מאמר שיטה

מידול זיהום נרתיקי עולה, לידה מוקדמת ותחלואה בילודים בעכברים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66723

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1EGA Institute for Women's Health, University College London, 2Department of Women and Children's Health, St Thomas' Hospital, King's College London

במאמר זה

סיכום

לידה מוקדמת (לידה < שבוע 37) היא בעיה בריאותית עולמית דחופה עם אפשרויות מניעה וטיפול לא אופטימליות. אנו מציגים מודל עכברי של לידה מוקדמת הנגרמת על ידי זיהום חיידקי בנרתיק ומתארים כיצד לנתח את התחלואה והתמותה של היילודים כתוצאה מכך.

תקציר

לידה מוקדמת ממשיכה להיות הגורם העיקרי לתמותה ותחלואה של יילודים ברחבי העולם, עם טיפולי מניעה מוגבלים. יש צורך הכרחי מבחינה קלינית
מודלים רלוונטיים וניתנים לשחזור של בעלי חיים לתרגום התערבויות חדשניות
להפוך למציאות. קיימים מודלים שונים של עכברים ללידה מוקדמת. עם זאת, הם אינם מסכמים תחלואה בילודים אנושיים, כולל שינויים נוירופתולוגיים ו
פגיעה ריאתית, שהן השלכות אופייניות לזיהום עולה ולידה מוקדמת. אפיינו מודל שלמיטב ידיעתנו, הוא היחיד שמחקה את התרחיש האנושי לפיו תחלואה בילודים אלה נוכחת לאחר השראת לידה מוקדמת על ידי חיידק חי העולה מהנרתיק. מאמר זה מדגים את המתן התוך-נרתיקי של זן ביולומינסנט של Escherichia coli ומפרט את הערכת התוצאות הנוירופתולוגיות ופגיעה בריאותית באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה.

מבוא

לידה מוקדמת (PTB; לידה < 37 שבועות) היא התורמת העיקרית לתמותת יילודים ברחבי העולם 1,2. מהווה 11% מכלל הלידות, זוהי בעיה בריאותית עולמית גדולה עם אטיולוגיה מורכבת שאינה מובנת היטב, מה שמקשה על חיזוי ומניעהשל 3,4,5. יילודים ששרדו PTB עלולים לחוות תוצאות נוירו-התפתחותיות שליליות, כולל שיתוק מוחין, הפרעות נשימה, כגון דיספלזיה של הסימפונות (BPD), והפרעות במערכת העיכול כגון דלקת מעי נמקית (NEC)6,7,8. לכן, יש צורך דחוף במודלים של בעלי חיים רלוונטיים מבחינה קלינית וניתנים לשחזור כדי לטפל במסלולים הביולוגיים התורמים ל-PTB ולפתח התערבויות חדשניות.

ישנם מספר מנגנונים אפשריים העומדים בבסיס PTB ספונטני, כגון הזדקנות דצידואלית, התמוטטות של סבילות אם-עובר, מתח, אורך צוואר רחם קצר או נזק לצוואר הרחם9. עם זאת, לפחות 40% מה-PTBs הספונטניים מדווחים כקשורים לזיהום מיקרוביאלי10,11. חיידקים העולים מתעלת הנרתיק דרך צוואר הרחם לרחם משוערים ומקובלים כדרך זיהום נפוצה בשל המתאם בין החיידקים המבודדים ממי השפיר לבין אלה השוכנים במיקרוביוטה הנרתיקית 12,13,14. מיקרואורגניזמים הקשורים לעתים קרובות ללידה מוקדמת כוללים מינים של מיקופלזמה, אוריאפלזמה, פוסובקטריום וסטרפטוקוקוס, ורוב המקרים הם פולימיקרוביאליים15,16.

עכברים משמשים לעתים קרובות למודל PTB, כאשר הגישה הנפוצה ביותר היא מתן הרעלן החיידקי ליפופוליסכריד (LPS), שיכול להימסר בדרכים תוך רחמיות, תוך-צפקיות או תוך-מי שפיר כדי לגרום לרמות דלקת הדרושות להתחלת לידה17. עם זאת, LPS אינו מדגמן זיהום מיקרוביאלי חי, וחשוב מכך, לא ניתן למדוד תוצאות יילודים במודלים אלה מכיוון ש-LPS גורם למוות עוברי18. בשנים האחרונות פותחו מודלים של בעלי חיים של זיהום חיידקי נרתיקי עולה, אך סיכום הן של לידה מוקדמת והן של תוצאות יילודים נלוות היה אתגר 19,20,21,22,23,24.

