מאמר שיטה

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66631

⸱

8 במרץ 2024

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

במאמר זה

סיכום

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

תקציר

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. תהליך זה חיוני לתפקוד תקין של המוח, וחוסר ויסות שלו עלול לגרום להפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות לאחר הלידה. למעשה, גנים רבים האחראים למחלות אלה נמצאו מעורבים בתהליך זה, ולכן חשיפת האופן שבו מוטציות אלה משפיעות על הדינמיקה התאית חשובה להבנת הפתוגנזה של מחלות אלה. פרוטוקול זה מציג טכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח המתקבלות מעוברי עכברים. תאים מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים באמצעות אלקטרופורציה ברחם , המדמה תאים בודדים הנודדים מאזור החדר עם יחס אות לרעש גבוה. יתר על כן, מערכת העברת גנים in vivo זו מאפשרת לנו לבצע בקלות ניסויים של רווח תפקוד או אובדן תפקוד על הגנים הנתונים על ידי אלקטרופורציה משותפת של הביטוי שלהם או וקטורים knockdown/knockout. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח את התנהגות הנדידה ומהירות הנדידה של תאים בודדים, מידע שלעולם אינו מתקבל ממוחות קבועים.

מבוא

במהלך התפתחות קליפת המוח, גליה רדיאלית (אפיקלית) באזור החדר הפליאלי (VZ) המצפה את החדר הצידי מייצרת תחילה נוירונים ולאחר מכן אבות גליה עם תקופה חופפתכלשהי 1. תאי עצב נוצרים גם מאבות ביניים או מתאי גליה רדיאליים בסיסיים באזור התת-חדרי (SVZ) הסמוך ל-VZ, שניהם נובעים מהגליה הרדיאלית (אפיקלית) 2,3. בעכברים, תאי גליה רדיאליים מייצרים רק תאי עצב ביום העוברי (E) 12-14, גם תאי עצב וגם אבות גלייה ב-E15-16, ואבות גלייה מ-E17 ואילך4. האוכלוסייה העיקרית של אבות גליה שנוצרו במהלך שלבים עובריים אלה מתמיינת באופן מועדף לאסטרוציטים, אם כי תאים מסוימים מתמיינים גם לאוליגודנדרוציטים5. תאי עצב ואבות אסטרוציטים הנוצרים בשלבים אלה נודדים לעבר פני השטח של המוח ונכנסים ללוח קליפת המוח (החומר האפור קליפת המוח העתידי). הגירה עצבית מה- VZ לצלחת קליפת המוח מתרחשת במספר שלבים. תאי עצב מאמצים תחילה מורפולוגיה רב-קוטבית ממש מעל אזור הצטברות התאים הרב-קוטביים (MAZ), החופפים את SVZ או אזור הביניים, שם הם מאריכים במרץ ונסוגים תהליכים דקים מרובים ונודדים לאט (נדידה רב-קוטבית)6,7. לאחר כ-24 שעות, תאי עצב הופכים למורפולוגיה דו-קוטבית, המאריכה תהליך מוביל עבה לעבר פני השטח של המוח ותהליך נגרר דק לאחור, ונודדים באופן ליניארי לעבר פני השטח של המוח באמצעות תהליך רדיאלי הנמשך מהגליה הרדיאלית אל פני השטח של הפיאל כפיגום, הנקרא מצב תנועה 2,8. מאחר שתאי עצב במצב תנועה תמיד מגיעים לפני השטח החיצוניים ביותר של לוח קליפת המוח, ועוברים דרך קודמיהם ממש מתחת לאזור השוליים, תאי עצב מיושרים באופן תלוי תאריך לידה מבפנים החוצה בלוח קליפת המוח 9,10,11.

לעומת זאת, אבות אסטרוציטים נודדים במהירות לאזור הביניים וללוח קליפת המוח, עם שינויי כיוון תכופים. התנהגות הגירה זו שונה לחלוטין מהגירה עצבית ונקראת הגירה לא יציבה5. אבות אסטרוציטים נודדים גם לאורך כלי הדם בתהליך שנקרא נדידה מונחית כלי דם. אבות אסטרוציטים עוברים בין מצבי נדידה אלה ומגיעים ללוח קליפת המוח 5,12. למרות המיקום של אסטרוציטים אינו נקבע בקפידה על ידי תאריך הייצור שלהם, נטייה קלה עבור אסטרוציטים שנולדו מוקדם להתיישב בחלק השטחי של צלחת קליפת המוח נצפתה5. באופן מעניין, אסטרוציטים המתיישבים בלוח קליפת המוח נוצרים בשלבים עובריים ובסופו של דבר מתמיינים לאסטרוציטים פרוטופלסמיים, בעוד שאסטרוציטים שנוצרו לאחר הלידה אינם נודדים באופן פעיל, נשארים בחומר הלבן ומתמיינים לאסטרוציטים סיביים5. כיצד מתרחש מפרט תלוי שלב זה של תת-סוגים אסטרוציטיים עדיין אינו ברור.

