מאמר שיטה

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

DOI:

10.3791/66653

⸱

18 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, National Defense Medical College, 2Department of Pharmacology, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחה שיטה להמחשת אקסטרוואזציה של צבע עקב פירוק מחסום דם-מוח (BBB) על ידי מתן שני צבעים פלואורסצנטיים לעכברים בנקודות זמן שונות. השימוש בגליצרול כחומר קריאופרוטקטנט הקל על אימונוהיסטוכימיה באותה דגימה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבעים פלואורסצנטיים משמשים לקביעת מידת הוצאת הצבע המתרחשת עקב פירוק מחסום הדם-מוח (BBB). תיוג עם צבעים אלה הוא תהליך מורכב המושפע ממספר גורמים, כגון ריכוז הצבעים בדם, חדירות כלי המוח, משך הוצאת הצבע והפחתת ריכוז הצבע ברקמה עקב פירוק ודיפוזיה. במודל פגיעה מוחית טראומטית קלה, חשיפה לגלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ (BSWs) גורמת להתמוטטות BBB בחלון זמן מוגבל. כדי לקבוע את הרצף המדויק של פירוק BBB, אוונס כחול ופלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן הוזרקו תוך וסקולרית ותוך קרדיאלית לעכברים בנקודות זמן שונות ביחס לחשיפה ל-BSW. לאחר מכן נרשמה התפלגות הקרינה של הצבע בפרוסות המוח. הבדלים בפיזור ובעוצמה בין שני הצבעים חשפו את הרצף המרחבי-זמני של התמוטטות ה-BBB. צביעה חיסונית של פרוסות המוח הראתה שתגובות אסטרוציטיות ומיקרוגליאליות היו בקורלציה עם אתרי התמוטטות BBB. לפרוטוקול זה יש פוטנציאל רחב ליישום במחקרים הכוללים מודלים שונים של פירוק BBB.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמוטטות מחסום דם-מוח (BBB) ותפקוד לקוי נגרמים על ידי דלקת מערכתית, זיהומים, מחלות אוטואימוניות, פציעות ומחלות ניווניות1. בפגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) הנובעת מחשיפה לגלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ (BSWs), נצפה מתאם מובהק בין עוצמת BSWs לכמות דליפת הצבע הפלואורסצנטי עקב התמוטטות BBB 2,3,4. מאפיין בולט אחד של פירוק BBB ב-mTBI הוא שהוא מתחיל מיד או תוך מספר שעות לאחר החשיפה ל-BSWs ובדרך כלל הוא תהליך חולף שנמשך כשבוע לפני הופעת הפרעות נוירולוגיות כרוניות מעוכבות 3,5,6,7. למרות שהפרטים נותרו לא ברורים, התמוטטות BBB היא חלק מהמפל הפתולוגי ארוך הטווח ועשויה לשמש גם כגורם פרוגנוסטי ב-mTBI6. לכן, הבנת ההתפלגות המרחבית והזמנית של פירוק BBB במוח חשובה.

צבעים פלואורסצנטיים משמשים לקביעת היקף פירוק ה-BBB 3,8. מכיוון שריכוז הצבעים בדם וגודל והיקף פירוק ה-BBB משתנים עם הזמן, נדרשת זהירות בעת פירוש תמונות של אקסטרוואזציה של צבעים. לדוגמה, היעדר אקסטרוואזציה של צבע אינו מעיד בהכרח על היעדר פירוק BBB. לא ניתן לזהות פירוק BBB לפני או אחרי עלייה בריכוז הצבע בדם. גם אם הצבע הצטבר בהצלחה במקום בו התרחשה התמוטטות BBB, ייתכן שהוא אבד עם הזמן לאחר הפסקת הפירוק. באופן כללי, חומרים מסיסים במים ואינרטיים ביולוגית מופרשים במהירות בשתן9. לכן, כדי לקבוע אם פירוק BBB מתרחש בזמן מסוים, מתקבלות התוצאות האמינות ביותר כאשר צבע פלואורסצנטי מוזרק לזרם הדם לתקופה קצרה מיד לפני תיקון החיה. יש להשתמש באופן זה בפלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן בעל משקל מולקולרי ספציפי.