הקבוצה שלנו הקימה מודל חדשני של זיהום חיידקי בנרתיק עולה, לידה מוקדמת ותחלואה בילודים המסכם את הפתופיזיולוגיה של PTB25 אנושי. כאן, אנו מדגימים כיצד להעריך נוירופתולוגיה של יילודים ופגיעה ריאתית בגורים שנחשפו לזיהום נרתיקי אימהי עולה עם זן Escherichia coli (E. coli) פתוגני שנקשר לדלקת קרום המוח בילודים אנושיים. מודל זה מציע הזדמנות ייחודית לחקור את הפתופיזיולוגיה של זיהום עולה, כמו גם לספק את האמצעים להעריך את היעילות של התערבויות לידה מוקדמות בשיפור תוצאות היילודים.

פרוטוקול

ההליכים נערכו תחת רישיון משרד הפנים הבריטי (PAD4E6357) בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי חיים (1986) והנחיות ARRIVE. טמפרטורה (19-23 מעלות צלזיוס), לחות (~55%) ומחזורי אור/חושך של 12 שעות נשלטו בקפדנות. עכבריC-2J נקבות בתולות C57BL/6 Tyr (בגילאי 6-12 שבועות) הזדווגו למשך 16-18 שעות. עדות לפקק ההזדווגות נקבעה ליום העוברי (E) 0.5.

E. coli O18:K1 (A192PP)26, זן שעבר חולדה של A192 (DSM. מס' 10719)27, שונה כדי להכיל את אופרון הלוקס (luxCDABE), שמקורו בסימביונט הנמטודה Photorhabdus Luminescens ATCC29999 (זן Hb), וכולל קלטת עמידות לקנאמיצין (Km2)28. זן זה מסווג כקבוצת סיכון 2 על ידי הוועדה המייעצת של ממשלת בריטניה לפתוגנים מסוכנים (ACDP). ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) ולעקוב אחר ההנחיות המקומיות בעת טיפול וסילוק חומרים ביולוגיים.

