הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

miR-15a אקזוזומלי שמקורו בדמעה ככלי אבחון חדש לרטינופתיה סוכרתית

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול לאיסוף וזיהוי של miR-15a מדמעות ככלי אבחון חדש לרטינופתיה סוכרתית.

תקציר

רטינופתיה סוכרתית (DR) היא סיבוך מרכזי בסוכרת, המשפיעה על אחוז משמעותי מאוכלוסיית הסוכרת. אבחון מוקדם והתערבות הם קריטיים למניעת אובדן ראייה בלתי הפיך. שיטות האבחון הנוכחיות, אף שהן יעילות, יש להן מגבלות. miRNA, RNA קטן שאינו מקודד המעכב את היציבות ו/או התרגום של mRNA על ידי קישור לאזורים 3'-לא מתורגמים (3'-UTRs) של mRNA מטרה, מוכר יותר ויותר כקשור משמעותית לסוכרת וניתן להשיגו מדמעות. מחקר זה בחן את הפוטנציאל של miR-15a אקזוזומלי שמקורו בנוזל דמעות כסמן אבחנתי חדש ל-DR. דגימות דמעות נאספו מ-135 חולי סוכרת (36 עם רטינופתיה סוכרתית [DR] ו-50 ללא DR) ו-49 ביקורת בריאה. אקסוזומים בודדו, ורמות הביטוי של miR-15a אקוזומלי נמדדו באמצעות PCR דיגיטלי לטיפות (ddPCR). התוצאות הראו כי ביטוי miR-15a אקזוזומלי השתנה אצל חולי סוכרת ו-DR בהשוואה לאנשים בריאים. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-miR-15a אקזוזומלי שמקורו בנוזל דמעות עשוי לשחק תפקיד במנגנונים המולקולריים שמאחורי הסוכרת ובסיבוכיה. יתרה מזאת, הוא טומן פוטנציאל כביוסמן אבחנתי לא פולשני ואמין לרטינופתיה סוכרתית, ומציע רגישות וספציפיות גבוהות.

מבוא

רטינופתיה סוכרתית (DR) היא אחת הסיבוכים המיקרווסקולריים הבולטים ביותר של סוכרת, המאיימת על ראייתם של מיליונים ברחבי העולם. השכיחות העולמית של DR לפי נתוני האוכלוסייה של Atlas 2019 הוערכה ב-22.7% מכלל אוכלוסיית חולי הסוכרת ברחבי העולם, כאשר מספר המקרים החדשים נמצא בעלייה מתמדת, במיוחדבמדינות מפותחות ומתפתחות. קלינית, DR מאופיינת ב-DR בשלב מוקדם או רטינופתיה סוכרתית לא-פרוליפרטיבית (NPDR), רטינופתיה סוכרתית בשלב מאוחר או פרוליפרטיבית (PDR), ונוכחות בצקת מקולרית. חדירות וסקולרית מוגברת וחסימת נימים הם שני שינויים פתולוגיים נפוצים הנראים ב-NPDR, ונאווסקולריזציה לא תקינה של הקשתית, המקולה, דיסק הראייה או הרשתית נצפית במקרה של PDR 2,3. ההתקדמות ל-PDR, שעלולה לגרום לדימום מזגוגי והיפרדות רשתית, עלולה לגרום לפגיעה משמעותית בראייה3. בכל המקרים, ניתן לזהות שינויים פתולוגיים באמצעות בדיקת פנדוסקופיה או צילום פנדוס על ידי רופאי עיניים מוסמכים4. באמצעות שיטת צילום הקרקעית הסטנדרטית, ניתן לזהות רטינופתיה סוכרתית ברגישות של 78%-96% ובספציפיות של 86%-97%5. עם זאת, שיטה זו מזהה רק לאחר שנגרם נזק לרשתית. קיים צורך לא מסופק לזיהוי מוקדם של DR לפני הופעת סימנים נראים קלינית ברשתית, כגון דימומים ברשתית כתמים, מיקרואניוריזמות, הפרשות והתרבות כלי דם חדשים.