כחול אוונס הוא צבע אזו כחול מוכר עם זיקה חזקה לאלבומין בסרום. הצבע מציג פלואורסצנטיות אדומה כאשר הוא נרגש על ידי אור ירוק במערכות ביולוגיות2. בשל אופיו האינרטי, קומפלקס האלבומין הכחול של אוונס נשאר בדם עד שעתיים, מה שהופך אותו לעוקב שימושי של 69 kDa לתיוג אזורים עם BBB שנפגע למשך זמן זה לפחות 10,11. לכן, חשוב לקחת בחשבון אי ודאות פוטנציאלית סביב הפרמקוקינטיקה והרעילות של אוונס כחול9. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי כחול אוונס ממשיך להצטבר באזורים שבהם ה-BBB נעדר או מופרע7. תכונה זו אפשרה לאוונס בלו לתעד את ההיסטוריה של התמוטטות ה-BBB, בעוד ש-FITC-dextran שימש לתיעוד התמוטטות ה-BBB בנקודת זמן מסוימת לאחר החשיפה ל-BSW. למרות שניתן לתת אוונס כחול תוך ורידי או תוך צפקי10, מתן תוך ורידי מועדף לניסויים רגישים לזמן. מחקר זה נועד להדגים את השימוש בכחול אוונס ו-FITC-dextan כדי לזהות את ההתפלגות המרחבית-זמנית של פירוק BBB בעקבות חשיפה ל-BSW.

שנית, המחקר הציג טכניקה להקפאת פרוסות מוח לאחר התבוננות בפלואורסצנטיות של פירוק BBB והכנת פרוסות דקות יותר המתאימות להליכים אימונוהיסטוכימיים. השימוש בגליצרול כמדיום הרכבה וכחומר הקפאה מפשט את תהליך האימונוהיסטוכימיה. על ידי השוואת תמונות של התמוטטות BBB עם אלה מאימונוהיסטוכימיה, ניתן לתאם את ההתפלגות המרחבית-זמנית של פירוק BBB עם תגובת הרקמה של אותה דגימה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות האתיות לניסויים בבעלי חיים שנקבעו על ידי המכללה הרפואית להגנה לאומית (טוקורוזאווה, יפן). פרוטוקול המחקר אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים במכללה הרפואית להגנה לאומית (אישור מס' 23011-1). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J בני 8 שבועות ובמשקל 19-23 גרם. כפי שמוצג באיור 1, הזרקה בודדת של אוונס כחול וזלוף FITC-dextran בוצעו בנקודות זמן שונות ביחס לחשיפה בודדת ל-BSW. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הרדמה

הערה: זהו פרוטוקול מותאם שמגדיל את כמות המדטומידין פי 2.5 בהשוואה לפרוטוקול המקוריפי 12. המינונים של מדטומידין הידרוכלוריד, מידזולם ובוטאורפנול היו 0.75 מ"ג/ק"ג, 4 מ"ג/ק"ג ו-5 מ"ג/ק"ג, בהתאמה.

  1. הכינו תערובת של מדטומידין הידרוכלוריד (75 מיקרוגרם/מ"ל), מידזולם (400 מיקרוגרם/מ"ל) ובוטאורפנול (500 מיקרוגרם/מ"ל) בתמיסת מלח פיזיולוגית.
  2. יש לתת את התערובת תוך צפקית כדי להרדים את העכבר (10 מיקרוליטר/גרם)13.
  3. לאחר כ-5-10 דקות, ודא הרדמה מספקת על ידי התבוננות בהיעדר צביטת זנב ורפלקסים של נסיגת דוושה.
  4. שמור על חום העכבר עד שהוא מתאושש מהשפעות ההרדמה.

2. חשיפה ל-BSW

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בצינור הלם פנימי14.