1. מודל עכבר של זיהום חיידקי בנרתיק עולה

  1. הכנת תרביות E. coli
    1. מכינים מרק לוריא-ברטאני (LB) על ידי המסת האבקה במים מזוקקים (dH2O) ליצירת תמיסה של 20% וחיטוי. לאחר שה-LB התקרר לטמפרטורת החדר, הוסף 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
    2. הכן תמיסת ג'ל פלורוני 20% F127 על ידי המסת המוצק בתמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS). מערבולת לערבב ולערבב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. הוסף 10 מ"ל מרק LB שטופל באנטיביוטיקה למיכל אוניברסלי סטרילי של 30 מ"ל. הסר מלאי גליצרול קפוא של E. coli מאחסון של -80 מעלות צלזיוס. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, מגרדים את ציר הגליצרול הקפוא של E. coli כדי לצפות קלות את קצה הקצה ולהוציא את הקצה ישירות למרק LB. אבטח את המיכל האוניברסלי עם פרפילם, סמן אותו כמפגע ביולוגי והנח אותו בשייקר מסלולי למשך הלילה (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס.
    4. למחרת בבוקר, יש לדלל את תרבית החיידקים 1:100 (0.1 מ"ל תרבית + 9.9 מ"ל מרק LB טרי) ולהחזיר אותה לשייקר האורביטלי למשך 1.5-3 שעות (200 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס), ולבדוק באופן קבוע את צמיחת התרבית על ידי מדידת הספיגה ב-600 ננומטר. פיפטה 100 מיקרוליטר של התרבית משוכפלת לצלחת שקופה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. מדוד את הספיגה בספקטרופוטומטר עם תיקון אורך נתיב מופעל. OD600 בין 0.5 ל-0.7 מסמל את השלב המידלוגריתמי של הצמיחה.
    5. כאשר מגיעים ל-OD600 0.5-0.7 (~108-9 יחידות יוצרות מושבה [CFU]), הסר 100 מיקרוליטר מתרבית החיידקים ודלל ב-900 מיקרוליטר של PBS סטרילי. צנטריפוגה בחום של 14,000 × גרם למשך דקה אחת לשטיפת הכדור החיידקי והסרת מרק ה-LB. הסר את ה-supernatant, השהה מחדש את הכדור החיידקי ב-PBS סטרילי, ודלל 1:10,000 ב-PBS סטרילי (ל-102-3 CFU).
    6. יש לחטא את כל הקצוות והמיכלים החשופים לחיידקים לפני השלכתם.
  2. הרדמה
    1. ב-E16.5, יש להרדים עכברים בהריון על ידי שאיפת איזופלורן (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה בחמצן). העבירו את זרימת ההרדמה ולאחר מכן את החיה אל חרוט האף, והניחו את הנקבה במצב שכיבה. אשר הרדמה באמצעות היעדר רפלקס צביטה בבוהן ושמור על איזופלורן באחוז המינימלי הנדרש להליך.
      אזהרה: איזופלורן הוא גורם מגרה לעיניים ולעור ורעיל למערכת העצבים המרכזית. ללבוש PPE מתאים. השתמש תמיד במערכת נבלות.
    2. מתן 20 מיקרוליטר של E. coli בשלב מידלוגריתמי (1 ×10 2-3 CFU מושעה ב-PBS סטרילי) או PBS סטרילי (בקרת רכב) לתוך הנרתיק באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 מיקרוליטר (איור 1). בעזרת קצה פיפטה סטרילי טרי של 200 מיקרוליטר, העבירו 20 מיקרוליטר של 20% ג'ל פלורוניק F127 לתוך הנרתיק כדי למנוע דליפת חיידקים. בעזרת גזה סטרילית, טפחו אבקת כינין על האינטרויטוס כדי להרתיע את העכברים מלנקות את תרחיף החיידקים. רשום את התאריך והשעה של הטיפול.