מספר גדל והולך של גנים המעורבים בהגירה עצבית זוהו, כולל אלה המעורבים בהפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות13,14. לכן, חיוני להבהיר את ההשפעות של מוטציות בגנים אלה על ההתנהגות של נוירונים נודדים. כאמור, הגירה עצבית מתרחשת במספר שלבים. תצפיות בהילוך מהיר יכולות לקבוע ישירות את השלב המושפע בעיקר (יציאת מחזור התא, מעבר רב-קוטבי-דו-קוטבי, מהירות נדידה של תנועה וכו '). עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המפרט, ההגירה והמיקום של אסטרוציטים עדיין אינם ידועים במידה רבה. בהתחשב בכך שאסטרוציטים ממלאים תפקידים מכריעים בסינפטוגנזה15 ובהיווצרות מחסום דם-מוח במהלך התפתחות המוח16, פגמים התפתחותיים באסטרוציטים עלולים לגרום להפרעות נוירו-התפתחותיות. מחקרים בהילוך מהיר על אבות אסטרוציטים עשויים להבהיר מנגנונים מולקולריים אלה ואת הקשר שלהם עם מחלות נפש.

פרוטוקול זה מספק שיטה לתצפית בהילוך מהיר של תאים שמקורם בקליפת המוח VZ. פרוטוקול וידאו דומה לתצפית על הגירה עצבית כבר פורסם17. במאמר זה אנו מתארים את השיטה הן עבור תאי עצב נודדים והן עבור אבות אסטרוציטים. כדי לתייג תאים אלה עם חלבונים פלואורסצנטיים, כגון חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים (GFP ו- RFP), תערובות פלסמיד המכילות רכיבים מתאימים מוכנסות לתוך VZ קליפת המוח על ידי אלקטרופורציה ברחם בשלבים המתאימים 18,19,20,21. העוברים שעברו מניפולציה מוסרים בשלבים הרצויים, והמוח נחתך ומשמש לתצפיות בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר. את מהירות הנדידה, הכיוון והתנהגויות אחרות, שלעולם אינן מטופלות באמצעות דגימות מוח קבועות, ניתן לבחון באמצעות שיטה זו. שימוש באלקטרופורציה ברחם, ביטוי ווקטורים של הדחה/נוקאאוט יכולים להיות מועברים בקלות במקביל לווקטורים של חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר לנו לבצע מחקרי רווח תפקוד ואובדן תפקוד של גנים ספציפיים.

פרוטוקול

המחקר הנוכחי בוצע באישור ובהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון למחקר התפתחותי, מרכז הנכות ההתפתחותית של אייצ'י (#2019-013) ואוניברסיטת קאיו (A2021-030). עכברי ICR (סוג בר) בהריון מתוזמן הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון את הקשר בין תאים נודדים וכלי דם, נעשה שימוש בעכברי Flt1-DsRed, שבהם תאי האנדותל מבטאים DsRed22. עכברי Flt1-DsRed זכרים הוצלבו עם נקבות עכברי ICR (שני העכברים היו בגיל 8-24 שבועות). כל בעלי החיים שוכנו ועברו מניפולציה בתנאים ספציפיים נטולי פתוגן (SPF) עד לדגימה. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. באלקטרופורציה ברחם

