שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לייצור תפוקה גבוהה של תעלות כלי דם עם גדלים גמישים ודפוסים רצויים על לוח סטנדרטי של שש בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המכונה כלי על צלחת (VOP). לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לקדם את הפיתוח של טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל בסיכון.

תקציר

חדירות כלי דם היא גורם מפתח בפיתוח טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל פגוע, כגון תפקוד לקוי של האנדותל בעורקים הכליליים ותפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח. טכניקות הייצור הקיימות אינן משכפלות כראוי את השונות הגיאומטרית ברשתות כלי הדם בגוף האדם, המשפיעה באופן משמעותי על התקדמות המחלה; יתר על כן, טכניקות אלה כוללות לעתים קרובות הליכי ייצור רב-שלביים המעכבים את הייצור בתפוקה גבוהה הדרושה לבדיקות פרמקולוגיות. מאמר זה מציג פרוטוקול הדפסה ביולוגית ליצירת רקמות כלי דם מרובות עם דפוסים וגדלים רצויים ישירות על לוחות סטנדרטיים של שש בארות, תוך התגברות על אתגרי הרזולוציה והפרודוקטיביות הקיימים בטכנולוגיית הדפסה ביולוגית. גישת ייצור פשוטה הוקמה כדי לבנות שש תעלות חלולות וניתנות לבודר בתוך הידרוג'ל, אשר לאחר מכן רופדו בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים ליצירת אנדותל פונקציונלי ובשל. האופי הנשלט על ידי מחשב של הדפסה ביולוגית בתלת-ממד מבטיח יכולת שחזור גבוהה ודורש פחות שלבי ייצור ידניים בהשוואה לשיטות מסורתיות. זה מדגיש את הפוטנציאל של VOP כפלטפורמה יעילה בעלת תפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם וקידום גילוי תרופות.

מבוא

רשת כלי הדם בכל גוף האדם מתפקדת כמחסום תחבורה חיוני על ידי ויסות דינמי של חילופי מולקולות ותאים בין הדם והרקמות הסובבות. ויסות זה חיוני למניעת בצקת רקמות ומאפשר חילופי חומרים מזינים ותאים סלקטיביים, ובכך תומך בחילוף חומרים ברקמה והומאוסטזיס¹. חדירות אנדותל משתנה, גורם במצבים בריאותיים רבים, משפיעה הן על חומרת המחלה והן על יעילות הטיפול². אנדותל כלי הדם פועל כמחסום סלקטיבי, המאפשר את המעבר בין כלי דם, רקמות ואיברים. ויסות זה כרוך במספר מנגנונים, כגון סינון בסיסי של מומסים ומולקולות קטנות, שיבוש מכוון של מחסום כלי הדם, והשפעת מולקולות כגון פרוסטגלנדינים וגורמי גדילה על רמות חדירות³.

גורמי מפתח בוויסות זה כוללים צמתים של תאי אנדותל, נדידת לויקוציטים והתפקוד של מחסום הדם-מוח⁴. בהתחשב במורכבותו, התהליך משתנה בסביבות שונות, מערב סוגים שונים של כלי דם ומשתמש במסלולים אנטומיים נפרדים. הבנת היסודות הביולוגיים של חדירות כלי הדם חיונית לפיתוח גישות טיפוליות לטיפול במצבים הקשורים לחדירות כלי דם חריגה. שמירה על חדירות כלי הדם חיונית לבריאות מערכת כלי הדם והרקמות הסובבות אותה; כתוצאה מכך, פגיעה בתפקוד זה מובילה לתפקוד לקוי של האנדותל, מצב שבו האנדותל מאבד את תפקודו הרגיל.

תפקוד לקוי של אנדותל הוא קודמן למספר מחלות נפוצות בבני אדם, כולל יתר לחץ דם, מחלת עורקים כליליים, סוכרת וסרטן ^5,6,7. מצב זה יכול להתבטא במספר דרכים, כולל ירידה בהרחבת כלי הדם, חדירות מוגברת של כלי הדם ונטייה למצב פרו-דלקתי. מצב פתולוגי זה הוא השלב המוקדם ביותר של מספר בעיות לב וכלי דם קריטיות, כגון מחלת לב כלילית, שבץ מוחי ומחלת עורקים היקפיים⁸, אשר ממשיכים להיות הגורמים המובילים לתמותה בארצות הברית¹. תפקוד לקוי של אנדותל משפיע על בריאות הלב וכלי הדם, כמו גם על מחסום הדם-מוח (BBB) וממלא תפקיד מרכזי בהתקדמות של הפרעות נוירולוגיות שונות. תפקוד לקוי יכול להגביר את חדירות BBB, ובכך לאפשר לרעלנים, פתוגנים ותאי מערכת החיסון לחדור למערכת העצבים המרכזית ולתרום להפרעות נוירולוגיות כגון שבץ, מחלת אלצהיימר, טרשת נפוצה וזיהומים במוח⁹.

תפקוד לקוי של אנדותל בסוכרת מסומן על ידי היכולת הנפגעת של האנדותל לווסת את טונוס כלי הדם ולייצר מתווכים מרחיבי כלי דם, כגון תחמוצת החנקן, מה שמוביל לפגיעה בהרחבת כלי הדם¹⁰. מצב זה מוחמר על ידי מסלולים הנגרמים על ידי היפרגליקמיה כגון הפעלת חלבון קינאז C ועקה חמצונית, התורמים באופן משמעותי להתקדמות מחלת כלי דם סוכרתיים¹¹. יתר על כן, סביבה דלקתית נמצאה כמגבירה את היצמדות תאי הגידול לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח בעוד אנדותל דולף דווח כגורם מרכזי בגרורות סרטניות^12,13. הגיאומטריה של כלי הדם נמצאה כמשפיעה ישירות על גרורות בסרטן המוח. תאי הגידול מתחברים באופן מועדף לאזורים בעלי עקמומיות כלי דם גדולה יותר⁷. ממצא זה מדגיש את חשיבותה של גיאומטריית כלי הדם בגרורות סרטניות. חשוב מכך, במצבים כגון פיברוזיס וסרטן, הפרעה בתפקוד מחסום האנדותל לא רק ממלאת תפקיד בהתפתחות המחלה, אלא גם מעכבת את יעילות הטיפול בכך שהיא מעכבת מתן תרופות נאות¹⁴. מחקר על חדירות כלי דם הוא חיוני לקידום הטיפול במחלות לב וכלי דם ומציע תובנות לניהול מחלות אחרות הקשורות לתפקוד כלי דם נפגע.