התקדמות הכלים המולקולריים הובילה לגילוי אקסוזומים ככלי אבחון פוטנציאלי למחלות שונות, כולל סרטןומחלות לב וכלי דם. אקסוזומים הם חלקיקים בגודל ננומטרי הקשורים על ידי ממברנת דו-שכבתית של שומן המופרשת על ידי רוב התאים אל מרחב הווסיקולה החוץ-תאית (EV) שלהם. אקסוזומים אלו יכולים להיות מועברים באמצעות נוזלים ביולוגיים כגון דם, דמעות, רוק ושתן, מה שהופך אותם לנגישים בקלות לפרוצדורות אבחון לא פולשניות או זעיר-פולשניות8. הם נושאים סמנים תאי מקור שונים הכוללים חלבונים, ליפידים וחומצות גרעין. מעניינים במיוחד הם RNA קטנים שאינם מקודדים הנישאים בתוך EVs. למרות שרנ"א אלו אינם מקודדים לחלבונים, הם ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות גנים והיו מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כולל בתאי β הלבלב, החשובים מאוד להתפתחות סוכרת 9,10.

בפרט, הוכח כי ל-miR-15a יש קשר חזק להתפתחות סוכרת, בעיקר באמצעות ויסות ייצור האינסולין ותפקודי תאי בטא בלבלב11. הקבוצה שלנו הראתה לאחרונה כי miR-15a משתנה בפלזמה של רטינופתיה סוכרתית. בנוסף, הוכח כי ה-miR-15a מופרש על ידי תאי הבטא בלבלב, והוא עובר דרך זרם הדם לרשתית12. נוזל דמעות נחשב לנוזל נגיש בקלות, שניתן להשיג מהעין בצורה לא פולשנית וחסכונית13. הוא מכיל תערובת של חלבונים, שומנים, אלקטרוליטים ומולקולות נוספות, המשקפת את המצב הפיזיולוגי של פני העיניים והרקמות הסובבות, כולל הרשתית14. מספר גבוה יותר של miRNA זוהה בנוזל דמעות מאשר בתמיסת סרום ומימי15,16. הרכב הדמעות משתנה בתגובה למצבים מערכתיים שונים, כולל סוכרת17. למעשה, ניתוח נוזלי דמעות הוכח כבעל פוטנציאל מבטיח למעקב ואבחון של מחלות שאינן קשורות לעיניים כמו טרשת נפוצה וסרטן השד18,19. עם הקשר הישיר של רטינופתיה סוכרתית לעין, יהיה רלוונטי יותר לבדוק תכונות אבחנתיות אפשריות של נוזל דמעות במחלה זו. רמות IL-1RA, IL-8, IL-6 ו-TNF-α בנוזלי הדמעות של חולים עם רטינופתיה סוכרתית נצפו כמשתנות, שגם הם משתנים בהתאם לחומרת המחלה20,21. בהשוואה לבדיקת הפונדוסקופיה המסורתית, ניתוח נוזלי דמעות לרטינופתיה סוכרתית מציע יתרונות פוטנציאליים מבחינת נגישות, אי-פולשניות וספציפיות, ומאפשר גילוי מוקדם לפניתחילת המחלה.