  1. הכינו תמיסת מלח חוצצת HEPES (HBS) על ידי הוספת נפח שווה של מים אוטוקלאביים ל-2x HBS הזמינים מסחרית.
  2. ישנן שתי אפשרויות של הרדמה; איזופלורן (שאיפה) ו-MMB (הזרקה). במקרה של שימוש MMB, להכין אותו כדלקמן. הוסף 0.75 מ"ל של medetomidine (1 מ"ג / מ"ל), 2 מ"ל של midazolam (5 מ"ג / מ"ל), ו 2.5 מ"ל של butorphanol (5 מ"ג / מ"ל) ב 19.75 מ"ל של מים autoclaved23.
    הערה: תמיסת הרדמה זו הופכת לפחות פעילה תוך חודשיים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עם מגן אור.
  3. הכן פתרון atipamezole. לדלל 0.75 מ"ל של atipamezole (5 מ"ג / מ"ל) עם 24.25 מ"ל של מים autoclaved.
  4. הכינו תמיסה ירוקה מהירה של 0.2% (w/v) במים אוטוקלאביים. לעקר עם מסנן (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר).
  5. הכינו פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד קונבנציונלית המבוססת על ליזה בסיסית וטיהור עמודים23 בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). להמיס את הפלסמיד המטוהר מתרבית חיידקים של 100 מ"ל ב-30-50 מיקרוליטר של HBS כדי להכין את ציר הפלסמיד (3-5 מיקרוגרם/מיקרוליטר) (קובץ משלים 1).
    1. מערבבים ומדללים את ציר הפלסמיד עם HBS, ומוסיפים נפח של 1/10 של 0.2% ירוק מהיר כדי לצבוע את המזרק. המרכיבים והריכוזים הסופיים של הפלסמידים נקבעים בהתאם לייעודם (טבלה 1).
  6. הפוך את micropipettes על ידי משיכת נימי זכוכית באמצעות מושך פיפטה.
    הערה: קצה הפיפטה נחתך בצורה אלכסונית באמצעות מלקחיים עדינים. הקוטר החיצוני של הקצה הוא כ-70 מיקרומטר. סמן את המיקרופיפטות במרווחים של 2 μL על ידי מציצת 2 μL מים.
  7. יש להזריק חומר הרדמה MMB במינון של 10 μL/g משקל גוף תוך צפקי לעכברה בהריון בשלב מתאים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד).
    הערה: השלבים העובריים שיש לבצע מניפולציה צריכים להיקבע בהתאם למטרה. כדי לתייג נוירונים פירמידליים עתידיים II/III, E14.5 מתאים. כדי לסמן אבות גלייה, אלקטרופורציה חייבת להתבצע על E15-16. לחילופין, ניתן להרדים את העכברים בשאיפת איזופלורן (1%-2%).
  8. לאחר שהעכבר מורדם עמוק, הניחו אותו על צלחת חמה ב 38 מעלות צלזיוס.
    הערה: ודא שהעכבר אינו מגיב לצביטת הזנב.
  9. לאחר הסרת הפרווה סביב אתר הניתוח באמצעות קרם דפילטורי, יש לחטא את אזור הניתוח מספר פעמים בתנועה מעגלית עם פילינג על בסיס יוד ואלכוהול 70%. בצעו חתך עור באורך 2 ס"מ לאורך קו האמצע מגובה זוג הפטמות השניהאחורי ביותר מלפנים, ולאחר מכן חתך בקו האמצע של 2 ס"מ בדופן הבטן לאורך קו האמצע (איור 1A).
    הערה: בתהליך החתך בדופן הבטן, הרימו אותו מעט בעזרת מלקחיים עדינים כדי לא לחתוך את האיברים הפנימיים.
  10. הניחו יריעת פלסטיק סטרילית על העור ופיסת נייר טישו סטרילית עליה (איור 1A). צור חור במרכז כדי לחשוף את אזור הניתוח.
    הערה: יריעת הפלסטיק הסטרילית ונייר הטישו הסטרילי מונחים לאחר ביצוע החתך מכיוון שנדרש שדה ראייה רחב כדי למקם את החתך המתייחס למיקום הפטמות.
  11. הרטיבו את הנייר עם PBS סטרילי, התבוננו היטב בקרני הרחם מהחתך, ומשכו את קרן הרחם דרך חורי גיליון הפלסטיק והנייר.
  12. באמצעות מיקרופיפטה המחוברת למכלול צינור אספירטור, הזריקו 1 מיקרוליטר של תערובת הפלסמיד לחדר הצדדי השמאלי או הימני דרך דופן הרחם באמצעות לחץ פקיעתי (איור 1A).
    הערה: לחלופין, ניתן להזריק פלסמיד באמצעות מיקרו-מזרק.
  13. צבטו את ראש העובר עם אלקטרודה מסוג טוויטר והפעילו פולסים אלקטרוניים באמצעות אלקטרופורטור (35 וולט עבור E14-16, 50 וולט עבור E17, 50 מילישניות פולסים מרובעים עם מרווחים של 450 מילישניות, 5 פעמים) (איור 1A).
    הערה: אין לצבוט את ראש העוברים בחוזקה, דבר שיפגע בעוברים. הזרם בפועל צריך להיות 40-70 mA.
  14. הניחו את קרן הרחם בחזרה לחלל הבטן.
  15. תפרו את דופן הבטן באמצעות חוט משי 5-0.
  16. החל תמיסת atipamezole במינון של 10 μL / g משקל גוף intraperitoneally.
  17. תפרו את העור באמצעות חוט משי 5-0.
    הערה: ניתן לסגור את העור באמצעות קליפ אוטומטי.
  18. שמרו את העכברים שעברו מניפולציה על צלחת חמה למשך 30 דקות לפחות. העכברים יתחילו לנוע בכלוב.
    הערה: ההליך של אלקטרופורציה ברחם (משלבים 1.7 עד 1.16) צריך להיעשות בתוך 30 דקות. זמן הפעולה הטיפוסי הוא 20 דקות.