  1. הרדמו את העכבר כמתואר בשלב 1.
  2. מקם את העכבר במרחק של 5 ס"מ מקצה היציאה של צינור ההלם, וודא שציר הגוף שלו מקביל לציר הצינור אך אינו מיושר איתו.
  3. ספק חשיפה בודדת ל-BSW עם לחץ יתר שיא של 25 kPa לראש.
    הערה: שמור על חום העכבר עד שהוא מתאושש מהשפעות ההרדמה. עקוב באופן קבוע אחר מצבו של העכבר המטופל. אם נצפים סימני מצוקה, כגון קושי בהאכלה או שתייה, התכופפות או הופעה חריגה ממושכת ללא סימני התאוששות, יש להמית את העכבר ולסיים את הניסוי מוקדם. הימנע ממתן משככי כאבים, מכיוון שהם עלולים להשפיע על תגובת הגליה.

3. הזרקה כחולה של אוונס לווריד הזנב

הערה: יש לתת את התמיסה הכחולה של אוונס דרך הווריד ללא הרדמה. בנוכחות הרדמה, הצבע לרוב אינו חודר לגוף מספיק, ככל הנראה עקב ירידה בלחץ הדם וטמפרטורת הגוף13. אוונס בלו ניתן במינון של 100 מ"ג/ק"ג.

  1. הכינו את התמיסה הכחולה של אוונס (4% משקל/נפח במי מלח) במיקרו-צינור, ולאחר מכן מערבולת ואחסנו אותה בחושך לפני השימוש.
  2. להזריק את התמיסה לווריד הזנב (2.5 מיקרוליטר/גרם)13.

4. זלוף טרנסקרדיאלי עם תמיסת FITC-dextran וקיבוע

  1. הוסף הפרין לתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) כדי לקבל ריכוז של 1 U/mL, ולאחר מכן הוסף FITC-dextan ל-PBS ההפריני כדי להשיג ריכוז של 3 מ"ג/מ"ל.
  2. יש להמיס לחלוטין את אבקת FITC-dextran לפני השימוש. לשם כך יש לנער בעדינות את התמיסה למשך 30 דקות ומעלה. לפני השימוש, בדוק היטב אם יש אבקת FITC-dextran לא מומסת. אם נשאר, המשיכו לנער עד להמסה מלאה.
  3. הרדמו את העכבר כמתואר בשלב 1.
  4. המשך עם פרוטוקול קיבוע הזלוף הסטנדרטי באמצעות משאבה פריסטלטית15,16. ראשית, לחלחל עם PBS הפריני המכיל FITC-dextran למשך 2 דקות בקצב של 4.0 מ"ל לדקה. לאחר מכן, יש להחדיר עם תמיסת חיץ ניטרלית פורמלין של 10% או 4% פרפורמלדהיד-PBS למשך 2 דקות בקצב של 4.0 מ"ל לדקה, ולאחר מכן 8 דקות בקצב של 3.5 מ"ל לדקה.
  5. הסר בזהירות את המוח באמצעות מספריים ופינצטה כירורגית15,16. לאחר הדיסקציה, יש לקבע את המוח למשך הלילה באותו קיבוע (כלומר, תמיסת חיץ ניטרלית פורמלין 10% או 4% פרפורמלדהיד-PBS) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. למחרת, החלף את הקיבוע ב- PBS.

5. עיבוד רקמות מוח

הערה: גם אם קיבוע הזלוף הושלם, כחול אוונס ו-FITC-dextán עלולים להתפזר לתוך המאגר. לכן, יש להשלים את ההליכים המובילים לשלב 6.8 תוך שבוע לאחר קיבוע הזלוף. בנוסף, הימנע מחשיפת הדגימה לאור.

  1. הכן צלחת של 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של 20% גליצרול במאגר פוספט (PB; pH 7.4) בכל באר.
  2. בעזרת פורס מוח, חותכים את המוח ל-12 פרוסות, כל אחת בעובי 1 מ"מ.
  3. מעבירים כל פרוסה לבאר המתאימה של צלחת 24 הבארות ושומרים אותה בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  4. החלף את התמיסה ב-50% גליצרול-PB ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  5. לבסוף, החלף את התמיסה ב 100% גליצרול. לתצפית מיקרוסקופית מיידית, אפשר לפרוסות לעמוד לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפרוסות יהיו כעת שקופות ומוכנות לתצפית מיקרוסקופית.