בהתחשב בתפקיד המכריע של חדירות כלי הדם בבריאות ובחולי, מחקרים רבים התמקדו בבחינת האופי הסלקטיבי של מחסום האנדותל לפיתוח טיפולי באמצעות מודלים של בעלי חיים, לצד פלטפורמות מסורתיות של בדיקות דו-ממדיות ותלת-ממדיות במבחנה. עם זאת, מודלים של בעלי חיים יש מגבלות בגלל הבדלים ספציפיים למין מסוים ובעיות אתיות, כמו גם עלויות גבוהות^15,16. לדוגמה, פייזר הצהירה ב-2004 כי במהלך 10 השנים שקדמו לכך, היא הוציאה יותר מ-2 מיליארד דולר על פיתוחי תרופות שהראו השפעות מבטיחות במודלים של בעלי חיים, אך בסופו של דבר נכשלו בשלבי ניסויים מתקדמים^{בבני אדם 17}. יתר על כן, מודלים דו-ממדיים מסורתיים אינם מחקים במדויק את הארכיטקטורה התלת-ממדית (3D) ואת המבנה הגיאומטרי המורכב של ערוצי כלי הדם.

עם ההתקדמות בטכנולוגיות ייצור ביולוגי, מאמצים נרחבים כוונו לייצור תעלות כלי דם תוך שחזור ארכיטקטורת תלת ממד. ניתן לייצר ביעילות תעלות כלי דם מיקרוסקולריות בתוך שבבים מיקרופלואידים באמצעות ליתוגרפיה רכה, ובכך להציע יתרון של ניתוח בזמן אמת^18,19. שיטות חלופיות, כגון יציקת הידרוג'ל או כריכת יריעות תאים סביב תבנית או מנדל, ניתן להשתמש כדי ליצור מבנים צינוריים עצמאיים בקוטר^{הרצוי 20,21}. עם זאת, שיטות אלה יש מגבלות; לדוגמה, שבבים מיקרופלואידים מוגבלים לתצורות מיקרו-ערוציות, ויציקת הידרוג'ל סביב תבנית אינה משכפלת ביעילות גיאומטריות מרובות.

עם הופעתה של טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית²², שכפול גיאומטריות מורכבות על ידי הפקדה מדויקת של חומרי הידרוג'ל שונים מבוססי מטריצה חוץ-תאית (ECM) הפך לאפשרי ^23,24. שיטות הדפסה ביולוגית מסוימות, כגון אלה המשתמשות בחרירים מסודרים באופן קונצנטרי, למשל, קואקסיאלי וטריאקסיאלי^25,26, אינן יכולות ליצור צינורות מפוצלים; עם זאת, מבנים מורכבים ניתן להשיג עם שיטות דפוס הקרבה²⁷. אף אחת משיטות ההדפסה הביולוגית הללו לא הוכחה כמאפשרת מידול במבחנה בתפוקה גבוהה - דרישה חיונית למחקר פרמקולוגי בגילוי תרופות. כאן אנו מציגים שיטה לייצור יעיל של תעלות כלי דם אנדותליות עם שליטה יעילה על ממדים.

ביססנו גישה פשוטה באמצעות לוחות בעלי שש בארות הזמינים באופן מסחרי, בשילוב עם שיטת דפוס הקרבה שבה מדפסת ביולוגית מייצרת תעלות כלי דם בגדלים ודפוסים רצויים בתוך הידרוג'ל ECM. תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) נזרעו כדי לאנדותל תעלות אלה ולהעריך את הפונקציונליות של אנדותל באמצעות בדיקת חדירות. תכנון זה מאפשר זילוח ללא משאבה על ידי יצירת מאגרי מדיה משני צידי הערוץ ומשתמש בזרימה מונעת כבידה בעזרת נדנדה דו-ממדית נפוצה כדי לחקות את התרבות הדינמית. גישה זו מבטלת את הצורך במשאבות פריסטלטיות ומקלה על המדרגיות של פלטפורמה זו עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה. האופי הנשלט על ידי מחשב של טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית גם מייעל את תהליך הייצור, ובכך מקטין את הסבירות לטעויות במהלך הייצור. מודל VOP מראה הבטחה ככלי רב ערך לבדיקות פרמקולוגיות בגילוי תרופות.

פרוטוקול

1. יצירת קוד G עבור המדפסת הביולוגית

1. כדי ליצור ולהציג באופן חזותי את נתיב ההדפסה, בקר בכלי סימולציה מקוון של G-code (לדוגמה, NCviewer).
2. לחץ על קובץ חדש סמל בממשק כדי ליצור קובץ G-code חדש.
3. צור נתיב הדפסה על-ידי כתיבה ידנית של פקודות G-code עבור ערוץ ההקרבה ותא הסיליקון. השתמש במידות של לוח סטנדרטי בעל שש בארות כנקודת ייחוס ליצירת הגיאומטריה.
   הערה: קוד G המשמש כאן מבוסס על קוד בקרה נומרית ממוחשבת (CNC). הפונקציות של כל פקודה מסופקות בטבלה משלימה S1. פורמט הלוח בעל שש הקידוחים נבחר בשל התאמתו לקוראי מיקרו-צלחות מסחריים ולמערכי מיקרוסקופיה ויכולתו להכיל נפחים מספיקים של מדיה לתמיכה בהבשלת אנדותל, ובכך למזער את הצורך בשינויי מדיה תכופים. פרוטוקול ייצור זה יכול להיות מותאם גם לשימוש עם לוחות באר סטנדרטיים אחרים.
4. לאחר השלמת קוד G, לחץ על שמור קובץ סמל בממשק כדי להוריד את הקובץ עם סיומת .nc.
   הערה: ניתן להשתמש בכל אלגוריתם יצירת G-code זמין אחר כדי ליצור את נתיבי ההדפסה. הגיאומטריה של תעלת כלי הדם ניתנת למניפולציה בקוד G זה.

