך התקופה הקריטית המוקדמת בחיים. אנו מראים כי הדקים סינפטיים Or42a באונה האנטנלית VM7 glomerulus יכולים להיות מסומנים באופן ספציפי על ידי נהיגה טרנסגנית של סמן mCD8::GFP הקשור לקרום, או מאוחה ישירות למקדם Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ או באמצעות מערכת הביטוי הבינארי Gal4/UAS (Or42a-Gal4 נהיגה UAS-mCD8::GFP)¹². ניתן לתייג באופן דומה סינפסות נוירונים בודדות Or42a באמצעות ביטוי מהונדס ממוקד של סמני אזור פעיל קדם-סינפטיים המאוחים למערך של תגים פלואורסצנטיים (לדוגמה, Bruchpilot::RFP)⁸ או אות צפוף אלקטרונים עבור אנליזות סינפסות אולטרה-מבניות (למשל, miniSOG-mCherry)⁸. ניתן לצלם הדקים סינפטיים Or42a בשילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מראים כי גיזום גלומרולי סינפטי Or42a תלוי במינון EB, ומשתנה לריכוז חוויית הריח המתוזמנת. אחוז ריח EB המומס בשמן מינרלי המשמש כרכב יכול להיות מגוון, כמו גם משך הזמן המתוזמן של החשיפה לריח בבעלי חיים בשלב התפתחותי. לבסוף, אנו מראים את השיטות המשמשות לניתוח היקף הגיזום הגלומרולי הסינפטי על ידי מדידת עוצמת פלואורסצנטיות ונפח העצבוב של VM7. ניתן לכמת את מספר הסינפסות גם על ידי ספירת פונקטה סינפטית מסומנת ועל ידי מדידת פרמטרים של אולטרה-מבנה סינפטי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת⁸. בסך הכל, הפרוטוקול המוצג כאן הוא גישה רבת עוצמה המאפשרת דיסקציה שיטתית של מנגנונים תאיים ומולקולריים כאחד המתווכת קישוריות סינפטית של מעגל הריח דרוזופילה במהלך תקופה קריטית לנוער. מערך החשיפה הכללי לריחות המתואר במחקר זה שימש במחקרים קודמים תוך שימוש בריחות אחרים וקביעת גלומרולי ^3,7 אחרים.

פרוטוקול

1. חשיפה לריח

1. בעזרת מכחול עדין, מיין 40-50 חיות בשלבים התפתחותיים כגלמים כהים (90+ שעות לאחר הגלמים ב-25°C) לבקבוקוני פוליסטירן דרוזופילה בגודל 25 מ"מ x 95 מ"מ המכילים מזון דבשת קמח תירס סטנדרטי (איור 1A).
2. הניחו רשת תיל עדינה מפלדת אל-חלד על קצה בקבוקוני הדרוזופילה כדי להכיל את הזבובים תוך מתן זרימת אוויר טובה. הדקו את מכסי רשת התיל בעזרת סרט שקוף מודבק לצד בקבוקוני הדרוזופילה .
3. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש להניח 1 מ"ל של 100% שמן מינרלי (בקרת רכב) או להמיס את ריח אתיל בוטיראט (EB) בשמן מינרלי בצינור אחר כדי להפיק את הריכוז הרצוי (למשל, 15% (150 μL) או 25% (250 μL)).
4. הניחו את צינורות בקרת הרכב או המיקרוצנטריפוגות הריחניות זקופות בתוך מיכל Glasslock אטום בנפח 3700 מ"ל. בעזרת נייר דבק, עגנו היטב את הצינורות במרכז תאי הריח יחד עם בקבוקוני הדרוזופילה (איור 1B).
5. הניחו את בקרת הרכב האטומה ואת תאי הריח EB המכילים את בקבוקוני הגלמים המבוימים של דרוזופילה לאינקובטור לח (70%), מבוקר טמפרטורה (25°C) במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות.
6. הוציאו את הזבובים שזה עתה נסגרו לאחר 4 שעות של חשיפה לתא הריח, והעבירו במהירות 20-25 זבובים לבקבוקוני דרוזופילה טריים בתאים עם ריח טרי (איור 1A,B). השליכו את הגלמים הלא סגורים.
7. שמרו את הזבובים בתאי הריח האטומים שלהם באינקובטורים למשך 24 שעות בסך הכל. למינון ארוך יותר של ריחנים, העבירו במהירות את הזבובים לבקבוקוני דרוזופילה חדשים בתאי ריח טריים כל 24 שעות.
8. הרדימו את הזבובים בשלב התפתחותי על ידי טבילתם בצלוחית של 70% אתנול למשך דקה אחת כהכנה לדיסקציה מיידית של המוח ולעיבוד אימונוציטוכימי.