2. הכנת פרוסות

הערה: טריות הפרוסות היא המפתח להצלחת ניסוי זה. יש להכין את הפרוסות (משלבים 2.5-2.12) תוך שעתיים.

  1. הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס עם Ca2+ ו-Mg2+; HBSS(+). הוסף 5 מ"ל של CaCl2 (14 גרם / ליטר, autoclaved) ו- 5 מ"ל של MgSO 4.7H2O (20 גרם / ליטר, autoclaved) ל 500 מ"ל של HBS(-). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש לבעבע את התמיסה עם גז 95% O2 + 5% CO2 למשך 5 דקות על קרח לפני השימוש.
  2. הכינו את מדיום התרבות. יש צורך בלפחות 2.5 מ"ל למנה. הוסף 2 מ"ל של סרום בקר עוברי, 25 μL של L-גלוטמין (200 mM), 200 μL B27 (50x), 50 μL של פניצילין + סטרפטומיצין (10 K יחידות / מ"ל ו 10 מ"ג / מ"ל) ל 8 מ"ל של מדיום נוירובזאלי.
  3. הכינו ג'ל אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה 3%. נקבוביות 50 מ"ל של HBSS(+), ואז להוסיף 1.5 מ"ג של אגרוז טמפרטורת התכה נמוכה, ו autoclave אותו. המיסו את האגרוז במיקרוגל ושמרו אותו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס באינקובטור אמבט מים לפני השימוש.
  4. מוסיפים 1.9 מ"ל של מדיום תרבית לצלחת בסיס זכוכית. הניחו עליו תוספת של תרבית תאים בזהירות כדי לא ללכוד נורות אוויר מתחת למסנן, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית למסנן (איור 1B). מניחים אותו על קרח.
  5. לאחר הרדמת העכברים שעברו מניפולציה על ידי שאיפת איזופלורן 5%, יש להקריב אותם על ידי נקע צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) בשלבים המתאימים למעקב.
    הערה: יומיים (48 שעות) ו-3 ימים לאחר אלקטרופורציה ב-E14.5 מתאימים לצפייה במעבר רב-קוטבי-דו-קוטבי ובמצב תנועה, בהתאמה.
  6. הוציאו את העוברים והניחו אותם בצלוחית פטרי עם PBS קר.
  7. בחר את העוברים על ידי ביטוי של GFP או חלבונים פלואורסצנטיים אחרים תחת מיקרוסקופ.
  8. לאחר עריפת הראשים של העוברים, נתחו את המוחות6 תחת מיקרוסקופ מנתח ושמרו אותם בקור HBSS(+).
  9. יוצקים את ג'ל האגרוז המומס בטמפרטורת התכה נמוכה של 3% לתוך קריומולד (ראו טבלת חומרים), ואז מכניסים לתוכו את המוחות ומגלגלים אותם מספר פעמים. מניחים אותו בטמפרטורת החדר עד שהאגרוז מתמצק לחלוטין, ואז מניחים אותו על קרח.
  10. חתכו את המוח באופן קורונלי בעובי של 350 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום רוטט (ראו טבלת חומרים).
  11. סדרו את הפרוסות על המסנן (מקסימום 6 פרוסות לכל מסנן).
  12. הוציאו את מדיום התרבית מבפנים ומבחוץ של המסנן (600 מיקרוליטר בסך הכל). בשלב זה, הפרוסות נלחצות ומקובעות על מסנן. לאחר 5 דקות, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לחלק הפנימי של תרבית התא.

3. הדמיה בהילוך מהיר

  1. שמור את תא התרבית מותקן על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוך ב 37 ° C באמצעות תנור החימום של התא או מכסה מנוע התוחם את המיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני הדמיה כדי למנוע Z להיסחף. אספקת לחות 5% CO2 + 40% O2 גז לתא התרבית.
  2. מניחים את מנת התרבות עם פרוסות שהוכנו למעלה בחדר התרבות.
  3. באמצעות עדשת 20x למרחקי עבודה ארוכים (NA = 0.45), קבל כ- 10 תמונות Z-stack עם צעדים של 5 מיקרומטר כל 15-30 דקות למשך 24 שעות.
    הערה: מומלץ מאוד להשתמש בשלב XY ממונע. זה מאפשר לנו לקבל תמונות משדות אובייקטיביים מרובים. בדרך כלל, אנו מקבלים 10-20 תמונות משדות אובייקטיביים שונים בניסוי אחד בהילוך מהיר.