6. מדידת פלואורסצנטיות של אקסטרוואזציה של צבע

הערה: יעילות תיוג הקרינה משתנה מעכבר לעכבר. לכן, יש לנרמל את עוצמת הקרינה. ערכי הקרינה באים לידי ביטוי ביחס לאלו שבתוך גרעין הרשתית הענק (GRN) מכיוון שאזור זה מושפע באופן מינימלי מטיפול BSW.

  1. הוסף 500 מיקרוליטר גליצרול לתחתית צלחת זכוכית 35 מ"מ.
  2. מעבירים את הפרוסה לתמיסת הגליצרול ומכסים את פני השטח שלה בכוס כיסוי.
  3. הסר עודפי גליצרול מקצה זכוכית הכיסוי.
  4. מדוד את עוצמת הקרינה של הפרוסה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  5. לאחר מדידה מיקרוסקופית מחזירים את הפרוסה לבאר.
  6. חזור על המדידה עבור כל 12 הפרוסות.
  7. מוסיפים 500 מיקרוליטר PB לכל באר ומאחסנים את צלחת 24 הבארות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה; למחרת, הפרוסות יהיו רוויות ב -50% גליצרול-PB.
  8. החלף את התמיסה ב-30% גליצרול-PB ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  9. בצע את ההליכים בשלב 7 תוך מספר שבועות.

7. קריוסקציה ואימונוהיסטוכימיה

  1. הכן צלחת של 24 בארות על ידי הוספת 1000 מיקרוליטר של תערובת של נפחים שווים של מדיום הקפאת רקמות ו -30% גליצרול-PB לבאר 1. לאחר מכן, הוסף 1000 מיקרוליטר של מדיום הקפאת רקמות לבאר 2.
  2. מעבירים את הפרוסה לבאר 1 ומנערים את הצלחת בחום של 4 מעלות למשך שעה.
  3. מעבירים את הפרוסה לבאר 2 ומנערים את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  4. הקפיאו במהירות את הפרוסה עם איזופנטן בעזרת קרח יבש, הקפידו לא לכופף את הפרוסה. אחסן את הפרוסות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.
  5. חתכו בהקפאה את הפרוסה לעובי של 6 מיקרומטר. לאחר הייבוש בשקופית המיקרוסקופ, אחסן את החלקים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  6. לאחזור אנטיגן17, טבלו את החלקים ב-10 מ"מ נתרן ציטראט (pH 6.0), חממו ל-100 מעלות צלזיוס פעם אחת, ולאחר מכן שמרו על 98 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  7. שוטפים את החלקים בהרחבה במים מזוקקים. החלקים מוכנים כעת לצביעה אימונוהיסטוכימית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1A מציג את מהלך הזמן של הזרקת הצבע ביחס להופעת BSW, עם לחץ יתר שיא של 25 kPa. בפרוטוקול 'פוסט', התמיסה הכחולה של אוונס ניתנה תוך וסקולרית שעתיים לפני זלוף FITC-dextran, שנערך 6 שעות, יום אחד, 3 ימים ו-7 ימים לאחר חשיפה ל-BSW. בפרוטוקול 'Pre', התמיסה הכחולה של אוונס הוזרקה מיד לפני החשיפה ל-BSW. בפרוטוקול 'פוסט', ריכוז הכחול של אוונס צפוי להגיע למקסימום שלו כשעתיים לפני קיבוע הזלוף, בעוד שבפרוטוקול 'Pre', הוא צפוי להגיע למקסימום בסביבות זמן החשיפה ל-BSW (איור 1B). ריכוז ה-FITC-דקסטרן בכלי הדם במוח נשמר קבוע במשך 2 דקות במהלך הזלוף.