      הערה: CFU ששימשו התבססו על ניסויי טיטרציה כדי להשיג את הפנוטיפ הרצוי (לידה מוקדמת עם גורים חיים). ניתן לקבוע CFU על ידי ביצוע דילול סדרתי וציפוי על לוחות אגר LB29.
    3. כלוב בודד של בעלי חיים בכלובים מאווררים בנפרד (IVC) ולאפשר להם להתאושש מההרדמה לפני החזרת הכלוב לחדר ההחזקה; סמן בבירור את הכלוב כמפגע ביולוגי. עקוב אחר בעלי החיים עד שהתנהגותם הרגילה תחזור.
      הערה: הליך זה אמור להימשך לא יותר מ-5 דקות, ובעלי חיים צריכים להתאושש במהירות (תוך 2-5 דקות).
  3. מדידת תוצאות הריון
    1. הגדר טלוויזיה במעגל סגור על ידי הצמדת מצלמה אחת לחלק החיצוני של כל כלוב כדי לנטר את העכברים לאיתור סימני לידה ולידת גורים. רשום את הזמן שלקח עד הלידה כמספר השעות מרגע מתן תוך נרתיקי של E. coli או PBS (שלב 1.2.2) ועד ללידת הגור הראשון.
    2. רשמו את מספר הגורים החיים/מתים בלידה וחישבו אחוז הישרדות לכל המלטה. התבוננו בסכר ובגורים מדי יום, רשמו את הישרדות הגורים עד 7 ימים לאחר הלידה והבטיחו את התאוששות הסכרים. בצעו מדידות אחרות, כגון משקל ואורך הגור, במהלך תקופה זו.
      הערה: סימני לידה כוללים טיפוח מוגבר, סיבוב במעגלים ומתיחה ובעיטה ברגליים האחוריות. מכיוון שמדובר בזיהום חיידקי חי, הסכרים יפתחו תסמינים לאורך זמן (בדרך כלל 24 שעות לאחר הטיפול). הנקבה אמורה להתאושש מהזיהום, אך אם היא עדיין מציגה תסמינים של זיהום לאחר הלידה, לא בנתה קן, או האכילה את הגורים שלה במהלך היום הראשון, אז להקריב את בעלי החיים באופן אנושי בשיטות לוח זמנים 1 (כגון חשיפה ל-CO2 בריכוז עולה ואישור מוות כתוצאה מפריקת צוואר הרחם).
  4. הדמיית ביולומינסנציה
    1. לאחר חיסון חיידקים, דמו את הנקבות ב-24 שעות ו-48 שעות כדי לעקוב אחר התפשטות הזיהום, כמתואר להלן. דמיינו את הגורים ביום שלאחר הלידה (P)0 עד P14 ללא צורך בהרדמה.
    2. לאחר פתיחת תוכנת ההדמיה, לחץ על אתחול והמתן עד שהמצלמה תגיע לטמפרטורת ההפעלה (סרגל הטמפרטורה יהפוך לירוק ו"יינעל"). סמן את התיבה עבור הדמיה זוהרת וודא שמסנן העירור מוגדר כחסום ומסנן הפליטה מוגדר לפתוח.
    3. להרדים נקבות בוגרות על ידי שאיפת איזופלורן (5% לאינדוקציה, 1.5% לתחזוקה בחמצן). הנח את בעלי החיים במצב שכיבה במכונת הדמיה ביולומינסנציה (עם שלב מחומם) תוך שמירה על ההרדמה לעכברים. בחר זמן חשיפה אוטומטי או הגדר ידנית את זמן החשיפה (טווח חשיפה: דקה אחת - 5 דקות). לאחר ההדמיה, החזירו את בעלי החיים לכלובים שלהם כדי להתאושש מההרדמה לפני החזרתם לחדר ההחזקה.
    4. כדי למדוד את קרינת הפוטון באופן כמותני, בחר אזורי עניין (ROIs) בתמונות העכבר ורשום את הפוטונים לשנייה לסנטימטר בריבוע לכל סטרדיאן (פוטונים∙ (ס"מ שני 2)-1∙sr-1).