לכן, המטרה העיקרית של מחקר זה היא לחקור את הפוטנציאל של miR-15a אקזוזומלי שמקורו בנוזל דמעות כסמן אבחוני חדש לרטינופתיה סוכרתית באמצעות בידוד וכימת miRNA מנוזלי דמעות באוכלוסיית הרטינופתיה הסוכרתית. עם זאת, תהיה שיטה חדשה לזיהוי רטינופתיה סוכרתית באמצעות סקר נוזלי דמעות, שניתן לזהות עוד לפני הופעת סיבוכי הרשתית, ומאפשרת צעדים מונעים או טיפוליים מוקדמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר נערך באישור הוועדה האתית למחקר רפואי במרכז הרפואי של אוניברסיטת מלאיה (מספר הפניה: 20165-2446). הושגה הסכמה בכתב מכל הנבדקים האנושיים לפני הגיוס. בסך הכול נכללו 135 נבדקים מתוך מטופלים שהגיעו למרפאת עיניים במרכז הרפואי של אוניברסיטת מלאיה (UMMC), קואלה לומפור. קריטריוני ההכללה כללו מטופלים שקיבלו שירותים תחת UMMC והיו בגילאי 20-80. מטופלים שעברו טיפול פעיל באינסולין, עם היסטוריה של טיפול בלייזר או אנטי-VEGF בשלושת החודשים האחרונים, או על אנטי-טסיות או מדללי דם באופן קבוע, הוצאו מהמחקר. הנבדקים חולקו לשלוש קבוצות: (1) ביקורת בריאה (ביקורת), (2) סוכרתי ללא רטינופתיה (DM No DR), ו-(3) סוכרתי עם רטינופתיה (DR). סיכום הפרוטוקול מופיע באיור 1. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

figure-protocol-1
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה רחבה יותר של איור זה.

1. הכנת חומרים    

  1. פרש סט ליטוש בסיסי סטרילי הכולל שני מלקחיים, שישה כדורי כותנה, ארבעה תחבושות גזה, מגש ותיק ביולוגי.
  2. שפכו 5 מ"ל של תמיסת השקיה של 0.9% w/v נתרן כלוריד למגש.
  3. פתח חבילת מגבוני ניקוי עפעפיים והניח אותו על השדה הסטרילי.
  4. הכינו צינור המכיל 250 מיקרוליטר של תמיסת משמר.
  5. קפלו רצועת שירמר בגובה הטריז כשהיא עדיין באריזה לפני שמניחים את הרצועה הסטרילית על השדה הסטרילי.
  6. תלבשי כפפות ניתוחיות בצורה אספטית.
  7. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, הרטיב את כדורי הכותנה בתמיסת השקיה סטרילית של 0.9% עם כלוריד נתרן סטרילי.

2. הכנת נבדקים אנושיים    

  1. תן לנבדק לשבת בנוחות ותבקש לעצום עיניים.
  2. נגב את העור הפריאורביטלי ארבע פעמים עם כדורי כותנה טבולים בתמיסת השקיה.
  3. נגב את העור הפריאורביטלי עם מגבון ניקוי עפעפיים.

3. איסוף נוזל דמעות אנושי

  1. אספו נוזלי דמעות באמצעות רצועת שירמרס המונחת בפורניקס הטמפורלי התחתון.
  2. כאשר מניחים את הרצועה המקופלת חלקית על העין הימנית, בקש מהנבדק להביט שמאלה. משוך את העפעף התחתון למטה כדי לחשוף את הפורניקס התחתון.
  3. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, מניחים רצועת שירמר על שני השלישים החיצוניים של הפורניקס התחתון של הלחמית. הימנע מלתת לרצועה לגעת בעור כדי למנוע זיהום של הדגימה בזיעה או חומרים אחרים על העור.
  4. הניחו תחבושת גזה מתחת לרצועה כדי למנוע מגע עם העור.
  5. אפשר לקרעים להיספג לתוך הרצועה עד לסימון 20 מ"מ או מקסימום של 5 דקות, המוקדם מביניהם.
  6. אם רמת 20 מ"מ לא מושגת, יש לתעד את רמת הקרעים בהתבסס על הסימונים כדי לאפשר סטנדרטיזציה של נפח נוזל הדמעות.
  7. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, הסר בזהירות את רצועת שירמר ומניח את הרצועה בצינור המכיל תמיסת מלח בופר פוספט 1x (PBS).
  8. שים את הצינור בתיבת קירור להובלה למעבדה.
  9. נקה את המשטח הפריאורביטלי על ידי ניקוי כל תמיסה שנותרה על העור.