2. דיסקציה מוחית

1. סמן בקבוקונים כבקרת רכב (100% שמן מינרלי בלבד) או EB חשוף (% EB) על ידי תיוג ושמירה על כינויים אלה למשך כל משך הדיסקציה המוחית והעיבוד שלאחר מכן. תהליך 10-20 בעלי חיים עבור כל מצב גנוטיפ/ריח.
2. בעזרת מלקחיים, העבירו זבוב מורדם בודד לתוך צלחת קטנה של מלח טרי חוצץ פוספטים (PBS)¹³. לטבול את הזבוב ב-PBS ולהמשיך בדיסקציה מוחית מלאה כשהזבוב שקוע במלואו.
3. עם מלקחיים מחודדים עדינים (# 2) בשתי הידיים, הניחו את הצד הגחוני של הזבוב למעלה ואחזו את בית החזה העליון במלקחיים אחת ואת הראש מתחת לחוטם עם המלקחיים האחרים. היזהרו לא לחדור למוח.
4. הסר את הראש משאר הגוף על ידי משיכה עדינה לכיוונים מנוגדים בשתי הידיים. הראש צריך בקלות להתנתק מבית החזה; השאירו את הראש המבודד לדיסקציה (איור 1C).
5. החלק את המלקחיים ששימשו בעבר לאחיזת בית החזה מתחת לצד הנגדי של החוטם. התחל למשוך בעדינות את הקוטיקולה השלד החיצוני בכיוונים מנוגדים, כך שהוא קורע בין העיניים כדי לחשוף את המוח.
6. בעת המשיכה, האונות האופטיות במוח עשויות להיפרד יחד עם השלד החיצוני. כדי למנוע זאת, השתמשו במשיכה איטית ויציבה עם שתי המלקחיים תוך הסרת הקוטיקולה של השלד החיצוני (איור 1C, באמצע).
7. המשך להסיר את הקוטיקולה של השלד החיצוני מהראש. ודא שכל חלקי השלד החיצוני מוסרים. הסר את כל הרקמות המחוברות למוח, כולל גוף השומן וכל קנה נשימה מקרין.
8. למניעת הידבקות, יש לשטוף קצה פיפטה P20 עם PBS + 0.2% Triton-X 100 (PBST). מיד לאחר הנתיחה, העבירו את המוחות לתמיסת הקיבוע (4% פרפורמלדהיד (PFA) + 4% סוכרוז) בצינור סגור (איור 1C,D).

3. אימונוציטוכימיה במוח

1. תקן את המוח למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם סיבוב מקצה לקצה. תוך שמירה על המוח בצינור, פיפטה להיפטר כראוי קיבוע מסוכן. שטפו במהירות מוחות קבועים פי 3 עם PBS (איור 1D).
2. לעתים קרובות ניתן למצוא מוחות תקועים במכסה הצינורות לאחר סיבוב. כדי למנוע אובדן מוחות בשוגג, המהווה סכנה מתמדת בכל ההעברות, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה בזמן שפיכת נוזלים.
3. כהכנה לתיוג נוגדנים, חסמו את המוח הקבוע למשך שעה אחת ב-RT ב-PBST + אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) + סרום עיזים רגיל 0.5% (NGS) עם סיבוב קבוע מקצה לקצה (איור 1D).
4. הסר את הבלוק ודגור על מוחות עם הנוגדן הראשוני שנבחר מדולל כראוי ב- PBST + 0.2% BSA + 0.1% NGS. לדגור על המוח במשך הלילה (14-16 שעות) ב 4 ° C עם סיבוב קבוע.
   הערה: נוגדנים לדוגמה בשימוש: עכברוש אנטי-CadN (דילול 1:50)¹⁴ כדי לתייג גלומרולי סינפטי ועוף אנטי-GFP (1:1000)⁸ כדי לתייג Or42a-mCD8::GFP (איור 1D).
5. פיפטה מהנוגדן הראשוני. שטפו את המוחות 3 פעמים במשך 20 דקות כל אחד עם PBST. לדגור על מוחות עם נוגדנים משניים מדוללים ב-PBST עם 0.2% BSA + 0.1% NGS במשך שעתיים ב-RT עם סיבוב קבוע.
   הערה: לחלופין, לדגור על המוח במשך הלילה (14-16 שעות) ב 4 ° C. נוגדנים מדוללים ב- PBST עם 0.2% BSA + 0.1% NGS; נוגדנים משניים המשמשים כאן: 488 עיזים נגד עוף (1:250) ו-546 נגד חולדות עיזים (1:250).
6. פיפטה מהנוגדנים המשניים. שטפו את המוחות 3 פעמים במשך 20 דקות כל אחד עם PBST. סיימו על-ידי שטיפת מוחות במשך 20 דקות עם PBS (איור 1D).
7. הכן שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ) על ידי הוספת שתי רצועות דקות של סרט דבק דו צדדי לשקופית ~ 25 מ"מ זו מזו. זה מספק ספייסר כדי למנוע ריסוק המוח.
8. פיפטה ~ 10-15 μL של אמצעי הרכבה בין שתי רצועות הסרט כדי להרכיב את המוח. עם קצה פיפטה P20 שנשטף מראש עם PBST, העבירו את המוחות המסומנים אל שקופית המיקרוסקופ (איור 1E).
9. לאחר העברת המוחות, השתמשו במברשת צבע עדינה כדי ליישר אותם, וודאו שאונות האנטנה פונות כלפי מעלה. חפש את הצד שיש לו את הדבשת המקושתת, אשר יכיל את אונות האנטנה.
10. ברגע שהמוח מכוון כראוי, כסו אותו בכיסוי זכוכית (מס' 1.5H), וודאו שהכיסוי מאובטח על סרט הדבק. לאחר מכן, מלאו את דפנות הכיסוי באמצעי הרכבה נוסף (איור 1E).
11. אטמו את שולי הכיסוי בלק שקוף. הניחו לשקופית להתייבש היטב ואחסנו אותה במקרר לצורך הדמיה נוספת.