2. אנליזות רקמות עובריות ויילודים

  1. איסוף רקמות סביב הלידה
    1. ב-E18.5, להקריב את הסכר על ידי חשיפה לעלייה בריכוז CO2 ואישור מוות מפריקת צוואר הרחם ולבצע מיני לפרוטומיה להסרת הרחם; לאחר מכן, בצע חתך ברחם בעזרת מספריים.
    2. אם אוספים מי שפיר, יש לבצע חתך קטן בקרומים ולאסוף את הנוזל באמצעות פיפטת פסטר או מזרק ללא מחט.
    3. בעזרת מלקחיים, ביד אחת החזיקו את החלק החיצוני של הרחם בנקודה בה מחוברת השליה, ובעזרת מלקחיים מעוקלים ביד השנייה, נתקו בעדינות את השליה מדופן הרחם הפנימית על ידי התגרות ברקמות, תוך הנחיית העובר בזהירות, כשהקרומים והשליה מחוברים, אל מחוץ לרחם. שוב, עם מלקחיים בכל יד, החזיקו בעדינות את השליה ותפסו ותמרו את הממברנות בנקודה שבה הן פוגשות את השליה (וודאו שהן יורדות נקיות).
    4. כעת, לאחר הפרדת הרקמות, אספו את רקמות ההריון הנדרשות (למשל, רחם, שליה, קרומי עובר, צוואר הרחם והנרתיק) ונתחו רקמות עובריות (למשל, מוח, ריאות ומעיים).
    5. יש להקפיא מיד את הרקמות על קרח יבש או בחנקן נוזלי ו/או לקבע רקמות בפרפורמלדהיד (PFA; 4% ב-PBS).
    6. אחסן טישו קפוא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וקבע את הטישו למשך 24-48 שעות; לאחר מכן, יש לאחסן ב-30% סוכרוז ב-4 מעלות צלזיוס.
      אזהרה: PFA הוא דליק ועלול לגרום לגירוי בעיניים, בעור ובנשימה. הכן תמיסה של 4% בארון בטיחות ביולוגית ולבש PPE מתאים בעת הטיפול.
  2. איסוף רקמות לאחר לידה
    1. ב-P7, יש להרדים את הגורים באמצעות איזופלורן (5% לאינדוקציה, 1.5% לתחזוקה בחמצן).
    2. בצע הוצאה וזלוף רקמות על ידי חיתוך הפרוזדור הימני והזרקת 10 מ"ל PBS לחדר השמאלי. ערפו את ראש הפגר והסירו את המוח והריאות באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים. עבד ואחסן רקמות כמתואר לעיל.
      הערה: ניתן לנתח רקמות קפואות של האם והעובר לאיתור מתווכים דלקתיים ואחרים על ידי qPCR, ELISA וכתם מערבי. פרוטוקולים לטכניקות אלה זמינים בקלות מיצרני הריאגנטים או בפרסומים אחרים 25,30,31.
  3. הקפאה של מוחות עוברים ויילודים
    1. בעזרת להב, הסר את המוח הקטן ליצירת משטח ישר והקפיא את הרקמה על קרח יבש. הרכיבו את הרקמה הקפואה על מחזיק הדגימה באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), וכסו את הרקמה בשכבה דקה של OCT. הניחו להקפאה (1-2 דקות).
    2. באמצעות קריוסטט המוגדר ל-20 מעלות צלזיוס, ודא שהידית נעולה וטען את מחזיק הדגימה. התאם בעדינות את מיקום הרקמה ונעל במקומו. חתוך את הרקמה והתחל לאסוף קטעי רקמה על מיקרו-שקופיות מהיתוך הקורפוס קלוסום, והקפיא מיד את החלקים על קרח יבש. חותכים 50 חלקים סדרתיים של 40 מיקרומטר מכל רקמה.
      זהירות: היזהר עם הלהב החד.
    3. אחסן את החלקים הקפואים על מיקרו-שקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  4. אימונוהיסטוכימיה
    הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול שלהלן לזיהוי אסטרוציטים (חלבון חומצי סיבי גליה; GFAP), מיקרוגליה (גורם דלקתי אלוגרפט 1; IBA-1), ונויטרופילים (אנטיגן לימפוציטים 6 בן משפחת G; Ly6G). מידע על נוגדנים ניתן למצוא ב טבלה 1.
    1. בחרו חמישה חלקים לכל מוח, במרחק של 400 מיקרומטר זה מזה, שיאפשרו להעריך אזורים שונים במוח בעומקים משתנים של המוח. יש להחזיר לחות לחלקים קפואים עם טיפה של dH2O ולמרוח ולפרוש את הטישו באמצעות שתי מברשות עדינות. יבש את הרקמה מתחת למאוורר למשך 20-30 דקות. בעזרת עט הידרופובי (PAP), צייר בזהירות סביב הרקמה מבלי לגעת בה.