4. עיבוד מוקדם של דגימות קרע    

  1. Vortex, הצינור המכיל את רצועת שירמר, הושרה ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. ערבב את הצינור על נדנדה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. צנטריפוגה את הצינור ב-2000 x g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. העבר את התמיסה לצינור חדש, מתייג ושמור על מינוס 80°C עד לעיבוד במורד הזרם.
  5. זרוק את הרצועה שנותרה.

5. בידוד אקסוזומי

הערה: בידוד RNA מתבצע באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראו טבלת חומרים).

  1. הפשיר את תמיסת הדמעות על הקרח למשך 10 דקות.
  2. איזון את עמודת הסיבוב ל-15 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. הסר את היציאה התחתונה של העמוד והנח אותה על לוח איסוף הפסולת שסופקה.
  4. הסר את שטיח האיטום העליון ואפשר לבופר האחסון לעבור דרך העמוד באמצעות כוח כבידה.
  5. הוסף 250 מיקרוליטר של PBS ותן לו לעבור דרך העמודה.
  6. חזור על שלב 5.5.
  7. הניחו דגימה של 110 מיקרוליטר לראש כל עמודה ואפשרו לדגימה להיכנס לעמודה.
  8. העבר את העמודה לפלטת איסוף דגימות שסופקה.
  9. הוסף 100 מיקרוליטר של PBS ואפשר לו לעבור דרך העמודה אל לוח איסוף הדגימות.
  10. העבר את העמודה ללוח איסוף הפסולת.
  11. הוסיפו 4x200 מיקרוליטר PBS לעמודה ואפשרו לה להיכנס לעמודה כדי להסיר את חלק החלבונים החופשיים מהטעינה הראשונה.
  12. הוסיפו 110 מיקרוליטר דגימה לעמודה. אפשר להיכנס לעמודה.
  13. הנח את העמודה על צלחת איסוף דגימות. הוסף 100 מיקרוליטר של PBS ותן לו לעבור דרך העמודה.
  14. צנטריפוגה קצרה של לוח איסוף הדגימות בעוצמה של 100 x גרם למשך 30 שניות. האקסוזומים המבודדים מוכנים כעת לבידוד RNA.

6. בידוד RNA

הערה: בידוד RNA מתבצע באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראו טבלת חומרים).

  1. נבדק 200 מיקרוליטר של אקסוזומים מבודדים לבידוד RNA.
  2. הוסף 60 מיקרוליטר של בופר ליזיס לאקסוזומים המבודדים. מערבולת ל-5 שניות.
  3. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  4. הוסיפו 20 מיקרוליטר של בופר משקעים מעכב, מערבולת למשך 20 שניות, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  5. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. העבר את הסופרנטנט השקוף וחסר הצבע לצינור חדש.
  7. הוסיפו נפח אחד של איזופרופנול.
  8. Vortex ל-5 שניות והעבר את הפתרון לעמודת הספין הקטנה שמסופקת בערכה.
  9. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב-8000 x g. זרוק את הזרימה דרך.
  10. שטוף את העמודה עם 700 מיקרוליטר של בופר שטיפה RWT.
  11. צנטריפוגה ל-15 שניות ב-8000 x g. השליכו את ה-flowthrough.
  12. שטוף את העמודה עם 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה RPE.
  13. צנטריפוגה ל-15 שניות ב-8000 x g. השליכו את ה-flowthrough.
  14. הוסיפו 500 מיקרוליטר של 80% אתנול לעמוד הסיבוב המיני לדוגמה.
  15. צנטריפוגה ל-2 דקות ב-8000 x g. זרוק את צינור הזרימה והאיסוף.
  16. שים את עמוד הסיבוב הקטן בתוך צינור איסוף חדש בנפח 2 מ"ל.
  17. צנטריפוגה את העמוד והצינור בעוצמה של 18,000 x g למשך 5 דקות. זרוק את הזרימה ואת צינור האיסוף.
  18. הניחו את עמודת הסיבוב המיני בצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל והוסיפו 15 מיקרוליטר מים ללא RNase במרכז ממברנת עמודת הספין.
  19. דגרו במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  20. צנטריפוגה בעוצמה של 18,000 x g למשך דקה אחת כדי להוציא את ה-RNA. RNA מוכן לעיבוד במורד הזרם.
  21. לבצע ניתוח מעקב ננו-חלקיקים לבקרת איכות ואימות תפוקת ה-RNA.