4. הדמיה קונפוקלית

1. עיוור את כל שקופיות המוח הן לגנוטיפ והן לחוות מצבים לפני הדמיה על ידי סימון השקופית בתווית מקודדת לפענוח מאוחר יותר.
2. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם מטרה טבילת שמן פי 63. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss 510 META בכל התמונות שמוצגות כאן (איור 1F).
3. השתמש בקווי לייזר מתאימים עבור הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש. כאן, השתמשו בלייזר Argon 488 ו-HeNe 543 עבור גלומרולי סינפטי של אונת האנטנה והדמיית נוירון חושי ריח Or42a (איור 2).
4. קבע את הרווח והקיזוז האופטימליים עבור שני הערוצים, תוך שמירה אידיאלית על הרווח עבור שני הערוצים <750 והיסט ≈0. זה נעשה כדי להבטיח את האות לרעש הוא אופטימלי תוך הגבלת הרקע.
5. מיקום הדמיה למרכז המוח. בעת הדמיה, הגלומרולי VM7 שוכן בסמיכות לחור שנותר במרכז המוח לאחר הסרת הוושט במהלך דיסקציה (איור 2A).
   הערה: גלומרולי VM7 תמיד יהיה קרוב לפתיחת הוושט. עם זאת, המיקום והגודל המדויקים משתנים מעט בהתבסס על דיסקציה מוחית והבדלי התגברות, לכן קחו זאת בחשבון בעת ההדמיה.
6. בחרו ברזולוציית ההדמיה ובעובי הפרוסה האופטית. כאן, 1024 x 1024 ברזולוציה עם עובי פרוסת Z של 0.37 מיקרומטר משמש.
7. בצע הקרנה קונפוקלית שלמה של מחסנית Z דרך אונת האנטנה, כדי להבטיח את לכידתו של עצבוב הנוירונים המלא Or42a של גלומרולי VM7.

5. מדידות סינפטיות

1. טען את התמונה עיוורת הגנוטיפ/מצב לתוך פיג'י (1.54f). פצל את ערוצי קו הלייזר על-ידי לחיצה על Image > Color > Split Channels.
2. בערוץ חוש הריח Or42a, קבעו אילו פרוסות מכילות את העצבוב Or42a על ידי גלילה לאורך כל ערימת Z, וזהו היכן הפלואורסצנטיות מתחילה ומסתיימת.
3. צור הקרנת סכום פרוסות הכוללת רק פרוסות המכילות עצבוב נוירונים Or42a על-ידי לחיצה על Image > Stacks > Z Project > Sum Slices והזנת הטווח הרצוי.
4. בפיג'י, לחצו על הכלי לאסו בסרגל העליון כדי לעקוב אחר קווי המתאר של עצבוב תאי העצב Or42a בגלומרולוס VM7, ומטפלים בכל גלומרולוס צד במוח בנפרד (איור 3).
5. הכפל את ההיקף במספר פרוסות ערימת Z ובעובי של כל פרוסה כדי לקבל את נפח העצבוב של גלומרולוס סינפטי VM7. כדי לכמת את מספר הסינפסה, ניתן להשתמש בכלי חיפוש מקסימלי יחד עם המאקרו find maxima stacks כדי לספור את synapse puncta באזור המתאר ^8,15.