התווית הכחולה של אוונס הראתה שפירוק BBB החל תוך 6 שעות ונמשך עד 7 ימים לאחר החשיפה ל-BSW (איור 2A). יש לציין כי התמוטטות BBB לא התרחשה מיד לאחר החשיפה ל-BSW, מכיוון שלא הייתה אקסטרוואזציה של צבע כחול אוונס לאחר 3 שעות בפרוטוקול 'Pre' (איור 2B). באופן מפתיע, תיוג ארוך טווח עם כחול אוונס הצביע על אופיו המצטבר בפרוטוקול 'Pre' (איור 2B)7.

השימוש בשני צבעים נפרדים, שכל אחד מהם הוכנס במרווחים של שעתיים או יותר, איפשר לבחון שינויים זמניים בשלמות ה-BBB על ידי השוואת התפלגותם. איור 3 מציג תמונות פלואורסצנטיות של הפרוסות שהראו הבדל משמעותי בהתפלגות של כחול אוונס ו-FITC-dextn.

נצפו נקודות חמות פלואורסצנטיות רבות בגדלים שונים. למרות שחלק מהנקודות החמות היו בהירות מספיק כדי להיות מדורגות בין 0.1% הפיקסלים העליונים, רבות מהן היו בהירות רק במעט מהרקמות שמסביב. הפער בין הצבעים מצביע על כך ששינויים התרחשו במרווח זה. נקודות חמות המציגות רק פלואורסצנטיות כחולה של אוונס הצביעו על התמוטטות BBB מתמשכת בזמן ההזרקה הכחולה של אוונס, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הזרקת FITC-dextran. לעומת זאת, נקודות חמות המציגות רק פלואורסצנטיות של FITC-dextern הצביעו על כך שהפרעה ב-BBB התרחשה בין שתי זריקות הצבע. לבסוף, נקודות חמות המציגות פלואורסצנטיות משני הצבעים הצביעו על פירוק BBB מתמשך במהלך כל תקופת ההזרקה.

איור 4A מציג את מספר הנקודות החמות החיוביות עבור אוונס כחול (כולל נקודות חמות כחולות של אוונס בלבד ושל אוונס כחול/FITC-dextran עם חיוביים כפולים), FITC-dextan (כולל נקודות חמות חיוביות כפולות של FITC-dextn-בלבד ו-Evans blue/FITC-dextran), או שני הצבעים (רק נקודות חמות עם אוונס כחול/FITC-dextran עם חיוביים כפולים). בפרוטוקול 'Pre' בשעה 3 שעות, נצפו נקודות חמות רבות של FITC-dextan בלבד. לאחר 6 שעות ויום אחד בפרוטוקול 'פוסט', זוהו גם נקודות חמות כחולות של אוונס בלבד וגם נקודות חמות של FITC-dextan בלבד. עם זאת, לאחר 3 ימים ו-7 ימים בפרוטוקול 'פוסט', הנקודות החמות היו חיוביות בעיקר לשני הצבעים. ממצאים אלה מצביעים על כך שהתמוטטות BBB התרחשה לאחר 3 שעות, עוצבה מחדש ביום אחד, ונמשכה עד 7 ימים לאחר החשיפה ל-BSW (איור 4B). חשוב לציין, היקף התפלגות ה-BBB נטה לרדת ב-7 ימים, כפי שהוזכר קודם לכן.

לאחר השלמת ניסויי האקסטרוואזציה של הצבע, בוצעה צביעה אימונוהיסטוכימית של הפרוסות7. סריקות התמונה האימונוהיסטוכימית הושוו באופן עקבי לאלו של אקסטרוואזציות הצבע, ואישרו כי השפעת ההעברה של החומרים הפלואורסצנטיים הייתה כמעט זניחה7. כפי שמוצג באיור 5, צבירים של אסטרוציטים ריאקטיביים היו קשורים קשר הדוק לאתרים של התמוטטות BBB. תצפיות נוספות גילו כי מיקרוגליה מופעלת ואמבואידית הייתה נוכחת לצד אסטרוציטים תגובתיים 3 ימים לאחר החשיפה ל-BSW.