2. הכנת דיו להקרבת ותא סיליקון

הערה: מקורות עבור כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. שלבו שני סוגים של פולימרי סיליקון, SE1700 ופולידימתילסילוקסאן (PDMS), ביחס של 10:2. הוסף חומר ריפוי של כל פולימר ביחס של 10:1, פולימר לחומר ריפוי.
2. השתמשו במערבל פלנטרי כדי לערבב ולנטרל ביסודיות את תערובת הפולימרים ב-2,000 סל"ד.
3. בעזרת מרית, מעבירים את פולימר הסיליקון המעורב למזרק חד פעמי בנפח 10 מ"ל. צנטריפוגה את המזרק הטעון ב 400 × גרם למשך 3 דקות ב 5 ° C כדי להבטיח עקביות אחידה ולמנוע בועות במהלך ההדפסה.
   הערה: יש להשתמש בדיו התא תוך שעתיים לאחר הוספת חומרי הריפוי כדי להבטיח איכות הדפסה מיטבית. אחסנו את המזרק בטמפרטורה של 5°C בזמן ההכנה להדפסה. תהליך זה מסייע להאט את ריפוי הדיו, דבר שעלול לשנות את פרמטרי ההדפסה.
4. שקול F-127 פלורוני (PF127) להכנת תמיסת מלאי של 40% (w/v) של PF127 במים מזוקקים.
5. ערבבו את תמיסת PF127 במערבל פלנטרי במשך 3 דקות ב-400 × גרם כדי להשיג הומוגניות. שמור את התערובת הומוגנית על 4 ° C להמסה מלאה של PF127.
6. הכינו תמיסת מלאי טרומבין של 1,000 יחידות/מ"ל במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco.
   הערה: אחסן תמיסת מלאי תרומבין ב 100 μL aliquots כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. aliquots צריך להיות מאוחסן ב -20 °C במשך לא יותר מ 6 חודשים.
7. לפני ההדפסה, הכינו דיו להקרבה על ידי ערבוב טרומבין בדילול של 1:10 עם PF127 לריכוז עבודה סופי של 36% (w/v) עבור PF127 ו-100 יחידות למ"ל עבור טרומבין. כדי להכין 1 מ"ל של דיו הקרבה, ערבבו 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי טרומבין עם 900 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PF127.
   הערה: בעת הכנת דיו ההקרבה להדפסת לוח יחיד, נפח כולל של 1 מ"ל הוא די והותר.

3. תהליך הייצור

1. לפני תחילת תהליך הייצור, טפל בצלחת בת שש בארות עם פלזמה חמצן (O₂) בחוזק של 100 וואט למשך דקה אחת.
2. בצע את ההליך המתואר בסעיף 2 כדי להכין הן את דיו ההקרבה והן את דיו הסיליקון, וודא שצבעי הדיו נקיים מבועות ומעורבבים בצורה הומוגנית להדפסה עקבית. טען בזהירות את צבעי הדיו בראש ההדפסה של המדפסת הביולוגית. הגדר את טמפרטורת ראש המדפסת הביולוגית ל- 37°C עבור דיו ההקרבה ו- 5°C עבור דיו הסיליקון.
3. חבר זרבובית מחודדת חוט בורג כפול 22 G למזרק הסיליקון. עבור דיו הקרבה, בחר את גודל הזרבובית בהתאם לקוטר הערוץ הרצוי.
   הערה: כאן, הדגמנו שלושה גדלים של חרירי: 18 G, 20 G ו- 22 G. פרמטרי הדפסה אופטימליים, כולל לחץ הדפסה ומהירות ראש הדפסה, מתוארים בטבלה 1.
4. טען את קוד ה-G הרצוי ולחץ על פונקציית סרוו מוכן בממשק התוכנה של המדפסת הביולוגית למשך 3 שניות. מקם את הלוח על הבמה בנקודת ההתחלה של G-code ולחץ על התחל כדי להתחיל בתהליך ההדפסה.
   הערה: בדרך כלל, ייצור לוח אחד המכיל שישה תאים דורש כשעה ו-10 דקות. שלב 3.4, הכולל טעינה וביצוע של קוד G, כפוף לשינויים בהתאם למדפסת הביולוגית הספציפית שבה נעשה שימוש. ודא שהתנאים הסטריליים נשמרים בעת השימוש במדפסת הביולוגית כדי למנוע זיהום.
5. מניחים מכסה מעל הצלחת ומעבירים את הצלחת לאינקובטור CO₂ לח בטמפרטורה של 37°C למשך 72 שעות כדי לרפא את תאי הסיליקון.
   הערה: למרות שריפוי הסיליקון עשוי להתרחש בקצב איטי יותר בתוך האינקובטור, אין להניח את הצלחת בתוך תנור יבש.

4. הכנת הידרוג'ל והטמעת תעלה

1. הכינו צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של 1x PBS. יש להכניס 0.01 גרם של ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזואילפוספינאט (LAP) לתוך הצינור החרוטי כדי ליצור תמיסת LAP של 0.05% (w/v). מערבבים אותו עד שהאבקה מומסת לחלוטין.
   הערה: עטוף את הצינור החרוטי בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. אחסן את תמיסת מלאי LAP ב- 4 ° C.
2. הוסף 3 גרם של ג'לטין מתקרילט (GelMA) ו 0.2 גרם של פיברינוגן ל 20 מ"ל של תמיסת LAP כדי להשיג ריכוז סופי של 15% GelMA ו 1% פיברינוגן (המכונה GelFib). מניחים את התערובת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים מעת לעת עד שהתמיסה מומסת במלואה.
3. לאחר הייצור כמתואר בסעיף 3, הוסף 300 μL של GelFib שחומם מראש לכל תא הידרוג'ל כדי להטמיע את תבנית ההקרבה. קשר במהירות את ה- GelMA עם אור אולטרה סגול (UV) באורך גל של 405 ננומטר בעוצמה של 85 mW / cm² למשך 120 שניות. חזור על הליך זה עבור כל הבארות האחרות.
   הערה: פיברינוגן מצטלב במהירות במגע עם דפוס ההקרבה המכיל טרומבין. אנו ממליצים להוסיף הידרוג'ל ולבצע קרוסלינקינג UV בנפרד עבור כל באר כדי למנוע ג'לציה לא רצויה של GelMA בטמפרטורת החדר. בנוסף, יש לשמור על תנאים סטריליים כדי למנוע זיהום במהלך תהליך ריפוי UV.
4. הוסף 1 מ"ל של DPBS לכל צד של תעלת כלי הדם בכל באר, ולשמור את הצלחת ב 4 ° C במשך 15 דקות כדי לנזול את PF127.
5. לאחר 15 דקות, יש לשאוב את ה-DPBS ולחזור על שלב 4.5 3x לשטיפה מלאה של PF127.
6. לפני החדרת תאים לתעלות, יש לערבב DMEM F12 המכיל 1% מטריג'ל למשך 30 דקות דרך התעלות כדי לשפר את חיבור התא.