תוצאות

איור 1 מראה את תהליך העבודה של חשיפה לריח, חשיפה לריחות תקופתיים קריטיים ושיטות הדמיה מוחית. הפרוטוקול מתחיל בהתאמת הגיל של הגלמים הכהים של הפאראט מיד לפני האקלוסיה (איור 1A). הגלמים מוכנסים לתאי ריח למשך 4 שעות, ואז הופכים בוגרים שזה עתה נסגרו לבקבוקונים טריים בבקרת הרכב או בתאי הריח EB (איור 1B). בדרך כלל אנו חושפים לריח במשך 24 שעות, אם כי כל משך זמן אפשרי. לאחר חשיפה לריח, דיסקציה מוחית מתחילה על-ידי הסרת הראש מבית החזה ולאחר מכן הסרת השלד החיצוני של הקוטיקולה בעזרת מלקחיים עדינים (איור 1C). המוח המבודד מנוקה מכל הרקמות הקשורות שעלולות להפריע לדימות ואז מקובע מיד ב-4% פרפורמלדהיד ו-4% סוכרוז ב-PBS. תיקון קצר של 30 דקות מספיק לשלמות טובה של רקמת המוח. הפרוטוקול האימונוציטוכימי מתחיל עם בלוק של שעה אחת (למשל, BSA, NGS), דגירה לילית בנוגדנים ראשוניים (למשל, anti-GFP, -CadN), ולאחר מכן דגירה קצרה של שעתיים בנוגדנים משניים (איור 1D). המוחות המסומנים מורכבים על שקופיות זכוכית מתחת לכיסויים אטומים כאשר פני השטח הגביים של המוח כלפי מעלה לצורך הדמיה מיטבית של אונות האנטנה (איור 1E). שים לב שכל הדגימות עיוורות הן לגנוטיפ והן לתנאי החוויה על ידי סימון השקופית עם ייעוד מקודד לפענוח מאוחר יותר. מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם מטרה של טבילת שמן פי 63 משמש להדמיה של אונות האנטנה המרכזיות במוח (איור 1F). קווי לייזר אופטימליים עבור פלואורופורים בשימוש נבחרים (למשל, Argon 488 ו- HeNe 543) כדי לצלם את עצבוב נוירון חוש הריח Or42a של VM7 בהקשר של גלומרולי שמסביב.

חשוב לבחור את הרווח, ההיסט, רזולוציית ההדמיה ועובי הפרוסה האופטית האופטימליים כדי ללכוד את כל הקרנת מחסנית Z של עצבוב הנוירונים Or42a בגלומרולי VM7. כל הגנוטיפים ותנאי החוויה שיש להשוות מצולמים עם הגדרות מיקרוסקופ זהות. ערימות Z מעובדות באמצעות תוכנת ImageJ עם שינויים תלויי ניסיון המוערכים בעיקר על ידי נפח עצבוב ^7,14. ישנן שתי דרכים שבהן חושבו מדידות נפחיות. מחשבים את אזור העצבוב פרוסה אחר פרוסה באמצעות פונקציית לאסו ImageJ ולאחר מכן מכפילים כל ערך בעובי של כל פרוסה (מיקרומטר)^8,9. השני משתמש בהקרנות סכום פרוסה Z ומכפיל את מספר פרוסות ערימת Z בעובי הפרוסה כדי לקבוע את הנפח הממוצע. שתי השיטות נותנות תוצאות עקביות. בנוסף למדידות נפח, ניתן להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות גם עם הקרנת עוצמה מרבית של VM7 glomeruli¹⁶. הסכום המשוקלל של כל הפיקסלים מוערך באמצעות הקרנה מקסימלית של פרוסת סכום ImageJ, כאשר מספר הפיקסלים בכל רמת עוצמה מסוכם כדי לחשב את העוצמה הכוללת ^8,9. ניתן להחסיר את הרקע על ידי כימות אזור אקסטרה-גלומרולרי בגודל זהה. שיטת חיסור זו גוזלת זמן רב יותר אך מדויקת יותר, מכיוון שהיא לוקחת בחשבון רמות משתנות של תיוג נוגדני רקע בכל דגימת מוח כדי לייצר כימות מייצג יותר של ערכי עוצמת פלואורסצנטיות העצבוב. מדידות העוצמה נעשות בטווח טיפוסי של 18-30 פרוסות אופטיות (0.37 מיקרומטר לפרוסה) בתוך ערימת Z, בממוצע עבור כל מוח¹⁶. כמעט בכל המקרים, עוצמת הפלואורסצנטיות של העצבוב ומדידות הנפח נותנות תוצאות עקביות.