figure-results-1
איור 1: תכנון הניסוי. (A) מהלך הזמן של הניסוי. התמיסה הכחולה של אוונס הוזרקה תוך ורידית לאחר (פרוטוקול 'פוסט') או מיד לפני (פרוטוקול 'לפני') חשיפה ל-BSW, בעוד ש-FITC-dextran הוזרקה דרך הלב במשך 2 דקות לפני הקיבוע. (B) ריכוזים צפויים של Evans blue ו-FITC-dextan בכלי הדם בפרוטוקולי 'Post' ו-'Pre', בהתאמה. BSW, גלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ; FITC, פלואורסצאין איזותיוציאנט. איור זה נלקח מ-Nishii et al.7. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: השוואה של עוצמת הקרינה בפרוסות מוח. עוצמת הקרינה של 0.1% הפיקסלים הבהירים ביותר במוח הוערכה על פני כל 12 הפרוסות והושוותה בין התנאים 'פוסט' (A) ו'טרום' (B). השונות והמשמעות של ההבדלים מצוינים. xxx מציין p < 0.001; xxxx מציין p < 0.0001 (ערכי p ממבחן F). *עמ' < 0.05; עמ' < 0.0001 (ניתוח השונות עם מבחן ההשוואות המרובות של דנט). איור זה נלקח מ-Nishii et al.7. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: התמוטטות BBB נצפתה בנקודות זמן שונות באמצעות תיוג כפול עם כחול אוונס ו-FITC-dextran. כחול אוונס (מגנטה), FITC-dextran (ירוק) ותמונות ממוזגות מוצגות. פרוטוקולי הזרקת הצבע מוצגים בצד שמאל. חלק מהנקודות החמות הראו פלואורסצנטיות דומיננטית של כחול אוונס (חץ) או FITC-dextan (ראשי חץ). כוכביות מציינות את מקלעת הכורואיד וכלי הדם הקשורים. BBB, מחסום דם-מוח; FITC, פלואורסצאין איזותיוציאנט; CVO, איברים סביב החדר השלישי. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. איור זה נלקח מ-Nishii et al.7. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: כימות הנקודות החמות הקרינה. (A) מספרי הנקודות החמות החיוביות לכחול אוונס (מגנטה), FITC-dextán (ירוק) ושני הצבעים (אפור). הם נאספו מהתמונות שהתקבלו ב-3 שעות בפרוטוקול 'Pre' וכן מהתמונות שהתקבלו ב-6 שעות, יום אחד, 3 ימים ו-7 ימים בפרוטוקול 'Post'. בין 3 שעות ליום אחד, חלק ניכר מהנקודות החמות הקרינה הראו אי התאמה בין צבעים, בעוד שבין 3 ימים ל-7 ימים, כמעט ולא נצפתה אי התאמה כזו. (ב) סכמה המסכמת את מהלך הזמן של התמוטטות BBB. הציר האנכי מייצג באופן רעיוני את עוצמת דליפת הצבע עקב התמוטטות BBB. דפוס הזיגזג בין 3 שעות ליום אחד מצביע על כך שהמיקום והעוצמה של דליפת הצבע אינם יציבים בתקופה זו. FITC, פלואורסצאין איזותיוציאנט; BBB, מחסום דם-מוח; BSW, גלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ. איור זה נלקח מ-Nishii et al.7. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ביטוי של GFAP ו-Iba1 כסמנים עבור אסטרוציטים ומיקרוגליה, בהתאמה. כל עמודה באיור מכילה תמונות פלואורסצנטיות של אקסטרוואזציה של צבע עם כחול אוונס או FITC-dextern, יחד עם תמונות אימונוהיסטוכימיות GFAP או Iba1. סרגל הצבעים מציין עוצמות פלואורסצנטיות מנורמלות של כחול אוונס ו-FITC-dextan באמצעות אלה בתוך GRN. פרוטוקולי הזרקת הצבע מוצגים בצד שמאל. הפרוסה של יום אחד בפרוטוקול 'Pre' מראה פלואורסצנטיות של כחול אוונס ו-FITC-dextn, בעוד שהפרוסה של 3 ימים בפרוטוקול 'Pre' מראה רק פלואורסצנטיות של כחול אוונס (חיצים). האזורים המסומנים על ידי החצים בתמונות אקסטרוואזציה של הצבע מתיישרים עם התמונות האימונוהיסטוכימיות. ראשי חץ מצביעים על צבירים של אסטרוציטים תגובתיים. נוגדן ה-GFAP הפוליקלונלי סימן אסטרוציטים בתוך החומר הלבן וסביבו, כמו גם ברקמת העצבים הסמוכה ל-pia mater. כתוצאה מכך, אסטרוציטים בתוך ה-DCW וקרוב אליו מסומנים באיור זה. התמונות המוגדלות המתאימות למסגרת או לחץ בעמודה Iba1 מתוארות בכניסות. פסי קנה מידה: 1 מ"מ ו-200 מיקרומטר עבור אקסטרוואזציה של צבע ותמונות אימונוהיסטוכימיות, בהתאמה. GFAP, חלבון חומצי סיבי גליה; Iba1, מולקולת מתאם קושרת סידן מיוננת 1; FITC, פלואורסצאין איזותיוציאנט; BSW, גלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ; DCW, חומר לבן מוחי עמוק. איור זה נלקח מ-Nishii et al.7. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת תיוג כפולה חדשה באמצעות כחול אוונס ו-FITC-dextn שימשה כדי להמחיש במדויק את ההתפלגות המרחבית-זמנית המדויקת של פירוק BBB במוח יחיד. במודל BSW בעצימות נמוכה, נצפו שינויים ניכרים בהיקף, במיקום ובדרגת הוצאת הצבע במוחות שנבדקו (איור 2 ואיור 3). אי התאמות בין צבעים גילו כי פירוק ה-BBB החל כ-3 שעות לאחר החשיפה ל-BSW, כאשר שיפוץ משמעותי התרחש ביום הראשון ונמשך עד היום השביעי (איור 4). במקרים חמורים, מיקרוגליה פעילה גויסו לאתרים של פירוק BBB, ואשכולות של אסטרוציטים תגובתיים היו קשורים קשר הדוק לאזורים האלה (איור 5). על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה על אותן פרוסות המשמשות לניתוח אקסטרוואזציה של צבע, נוצר מתאם מדויק בין תגובות גליה לאקסטרוואזציה של צבע. לנתונים וניתוח מפורטים יותר, עיין ב-Nishii et al.7.