5. תרבות HUVEC

1. מדיום גידול תאי אנדותל טרום חם (ECGM) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
2. בינתיים, שלפו בקבוקון של HUVECs שמורים בהקפאה ממיכל החנקן, שחררו בעדינות את מכסה הבקבוקון, ואז הדקו אותו מחדש כדי לשחרר חנקן מהחוטים. מיד להפשיר את התאים על ידי טבילת הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות, להבטיח כי כמות קטנה של קרח נשאר בתוך הבקבוקון. שטפו את הבקבוקון באתנול 70% כדי למנוע זיהום.
   הערה: יש להרכיב משקפי מגן בעת שליפת תאים ממיכל החנקן. מכסה הבקבוקון חייב להישמר מעל פני המים בתהליך זה.
3. הכינו צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של ECGM שחומם מראש. בעזרת מיקרופיפטה, מעבירים בזהירות את התאים המופשרים מהבקבוקון לתוך הצינור החרוט. כדי להבטיח שלא יישארו תאים מאחור, הוסף 1 מ"ל של מדיום טרי שחומם מראש לקריוביאל, שטוף את החלק הפנימי והעבר את כל התאים הנותרים לתוך הצינור החרוט.
4. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 200 × גרם במשך 3 דקות כדי לקבל גלולה התא. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של תווך טרי, העבירו את התאים לצלוחית T75 והניחו את הבקבוק בתוך אינקובטור CO₂ לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלב זה חשוב כדי להסיר dimethyl sulfoxide נוכח בתווך ההקפאה ב cryovial באמצעות צנטריפוגה.
5. רעננו את המדיום אחת ליומיים עד שהתאים יגיעו למפגש של 80-90%.

6. אנדוטליזציה של ערוצים

1. חימום מראש של ECGM, DPBS, תמיסה מנטרלת טריפסין וחומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (TE) באמבט מים של 37°C למשך 30 דקות.
2. במפגש של 90%, שטפו את התאים בבקבוק T75 עם 10 מ"ל של DPBS, הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% TE לצלוחית, ודגרו עליו במשך 3 דקות.
3. טפחו בעדינות על דפנות הבקבוק והוסיפו 5 מ"ל של תמיסה מנטרלת טריפסין כדי לנטרל את TE. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. השתמש 5 מ"ל של ECGM טרי כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהוסיף אותם צינור חרוט.
4. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 250 × גרם במשך 3 דקות כדי לאסוף את גלולת התא.
5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של אקג"מ טרי. ספור את התאים עם המוציטומטר וחזור על שלב 6.4 כדי לקבל גלולת תא. להשהות מחדש 3 מיליון תאים ב 90 μL של ECGM טרי.
6. לפני הכנסת תרחיף התא לתעלה, יש לשאוב לזמן קצר את שאיבת התעלה כדי לנקות את הלומן.
   הערה: יש להימנע מניניקה ממושכת של התעלה כדי למנוע פגיעה בשלמותה.
7. טוענים בעדינות את התעלה בתרחיף תאים בצפיפות זריעה של 0.5 מיליון תאים לבאר. השתמש micropipette להוסיף ~ 15 μL של השעיה זו כדי למלא את התעלה.
   הערה: צפיפות הזריעה עשויה להשתנות בהתאם לגודל הערוץ. צפיפות זו מותאמת לתעלה המודפסת עם פייה של 20 G וקוטר פנימי של כ- 900 מיקרומטר.
8. מניחים את הצלחת שטוחה בתוך האינקובטור למשך שעתיים. לאחר מכן, הפוך את הצלחת ל- 180°, ושמור אותה במצב שטוח למשך השעתיים הבאות.
9. לאחר 4 שעות, שטפו את התעלה עם DPBS כדי להסיר תאים שאינם דבקים ומתים. הוסף 2 מ"ל של ECGM טרי לכל באר (1 מ"ל לכל צד של התעלה). התחל את התרבות הדינמית על נדנדה בזווית הטיה של 10° ו- 5 סל"ד על ידי מיקום הלוח על הנדנדה כאשר התעלות מקבילות לכיוון הנדנדה. רעננו את מדיום הגידול אחת ליומיים.
   הערה: תרבית דינמית משפרת את חילופי התווך בין המאגרים והתעלות ומסייעת לתאים להתרבות בן לילה.

7. הערכת הבשלת אנדותליום

1. חממו מראש אקג"מ ו-DPBS באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ומגיב Cell Counting Kit-8 (CCK8) בטמפרטורת החדר.
2. צור פתרון עבודה של CCK8 על ידי ערבוב 100 μL של מגיב CCK8 עם 1 מ"ל של ECGM טרי עבור כל באר. בזמן העבודה עבור צלחת / 6 ערוץ, להכין 600 μL של מגיב CCK8 על ידי שילוב עם 6 מ"ל של ECGM טרי.
3. הסר את מדיום הגידול על ידי יניקה ושטוף את התעלות עם DPBS. הוסף 1 מ"ל של פתרון עבודה CCK8 לכל באר ואפשר לצלחת להישאר שטוחה בתוך האינקובטור למשך 30 דקות. לאחר מכן, התחל את התרבות הדינמית על נדנדה כמתואר בשלב 6.9, והמשך בתהליך זה במשך 3 השעות הבאות.
4. לאחר 3 שעות, מוציאים את התכולה מכל באר על ידי הטיית הצלחת לצד אחד, ומעבירים אותם לצלחת חדשה בת שש בארות. שוטפים את התעלות עם DPBS ומוסיפים מדיום טרי.
   הערה: כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום עד למדידת הספיגה. שמור על נפח מגיב עקבי בכל הבארות כדי להבטיח קריאות אחידות. בזמן הפיפט, הימנעו בזהירות מהחדרת בועות אוויר, שעלולות לשבש את הדיוק של קריאות הצפיפות האופטית.
5. לאחר ניעור עדין של הצלחת במשך 15 שניות כדי להבטיח ערבוב אחיד של הצבעים, השתמש בקורא מיקרו-צלחות כדי למדוד את הספיגה ב-450 ננומטר.
6. חזור על הליך זה במרווחי זמן מוגדרים מראש. חשב את הצפיפות האופטית הממוצעת עבור כל נקודת זמן והתווה עקומת צמיחה בתוכנת גרפים. עקומה זו מציינת את ההבשלה היחסית של האנדותל לאורך זמן.