7. סינתזת cDNA

  1. בצע סינתזת cDNA באמצעות ערכות זמינות מסחרית בהתאם לפרוטוקולי היצרן (ראו טבלת חומרים).
  2. הכינו את התערובת הראשית לפי טבלה 1 בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  3. מערבבים את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  4. פיפט 5.1 מיקרוליטר של תערובת המאסטר לצינורות PCR של 0.1 מיקרוליטר.
  5. הוסף 9.9 מיקרוליטר דגימה לצינור שהוקצה המכיל את תערובת המאסטר.
  6. הכניסו את צינורות ה-PCR לתוך תרמחזור והריצו לפי טבלה 2.
    הערה: ה-cDNA מוכן לניתוח נוסף.
רכיבעוצמה/תגובה
10x RT Buffer1.5 מיקרוליטר
100M dNTP mix0.15 מיקרוליטר
מעכב RNAse (200U/μL)0.19 מיקרוליטר
Multiscribe RT Enzyme (50U/μl)1 מיקרו ליטר
20x RT פריימר0.75 מיקרוליטר
מים חופשיים מ-RNAse1.51 מיקרוליטר
דוגמה9.9 מיקרוליטר
נפח כולל15 מיקרוליטר

טבלה 1: הכנת תערובת המאסטר PCR המשמשת לסינתזת cDNA מה-RNA המבודד.

צעדטמפרטורהמשך
תמלול הפוך16 מעלות צלזיוס30 דקות
42 מעלות צלזיוס30 דקות
עצור85 מעלות צלזיוס5 דקות
המתן4 מעלות צלזיוס

טבלה 2: תנאי תרמחזור לסינתזה של cDNA.

8. PCR טיפות דיגיטליות

הערה: PCR טיפות דיגיטליות (ddPCR) מתבצע באמצעות ערכות מסחריות הפועלות לפי פרוטוקולי היצרן (ראו טבלת חומרים).

  1. הכינו את התערובת הראשית ל-ddPCR בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לפי טבלה 3.
  2. פיפטה 19.8 מיקרוליטר של מיקס מאסטר לצינורות PCR של 0.1 מיקרוליטר. הוסף 2.2 מיקרוליטר דגימות וערבב היטב על ידי פיפטינג של התערובת למעלה ולמטה במשך 10 פעמים.
  3. העבר 20 מיקרוליטר מתערובת הדגימה לנתיב הדגימה של מחסנית ddPCR.
  4. הוסיפו 50 מיקרו ליטר שמן לנתיב השמן של המחסנית.
  5. חבר אטם למחסנית באמצעות הוו שעל הפלטה.
  6. הכניסו את המקלט למכונת יצירת הטיפות. צליל קליק מציין הכנסה נכונה של המחסנית למכונת יצירת הטיפות.
  7. העבר בזהירות את כל הטיפות שנוצרו לבארות של לוח של 96 בארות. הוסיפו לפחות באר אחת ללא בקרת תבנית כמו בקרה שלילית.
  8. אטום את הלוח באמצעות נייר כסף חדיר במכונת איטום לוחות (ראו טבלת חומרים).
  9. הכניסו את הצלחת לתוך תרמוסייקלר והריצו לפי טבלה 4.
  10. העבר את הלוח למכונת קורא הטיפות כדי לספור טיפות חיוביות ושליליות.
  11. כמת את מספר העותק/מ"ל באמצעות ערך מספר העותק/20 מיקרוליטר שנוצר מהריצה.
רכיבעוצמה/תגובה
2x ddPCR Supermix ל-Probes (ללא dUTP)10 מיקרוליטר
20x פריימרים/גלאי1 מיקרוליטר
דוגמה7 מיקרוליטר
מים חופשיים מ-RNAse2 מיקרוליטר
נפח כולל20 מיקרוליטר

טבלה 3: הכנת תערובת ה-PCR הראשית המשמשת ל-ddPCR.