4. ניתוח הדמיה

  1. המרת תמונות XYZT ל- XYT על ידי הקרנה מרבית של ציר Z באמצעות ImageJ או תוכנה אחרת.
    הערה: אם הפרוסות החליקו במהלך התצפית, התאימו את מיקום התאים בתוך התמונות באמצעות StackRed, תוסף ImageJ, עם הפונקציה שלו של טרנספורמציית גוף קשיח (ראו טבלת חומרים).
  2. עקוב אחר מסלולם של GFP או תאים חיוביים אחרים לחלבון פלואורסצנטי באופן ידני או אוטומטי. ניתן לבצע מעקב ידני ואוטומטי באמצעות MTrackJ24 ו- TrackMate 25,26 (תוספי ImageJ), בהתאמה. מעקב אוטומטי באמצעות TrackMate יעיל לניתוח תאים רבים באופן בלתי משוחד. עם זאת, מעקב ידני באמצעות MTrackJ נשאר שימושי למעקב מדויק של תאים בודדים.

תוצאות

תאי גליה רדיאליים ב-VZ הפליאלי מייצרים רק תאי עצב עד E14, וגם תאי עצב ותאי גלייה ב-E15 ו-E16. כדי לבחון את התנהגויות הנדידה של תאי עצב ותאי גלייה בו-זמנית, סימנו אותם עם GFP משופר (EGFP) ו-RFP, בהתאמה, באמצעות מקדם ספציפי לנוירונים, Tα1 promoter27, ומקדם חלבון גליה פיברילרי חומצי אנושי (hGFAP)28, אשר מופעל באופן מועדף באסטרוציטים. אבות אסטרוציטים חוזרים על חלוקות תאים במהלך הנדידה, מה שמוביל לדילול פלסמיד בתאים. כדי להימנע מכך, נעשה שימוש במערכת וקטורית טרנספוזון המורכבת מפלסמיד תורם (pPB) ווקטור ביטוי טרנספוזון (pCAG-hyPBase)29,30. פלסמיד התורם המשמש כאן (pPB-CAG-LNL-RFP) יש קלטת loxP-neo-loxP (LNL), ומבטא RFP בהתאם Cre recombinase. עכברי ICR (סוג בר; WT) התחשמלו עם הפלסמידים שצוינו באיור 2A ב-E15, והפרוסות הוכנו 3 ימים לאחר מכן. במהלך פרק הזמן הזה, הקבוצה הראשונה של תאי עצב מסוג EGFP+ הגיעה לפני השטח של לוח קליפת המוח (איור 2B), אולם תאי עצב רבים מסוג EGFP+ עדיין נדדו. תצפית בהילוך מהיר בוצעה במשך 24 שעות. במהלך תצפית זו, תאי עצב בעלי תהליך מוביל עבה נדדו באופן ליניארי לעבר פני השטח של המוח בקצב קבוע יחסית בלוח קליפת המוח (19.54 ± 6.21 מיקרומטר לשעה, ממוצע ± סטיית תקן, 70 תאים). מסלולי הנדידה אותרו באופן אוטומטי באמצעות תוכנת TrackMate (קווי מגנטה באיור 2B). באותו שדה אובייקטיבי הודגמו אבות אסטרוציטים באמצעות RFP (איור 2C). מאחר שמקדם hGFAP פעיל גם בתאי גלייה רדיאליים בשלבים עובריים מאוחרים, חלק מתאי העצב שמקורם בתאי הגליה הרדיאליים האלה מבטאים גם RFP (חיצים כחולים באיור 2B,C). תאי עצב אלה כמעט תמיד נגועים בווקטור ביטוי EGFP. לכן, אבות אסטרוציטים זוהו כתאים חיוביים בודדים RFP.

בניגוד לנוירונים, אבות אסטרוציטים נודדים במהירות ובאקראי עם שינויי כיוון תכופים בתוך אזור הביניים והצלחת בקליפת המוח (נדידה לא יציבה)5. נדידת אבות אסטרוציטים אותרה ידנית על-ידי תוכנת MTrackJ (קווי מגנטה באיור 2C), שחשפה את תנועתיותם הגבוהה (88.37 ± 33.61 מיקרומטר לשעה, 5 תאים). כדי לבחון את הקשר בין אבות אסטרוציטים וכלי דם, נעשה שימוש בעכברי Flt1-DsRed, המבטאים DsRed, RFP, בתאי אנדותל. בניסוי זה, אבות האסטרוציטים היו אמורים להיות מזוהים רק על ידי EGFP. לשם כך פותחה מערכת rDIO5 , שבה ניתן לסלק ביטוי EGFP בהתאם ל-hGFAP-Cre בתאי עצב באמצעות מקדם Dcx (מקדם מוקדם ספציפי לנוירון)31-תלוי הפעלה של קבוצה אחרת של רקומבינאז DNA ורצף הזיהוי שלו (Dre-rox) (איור 2D, הרצף של pPB-CAG-rDIO-EGFP מסופק בקובץ משלים 1)32, 33. מערכת rDIO הוכנסה לעכבר Flt1-DsRed ב- E15 על ידי אלקטרופורציה ברחם, ופרוסות הוכנו 24 שעות מאוחר יותר. כתוצאה מכך, נצפה כי אבות אסטרוציטים חיוביים ל-EGFP נדדו באופן פעיל לאורך כלי הדם (נדידה מונחית כלי דם)5 (איור 2E).