    2. ביום הראשון, הכינו פורמלדהיד 4% (FA) על ידי הוספת 5.4 מ"ל פורמלדהיד ב-50 מ"ל של 0.1 מ"ל מאגר פוספט (PB) לקובטה אחת של 50 מ"ל (קיבולת 15 שקופיות). טבלו את השקופיות ב-FA למשך 5 דקות כדי לתקן את הקריוקציה, לאפשר הידבקות לשקופיות ולשתק אנטיגנים.
      זהירות: FA דליק ועלול לגרום לגירוי בעיניים, בעור ובנשימה. הכן תמיסה של 4% בארון בטיחות ביולוגית ולבש PPE מתאים בעת הטיפול.
    3. הכן סרום אלבומין בקר 0.1% (BSA) על ידי הוספת 0.4 גרם BSA ל-400 מ"ל של 0.1 M PB. שטפו את החלקים פי 2 על ידי טבילתם ב-0.1 M PB, ולאחר מכן שטיפה אחת ב-BSA (~3 שניות לכל כביסה). אחסן שקופיות ב
      קובטות המכילות BSA עד הצורך.
    4. הכן תאי לחות על ידי הרטבת נייר טישו עם dH2O והנח אותם בתא, תוך ניקוז עודפי מים.
    5. הכינו סרום עיזים 5% (50 מיקרוליטר סרום עיזים ב -1 מ"ל של 0.1 M PB). יבש בזהירות את השקופית סביב חלק הטישו עם נייר טישו, וודא שגבול עט ה-PAP שלם, ולאחר מכן מרח 50 מיקרוליטר מהתמיסה לכל קטע טישו. דגירה בתא הלחות למשך 30 דקות.
    6. הסר את הסרום על ידי הקשה על השקופית על נייר טישו נקי והוסף את הנוגדן העיקרי המדולל ב-BSA (נוגדנים ודילולים מוצגים בטבלה 1). דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. ביום השני, דגרו את הנוגדן המשני בסרום העכבר (ראה טבלה 1) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והוסיפו ל-BSA (דילול של 1:100) (למשל, 5 מ"ל BSA + 100 מיקרוליטר סרום עכבר + 50 מיקרוליטר נוגדן משני).
    8. שטפו את השקופיות פעמיים על ידי טבילתן (~3 שניות) ב-BSA ולאחר מכן פעם אחת ב-0.1 M PB. החזיקו את השקופיות בקובטות המכילות BSA, וייבשו את הגבול סביב כל קטע רקמה. יש למרוח 50 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית לכל קטע רקמה ולדגור למשך שעה אחת בתא הלחות.
    9. הכן קומפלקס ביוטין אבידין (ABC) (דילול של 0.1%) על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של A ו-10 מיקרוליטר של B ב-1 מ"ל של 0.1 M PB. טבלו (~3 שניות) את השקופיות פי 2 ב-BSA ופעם אחת ב-0.1 M PB, ולאחר מכן הניחו את השקופיות בקובטה המכילה 0.1 M PB. יש לייבש את השקופיות, למרוח 50 מיקרוליטר של תמיסת ABC לכל שקופית ולדגור למשך שעה אחת בתא הלחות.
    10. הכן תמיסת דיאמינובנזידין (DAB). שוקלים 25 מ"ג DAB לקובטה, ממיסים ב-50 מ"ל של 10 מ"מ PB ומסננים עם נייר סינון מס' 4.
      זהירות: DAB מהווה סכנה בריאותית עם מוטגניות אפשרית של תאי נבט ומסרטן. ללבוש PPE מתאים ולהשליך בבטחה.
    11. שטפו את השקופיות 3 x 3 שניות עם 10 מ"מ PB והניחו אותן בקובטות המכילות 10 מ"מ PB. הוסף מי חמצן (H2O2) לתמיסת DAB לפני ששופכים מיד את התמיסה לקובטות טריות (16.7 מיקרוליטר של H2O2 לקובטה). העבר את השקופיות לקובטות DAB והשאיר למשך ~3 דקות (מקסימום 5 דקות), תוך בדיקה מתמדת של עוצמת הצביעה מתחת למיקרוסקופ.
      אזהרה: H2O2 עלול לגרות את העיניים, העור והגרון. ללבוש PPE מתאים.
    12. שטפו את השקופיות (3 שניות) פעם אחת ב-10 מ"מ PB ו-2x ב-dH2O והניחו לשקופיות להתייבש. טבלו את המגלשות היבשות פי 3 בקסילן. מרחו טיפה של אמצעי הרכבה DPX על כיסוי והניחו מעל חלק הרקמה, היזהרו להימנע מבועות אוויר.