בכל אופני המדידה, התוצאות המייצגות נותרות בלתי מעורערות; ניסיון מוקדם בריח EB גורם לאובדן משמעותי של עצבוב נוירון Or42a. ניתן לזהות את הגלומרולוס VM7 באופן מהימן על-ידי גודל, צורה ומיקום בין גלומרולי ריח אחרים של אונת האנטנה הממופה במדויק (איור 2A) ועל-ידי ביטוי ממוקד של תווית הממברנה Or42a-mCD8::GFP המוצמדת לתיוג גלומרולרי עם קדרין אנטי-עצבי (CadN; איור 2B). חשיפה מתוזמנת לבקרת רכב הריח (שמן מינרלי) גורמת לעצבוב נוירונים Or42a שלא ניתן להבדיל בינו לבין חיה רגילה שאינה מטופלת. ובכל זאת, חוויית ריח EB בימים הראשונים שלאחר האקלוסיה (dpe) גורמת לגיזום גלומרולי סינפטי (איור 2C). מנגנון גיזום זה מוגבל לחלוטין לתקופה הקריטית הקצרה של ראשית החיים ^8,10. בדרך כלל אנו משתמשים כעת בחשיפות לריח 24 שעות כדי להעריך את הגיזום הסינפטי של VM7 גלומרולי ואת הירידה בנפח העצבוב במוח הדרוזופילה הצעיר כתוצאה מכך. חשיפה של 24 שעות (0-1 dpe) לבקרת רכב הריח (שמן מינרלי) שומרת על העצבוב הרגיל והצפוף Or42a-mCD8::GFP (ירוק) בגלומרולי הסינפטי VM7 (עיגולים מקווקווים לבנים) בשתי אונות האנטנה של חצי המוח (איור 2D, משמאל). בניגודיות בולטת, חשיפה של 24 שעות (0-1 dpe) ל-25% EB odorant מומס בשמן המינרלי גורמת לגיזום חזק של Or42a-mCD8::GFP innervation (ירוק) ולאובדן הנפח הגלומרולרי הסינפטי (איור 2D, מימין). תוצאות אלה הן ברורות מבחינה חזותית והן ברורות באופן עקבי. אחת התכונות הגדולות ביותר של פרוטוקול חוויית ריח זה היא בהירות תוצאות הדמיה מוחית, אשר גם מקובלות מאוד על עצבוב פשוט, עוצמת פלואורסצנטיות וכימות נפח.

היתרון הגדול של פרוטוקול חוויית ריח זה הוא היכולת לרתום אותו לחקר הגבלת זמן ומנגנונים תלויי מינון ריח במהלך גיזום סינפטי לתקופות קריטיות. עבור סילוק סינפסת נוירון מונחה EB Or42a בגלומרולוס VM7, מנגנון העיצוב מחדש מוגבל בעיקר לצעירים המוקדמים (0-2 dpe), ללא גיזום סינפטי תלוי ניסיון הניתן לגילוי בבגרות (7-9 dpe) למעט אפנון קל ברמות החשיפה הגבוהות ביותר ל- EB⁸. הגבלת זמן כזו מגדירה תקופה קריטית, והבנת מנגנון תזמון זה היא מטרה חשובה. תכונה נוספת של פרוטוקול זה היא שגיזום סינפטי תלוי ניסיון הוא תלוי מינון EB (איור 3). חשיפה מתוזמנת לבקרת רכב הריח (שמן מינרלי) עם ריח EB 0% גורמת לעצבוב נוירון Or42a תקין של הגלומרולוס הסינפטי VM7, שלא ניתן להבחין בינו לבין בעל חיים שאינו מטופל. חישוב הנפח התלת-ממדי של עצבוב נוירון Or42a מראה גודל אופייני למוח צעיר רגיל (2260 מיקרומטר³; איור 3A, משמאל). תוצאות מייצגות מראות כי עלייה בריכוז הריח EB גורמת לגיזום גלומרולי סינפטי גדול יותר ויותר. לדוגמה, חשיפה של 24 שעות (0-1 dpe) ל-15% EB גורמת לאובדן עצבוב ברור ועקבי (איור 3A, באמצע). כימות נפח העצבוב התלת-ממדי מראה ירידה מרשימה בהשוואה לבקרות הרכב (760 מיקרומטר³ לעומת 2260 מיקרומטר³). חשיפה של 24 שעות (0-1 dpe) ל-25% EB גורמת לאובדן עצבוב גדול עוד יותר (281 מיקרומטר³; איור 3A, מימין). כימות מייצג עבור טווח זה של ריכוזי EB odorant מראה תוצאות עקביות עבור עוצמת פלואורסצנטיות (איור 3B) ונפח עצבוב (איור 3C). תלות זו במינון מאפשרת לחקור את האמצעים למניעת גיזום סינפטי וכן לשפר את הגיזום עם חשיפות נמוכות יותר לריח כדי להדגים שיפוץ גלומרולי סינפטי מוגבר. כמה מחקרים קודמים הראו את ההשפעה ההפוכה של נפח גלומרולרי מוגבר באמצעות ריחות אחרים עם פרוטוקול^{זה 10}. חשיפה לריח EB בתקופה הקריטית גורמת תמיד לגיזום גלומרולי סינפטי מרשים וקל לזיהוי.