figure-results-1
איור 1: זרימה של תצפיות בהילוך מהיר של תאים המסומנים על-ידי אלקטרופורציה ברחם. (A) עכברה בהריון בשלב מתאים מורדמת, וחלל הבטן נחתך. אזור הניתוח מכוסה בפלסטיק סטרילי ודפי נייר סטריליים. קרני הרחם חשופות, ולעוברים מוזרקים 1 מיקרוליטר של תערובת פלסמיד ופולסים אלקטרוניים מוחלים. דופן הבטן והעור נתפרים, והעכברים שעברו מניפולציה מוכנסים בחזרה לכלוב הביתי. (B) פרוסות שהוכנו ממוחות מחושמלים מונחות על המסנן של תרבית תאים (6 פרוסות לכל היותר) בכלי בסיס זכוכית. כלי בסיס הזכוכית המכילים פרוסות מותקנים בתא תרבות. מערכת קיטוע זמן זו כוללת מכסה מנוע אקריל המכסה את כל המיקרוסקופ כדי לשמור על הטמפרטורה ב -37 מעלות צלזיוס. תא התרבית, שבו מסופק גז מעורב לח, מצויד בשלב מיקרוסקופ בתוך מכסה המנוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תצפיות בהילוך מהיר של תאי עצב ואבות אסטרוציטים. (A) שיטה לתיוג דיפרנציאלי של תאי עצב (EGFP, ירוק) ואבות אסטרוציטים (RFP, אדום), ותמונה מייצגת של פרוסה שהוכנה יומיים לאחר האלקטרופורציה בשעתיים מתחילת הדימות בהילוך מהיר (מימין). (ב,ג) תמונות קיטועי זמן של תאי EGFP+ (B) ו- RFP+ (C) באותו שדה אובייקטיבי המוצג ב- (A) - מימין בין שעתיים ל- 21 שעות של תצפית. (B) מסלולים של תאים נודדים מסוג EGFP+ שזוהו אוטומטית על ידי תוכנת TrackMate הוצגו במגנטה. (C) מסלולים של תאי RFP+ אותרו באופן ידני באמצעות תוכנת MTrackJ. תאים חיוביים כפולים מסוג EGFP/RFP, שנחשבים לנוירונים, מסומנים על ידי חיצים כחולים. (D) אסטרטגיית תיוג של אבות אסטרוציטים באמצעות מערכת rDIO בעוברי עכבר Flt1-DsRed. (ה) תוצאה מייצגת של נדידה מונחית כלי דם. תא (חץ) בלט בתהליך מוביל (ראש חץ), ונדד לאורך כלי הדם המבטא DsRed (מגנטה) לעבר פני השטח של הפיאל. CP; צלחת קליפת המוח. איז; אזור ביניים. VZ; אזור חדרי. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר (A-C), 50 מיקרומטר (E). נתון זה נלקח מ Tabata H. et al.5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תאי עצב (שכבות II/III)אבות אסטרוציטיםמערכת rDIO
(תיוג ספציפי לאסטרוציטים)
pCAG-EGFP0.5 מיקרוגרם/μLPPB-CAG-LNL-EGFP0.5 מיקרוגרם/μLpPB-CAG-rDIO-EGFP0.5 מיקרוגרם/μL
או Ta1-EGFP (ספציפי יותר עבור נוירונים)0.5 מיקרוגרם/μLhGFAP-Cre0.75 מיקרוגרם/μLhGFAP-Cre0.75 מיקרוגרם/μL
pCAG-hyPBase0.5 מיקרוגרם/μLpDcx-Dre0.5 מיקרוגרם/μL
pCAG-hyPBase0.5 מיקרוגרם/μL

טבלה 1: רכיבים מייצגים של תערובת פלסמיד עבור כל מטרה. ניתן להחליף וקטורי EGFP בווקטורים מקבילים של RFP או וקטורים אחרים של ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים. כדי לתייג אבות אסטרוציטים, נעשה שימוש במערכת וקטורית טרנספוזון. וקטורי pPB הם וקטורי טרנספוזון PiggyBac לאינטגרציה גנומית. pCAG-hyPBase הוא וקטור ביטוי טרנספוזאז PiggyBac. LNL היא קלטת loxP-neo-loxP לביטוי תלוי Cre. rDIO-EGFP הוא Cre-loxP ו- Dre-roxP תלוי קלטת הפעלה/כיבוי של ביטוי EGFP. כדי לבחון את הפנוטיפ של רווח תפקוד או אובדן תפקוד של גנים רצויים, ניתן להוסיף וקטורי ביטוי או וקטורי הפלה ב 1 מיקרוגרם / μL. יש להתאים את ריכוז הווקטורים הללו בכל מקרה.