צעדטמפרטורהמשךרמפהמחזור
הפעלת אנזימים95 מעלות צלזיוס10 דקות~2 °C/s לכל שלב1
דנאטורציה94 מעלות צלזיוס30 שניות40
אנילינג60 מעלות צלזיוסדקה אחת40
השבתת אנזימים98 מעלות צלזיוס10 דקות1
המתן4 מעלות צלזיוסלא זמיןלא זמין

טבלה 4: תנאי תרמומחזור עבור ddPCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עקומה סטנדרטית
נוצרה עקומה סטנדרטית לקביעת נפח הקרעים המדויק שנאספו מכל מטופל. בעיקרון, נפחים שונים של חומרים משמרים נחשפו לרצועות שירמר. ונצפה מרחק האזור הרטוב על השירמר. ההליך חזר על עצמו שלוש פעמים לכל פרוצדורה, וממוצע הקריאה חושב. נוצרה עקומה סטנדרטית של נפח הקרעים שנאספו לעומת המרחק בין אזורים רטובים בשירמר (איור 2) והיא נקראה ייחוס לנפח קרעים שנאסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדיקת פנדוסקופיה, טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ואנגיוגרפיה פלואורסצאין הן טכניקות הגילוי הזמינות כיום לגילוי רטינופתיה סוכרתית. שלוש הטכניקות משמשות לעיתים קרובות יחד כדי לספק הערכה מקיפה של מחלות רשתית וכורואידיות שונות. פונדוסקופיה היא בדיקה קלינית המתבצעת באופן שגרתי במהלך הערכת רטינופתיה סוכרתית. שיטה זו מבוצעת על ידי רופאי עיניים מוסמכים ונחשבת לסטנדרט הזהב לאבחון רטינופתיה סוכרתית. שיטה זו מאפשרת הערכה מפורטת של הרשתית ומאפשרת תיעוד מראה הרשתית להשוואות עתידיות, להגדיל אלקטרונית אזורי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מכון אלקון למחקר (IF011-2020) ומענק מחקר פוסט-דוקטורט של FOM UMSC Care לשנת 2021.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% בלי נתרן כלורידAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x מיל מלח בופר פוספטתרמו פישר סיינטיפיק10010-023
Applied Biosystems  ערכת שעתוק הפוך MicroRNA של TaqManמערכות ביולוגיות יישומיות4366596
ddPCR Supermix לפרובים (ללא dUTP)מעבדות ביוראד1863024
לוחות ddPCR 96-בארמעבדות ביוראד12001925
מחסניות DG8מעבדות ביוראד1864008
אטמי DG8מעבדות ביוראד1863009
שמן ליצירת טיפות לגשושיםמעבדות ביוראד1863005
ערכת בידוד אקסוזום אקסוספינ-96מערכות הנחיה תאיתEX07-96
ערכת סרום/פלזמה מתקדמת miRNeasyקיאגן  217204
חותם לוחות PCR PX1מעבדות ביוראד1814000
מערכת PCR דיגיטלית של טיפת QX100מעבדות ביוראדQX100
QXDx Droplet Generator מעבדות ביוראד12001049
רצועת שירמראופטיטקSCH-100
T100 Thermal Cyclerמעבדות ביוראד1861096
בדיקת MicroRNA Taqman MTOMED 20 (מזהה בדיקה: 000389)מערכות ביולוגיות יישומיות4440887רצף מטרות: UAGCACAUAAUGGUUUGUG

מקורות

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אקסוזומים מדמעותסמנים ביולוגיים בנוזל הדמעותPCR דיגיטלי של טיפות (ddPCR)בידוד אקסוזומיםפרופילינג של MicroRNAמעקב אחר ננו-חלקיקיםאבחון לא פולשנימניעת אובדן ראייה
miR-15a אקזוזומלי שמקורו בדמעה ככלי אבחון חדש לרטינופתיה סוכרתית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.