8. בדיקת חדירות

1. הסר את המדיום מבאר עניין אחת.
   הערה: עבור בדיקת החדירות, מומלץ לעבד כל באר בנפרד כדי למנוע התייבשות של ערוצים אחרים, מה שעלול לשנות את חדירות כלי הדם שלהם.
2. הכן 6 מ"ל של תמיסת 0.1 מ"ג/מ"ל של דקסטרן מצומד FITC על ידי המסת דקסטרן FITC 70 kDa ב-DPBS.
   הערה: הכינו תמיסת מלאי של 20 מ"ג/מ"ל של FITC dextran על ידי המסת 100 מ"ג של FITC dextran ב-5 מ"ל של DPBS. לאחר ערבול עדין של התמיסה, aliquot 500 μL לתוך צינורות 1.5 מ"ל כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. aliquots אלה ניתן לאחסן ב -20 °C למשך מקסימום של 6 חודשים. לפני ביצוע הבדיקה, לדלל את תמיסת המניות לריכוז עבודה של 0.1 מ"ג / מ"ל.
3. מקמו את הצלחת בחוזקה על במת המיקרוסקופ והתאימו את הגדלת המטרה במצב ניגודיות פאזה כדי להבטיח ראות ברורה של דופן התעלה באזור העניין, יחד עם הג'ל הממוקם בקרבת מקום, בתוך שדה הראייה.
   הערה: להערכת חדירות יעילה, נסה למקסם את שטח הג'ל המקיף את אזור העניין בשדה הראייה; היבט זה הוא המפתח לניטור מדויק של תחבורה דקסטרן.
4. לאחר התמקדות באזור הרצוי, יש לעבור מניגוד פאזה למצב פלואורסצנטי. תחת הכרטיסייה רכישת תמונה, הוסף FITC לערוץ השדה הרחב, וקבל תמונה לפני הוספת תמיסת דקסטרן, כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של פתרון עבודה FITC dextran לצד אחד של התעלה ותן לתמיסה לזרום לכיוון הצד השני של הבאר, מונע על ידי הפרש הלחץ ההידרוסטטי.
5. קבל תמונות בפרקי זמן קבועים מראש - בתדירות גבוהה יותר עבור ערוצים עם חדירות גבוהה ובתדירות נמוכה יותר עבור ערוצים עם חדירות נמוכה יותר.

9. מדידת עוצמת פלואורסצנטיות ב-ImageJ

1. בתוכנת ניתוח התמונה ImageJ, מדדו את העוצמה בנקודת הזמן הראשונית (I_{t1), את} העוצמה הממוצעת שנצפתה בנקודת הזמן המאוחרת יותר (I_t2) ואת העוצמה הנובעת מרעשי רקע (I_b), כמתואר להלן. השתמש במשוואה (1) כדי לחשב את מקדם החדירות (P_d). T₁ ו- T₂ מתייחסים לנקודות הזמן הראשוניות והמאוחרות יותר של רכישת תמונה.
   (1)
   1. הפעל את ImageJ ופתח את התמונה שנרכשה בנקודת הזמן הראשונית.
   2. הגדר את קנה המידה ב- ImageJ. נווט כדי לנתח | הגדר קנה מידה. הזן את קנה המידה ויחידת המידה הידועים.
   3. בחרו בכלי המלבן ושרטטו מלבן על שטח הג'ל שבו נדרשת מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות.
   4. נווט כדי לנתח | הגדר מדידות וודא שהערך האפור הממוצע מסומן.
      הערה: אפשרות זו מודדת את העוצמה הממוצעת באזור שנבחר. ניתן לבחור פרמטרים אחרים לפי הצורך לניתוח הנתון.
   5. כאשר האזור עדיין נבחר, נווט אל נתח | מדדו או פשוט לחצו על M. המתן עד שייפתח חלון תוצאות , המציג את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת וכל פרמטר אחר שנבחר.
   6. בצע שלוש מדידות וחשב את ערך עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בגיליון אלקטרוני.
   7. חזור על הליך זה עבור התמונות שצולמו בנקודת הזמן הבאה t₂, כמו גם אלה שצולמו לפני הוספת פתרון דקסטרן לחישוב עוצמת הפלואורסצנטיות בנקודת הזמן המאוחרת יותר, כדי לקבוע את פלואורסצנטיות הרקע.

תוצאות

פלטפורמת VOP, הכוללת גמישות בגודל ובתבנית, יוצרה באמצעות מערכת הדפסה ביולוגית מרובת ראשים. תעלות, חלולות ומסוגלות זילוח, נזרעו עם HUVECs כדי להקל על אנדותליאליזציה, ולאחר מכן הוערכו באמצעות בדיקת חדירות (איור 1A). כדי להדגים את יכולת הייצור הרב-ממדית של שיטה זו, הדפסנו שלוש תצורות נפרדות: ישרה, מפוצלת ומפותלת (איור 1B). באמצעות גישת ייצור פשוטה, ניתן לייצר שש תעלות כלי דם חלולות וניתנות לערבול המשובצות בתוך מטריצת הידרוג'ל בתוך צלחת סטנדרטית בעלת שש בארות. לאחר מכן ניתן לבצע אנדותל לתעלות האלה באמצעות HUVECs (איור 2A). התאים מתחברים ומתרבים במהירות כדי לכסות את פני השטח הלומינליים של תעלת כלי הדם (איור 2B). תאים שנצמדים גם למשטח הלומינלי התחתון וגם למשטח הלומינלי העליון מציגים פיזור אחיד בתוך הלומן (איור משלים S1).

הצלחת הונחה באינקובטור לח במשך 3 ימים כדי לאפשר לדיו הסיליקון להחלים תוך הבטחה שתבנית ההקרבה תישאר נקייה מיובש (איור 3A). כדי להעריך את הזרימה דרך ערוצים אלה, הוכנסו מיקרו-כדוריות ירוקות, המוכיחות כי הערוצים ניתנים לבלבול יעיל (וידאו משלים S1). קוטר התעלות השתנה מ-558 ±-38 מיקרומטר ל-1094 ±-45 מיקרומטר על ידי שינוי גודל הזרבובית מ-22 גרם ל-18 גרם במהלך הדפסת דפוס הקרבה. בנוסף, התצורה הגיאומטרית של הערוצים עברה מניפולציה על-ידי שינוי קוד G של המדפסת הביולוגית (קובץ משלים 1) כדי לאפשר הדפסה של תבניות מפותלות ומפותלות (איור 3B).