      אזהרה: קסילן ו-DPX דליקים ועלולים לגרום לגירוי בעיניים, בעור ובמערכת הנשימה. טפל בארון בטיחות ביולוגית ולבש תמיד כפפות בעת הטיפול.
  5. צביעת ניסל
    1. ביום הראשון, החזירו לחות ופזרו את הרקמה ב-dH2O. הכינו 4% FA על ידי הוספת 5.4 מ"ל FA ב-50 מ"ל של 0.1 M PB והשתמשו מיד. דגרו את המגלשות ב-4% FA למשך הלילה.
    2. ביום השני, העבירו את המגלשות מ-4% FA ל-70% אתנול (EtOH) ודגרו למשך הלילה.
    3. הכן כתם Nissl על ידי המסת 4 גרם של Cresyl Violet ב-40 מ"ל של 100% EtOH בצינור חרוטי סגור של 50 מ"ל. הופכים למשך 15 דקות, מוסיפים את התמיסה ל -360 מ"ל של dH2O חם, ומערבבים על צלחת ערבוב למשך 20 דקות. סנן את התמיסה לפני השימוש.
    4. ביום השלישי, בצע את הליך הצביעה המתואר בטבלה 2, וכסה את חלקי הרקמה ב-DPX.
  6. תיוג קצה קצה ניק דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז dUTP (TUNEL)
    1. יש להחזיר לחות ולפזר את הרקמה ב-dH2O, ואז לדגור את השקופיות ב-4% FA למשך 5 דקות. העבירו את השקופיות לתמיסה של H2O2 ומתנול (CH3OH) (1:10) ודגרו למשך 15 דקות. שטפו את השקופיות למשך 2 x 3 שניות ב-0.1 M PB והניחו אותן בקובטות המכילות 0.1 M PB.
    2. הכן תמיסת TUNEL על קרח לפי הוראות היצרן. הוסף את התמיסה לשקופיות (50 מיקרוליטר לכל קטע רקמה) ודגירה בתא לחות בטמפרטורה של 37 מעלותצלזיוס למשך שעתיים.
    3. לאחר דגירה של שעה, הכינו את תמיסת ה-ABC כמתואר בשלב 2.4.9 ודגרו בטמפרטורת החדר.
    4. לאחר שעתיים, העבר את השקופיות לתמיסת TUNEL STOP (300 מ"מ NaCl, 30 מ"מ נתרן ציטראט) למשך 10 דקות וטבול את השקופיות כדי לשטוף 3 x 3 שניות בתמיסת PBS של 10 מ"מ. דגרו את השקופיות בתמיסת ABC למשך שעה.
    5. הכן קובלט גופרתי (1.55 גרם CoSO4 נטול מים ב 100 מ"ל של dH2O) וניקל כלוריד הקסהידרט (2.38 גרם של NiCl2·6H2O ב 100 מ"ל של dH2O). הכן תמיסת DAB Co-Ni (10 מ"מ PB + 25 מ"ג DAB + 1 מ"ל/100 מ"ל של Co + 1 מ"ל/100 מ"ל של Ni). מסננים את התמיסה בוואקום ושומרים אותה בחושך. מיד לפני ששופכים את תמיסת ה-DAB לקובטות, הוסיפו 16.7 מיקרוליטר של H2O2 לכל קובטה של 50 מ"ל.
    6. לאחר שעה, העבירו את השקופיות לקוביות DAB ודגרו למשך ~3 דקות בטמפרטורת החדר, תוך בדיקה מתמדת של עוצמת הכתמים. עצור את התגובה על ידי הזזת השקופיות לקובטות המכילות 10 מ"מ PB. שטפו על ידי טבילה של 2 x 3 שניות ב-dH2O והניחו לחלקי הטישו להתייבש לפני שמכסים אותם ב-DPX.
  7. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
    1. החזירו לחות ופזרו את הרקמה ב-dH2O ואפשרו לחלקים להתייבש באוויר.
    2. טבלו את השקופיות בהמטוקסילין למשך 2 דקות.
      אזהרה: המטוקסילין עלול לגרום לגירוי בעיניים ובעור. ללבוש PPE מתאים.
    3. שטפו את המגלשות במי ברז זורמים למשך 5 דקות, הסירו צבע באלכוהול חומצי למשך שנייה אחת ושטפו במי ברז.
    4. כתמים נגדיים ב-0.5% אאוזין (1.5 גרם מומס ב-300 מ"ל של 95% EtOH) למשך 30 שניות.
      אזהרה: אאוזין הוא דליק ועלול לגרום לגירוי בעיניים ובעור. הכן את התמיסות בארון בטיחות ביולוגית ולבש PPE מתאים.
    5. יבש את חלקי הרקמה בשיפוע של EtOH: 50%, 70%, 95% ולבסוף 100% EtOH, כל אחד למשך 3 דקות. העבר את השקופיות לקסילן למשך 2 x 5 דקות. כיסוי עם DPX.