מכיוון ש-FITC-dextran הוזרם בריכוז קבוע למשך זמן זהה מיד לפני קיבוע הזלוף, סביר להניח שהתפלגות ועוצמת הצבע מייצגים במדויק את היקף פירוק ה-BBB בזמן קיבוע הזילוף. עם זאת, הוכח בדוח קודם כי הקרינה של FITC-dextan נוטה להיות חלשה במודל BSW7 בעוצמה נמוכה. תיוג עם כחול אוונס למשך זמן ארוך יותר היה יתרון, מכיוון שהוא יכול לזהות שינויים עדינים יותר בהתפלגות BBB (איור 2). עם זאת, בשל משך התיוג הארוך יותר, ייתכן שתידרש זהירות בעת פירוש תמונות פלואורסצנטיות של כחול אוונס. ריכוז הדם של כחול אוונס היה הגבוה ביותר מיד לאחר ההזרקה וירד בהדרגה במשך כמה שעות (איור 1)11. משערים כי עוצמת התיוג תהיה בקורלציה עם חומרת ומשך פירוק ה-BBB כמו גם ריכוז הדם של אוונס כחול; עם זאת, הוא יקטן באופן אקספוננציאלי לאחר התיקון. כל הגורמים הללו משתנים מעת לעת ומניסוי אחד למשנהו. לכן, אין להסיק מסקנה מתמונה אחת של אקסטרוואזציה של צבע, ושיקולים סטטיסטיים תמיד נחוצים.