משך ההצלבה עם UV עבר אופטימיזציה ל-120 שניות, מה שתומך בשגשוג תאים יעיל (איור משלים S2). משך הצלבה זה הביא לסביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית המקדמת התפשטות תאי אנדותל, ככל הנראה בשל התכונות המכניות המאוזנות והנקבוביות של ההידרוג'ל, מה שמקל על התקשרות תאים טובה יותר והתפשטות לאחר מכן. HUVECs התרבו ביעילות על פני השטח הלומינליים והראו מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת ביום 5 לאחר הזריעה. ההבשלה של האנדותל הוערכה באמצעות בדיקת CCK8 שנערכה בימים 1, 3 ו-5 (איור 4A,B). ההבשלה של האנדותל אומתה על-ידי אימונוסטיין עבור CD31 5 ימים לאחר זריעת תאים, אשר הדגימה את הלוקליזציה של CD31 בצמתים הצפופים (איור 4D).

כדי להעריך את תפקוד המחסום של האנדותל, ביצענו תמיסת דקסטרן של 70 kDa דרך התעלות ביום 5 להבשלה. לשם השוואה, נבחרה תעלת ביקורת ללא אנדותל (חשוף). התעלה האנדותלית הראתה שינויים מינימליים בפלואורסצנטיות באזור הג'ל הפריווסקולרי לאורך זמן, מה שמרמז על כך שהאנדותל שמר ביעילות על תפקוד המחסום שלו. אולם התעלות החשופות הראו עלייה בפלואורסצנטיות באזור הג'ל הפריווסקולרי, מה שמצביע על חדירות גבוהה יותר עקב היעדר אנדותל (איור 4C ואיור 4E).

איור 1: הכנת תעלות כלי דם מודפסות ותצורותיהן. (A) סכמטיות של ייצור, אנדותל ובדיקת חדירות של תעלות כלי דם מודפסות. (B) סכמה של שלוש התצורות שהודגמו בשיטה זו: ישרה, מפוצלת ומפותלת. קיצור: VOPs = כלים על צלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציר הזמן לייצור להדפסת תבנית הקורבן ותא הסיליקון, כמו גם אנדותל תעלת כלי הדם. (A) האיור מייצג באר אחת של לוח הבאר ו-AA' מתייחס לנוף לאורך מישור החתך. (ב) תמונות מייצגות של השלבים המעורבים בתהליך הייצור. פסי קנה מידה = 5 מ"מ (B1), 200 מיקרומטר (B2-4). קיצורים: GelFib = 15% ג'לטין מתקרילט ו 1% פיברינוגן ב 0.05% w / v ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate תמיסה; HUVECs = תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כלים על צלחת. (A) תמונה גסה של כלים על לוח לאחר הדפסת תבנית הקורבן ותא הסיליקון. (B) הדגמה של ייצור רב-ממדי של תעלות כלי דם במגוון תצורות וגדלים, עם מיקרו-חרוזים ירוקים. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (ערוצים ישרים), 1,000 מיקרומטר (ערוצים מפותלים ומפוצלים). קיצורים: ID = קוטר פנימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תעלות כלי דם והבשלתן וחדירותן באנדותל. (A) תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של תעלות כלי דם בימים 1, 3 ו-5 לאחר הזריעה עם HUVECs עם חלבון פלואורסצנטי ירוק, המראות את ההתרבות ואת המורפולוגיה המרוצפת של HUVECs ביום 5. (B) הבשלת אנדותל הוערכה עם בדיקת CCK-8 בימים 1, 3 ו-5 לאחר זריעת תאים. (C) בדיקת חדירות של תעלות כלי דם אנדותל (אנדותל +) וחשופות (אנדותל -). (D) תמונות מייצגות של צביעת CD31 ממחישות את הלוקליזציה של CD31 בצמתים צפופים ביום 5. (ה) כימות חדירות דיפוזיה. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A, C, D). קיצורים: HUVECs = תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; GFP HUVECs = HUVECs מתויגים GFP; CCK-8 = ערכת ספירת תאים 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הדפסת דיו	פרמטרי הדפסה
	מד זרבובית	טמפרטורה (°C)	לחץ אוויר (kPa)	מהירות ראש (מ"מ / דקה)
דיו הקרבה	18	37	40-48	200
	20
	22
דיו סיליקון	22	5	100

טבלה 1: פרמטרי הדפסה עבור דיו הקורבן והסיליקון.

קובץ משלים 1: סקריפט G-Code המכיל את הפקודות להדפסה תלת-ממדית של תבנית הקורבן ותא הסיליקון בתוך לוח בעל שש בארות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S1: תמונות מייצגות של המשטח המואר התחתון והעליון לאחר זריעת תאים המראות חיבור GFP-HUVEC הן במישור המוקד התחתון והן במישור המוקד העליון. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: UU' = מישור מוקד עליון; LL' = מישור מוקד תחתון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: התפשטות GFP-HUVEC תחת משכי זמן שונים של קישור עם UV (405 ננומטר). פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: HUVECs = תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; GFP HUVECs = HUVECs עם תג GFP. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S1: זילוח עם מיקרו-כדוריות ירוקות המציג את הזילוח היעיל דרך הערוצים הישרים, המפותלים והדו-צדדיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: פונקציות של פקודות G-code ו-M-code. הערה: בקוד G, X, Y ו-Z מציינים את הקואורדינטות לתנועה לאורך ציר X, ציר Y וציר Z, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

תוך ניצול הדיוק, האוטומציה והאופי הנשלט על ידי מחשב של טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, ביססנו שיטה יעילה לייצור תעלות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות, שנבחרו בשל התאמתם לקוראי מיקרו-לוחות מסחריים ולמערכי הדמיה במיקרוסקופ. עיצוב הלוח יכול להכיל ערוצים מרובי גדלים ונפח מדיה מספיק לצמיחת ערוצים גדולים יותר תוך הפחתת התדירות הנדרשת של שינויי מדיה. התאמות עתידיות של עיצוב זה יכולות להיות מותאמות ללוחות באר סטנדרטיים אחרים הזמינים מסחרית, ובכך להגדיל את התפוקה הניסיונית ולהפחית את השימוש בחומרים.