קובץ משלים 1: רצפי פלסמיד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

פרוטוקול זה הציג שיטה לתצפית בהילוך מהיר של תאים שמקורם ב- VZ הפליאלי (קליפת המוח). כדי לתייג את התאים הנודדים מה-VZ, השתמשנו באלקטרופורציה ברחם, שבה תאים בודדים סומנו בבירור עם יחס אות לרעש גבוה יותר מאשר בתיוג וקטורי נגיפי. באמצעות אלקטרופורציה ברחם, כל סוג של וקטור בכל שילוב יכול להיות מוכנס בקלות לתוך תאי גליה רדיאלי (תאי גזע עצביים) בעוברים חיים. תאי עצב ואבות גלייה יכולים להיות מסומנים באופן סלקטיבי באמצעות מקדמים שונים. מכיוון שמספר ההעתקים של פלסמידים המוחדרים על ידי אלקטרופורציה ברחם הוא גבוה, ניתן לבצע בקלות מחקרי רווח של תפקוד ואובדן תפקוד על ידי אלקטרופורציה משותפת של וקטורי ביטוי GFP ווקטורים שונים הקשורים לגנים המעניינים, כגון וקטורי ביטוי ווקטורי נוקאאוט/נוקאאוט. יתר על כן, ברחם electroporation יכול לשמש כדי להציג וקטורים פלסמיד לתוך VZ של אזורי מוח שונים מלבד VZ קליפת המוח, אשר מאפשר לנו לצפות בנדידה של סוגי תאים אחרים כגון נוירונים מעכבים, אבות oligodendrocyte מ ganglionic eminences 34,35,36 ונוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס 37.

במחקרי קיטועי זמן, ניתן להעריך את ההשפעות של ניסויי שיפור תפקוד ואובדן תפקוד על התנהגות התא באמצעות תוכנות TrackMate ו- MTrackJ. גנים רבים, כולל אלה האחראים להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמוגבלות שכלית, מעורבים בהגירה עצבית. מחקרי קיטועי זמן יכולים לגלות ישירות כיצד גנים אלה מווסתים את התנהגות התא. בהשוואה להגירה עצבית, המנגנונים המולקולריים של נדידת תאי גליה אינם מובנים היטב. שיטה זו עשויה לחשוף לא רק את ההתפתחות התקינה של תאי גלייה, אלא גם את הגורמים הגנטיים והסביבתיים שיכולים להשפיע על התפתחות גליה ועל הקשר שלה עם מחלת נפש.

המגבלה של שיטה זו היא שהיא תלויה בהכרח בשיטת תרבית פרוסות חוץ גופיות . באופן מעניין, תאי עצב נודדים אינם מאבדים רמזי כיוון לנדידה לעבר פני השטח של המוח, אפילו בפרוסות המעובדות במבחנה. עם זאת, החוקרים חייבים להיות זהירים לגבי חפצים. תאים ליד פני השטח מחוברים למסנן, וקצוות הפרוסות מעוותים בקלות. תאים אלה צריכים להיות מחוץ לניתוח. יש לשקול ניסויי בקרה במידת האפשר. חשוב לציין כי פרוסות המוח מחזירות התפתחות תקינה תוך כ-24 שעות. לכן, יש לקבוע את העיתוי של הכנת פרוסה מאלקטרופורציה כך שהאירועים שיש לנתח יתרחשו בחלון זמן זה. כדי לצפות במעבר רב קוטבי-דו קוטבי, פרוסות צריך להיות מוכן 2 ימים לאחר electroporation. כדי לנתח הגירה במצב תנועה, 3 ימים מאוחר יותר מתאים. התצפית על נדידה מונחית כלי דם היא משימה קשה יותר מזו של ניסויים אחרים. תאי האנדותל מתפרקים בקלות בפרוסות ללא זרימת דם. כדי למזער את השפלת כלי הדם, יש להכין את הפרוסות מהר ככל האפשר ולשמור עליהן במדיום המכיל 20% סרום ו-40% גז O2 . ניסויים משלימים אחרים, כגון ניתוחים היסטולוגיים של מוחות קבועים או הדמיה חיה in vivo באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים, עשויים לחזק את התצפיות שנמצאו בניתוחי פרוסות בהילוך מהיר.