בהתאם למטרת הניסוי, ייתכן שיהיה מעניין לשנות את המשקל המולקולרי כמו גם את שילוב הצבעים. במחקר זה נעשה שימוש בשילוב של אוונס בלו ו-FITC-דקסטרן. לאחר קשירה עם אלבומין בסרום, כחול אוונס התנהג כעוקב של 69 kDa, וה-40 kDa FITC-dextan ששימש במחקר זה הראה היקף דומה של התמוטטות BBB כמו כחול אוונס. ההתפלגות המרחבית-זמנית של פירוק BBB נחקרה באופן שיטתי באמצעות שילוב של צבעים הפולטים פלואורסצנטיות שונה7. במחקר קודם שהשתמש בשילוב של אוונס כחול ונתרן פלואורסצאין (376 Da), נתרן פלואורסצאין, בשל משקלו המולקולרי הקטן יותר, יכול היה לתייג טווח רחב יותר של פירוק BBB לאחר חשיפה ל-BSW3. במחקרים אחרים, שילובים של כחול אוונס ו-FITC-דקסטרן בעל משקל מולקולרי גבוה יותר שימשו להשוואת היקף התפלגות ה-BBB18,19. כל הדוחות הקודמים נתנו את אוונס כחול ו-FITC-dextan כמעט בו זמנית. ההיבט הייחודי של הפרוטוקול המוצג כאן הוא ששני הצבעים הוכנסו בנקודות זמן שונות, מה שמאפשר לבחון את ההתקדמות הזמנית של פירוק BBB.

האופי המצטבר של כחול אוונס עשוי להועיל במודלים שונים של פירוק BBB. מכיוון שהוא מתעד את ההיסטוריה של התמוטטות BBB, ניתן להקל על הבנת הופעת המחלה והתקדמותה. חוקרים צריכים להיות מודעים למאפיינים החיוביים והשליליים של צבעים ולנצל אותם במלואם9. לפרוטוקול זה יש מגוון רחב של יישומים עבור מודלים שונים של פירוט BBB.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למאיומי וואטאנאבה על טכניקת ההקפאה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר מתקדם ברפואה צבאית ממשרד ההגנה ביפן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% תמיסת חיץ ניטרלית פורמליןFUJIFILM Wako Chemicals062-01661
אנטי GFAP, ארנבDAKO-AgilentIR524
אנטי IBA1, ארנבFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
עוף נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351מדיום הקפאת רקמות
DomitorOrion Corporationmedetomidine
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24 בארות פוליסטירן שקוף תחתית שטוחה לא מטופלת צלחת תרבית תאים, עם מכסה, עטוף בנפרד, סטרילי, 50/מארזCORNING351147
פלואורסצאין איזותיוציאנט – דקסטרן ממוצע מול משקל 40,000סיגמא-אולדריץ' FD40SFITC-dextran
צלחת בסיס זכוכית 27 מ"מ (זכוכית מס' 1)AGC TECHNO GLASS3910-035צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ
IX83 מיקרוסקופ הפוךOLYMPUS
MAS שקופיות מיקרוסקופ הידרופילי הידרופיליזכוכית מטסונאמיMAS-04
Matsunami  זכוכית כיסוי (מס' 1)  18 x 18 מ"מזכוכית מטסונאמיC018181
הזרקת מידזולם 10 מ"ג [SANDOZ]Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
משאבה פריסטלטיתATTOSJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX
עכבר למבוגרים, 30 גרם, Coronal		ASI INSTRUMENTSRBM-2000Cפורס מוח
VetorphaleMeiji בריאות בעלי חייםVETLI5butorphanol

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971(2015).
  3. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681(2018).
  4. Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
  5. Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
  6. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232(2014).
  7. Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
  8. Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
  9. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385(2015).
  10. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
  11. Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595(2013).
  12. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  13. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771(2012).
  14. Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  16. Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807(2011).
  17. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  18. Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
  19. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Evans BlueFITC Dextran

מאמרים קשורים