פלטפורמות מיקרופלואידיות משתמשות לעתים קרובות בפולימר סיליקון הנקרא PDMS בגלל אי-רעילותו, חדירות גזים ושקיפות גבוהה²⁸. עם זאת, הנאמנות הנמוכה של PDMS מגבילה את השימוש בו בהדפסה ביולוגית מבוססת מיקרו-אקסטרוזיה לייצור שבבים עם נאמנות צורה גבוהה. SE1700²⁹, פולימר סיליקון נוסף, מציע דיוק גבוה יותר בבניית תאים לייצור רקמות, אך צמיגותו הגבוהה מחייבת חרירים גדולים יותר ולחץ פניאומטי משמעותי. יצרנו תערובת של SE1700 ו-PDMS שניתן להשתמש בה עם חרירים קטנים יותר, ובכך לאפשר ייצור באזורים סגורים בדיוק גבוה ובנאמנות צורנית. סוגים אחרים של פולימרים, כגון Polycaprolactone (PCL) או Polyethylene Vinyl Acetate (PEVA), יכולים לשמש גם להדפסה תאית בהתחשב בצורתם הגבוהה fidelity³⁰.

גם השקיפות האופטית של GelMA חיונית³¹. בניגוד להידרוג'לים אחרים מבוססי ECM - כגון קולגן, שהופך אטום לאחר crosslinking - GelMA שומר על שקיפות, ובכך מאפשר ניתוח תאי בזמן אמת בתוך ערוצים, גם כאשר גודל הערוץ גדל. היבט זה מספק יתרון גדול על פני שיטות הדורשות חתכים דקים לתצפית כאשר גודל המבנה גדל³². יכולת ההתכלות הביולוגית של GelMA מאפשרת את החלפת פיגום ה-ECM ברקמה חדשה ופונקציונלית בעת התפרקותו, ובכך מספקת את המקום הדרוש לצמיחת רקמה תפקודית חדשה^33,34. בנוסף, הציטוטוקסיות הנמוכה המוכחת שלו הופכת אותו למתאים ביותר ליישומי הנדסת רקמות ^35,36. המאפיינים המכניים המצוינים של GelMA הופכים אותו למועמד טוב ליישומים בהנדסת רקמות כלי דם³⁷. יעילותו בהקלה על אנדותל של צינורות כלי דם עם HUVECs תועדה היטב³⁸.

התאים ששימשו לאנדותל במחקר זה, HUVECs, מציגים שיעור הצלחה גבוה בבידוד ומהווים מודל יוצא דופן לבחינת מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם ומחלות מטבוליות³⁹. עם זאת, גישה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים סוגים שונים של תאי אנדותל, כולל אלה שמקורם בעורקים או ישירות ממטופלים. יכולת הסתגלות זו מאפשרת יצירת מודלים ספציפיים של רקמת כלי דם למטופל, מה שמקל על הערכת תגובות אינדיבידואליות לתרופות ספציפיות.

פרוטוקול זה כולל כמה שלבים קריטיים שעל הקוראים לזכור. ראשית, טיפול פלזמה הוא קריטי לשינוי מאפייני פני השטח של הצלחת, במיוחד כדי לשפר הידרופיליות, כי רוב לוחות באר מסחרית הם הידרופוביים. טיפול הפלזמה מציג קבוצות פונקציונליות קוטביות על פני השטח, ובכך משפר את יכולת הקשר עם תא הסיליקון וההידרוג'ל. שנית, בקרת טמפרטורה היא קריטית מכיוון שהדיו המקריב נוזל בטמפרטורות נמוכות יותר, ודיו הסיליקון דורש טמפרטורות נמוכות יותר כדי למנוע ריפוי מוקדם, מה שעלול לעכב את שחול הדיו דרך הזרבובית. שלישית, הסרה יסודית של כל עקבות PF127 היא חיונית מכיוון שכל שארית PF127 יכולה להשפיע לרעה על התהליכים התאיים, למשל על ידי הפרעה להידבקות התא⁴⁰. רביעית, במהלך תרבית תאים, אם התאים גדלים למפגש העולה על 90%, הם יכולים לחוות לחץ בגלל תחרות על מקום וחומרי מזון. סטרס זה יכול לגרום לשינוי בהתנהגות התא, לירידה בכדאיות התא ולשינויים במיקרו-סביבה התאית. כדי לשמור על בריאות התאים ושגשוג תקין, מומלץ לשמור על תרביות מתחת ל-90% מפגש. חמישית, חשוב לשמור על פלטה שטוחה בתוך האינקובטור לפני ואחרי היפוך כדי להשיג היצמדות תאים אחידה בתוך התעלה ובסופו של דבר אנדותל אחיד. לבסוף, שמירה על זמן חשיפה עקבי, עוצמת לייזר עירור ומיקוד במיקרוסקופ היא חיונית במהלך רכישת תמונה, מכיוון ששינויים בפרמטרים אלה עלולים לשנות את עוצמת אות הפליטה, ובכך להשפיע על דיוק התוצאות.

הגישה שלנו מאפשרת יצירת ערוצים בתצורות מרובות, כגון הדפוסים הישרים, המפוצלים והמפותלים המוצגים כאן. יכולת הסתגלות זו חיונית לשכפול הגיאומטריות המגוונות של רשת כלי הדם בגוף האדם ועולה על היכולות של שיטות מסורתיות, כגון יציקת הידרוג'ל סביב תבנית או טכניקות הדפסה ביולוגית מבוססות זרבובית קונצנטריות המשמשות למבנים דמויי צינור 30,41,42. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא שהיא אינה מבטיחה את המעגליות של התעלות מכיוון שתבנית ההקרבה מונחת על משטח שטוח.

היתרון של בניית ערוצים בגדלים מרובים הוא המפתח להתגברות על המגבלות של פלטפורמות מיקרופלואידיות, אשר מוגבלות לעתים קרובות למיקרו-ערוצים. הגבלה זו יכולה להיות חיסרון בבדיקות ביוכימיות קונבנציונליות. לדוגמה, כדי לקבל מספיק חומר לבדיקות ביטוי חלבונים סטנדרטיות כגון כתם מערבי, יש לשלב פלטים ממספר התקנים מיקרופלואידים. בנוסף, כאשר נוצרות תעלות חלולות, ההידרוג'ל חייב לשמור על קשיחות מספקת כדי לעמוד בתהליך הסרת המחט. הגישה שלנו משתמשת בחומר הקרבה תרמי-הפיך, שהופך לנוזל כאשר הטמפרטורה יורדת, ובכך מקל על תהליך זה מבלי לפגוע בשלמות הג'ל. יתר על כן, חומרי ג'ל אחרים הניתנים להקרבה תרמית, כגון ג'לטין⁴³, יכולים לשמש גם כחומרי הקרבה בשיטה זו.

גישה זו מאפשרת התאמה אישית קלה של מבני הרקמה בצלחת, ובכך מספקת כלי מבטיח לבדיקות פרמקולוגיות בגילוי תרופות. שיטה זו יכולה להקל על סינון תרופות על ידי הערכת השפעתן על חדירות כלי הדם - גורם מפתח בפיתוח טיפולים למחלות הקשורות לתפקוד לקוי של כלי הדם. המודל שלנו יכול לשמש לחקר חדירות כלי הדם בתנאים ספציפיים, כגון דלקת, ולפיתוח אסטרטגיות לנורמליזציה של כלי הדם, הרלוונטיות לטיפול במחלות שונות המערבות חדירות כלי דם חריגה⁴⁴, לקידום ההבנה של תהליך זה, ולפיתוח יישומים קליניים פוטנציאליים⁴⁵.

כדי להעריך את חדירות כלי הדם, ניקבנו 70 kDa דקסטרן דרך תעלת כלי הדם. בדרך כלל, אנדותל כלי דם בריא משמש מחסום יעיל למולקולות דקסטרן בעלות משקל מולקולרי זה⁴⁶. עם זאת, בנוכחות דלקת, מתרחשת הפרעה בצמתים ההדוקים, המאפשרת למולקולות אלה לדלוף דרכן, ובכך להגדיל את חדירות כלי הדם³⁰. בנוסף, דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית משמש להערכת התפלגות התרופות בתוך רקמות מהונדסות⁴⁷. למרות שזרימה דו-כיוונית ודינמיקת גלישה מוגבלת בתוך הערוץ הן מגבלות של מודל זה, אנו צופים כי משתמשי הקצה יוכלו להתאים את המערכת בהתאם לדרישותיהם באמצעות נדנדות מותאמות אישית כדי לשלוט בדינמיקת הזרימה בתוך הערוצים. התאמה זו עשויה לכלול יישום של זרימה חד-כיוונית ללא משאבה⁴⁸.

בעתיד, ניתן יהיה להרחיב את שיטת הייצור הזו לבניית רקמות מורכבות. על ידי מיקום מדויק של סוגים אחרים של תאים ליד תעלות כלי הדם, רקמות מבלבלות וכלי דם יכול להיווצר, ובכך להתגבר על אתגר גדול בהדפסה ביולוגית של רקמות נפחיות. כמו כן, אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה להיות מותאמת להדמיית סוגים אחרים של רקמות חלולות וחדירות, כגון כלי לימפה ומעיים, באופן בתפוקה גבוהה למגוון יישומים ביו-רפואיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 מ"ל פיפטה סרולוגית	SPL SPL	91010
מזרק 10 מ"ל	Shinchang Medical
15 מ"ל צינור חרוטי	SPL	50015
3D Bioprinter	T& R Biofab	3DX-מדפסת
צלחת 6 בארות	SPL	37206
ארונות בטיחות ביולוגיים	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
הפוכה	Brightfield Leica	DMi1
(CCK8)		GK10001
(CCK8)	GlpBio	GK10001
בקבוק תרבית תאים 75T	SPL	70075
קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס, ללא LDEV, 10 מ"ל	קורנינג	354230
			מזוקקים
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, ערכת תרבית תאים	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, ערכת PDMS-Sylgard 184a DOW		DC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
מדיום גידול תאי אנדותל MV 2 (מוכן לשימוש)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipette (1000,200,100,20,10)	אפנדורף
אתיל אלכוהול 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
פיברינוגן מפלזמת בקר	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
חרוזים פלואורסצנטיים (1.0 μ m, ירוק)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
אבקת ג'לMA (ג'לטין מתאקרילט) 50 גרם	חומרי תלת מימד	20JT29
Gibco, מדיום הקפאת תרבית תאי התאוששות, 50 מ"ל	Gibco
HUVECs (תאי אנדותל ורידים טבוליים אנושיים)	תוכנת Promocell
ImageJ	NIH
	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2
Invitrogen, ערכת כדאיות/ציטוטוקסיות חיה/מתה/ציטוטוקסיות (לתאי יונקים)	Thermo Fisher	L3224
ליתיום פניל (2,4,6-טרימתילבנזויל) אבקת פוספט	טוקויו תעשיה כימית ושות'.	85073-19-4
Marienfeld Superior, כיסוי תא ספירה	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, המוציטומטר, תא ספירת תאים	Marienfeld Superior	HSU-0650030
מיקרוצנטריפוגה	אפנדורף	צנטריפוגה 5920 R
NCViewer.com
מיכל חנקן	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
לייזר UV Omnicure	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100x)	GenDEPOT	CA005-010
מיקסר פלנטרי	THINKY CORPORATION, יפן	ARE-310
מכונת טיפול בפלזמה	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Pluronic F-127	Sigma aldrich	P2443-250G
מאגר מוכן מראש, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
ארון אחסון ריאגנטים	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
בזמן אמת מיקרוסקופ הדמיה של תא חי	קרל ZEISS
מקרר	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D דיגיטלי	IKA	4003000
מטמון סקופ-מריתמאת		SL-SCO7001-EA
סיגמא, בקשת טריפסין-EDTA, 0.25%	סיגמא אולדריץ'	T4049-100 מ"ל
נתרן דודציל סולפט (SDS)	תרמו פישר מדעי	151-21-3
מכסה קצה חבית מזרק	FISNAR	3051806
חברת בקרת	דלפק	C23-147-050
זרבובית מחודדת (18 גרם)	Mushashi	TPND-18G-U
(22 גרם)	Mushashi	TPND-22G-U
20 G	Musashi	TPND-20G-U
תרומבין מפלזמת בקר	Sigma Aldrich	T7326-1KU
טיימר, 4 ערוצים	ETL	SL. Tim3005
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15250061
תמיסת נטרול טריפסין	Promocell	C-41120
UG 24 מ"ל צנצנת משחה UG	Yamayu	מס' 3-53
UG 58 מ"ל צנצנת משחה UG	Yamayu	מס' 3-55
אמבט מים	DAIHAN Scientific	WB-11
מכונת משקל	Sartorius	bce2241-1skr