איור 1: תרשים זרימה של מחקרי חשיפה לריח במוח הצעיר של דרוזופילה . (A) גלמים כהים של פראט (90+ שעות לאחר הגלמים ב-25°C) נאספים ומונחים בתאי ריח. בתנאי ריח, 4 שעות מותרות לקלושה, ואז זבובים צעירים מועברים לבקבוקון טרי. (B) זבובים תואמי גיל מחולקים לתנאי בקרת הרכב (100% שמן מינרלי) או אתיל בוטיראט (EB; % v/v בשמן מינרלי). רשת תיל עדינה (inset) מאפשרת גישה לריח. זבובים נחשפים בדרך כלל למשך 20 שעות נוספות למשך 24 שעות חשיפה בסך הכל, 0-1 יום לאחר האקלוסיה (dpe). (C) מנתחים זבובים על-ידי הסרת הראש תחילה, ולאחר מכן משתמשים במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות את השלד החיצוני של הקוטיקולה ולבודד את המוח הצעיר. המוח המבודד מנוקה מכל הרקמות הסובבות ומקנה הנשימה הבולט. (D) מוחות מבודדים מקובעים, נחסמים ואז מודגרים ברצף בנוגדנים ראשוניים ומשניים. טווח הנוגדנים המשמש בדרך כלל כולל בדיקה כללית של הממברנה כדי לחשוף את האונה האנטנלית, גלומרולי סינפטי ובדיקה ספציפית של הממברנה עבור נוירוני חוש הריח Or42a. (E) מוחות מסומנים ממוקמים בתווך הרכבה על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית עם ספייסרים של סרט הקלטה מתחת למכסה אטום. כיוון מוחי נכון (פני השטח הגביים למעלה) הוא קריטי לדימות אופטימלי של אונות האנטנה. (F) המוח מצולם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי סורק לייזר. כל הדגימות עיוורות לגנוטיפ וחוות תנאים לפני הדמיה וניתוחים מכומתים לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: גיזום גלומרולי סינפטי תלוי חוויה בתקופה קריטית. (A) גלומרולי הריח של אונת האנטנה (AL) ממופים במדויק. כמה גלומרולי סינפטי מייצג מוצגים. קבוצת הנוירונים החושיים של קולטן הריח Or42a (OSN) מעצבבת באופן ספציפי את הגלומרולי VM7. (B) Or42a-mCD8::GFP מתויגים נוירונים (ירוק) מעצבבים בצפיפות את הגלומרולי VM7 הזוגי בצד שמאל (L) ובצד ימין (R) של המוח, עם תיוג נוגדנים N-Cadherin (CadN) של כל הגלומרולי הסינפטי AL (מגנטה). קו הזבוב הוא W¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) ייצוג גרפי סכמטי של עצבוב Or42a OSN של הגלומרולי הסינפטי VM7 במצב בקרת הרכב (100% שמן מינרלי; משמאל) וחשיפה לאתיל בוטיראט (% EB v/v בשמן מינרלי; מימין) במהלך התקופה הקריטית לנוער. גיזום עצבוב תלוי ניסיון מתרחש רק עם חשיפה מוקדמת ל- EB, כאשר סינפסות מסולקות ואקסונים אובדים, וכתוצאה מכך נפח העצבוב מופחת. (D) תמונות קונפוקליות מייצגות של עצבוב Or42a OSN של הגלומרולי הסינפטי VM7 (עיגולי מתאר לבנים מקווקוים; Or42a-mCD8::GFP, ירוק) בעקבות בקרת רכב שמן (משמאל) וחשיפה EB של 25% (מימין) למשך 24 שעות (0-1 dpe). חוויית הריח EB מניעה גיזום סינפטי ואובדן נפח עצבוב. מנגנון תלוי ניסיון זה מוגבל זמנית והפיך באופן זמני רק בתוך תקופה קריטית מוגדרת היטב של חוש הריח בימים הראשונים שלאחר האקלוסיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כימות עוצמת ונפח פלואורסצנטיות של גלומרולי סינפטי תלוי מינון EB. (A) Or42a-mCD8::GFP מסומן כעצבוב בגלומרולוס סינפטי VM7 (ירוק) שנחשף מ-0-1 dpe לבקרת השמן המינרלי של רכב הריח (0% EB, משמאל), 15% EB (באמצע) או 25% EB (מימין). למטה: אותן תמונות עם מתואר עצבוב גלומרולרי (עיגולים לבנים) ונפח עצבוב תלת מימדי מחושב. בקרת הרכב כוללת עצבוב גלומרולוס סינפטי VM7 על ידי נוירונים Or42a שלא ניתן להבחין בינו לבין בעלי החיים שלא טופלו. ניסיון של תקופה קריטית עם חשיפה של 15% לריח EB מביא לגיזום גלומרולוס סינפטי ברור, עם ירידה של 66% בנפח העצבוב התלת-ממדי במקרה זה. חשיפה לרמה גבוהה יותר של 25% EB גורמת לגיזום גדול יותר, עם אובדן של כמעט 90% של נפח גלומרולוס סינפטי במקרה זה. לכן, ניתן לדמיין גיזום תלוי מינון ככל שחוויית הריח גדלה. (B) תוצאות מייצגות של Or42a-mCD8::GFP המסומן בעוצמת פלואורסצנטיות בתוך גלומרולי סינפטי VM7 שנחשף מ-0-1 dpe לבקרת רכב הריח (שמן, ירוק), 15% EB (באמצע, כתום) או 25% EB (מימין, שחור). (C) תוצאות מייצגות של נפחי העצבוב התלת-ממדי של VM7 glomeruli באותם תנאי חשיפה לריח בתקופה קריטית. תרשימי הפיזור מציגים את כל נקודות הנתונים הבודדות עם ממוצע ± SEM. המשמעות מסומנת כ - p≤0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***) ו - p ≤ 0.0001 (****). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ניתן להשתמש בפרוטוקול החשיפה לריח והדמיית המוח המוצגים כאן כדי לגרום ולכמת באופן מהימן גיזום גלומרולי סינפטי של נוירוני חוש הריח תלויי ניסיון במהלך תקופה קריטית מוקדמת בחיים. מחקרים מוקדמים יותר שהשתמשו בפרדיגמת טיפול זו כדי לחקור שיפוץ מעגלי ריח החלו בחשיפה לריח^{ביום השני} לאחר אקלוסיה ^3,4,5. לעומת זאת, אנו מתחילים להיחשף לריח בגלמי פאראט לפני האקלוסיה הבוגרת ומגלים שהרוב המכריע של השיפוץ מתרחש במהלך 24 השעות הראשונות לאחר האקלוסיה ^8,9. לכן, צעד חיוני בפרוטוקול החשיפה הזה לריח הוא להכניס גלמים כהים מבוימים לתאי ריח לפני האקלוסיה (איור 1). זה לא נועד לחשיפה לריח גולם כשלעצמו, אלא כדי להבטיח חשיפה לריח מיד עם האקלוסיה של הבוגר. בחרנו מבוגרים צעירים סגורים 4 שעות לאחר ההיערכות כדי לסנכרן גילאים בתוך חלון זמן צפוף ולהימנע מהבדלים בזמני החשיפה לריח. מרווח התנסות מוקדם זה עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרונים המוכיחים כי התרגלות חוש הריח של EB נסגרת לאחר יומיים בלבד לאחר אקלוסיה¹⁰. עם זאת, ההשלכות של הבדלי תזמון החשיפה לריח בתקופה הקריטית (למשל, 0-1 לעומת 1-2 ימים) לא אופיינו היטב. Or42a נוירוני חוש הריח מעצבבים באופן סלקטיבי את VM7 glomerulus באונת האנטנה, אשר מזוהה בקלות על סמך מפות גלומרולריות מדויקות ותיוג עצבוב ממוקד (למשל, Or42a-mCD8::GFP; איור 2). חשיפה לריח EB במהלך התקופה הקריטית אינה משנה את ביטוי מקדם Or42a או את רמות^{הכתב 8}. חשיפה מתוזמנת לריח גורמת לסילוק סינפסות רציף ולאובדן עצבוב אקסונים מנוירונים קולטני Or42a. גיזום זה הפיך לחלוטין בתקופה הקריטית של תחילת החיים (0-2 dpe) אך לא בבגרות בוגרת (7-9 dpe) כאשר שינויים בסביבת הריח כבר לא משנים את העצבוב. הגבלת הזמן ההדוקה של מנגנון זה התלוי בחוויה חושית היא שאלה מרכזית ובולטת בתחום. נעשים ניסיונות רבים לפתוח מחדש פלסטיות קריטית דמוית תקופה בבגרות. הפרוטוקול שניתן כאן הוא אפיק חקירה רב עוצמה.