לסיכום, שיטה זו היא האפשרות היחידה לצפייה בהתנהגות התא במשך 24 שעות. עם הפיתוח של וקטורי פלסמיד חדשים, מגוון היישומים של שיטה זו יתרחב עוד יותר בעתיד.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

Tα1 promoter הוא מתנה מ P. Barker ו F.D. מילר. מקדם Dcx הוא מתנה מ Q. Lu. hGFAP-Cre היה מתנה מאלבי מסינג. מערכת וקטורי הטרנספוזון PiggyBac סופקה על ידי מכון סנגר. עכברי Flt1-DsRed סופקו על ידי M. Ema (אוניברסיטת שיגה). עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (מענק מספר JP21K07309 ל- H. Tabata, JP20H05688 ו- JP22K19365 ל- K. Nakajima) וקרן המדע טקדה, קרן הזיכרון Keio Gijuku Fukuzawa לקידום החינוך והמחקר, Keio Gijuku Academic Development Fund ל- K. Nakajima.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכלול צינור שואבDrummond2-040-000
Atipamezole (5 מ"ג/מ"ל)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 מ"מ
תוסף B27Gibco17504-044
Butorphanol (5 מ"ג/מ"ל)MeijiVetorphale
תרבית תאים הכנסMilliporePICM ORG 50
מיקרוסקופ קונפוקליNikonA1RHD25מצויד בעדשה למרחקי עבודה ארוכים (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
תא תרבותTokkenTK-NBCMP
אלקטרופורטורNEPA GeneNEPA21
מהירירוק סיגמא-אולדריץ'F7258
מערבל גזTokkenTK-MIGM01-02
צלחת בסיס זכוכיתIwaki3910-035קוטר בסיס הזכוכית הוא 27 מ"מ
נימי זכוכיתNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
יחידת חימוםTokkenTK-0003HU20בהתאמה אישית, כולל מכסה מנוע ומחמם
hGFAP-CreAddgene#40591מתנה מ- Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-גלוטמין (200 מ"מ)Gibco25030
טמפרטורת התכה נמוכה אגרוזLonza50100
Medetomidine (1 מ"ג/מ"ל)MeijiMedetomin
מיקרו-מזרקNarishigeIM-300
Midazolam (5 מ"ג/מ"ל)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
מדיום נוירו-בזאליGibco21103-049
pCAG-hyPBaseה-cDNA של hyPBase מ-pCMV-hyPBase (מתנה ממכון סנגר) הוכנס למורד הזרם של מקדם ה-CAG של pCAGGS (מתנה מג'יי מיאזאקי).
pDcx-Dreמקדם ה-Dcx מ-Dcx4kbEGFP70 (מתנה מ-Q. Lu) הוחלף עם מקדם CAG של pCAG-NLS-HA-Dre34 (מתנה מ-Pawel Pelczar, Addgene #51272).
פניצילין + סטרפטומיציןGibco15140122
ערכת טיהור פלסמידInvitrogenPureLink HiPure פלסמיד midiprep ערכת (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL קלטת מבית pCALNL-DsRed (מתנה מקוני צ'פקו, Addgene #13769), ו-TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) הוכנסו לאתר השיבוט של pPB-CAG.EBNXN (מתנה ממכון סנגר).
pPB-CAG-rDIO-EGFPהרצף המכיל אתרי רוקס סינתטיים, קלטת DIO סינתטית ו-EGFP cDNA מ-pEGFP-N1 (Clontech, U55762) בכיוון הפוך  הוכנסו לאתר השיבוט של pPB-CAG.EBNXN (מתנה ממכון סנגר). הרצף מסופק בקובץ המשלים.
חולץNarishigePN-31
StackRedתוסף עבור ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
מחט תפרNazmeC-24-521-R מס1 1/2 מעגל, אורך 14 מ"מ
חוט תפרNazmeC-23-B2משי, גודל 5-0
עכברי ICR בהריון מתוזמן (סוג פראי)עכבר
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
אלקטרודה מסוג פינצטהBEX או NEPA GeneCUY650P5 
Tα 1-EGFPEGFP cDNA מ-pEGFP-N1 (Clontech, U55762) הוכנס במורד הזרם של ה-Tα מקדם 1 בפלסמיד 253 (מתנה מ- P. Barker ו- F.D.Miller)
מיקרוטום מיקרוטום רוטטLeica או Zeissמיקרוטום להב רוטט VT1000S או Hyrax V50.
בהתאמה אישית ' יפן SLC ICR

מקורות

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים