מאמר שיטה

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

21 ביוני 2024

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

תקציר

הלבלב הוא איבר חיוני לשמירה על איזון מטבולי בגוף, בין היתר בשל ייצורו של הורמונים מטבוליים כגון אינסולין וגלוקגון, כמו גם אנזימי עיכול. הלבלב הוא גם איבר מאוד וסקולרי, תכונה הקלה על ידי הרשת המורכבת של נימי הלבלב. רשת נימים נרחבת זו מורכבת מתאי אנדותל בעלי הגנה גבוהה (ECs) החשובים להתפתחות הלבלב ולתפקודו. לפיכך, תפקוד לקוי של ECs יכול לתרום לזה של הלבלב במחלות כמו סוכרת וסרטן. לכן, חקר הפונקציה של ECs הלבלב (pECs) חשוב לא רק להבנת הביולוגיה של הלבלב, אלא גם לפיתוח הפתולוגיות שלה. מודלים של עכברים הם כלים יקרי ערך לחקר מחלות מטבוליות ומחלות לב וכלי דם. עם זאת, לא היה פרוטוקול מבוסס עם פרטים מספיקים המתוארים לבידוד של pECs עכבר בשל האוכלוסייה הקטנה יחסית של ECs ואנזימי העיכול השופעים שעלולים להשתחרר מרקמת acinar שיכול להוביל נזק לתאים, ולכן, תפוקה נמוכה. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו פרוטוקול להעשרה ושחזור של pECs בעכברים, המשלב דיסוציאציה פיזיקלית וכימית עדינה וברירה בתיווך נוגדנים. הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה חזקה לחילוץ ECs שלמים וברי קיימא מכל לבלב העכבר. פרוטוקול זה מתאים לבדיקות מרובות במורד הזרם וניתן להחיל אותו על דגמי עכברים שונים.

מבוא

הלבלב, המפתח לשליטה מטבולית והומאוסטזיס, הוא איבר מאוד וסקולרי. הלבלב יש פונקציות אנדוקריניות ואקסוקריניות, שליטה על הרגולציה של גלוקוז בדם אנזימי עיכול, בהתאמה. שני תאים אלה מחוברים יחד על ידי רשת נרחבת של כלי דם הלבלב, המאפשרים החלפה והובלה של חמצן, הורמונים ואנזימים. באופן קריטי, רשת נימים צפופה זו חודרת לאי לנגרהנס, אשכול של תאים מווסתים הורמונים בתוך הלבלב האחראי על תפקודו האנדוקריני, המורכב מתאי אלפא מפרישי גלוקגון (α), תאי בטא מפרישי אינסולין (β) ותאי דלתא מפרישי סומטוסטטין (δ) 1,2. למרות שהאיים מהווים רק 1-2% ממסת הלבלב, הם מקבלים 20% מזרימת הדם הכוללת3, מה שמדגיש את החשיבות של כלי הדם של האיונים. נימי הלבלב מורכבים בעיקר מתאי אנדותל בעלי fenestrated גבוהה (ECs), המוקפים בפריציטים ציורי קיר. ECs נימים אלה ממלאים תפקיד חיוני בהתפתחות האיונים, בהבשלתם ובתפקודם (דיס), ויוצרים שיחות צולבות אינטימיות עם תאים אנדו-סוקרינים ואקסוקריניים שונים4 (איור 1).

הפרעות אנדותל נצפו הן בסוכרת מסוג 1 והן בסוכרת מסוג 2, המצבים השכיחים ביותר הנגרמים על ידי תפקוד לקוי של אי הלבלב 5,6. גם צפיפות כלי הדם וגם המורפולוגיה של האיונים ניתנים לשינוי בסוכרת7. יתר על כן, סרטן הלבלב, גידול אגרסיבי מאוד שיכול להתבטא גם כסוכרת, מאופיין בצפיפות כלי דם גבוהה עם זילוח ירוד8. בהתחשב בתפקידים המבניים והתפקודיים המרכזיים של ECs ברקמת לבלב נורמלית וחולה, יש צורך רלוונטי לחקור את pECs בפיתוח, פיזיולוגיה ופתולוגיה כדי לחשוף את המנגנונים המניעים בריאות או מחלות.

פרוטוקולים רבים פותחו לבידוד ECs ממורין שונים (למשל, מוח 9,10, ריאות11, לב12, כבד13, שרירי שלד14 ורקמות שומן15) ובני אדם (למשל, מוח16, רקמת שומן ויסצרלית17,18, עצבים היקפיים19, ריאות 20,21,22 ועורק מזנטרי 23) רקמות. פרוטוקולים אלה כוללים בדרך כלל שימוש בעיכול אנזימטי (למשל, על ידי collagenase, טריפסין24, dispase24,25, ו liberase26), ולאחר מכן שלב העשרה מבוסס נוגדנים. יתר על כן, פרוטוקולים אלה נוטים להסתמך על משכי עיכול ממושכים בריכוזים גבוהים של אנזימים עם תסיסה נמרצת ב-37°C (טבלה 1). בשל התכונות הייחודיות של הלבלב, כולל העובדה שהוא מכיל שפע של אנזימי עיכול אנדוגניים, לא ניתן ליישם פרוטוקולים קיימים אלה ישירות לבידוד pECs. ראשית, הרכב המטריצה החוץ תאית (ECM) של הלבלב שונה מרקמות אחרות. בעוד שקולגנאז משמש בדרך כלל לבידוד EC, ישנם תת-סוגים רבים עם יכולות דיסוציאציה ספציפיות לרקמות שונות, ולכן דורשים אופטימיזציה. שנית, וחיוני לבידוד pEC, שחרור והפעלה של אנזימים אנדוגניים בלבלב יכולים לעכב באופן משמעותי את תהליך הבידוד. לשם כך, יש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את הקרע של תאי אצינר אקסוקריניים (המקור העיקרי של zymogens, proteases, ו RNase27), אשר יכול לגרום נזק נוסף לתאים ולגרום לכדאיות תאים נמוכה ולהשפיע על התאוששות כללית 27,28,29.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, התאמנו שיטות מפרוטוקולי בידוד קיימים של EC וקבענו פרוטוקול חדש המתאים לבידוד EC מלבלב עכברים. באופן ספציפי, אנו מתארים כאן זרימת עבודה (איור 2) באמצעות collagenase Type I (מיושם בדרך כלל עבור בידוד EC ריאות), טמפרטורות עיכול נמוכות יותר וללא תסיסה (כדי למנוע הפעלה של zymogens הלבלב), ותוספת DNase30,31,32 (כדי למנוע אפופטוזיס המושרה על ידי DNA ולשפר את כדאיות התא, ונוגדן עבור CD3133 (PECAM1, סמן פאן-EC). הפרוטוקול המתואר מייצר אוכלוסיות EC מבודדות מלבלב עכברים שניתן להשתמש בהן לפרופיל ביטוי גנים ולבדיקות חלבונים.

פרוטוקול

בידוד רקמות בוצע תחת פרוטוקול המחקר המאושר #17010 על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכון המחקר בקמן, עיר התקווה (דוארטה, קליפורניה, ארה"ב). כאן, אנו משתמשים Tie-2CreERT2; קו העכבר Rosa26-TdTomato ברקע C57BL/6 בגיל 8 - 12 שבועות. בשורה זו, ECs מסומנים עם TdTomato כאשר מושרה עם טמוקסיפן כפי שתואר קודם34. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל הגילאים של עכברים בוגרים עם גנוטיפים שונים ורקע גנטי שונה.

1. איסוף רקמות (זמן משוער: 1-2 שעות)

הערה: הערכת הזמן היא 15 דקות לכל חיה, מומלץ מקסימום 3 בעלי חיים מאוגמים לכל דגימות דיסוציאציה.

  1. המתת חסד של בעלי חיים על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני (CO2), ואחריה אישור משני למוות. לפני הנתיחה, יש לרסס את כל הגוף באתנול 70% (EtOH), תוך חיטוי מלא של אזור הניתוח.
  2. מתחו ואבטחו גפיים באמצעות פינים. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך קטן קו האמצע דרך העור והצפק החל מאזור הבטן התחתונה ונמשך לכיוון אזור בית החזה.
  3. חשוף את כלוב הצלעות על ידי חיתוך דרך הסרעפת והרם את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
  4. הכנס מחט (25G-30G) המחוברת למזרק המכיל PBS סטרילי קר כקרח, לחדר השמאלי של הלב.
  5. התחל את הזילוח על ידי הזרקת PBS דרך הלב בקצב של 5 - 10 מ"ל / דקה. יש להפסיק לאחר הזרקת 10 מ"ל, או עד שהכבד והכליות הופכים דהויים.
  6. לאחר הזילוח, אתרו את הלבלב (מתחת לקיבה ומחוברים לתריסריון)35 (איור 3A) והוציאו אותו בזהירות בעזרת מספריים ומלקחיים.
  7. לאחר הבידוד, העבירו את הלבלב לצינור של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח + מעכב טריפסין 0.2 מ"ג/מ"ל, שמרו על קרח (איור 3B).
    הערה: ניתן לאגד לבלב ממקסימום 3 עכברים בשלב זה ולהעבירו לצינור אחד. דגימות ניתן לשמור על קרח לזמן מקסימלי של 2 שעות.

2. הכנת collagenase (זמן משוער: 15-30 דקות)

  1. הכן פתרונות ומאגרים כמתואר להלן.
    1. תמיסת דיסוציאציה: הוסף collagenase Type I לתוך צינור 50 מ"ל לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל במי מלח חוצצים פוספט של Dulbecco (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; ראה טבלה של חומרים) ו 0.001 U/mL DNase I + 0.2 מ"ג / מ"ל מעכב טריפסין.
    2. תמיסת עצירת דיסוציאציה: הוסף מלח חוצץ פוספט (PBS 1x, ללא Ca2+, Mg2+; זהה עבור כל שאר PBS בפרוטוקול זה; ראה טבלת חומרים), אלבומין בסרום בקר 5% (BSA), 0.001 U/mL DNase I או DMEM + 10% FBS + 0.001 MU/mL DNase I.
    3. חיץ שטיפה: הוסף PBS 1x, אלבומין סרום בקר 0.5% (BSA), 0.001 U/mL DNase I + 0.05 מ"ג/מ"ל מעכב טריפסין.
  2. יש להמיס את המאגרים לחלוטין ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. מניחים בצד ושומרים על קרח.

3. עיכול (זמן משוער: 40 דקות-1 שעות)

  1. מוציאים את הלבלב מ-PBS קר כקרח ומניחים על צלחת פטרי על גבי קרח. הסירו בזהירות עודפי רקמה (למשל טחול, שומן, פסולת) בעזרת מספריים כירורגיים ופינצטה כירורגיים (איור 3C).
    הערה: חיוני להסיר שומן, שכן עודף שומנים יכול להפריע לעיכול רקמות.
  2. העבר את לבלב העכבר החתוך לצינור 5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה.
  3. יש לשמור את הצינור על קרח ולטחון את רקמות הלבלב בעזרת מספריים מנתחים לחתיכות דקיקות, למשל 0.5 מ"מ או 1 מ"מ. מעבירים ליזט לתוך צינור של 50 מ"ל ושומרים על קרח.
  4. הוסף לבלב נוסף לצינור 5 מ"ל המשמש בתחילה לטחון את רקמת הלבלב ולהוסיף 1 מ"ל נוספים של collagenase. חזור על הפעולה לפי הצורך עבור תכשירים מרובים ללבלב.
  5. הוסף 2 מ"ל של תמיסת collagenase לצינור 5 מ"ל כדי להסיר כל רקמת לבלב שיורית ולהעביר לצינור 50 מ"ל. נפח collagenase הכולל צריך להיות 5 מ"ל עבור 3 לבלב או 3 מ"ל עבור לבלב יחיד.
  6. לאחר שכל הדגימות עברו דיסוציאציה מכנית, העבירו את צינורות 50 מ"ל המכילים את ליזה הרקמה ההומוגנית לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו במשך 10 דקות.
    הערה: אין להתסיס או לערבל במרץ את תערובת הרקמות במהלך תהליך זה, שכן הדבר עלול לגרום לקרע של רקמות אסינאריות ולשחרור אנזימים אנדוגניים ודנ"א בשפע.
  7. מוציאים את הצינורות מאמבט המים ומערבלים בעדינות כדי לערבב היטב, ומשאירים באמבט מים למשך 10 דקות נוספות (סה"כ זמן: 20 דקות).
    הערה: אין לחרוג מ-30 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי למנוע עיכול יתר.
  8. הניחו צינורות על קרח, ותנו להומוגנט להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר ההתיישבות, מעבירים סופרנאטנט דרך מסנן 70 מיקרומטר, ומוסיפים 5 מ"ל של תמיסת עצירת דיסוציאציה.
  9. הוסף 1 מ"ל נוסף של תמיסת דיסוציאציה לגלולה הנותרת וטריטורט עם מחט 18G.
  10. מעבירים את ההומוגנט הנותר דרך המסנן ושוטפים עם 5 מ"ל נוספים של תמיסת עצירת דיסוציאציה.
  11. השעיית תא סחרור ב 300 x גרם במשך 10 דקות, ב 4 ° C. הסר את הסופרנאטנט לחלוטין על ידי שאיפה ושמור את גלולת התא על קרח.
  12. גלולת תא השעיה עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף ולהעביר צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
  13. קח aliquot קטן מן גלולת התא resuspended (10 μL) וערבב עם כחול טריפאן ביחס של 1:1 כדי לספור תאים באמצעות מונה תאים ולמדוד את הכדאיות.

4. העשרת תאי אנדותל (EC) (זמן משוער: 2-3 שעות)

  1. הוסף 1 μL של נוגדן אנטי CD31-ביוטין עבור כל 1 x 107 תאים שנספרו ודגר במשך 30 דקות ב 4 ° C על מסובב (כ 5 μL לכל 3 לבלב).
  2. הוסף 20 μL של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין ודגור במשך 40 דקות ב-4°C על מסובב צינור.
  3. הגדר מעמד מגנטי עם מחזיק מפריד העמודים והחל את העמודה. יש לאזן את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ כביסה.
  4. הוסף דוגמה לעמודה ושטוף עם מאגר כביסה כולל של 9 מ"ל.
    הערה: אם ריכוז התאים גבוה, יש לדלל תאים ב-2 מ"ל נוספים של חיץ שטיפה בצינור נפרד. הוסף 1 מ"ל של דגימה בכל פעם לעמודה כדי למנוע סתימה של העמודה.
  5. הסר את העמודה ממחזיק העמודות והנח בצינור של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של חיץ כביסה, לעמודה. השתמש בבוכנה כדי לדחוף למטה תאים בעמודה ולאסוף אלוציה (המכילה EC מועשר).
  6. סובב כלפי מטה את הזרימה ואת החלק elution/EC ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. ספור תאים ומדוד כדאיות כמו בשלב 3.13.
  7. אימות העשרת EC באמצעות qPCR של שברי זרימה ו- EC. השתמש ב- NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) כסמן כללי עבור תאים אנדוקריניים ומולקולת הידבקות טסיות דם ותאי אנדותל (Pecam1) כסמן עבור EC33. השתמש ב- 36B4 (Rplp0, פוספופרוטאין ריבוזומלי חומצי p0) כבקרה פנימית לנורמליזציה של ביטוי גנים.
    הערה: דגימות שנאספו יכולות לשמש לניתוח חלבונים או RNA בשלב זה.

5. טיפוח pECs

  1. הכינו את מדיום M199. תוסף M199 בריכוז בינוני עד סופי של 20% סרום בקר עוברי (FBS) ו-0.1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. מצפים צלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ בקולגן מסוג I (1 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.1 מ') ומניחים לשבת 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מוציאים קולגן מסוג I ושוטפים את הצלחת עם 1X PBS, פעמיים. הוסף 2 מ"ל של מדיה מוכנה M199 ומניחים צלחת תרבית תאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי (5% CO2, 37 ° C) למשך 5 דקות.
  4. לאחר בידוד התאים, הוסיפו תאים מבודדים לצלחת תרבית תאי M199 שחוממה מראש. שמור תאים בתנאי תרבית במשך כ -14 ימים ולשנות מדיה כל 2-3 ימים.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לקבל כ 2 x 106 תאים חיים בעת איגום 3 לבלב עכבר, ו 750,000 תאים מלבלב עכבר יחיד. כדי לאמת את ההעשרה של EC, ביצענו את הניתוחים הבאים: 1) PCR כמותי: בהשוואה לדגימות הזרימה (FT) (כלומר, השברים שאינם קשורים לנוגדנים CD31), לשברי EC היו רמות גבוהות משמעותית של Pecam1 (קידוד CD31) ו - Kdr (קידוד VEGFR2), שני גנים של סמן EC33, ורמות נמוכות יותר של NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), גורם שעתוק בתאים האנדוקריניים של הלבלב (איור 4A); 2) כתמים מערביים: דגימות מועשרות ב-EC משלושה תכשירים (pEC-1-3) הראו אותות חזקים של CD31 בגודל הצפוי (~130 kDa). לשם השוואה, דגימות הקלט וה-FT הראו אות CD31 מינימלי. כבקרה חיובית, ליזטים של תאי MS1, קו תאי pEC, הראו גם אות CD31 חזק (איור 4B); 3) צביעה כחולה של טריפאן: מצאנו שהכדאיות של תאים מבודדים הייתה בסביבות 50% (איור 4C); 4) ציטומטריית זרימה בעקבות פרוטוקול15 שפורסם: באמצעות gating על אוכלוסיית התאים החיים (איור 4D), מצאנו שתאי CD31+ היו ב-88% ותאי TdTomato+ היו ב-76%. שימו לב, רוב התאים המבודדים מבטאים במשותף CD31 ו-TdTomato (איור 4E). כבקרות שליליות, תאי MS1 לא מוכתמים ו- MS1 מודגרים עם IgG לא הראו תאים חיים כפי שמסומן על ידי CD31. כבקרה חיובית, כלומר תאי MS1 מוכתמים עבור CD31 הראו קרוב ל-100% תאי CD31+ חיים (איור 4F). תרבינו גם את התאים המבודדים, ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית של PECAM1 בעקבות פרוטוקול36 שפורסם, וצילמנו את TdTomato, שהראה אותות חזקים של שני הסמנים בתאים המבודדים, מה שמרמז על נוכחות ECs (איור 4G).

דיאגרמת לבלב הממחישה ECs תוך-איים לחקר מבנה כלי הדם וניתוח אינטראקציה תאית.
איור 1: איור של וסקולריזציה של איי לבלב ולבלב . תיאור ציורי של תאי אנדותל הלבלב (ECs) ותאי EC בתוך איון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים הכנת לבלב חד-תאי; צנטריפוגה, תיוג CD31-ביוטין, ניתוח זרימה.
איור 2: מבט כולל על זרימת עבודה. 1) דיסקציה של הלבלב, 2) עיכול מכני, 3) דגירה של אנזימים, 4) צנטריפוגה, 5א) סילוק סופרנטנט ו-5ב) עיכול קולגנאז משני של כדורי התא עם טריטורציה לסינון ב-6), 7), ו-8) בנייה מחדש של כדוריות וקשירת נוגדנים, 9) דגירה של מיקרו-כדוריות, 10) העשרת עמודת MACS, 11) ספירת תאים לצורך כדאיות, ו-12) אנליזה במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיסקציה של רקמות המציגה את תהליך הקציר, הבידוד והחיתוך של הלבלב במחקר ביולוגי.
איור 3: שלבי עיבוד רקמות. תמונות של (A) חלל הבטן, (B) לבלב העכבר המבודד, ו-(C) לבלב העכבר החתוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ביטוי גנים, ניתוח CD31, DAPI, מיון תאים, פלואורסצנציה ותוצאות ציטומטריית זרימה.
איור 4: אימות של שברי EC מבודדים מלבלב עכבר. (A) qPCR של דגימות FT ומקטע EC מועשר ב-CD31 להעשרה. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) ו- Nkx6.1 (גורם שעתוק ספציפי ללבלב β תאים)33. * מציין p <0.05 בהשוואה ל-FT בהתבסס על בדיקות t . n = 3-4 דגימות מאוגמות, המורכבות מ-3 עכברים כל אחת. (B) כתם מערבי של CD31. pEC-1-3 מציין ECs מועשרים מ-3 דגימות עכבר נפרדות. ליזטים של 30 מ"ג הועמסו על כל נתיב, ואחריו צביעת פונסו S. (C) ספירת תאים וצביעה כחולה טריפאן של pECs מועשרים לבדיקת כדאיות. (D) אסטרטגיית גאטומטריית זרימה עבור pECs עכבר מוכתמים על ידי 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ונוגדן CD31. (E) היסטוגרמות ציטומטריית זרימה של MS1 לא מוכתם (למעלה משמאל), MS1 מוכתם בנוגדן משני AlexaFluor-488 (בקרת IgG; למעלה מימין), MS1 מוכתם ב-CD31 (למטה משמאל), ו-pECs העכבר המבודדים מוכתמים ב-CD31 (למטה מימין). (F) אחוז התאים החיים שכומתו באמצעות ציטומטריית זרימה. (G) אימונופלואורסנציה של ביטוי CD31 (ירוק) עם DAPI (כחול) כתם נגדי וכתב פלואורסצנטי אנדוגני TdTomato (אדום). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית CD31 / CD144 / DAPI, ניתוח ביטוי גנים UMAP של Cdh5, Pecam1.
איור 5: ספציפיות CD31 ו-CD144 בלבלב עכבר. (A) אימונופלואורסצנטיות של לבלב עכבר עם CD31 (מגנטה) ו-CD144 (ציאן), עם כתם נגדי DAPI. התמונה צולמה באמצעות עדשת 10x תחת מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי רחב. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קווים מקווקווים תוחמים את אזור האיון. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) המציג ביטוי Cdh5 ו-Pecam1 באיונים ECs מעכברי C57BL6 שזוהו על ידי scRNA-seq (GSE128565)37. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אנזיםשימושטמפרטורה וזמןהפניה
קולגנאז Iדיסוציאציה של תא בודד, העשרת EC בלבלב שלם37°C, 20 דקותפרוטוקול זה
קולגנאז IVבידוד האי ודיסוציאציה לא אנזימטית37°C, 20 דקות46
קולגנאז + טריפסיןבחינת תאים דוקטליים בלבלב עכבר37°C, 30 דקות47
קולגנאז Bהשעיית תא בודד של הלבלב37°C, 30 דקות48
Collagenase NBIבידוד איילט37°C, 30 דקות49
קולגנאז PAcinar קיימא השעיה37°C, 15 דקות45
קולגנאז XIבידוד איילט37°C, 15 דקות35
דיספסימתלה תא יחיד37°C, 45 דקות24
ליבראסהמתלה תא יחיד37°C, 10 דקות25, 48
טריפסיןדיסוציאציה של תא בודד, לבלב שלם4 °C, O/N28

טבלה 1: סיכום פרוטוקולים שונים המשמשים לעיבוד דגימות לבלב עכבר.

דיון

במאמר זה נציג פרוטוקול להעשרה ובידוד של ה-pECs. בדומה לפרוטוקולי בידוד EC קודמים מרקמות או איברים אחרים, פרוטוקול זה מורכב משלושה תהליכים עיקריים, כלומר, דיסוציאציה פיזית, עיכול אנזימטי והעשרת EC מבוססת נוגדנים. כדי להתמודד עם האתגרים הייחודיים בעיבוד הלבלב, הצגנו מספר התאמות מרכזיות ושלבים קריטיים בפרוטוקול שלנו: 1) עיכול עדין של collagenase בצעד אחד עם זמן דגירה קצר, 2) תוספת של ריכוז גבוה יותר של DNase ומעכב טריפסין כדי למזער זיהום DNA ועיכול אנזימים אנדוגניים, אשר יכול להפריע לקשירת נוגדנים ובכך להפחית את העשרת EC ואת הכדאיות 3) ספירת תאים לאחר שלב העיכול כדי להתאים כיצד נוגדנים רבים מתווספים לדגימה כדי לייעל את העשרת EC. בתהליך המיטוב של פרוטוקול זה, בדקנו אנזימים אחרים ששימשו במחקרים קודמים, למשל טריפסין28, קולגנאז סוג IV31 וטמפרטורות עיכול אחרות, למשל 4°C, כמו גם זמני דגירה שונים (טבלה 1). מצאנו שקולגן מסוג I, 20 דקות, בטמפרטורה של 37°C הוא המצב האופטימלי לבידוד pEC בעכבר והשתמשנו בו כאן. בעוד שתוספת של נוגד קרישה במהלך הזילוח עשויה לשפר את הכדאיות הכוללת של התא, חומר נוגד קרישה טיפוסי, למשל, EDTA או הפרין עלול להפריע לפעילות של אנזימים מסוימים, למשל, collagenase לדיסוציאציה של תאים ושעתוק לאחור המשמש qPCR. כדי למנוע את ההשפעה הבלתי צפויה/בלתי רצויה של נוגדי קרישה אלה, PBS (ללא Ca2+ ו- Mg2+) עבור זילוח משמש.

התמקדנו בפיתוח פרוטוקול להעשרת אוכלוסיית EC מלבלב עכבר שלם, שיכלול גם ECs תוך-איים וגם ECs ברקמות האקסוקרניות, וכתוצאה מכך יבול גבוה יותר. בפרוטוקול הנוכחי, איגמנו יחד 3 בעלי חיים במהלך שלב הדיסוציאציה והשגנו בממוצע תרחיף חד-תאי עם כ-2.0 x 106 תאים בני קיימא. בדקנו גם דגימות מלבלב עכבר יחיד וניתן להשיג כ-750,000 תאים. ראוי לציין כי בעת הסתגלות לעיבוד חיה אחת, יש להשתמש בתמיסת דיסוציאציה פחות (3 מ"ל דיסוציאציה ללבלב). שלב מכריע בפרוטוקול הוא לחתוך ולהסיר לחלוטין כל שאריות שומן שמחוברות ללבלב (איור 3B). זיהום רקמת השומן בעיכול הקולגנאז יפריע לשלב הדיסוציאציה של התא הבודד בלבלב ויפחית את יכולת הקיום של התא בשלבי ההעשרה הבאים38. יתר על כן, כדי להעשיר pECs השתמשנו סמן פני השטח pan-EC, PECAM1 / CD31. באמצעות נוגדן PECAM1/CD31, הצלחנו להעשיר באופן משמעותי שברים EC, כפי שניתן לראות על ידי ניתוח ביטוי גנים. בפיתוח פרוטוקול זה, בדקנו גם את התועלת של נוגדן CD144, אשר שימש גם בדרך כלל לבידוד ECs13. עם זאת, לא הצלחנו להעשיר pECs (נתונים לא מוצגים). באופן מסקרן, צביעה אימונופלואורסצנטית גילתה כי בעוד CD31 מתבטא בכל ECs ברקמת הלבלב, נוגדן CD144 נראה מכתים רק ECs בתוך האי (איור 5A). בנוסף, ניתחנו נתוני RNA-seq של תא בודד הזמינים לציבור מאיים שבודדו מעכברי C57BL/6 (GSE128565)37 ומצאנו שכ-50% מתאי ה-EC של האיים מבטאים גם Cdh5 (VE-Cad) וגם של Pecam1, אולם שאר האיים מבטאים רק Cdh5 או Pecam1 (איור 5B). לפיכך, אנו משערים כי נוגדני CD31 מתאימים יותר לבידוד pEC והתועלת של נוגדן CD144 למטרה זו מצדיקה חקירה עתידית. יתר על כן, ישנם אנטי CD31 זמין מסחרית מצומד עם חרוזים מגנטיים אשר יכול לפשט את שלב קשירת נוגדנים שני שלבים לשלב יחיד.

כפי שהוכח, ביצענו qPCR, immunoblotting, ציטומטריית זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית כדי לאמת את מקטע EC המבודד. ניתן להעלות על הדעת כי שברים אלה יכולים להיות נתונים לבדיקות אחרות, כגון (sc)RNA-seq וספקטרומטריית מסות. מגבלה של פרוטוקול זה היא שלא הצלחנו להשיג תת-תרבות חזקה ולבצע בדיקות פונקציונליות. בהתחשב בכך שתת-תרבות של עכברים מבודדים הוכחה כמאתגרת, זהו תחום המצדיק מאמצים עתידיים. דרך אחת להתמודד עם זה עשויה להיות הכנסת אנטיגן T גדול, אשר שימש לאימורטליזציה של תאים ראשוניים39.

ההתקדמות האחרונה והיישום של ריצוף scRNA אפשרו פרופיל ברזולוציה גבוהה של תאי לבלב40 ובמיוחד תאי איון41. עם זאת, רוב המחקרים הקיימים התמקדו באוכלוסיות תאים אנדוקריניים והשתמשו בפרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות שאינם שומרים ביעילות על ECs. כתוצאה מכך, שברי EC לעתים קרובות בסופו של דבר נדירים, המהווים רק 3%-5% בכל אוכלוסיות התאים שנלכדו 42,43,44. פרוטוקול עדכני משתמש בעיכול אנזימטי דו-שלבי ובנטרול ושלב מיון תאים המופעל באופן פלואורסצנטי ומאחזר ECs ב-12% מכלל אוכלוסיית תאי הלבלב45. משלים לפרוטוקול זה, הפרוטוקול שלנו מספק זרימת עבודה פשוטה, אשר עשויה להיות חסכונית יותר ופחות תובענית מבחינה טכנית אם ECs יהיו מוקד המחקר. למרות שפרוטוקול זה נבדק רק בלבלב עכברים, ניתן להגדיל אותו ולהתאים אותו כדי לבודד ECs מאורגניזמים אחרים, כולל לבלב אנושי.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לד"ר בריאן ארמסטרונג מ-City of Hope, ולמינדי רודריגז מאוניברסיטת קליפורניה בריברסייד על הסיוע הטכני. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים מה-NIH (R01 HL145170 ל-ZBC), קרן אלה פיצג'רלד (ל-ZBC), עיר התקווה (Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award) ומענק EDU4-12772 של המכון לרפואה רגנרטיבית של קליפורניה (ל-AT). המחקר שדווח בפרסום זה כלל עבודה שבוצעה במיקרוסקופ אור והדמיה דיגיטלית בתמיכת המכון הלאומי לסרטן של ה- NIH תחת פרס מספר P30CA033572. איור 1 ואיור 2 נוצרו באמצעות BioRender.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל eppendorfארה"ב מדעי1615-5500
צלחת 10 ס"מGenesee Scientific25-202
25G מחטיםBD305145
2X Taq Pro אוניברסלי SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 מ"ל eppendorfThermo Fisher 
14282300 צלחת 6 בארותגריינר ביו-וואן07-000-208
70 ומיקרו; m מסננתפישר22-363-548
אנטי-CD31-ביוטיןMiltenyi BiotechREA784
סרום בקר אלבומין מטופל בהלם חוםפישרBP1600-100
CaCl2FisherBP510
צנטריפוגהאפנדורף
קולגן סוג 1, מעור עגלסיגמא אולדריץ'& נ.ב.פ;C9791מגיב מצורף בפרוטוקול
קולגנאז סוג 1 וורת'ינגטון ביוLS004197
רוזנת מונה תאים אוטומטיתרמו פישר 
DAPIתרמו פישר D1306אימונופלואורסצנציה
אזמל בטיחות חד פעמיMyco Instrumentation6008TR-10
DNAse I רוש260913 
D-PBS (Ca2+, Mg2+)תרמו פישר 
אתנולפישרBP2818-4
סרום בקר עובריפישר10437028
אינקובטורנשמר ב-37 מעלות; C 5% CO2
LS עמודותMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand עם מפריד QuadroMACs Miltenyi Biotech130-042-303
בינוני 199סיגמא אולדריץ' M2520-10X
מיקרו-חרוזים אנטי ביוטיןMiltenyi Biotech130-090-485
מיקרוסקופLeicaלהערכת מורפולוגיה של תאים
קורנינגמים בדרגה מולקולרית46-000-CM
NaClFisherS271-1
ניו ברונסוויק Innova 44/44R שייקר אורביטלי Eppendorf
PECAM1 (CD31) נוגדןAbcamab56299אימונופלואורסצנטי
PECAM1 (CD31) נוגדןR& D SystemsAF3628
פוספט חוצץ מלח (10X) (ללא Ca2+, ללא Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
פריימר 36B4 עכבר קדימהIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
פריימר 36B4 עכבר Revese  IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
פריימר Kdr עכבר קדימה IDTTCCAGAATCCTCTCTCCATGC
פריימר Kdr עכבר הפוךIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
פריימר Nkx6.1 עכבר הפוך IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
פריימר Nxk6.1 עכבר קדימהIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
פריימר PECAM1 עכבר קדימהIDTACGCTGGTGCTATGCAAG
פריימר PECAM1 עכבר הפוךIDTTCAGTTGCTGCCCATCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
RNase מים ללא TakaraRR036B
מלקחיים ארוכים סטריליים 12 אינץ'FST91100-16
מלקחיים עדינים סטרילייםFST11050-10
מספריים עדינים סטרילייםFST14061-11
כלי תרבית רקמות 2 ס"מGenesee Scientific25-260
TRIzol מגיבפישר15596018
טריפן בלוקורנינגMT25900CI
מעכב טריפסין Roche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin AntibodyAbcamab33168אימונופלואורסצנטי
אמבט מים
14080055

מקורות

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

לבלב עכברבידוד תאי אנדותלמיון תאים מגנטידיסוציאציה עדינהסמני שטח תארצף תא בודדכלי הדם של הלבלבנוגדן CD31ווסטרן בלוט (Western Blotting)
בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.