קלות החשיפה לריח ופרוטוקול הדמיה מוחית המתוארים כאן מאפשרים נגישות רחבה ויכולת הסתגלות רחבה. חוויית החשיפה לריח, סיומה ומשכם נתונים לחלוטין לשיקול דעתו של החוקר כדי לאפשר מחקרים ממוקדים של תכונות התקופה הקריטית, הפיכות שיפוץ ופתיחה מחדש של פלסטיות דמוית תקופה קריטית. באופן דומה, ניתן לתמרן בקלות את עוצמת חוויית הריח לחקר גיזום גלומרולי סינפטי תלוי מינון (איור 3). חשוב לציין, מחקרים המשתמשים בריכוזי EB נמוכים יותר (למשל, 15% EB) יכולים לשמש לבדיקת מניפולציות שיכולות לשפר את קצב או היקף העיצוב מחדש של גלומרולי סינפטי. לדוגמה, התוצאות יכולות להראות גיזום סינפטי ברמות EB נמוכות יותר (למשל, 15%) שלא ניתן להבדיל בינן לבין רמות EB גבוהות יותר (למשל, 25%). במניפולציות שונות, ניתן להשוות את התוצאות לעצבוב עקבי של בקרות רכב ריחניות ולגיזום גלומרולי סינפטי חזק המתרחש ב-25% EB (איור 3). מגבלה אחת של שיטה זו היא שהחשיפה לריח תלויה לחלוטין בתנודתיות של הריח המומס. גורמים משתנים כגון טמפרטורה ולחות יחסית משפיעים על יעילות החשיפה לריח⁸. צפיפות הזבובים בתאי הריח יכולה גם להשפיע על החשיפה לריח, למשל, באמצעות ייצור ריחות שמקורם בזבובים. צפיפות של לא יותר מ 20-25 זבובים לכל בקבוקון מומלץ. ריכוז הריח הנדרש כדי לגרום לגיזום גלומרולי סינפטי חזק מאוד הוא ככל הנראה גבוה יותר ממה שנחווה בדרך כלל בטבע^10,17. טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה בהרבה יידרשו כדי להעריך סילוק סינפסות בריכוזי ריח נמוכים יותר. עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר מחקרים עקביים ואמינים למגוון מניפולציות.

יש יתרונות עצומים לחשיפה לריח ולפרוטוקול דימות מוחי זה. דרוזופילה הוא מודל בעל יתרונות עצומים לבעלי חיים המבוסס על ארגז כלים גנטי נרחב ומתוחכם, שניתן לנצלו באופן שיטתי למחקר רחב של אינטראקציות גן-סביבה בעיצוב מחדש של מעגלי ריח בתקופות קריטיות. דוגמאות המוצגות כאן כוללות את קו הדרייברים הטרנסגניים Or42a-Gal4, סמן הממברנה UAS-mCD8::GFP והיתוך ישיר Or42a-mCD8::GFP. אין הבדלים ברורים בין גיזום גלומרולי סינפטי עם היתוך ישיר Or42a לעומת גישות תיוג עקיפות Gal4/UAS ^8,9. מנהל ההתקן Or42a-Gal4 מספק את היכולת גם לתפעל את נוירוני קולטן הריח הממוקדים וגם לדמיין שינויים תלויי חוויה בעצבוב VM7, בעוד שקו האיחוי הישיר משחרר את המערכת המהונדסת הבינארית UAS-Gal4 למניפולציות ממוקדות תאים אחרות. ניתן להשתמש בקווים מוטנטיים וטרנסגניים רבים אחרים מארגז הכלים הנרחב של דרוזופילה כדי לבחון מנגנונים תלויי הגבלה טמפורלית וניסיון, כולל זיהוי תאים המתווכים גיזום סינפטי, מסלולי האיתות הבין-תאיים המעבירים מידע על חוויית הריח, והמנגנון התוך-תאי הדרוש לסילוק סינפסות ממוקד. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר חקירה שיטתית של מנגנונים רבים המניעים עיצוב מחדש של מעגלי המוח התלויים בחוויית הריח. חשיפה לריח ופרוטוקול הדמיה מוחית זה יכולים לשמש גם לחקר חוויות ריח קריטיות ספציפיות לתקופה, שינויים התנהגותיים, מניפולציות גנטיות ותרופות שעשויות לאפשר פתיחה מחדש של פלסטיות דמוית מחזור קריטית בבגרות והיבטים אחרים של פלסטיות מעגלי הריח מעבר לגיזום גלומרולי סינפטי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>לחשיפה לריח
Drosophila בקבוקונים	Genesee Scientific	32-110
אתיל בוטיראט	סיגמא אולדריץ'	E15701
צינורות מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-129
שמן מינרלי	Sigma Aldrich	M3516
תאי ריח	Glasslock
	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
רשת תיל	Scienceware	378460000
<חזק>דיסקציה מוחית
אתנול, 190 הוכחה	Decon Labs	2801	מדולל ל-70%
מלקחיים	כלי מדע עדינים	11251-30	Dumont #5
פרפורמלדהיד	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	157-8	מדולל ל-4%
צלחות פטרי	פישר סיינטיפיק	08-757-100B
מי מלח חוצץ פוספט	תרמו פישר סיינטיפיק	70011-044	מדולל ל-1x
סוכרוז	פישר מדעי	BP220-1
סילגארד	מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי	24236-10
טריטון-X 100	פישר סיינטיפיק	BP151-100
<חזק>מוח אימונוציטוכימיה
488 עיזים נגד עוף	Invitrogen	A11039
546 עזים נגד חולדות	Invitrogen	A11081
אלבומין סרום בקר	סיגמא אולדריץ'	A9647
עוף נגד GFP	Abcam	13970
כיסויים	Avantor	48366-067	25 x 25 מ"מ
סרט דו צדדי	סקוטש	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	17984-25
שקופיות מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-544-2	75 x 25 מ"מ
לק	סאלי הנסן	109	Xtreme Wear, סרום
עזים רגיל	סיגמא אולדריץ'	G9023
עכברוש אנטי-CadN	מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה	AB_528121
<חזק> קונפוקל/אנליזה
כל מחשב/מחשב נייד
מיקרוסקופ קונפוקלי	Carl Zeiss Zeiss		510 META
תוכנת פיג'י	פיג'י		גרסה 2.14.0/1.54f