3. הערכות היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה לנוירופתולוגיה ופגיעות ריאות

הערה: הערכות יכולות להתבצע באזורים הבאים: קליפת המוח, קליפת המוח הפיריפורמית, הקפסולה החיצונית, הסטריאטום, ההיפוקמפוס והתלמוס (איור 2). עבור מוחות E18.5, ניתן לכלול גם את הקורפוס קלוסום מכיוון שהתמיינות התאים עדיין לא הושלמה ותאי גליה לא נדדו לכל אזורי המוח. המעריך צריך להיות עיוור לקבוצות הטיפול.

  1. מוות תאי TUNEL+
    1. באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי, ספרו את התאים החיוביים לצביעה דו-צדדית של TUNEL בהגדלה של פי 20 בכל אזורי המוח (איור 2).
    2. העריכו שלושה שדות אופטיים שנבחרו באקראי לכל אזור במוח וחשבו את מספר התאים הממוצע לכל אזור במוח.
  2. הערכת מורפולוגיה של ניסל
    1. צלם תמונות רקמה שלמה באמצעות מצלמה צבעונית בהגדלה פי 1 ושמור כקובץ TIFF או פורמט רצוי אחר. ייבא את התמונות ל-ImageJ להמשך ניתוח.
    2. תאר את אזורי המוח המעניינים (כמו למשל קליפת המוח וההיפוקמפוס) ומדוד באמצעות הכלי ביד חופשית (איור 2).
    3. כדי להשיג את מדידת הרקמות, החל את הנוסחה: (מ"מ2 × 400 מיקרומטר) = נפח × 100 (מתוקן32).
  3. אינדקס הסתעפות מיקרוגליה
    1. באמצעות מיקרוסקופ עם תכונת רשת מרובעת של 0.049 מ"מ x 0.049 מ"מ, בהגדלה של פי 40 סופרים את מספר גופי התאים IBA-1+ בתוך הרשת (C) ואת המספר הממוצע של ענפים החוצים את קווי הרשת (B). בצעו זאת בשלושה שדות שנבחרו באופן אקראי (ראו איור 3) עבור כל אזור במוח שמוצג באיור 2.
    2. השתמש בנוסחה (B2/ C) כדי לחשב את מדד ההסתעפות של המיקרוגליה.
  4. בהירות אופטית לעוצמת צביעה של GFAP
    1. באמצעות התוכנה המוזכרת (טבלת החומרים) ומצלמה צבעונית בהגדלה של פי 40, לכדו שלושה שדות שנבחרו באופן אקראי לכל אזור במוח (איור 2). הקש Ctrl+H כדי לקבל היסטוגרמה המציגה את הממוצע וסטיית התקן (SD). רשום את ערכי הממוצע וה- SD בגיליון אלקטרוני. צלם תמונת בקרה של הזכוכית שמסביב בלבד (כלומר, ללא רקמה) ורשום את ערכי הממוצע וה-SD כמו קודם
    2. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את ערכי הבהירות האופטית (OLV) בגיליון אלקטרוני:
      OLV = (ממוצע הזכוכית − סטיית התקן של הזכוכית) − (ממוצע של [ממוצע לתמונה − סטיית תקן לתמונה])
      הערה: לדוגמה:
      זכוכית מסביב
      ממוצע ± SD = 143.5 ± 8.56
      אזור במוח (למשל, קליפת המוח)
      1. 136.7 ± 10.6
      2. 140.6 ± 10.4
      3. 137.4 ± 11.3
      OLV = (143.5 - 8.56) - (ממוצע של [136.7 - 10.6], [140.6 - 10.4], [137.4 - 11.3])
      OLV = 134.94 - 127.47
      OLV = 7.47
    3. ממוצע של כל ערך לאזור, לכל בעל חיים, ולאחר מכן לכל קבוצת ניסוי.
  5. הערכות מורפולוגיה של הריאות
    1. צלם מקטעי H&E בהגדלה של פי 40 (שלושה שדות אופטיים לכל שקופית, מדוד מרחבים אוויריים לכל שדה), שמור כ-TIFF (או שווה ערך) וייבא תמונות ל-ImageJ. בחר באופן אקראי שדות המייצגים את כל מקטע הריאות.
    2. בעזרת הכלי ביד חופשית, מתאר את המרחבים האוויריים ורשום את המדידה (איור 4A). מצא את הממוצע של שלושה מרחבים אוויריים לכל שדה, לאחר מכן בין שלושת השדות לכל מקטע, ובסופו של דבר, בין שלושת המקטעים לדגימה.
  6. זרם נויטרופילים בריאות
    1. צלם תמונות לדוגמה באמצעות מצלמה צבעונית בהגדלה של פי 40, שלוש פעמים לכל מקטע רקמת ריאה, ושמור את הקובץ המקורי כקובץ TIFF או פורמט רצוי אחר. ייבא את התמונות ל-ImageJ וספור ידנית נויטרופילים בודדים בשלושה שדות של אותה ריאה. חשב את ממוצע הנויטרופילים לריאה.

תוצאות

פרוטוקול זה מציג מודל עכברי של זיהום נרתיקי עולה ומתאר שיטות להערכת נוירופתולוגיה של יילודים ותוצאות נשימתיות. ההליך לגרימת זיהום נרתיקי עולה צריך להיות מהיר (תוך 5 דקות) ועכברים צריכים להתאושש תוך מספר דקות. סכרים פיתחו תסמינים של זיהום לאחר כ-24 שעותו-25. זה כולל תנועה איטית, פילוזקציה ויציבה כפופה. זמן האספקה הממוצע המשוער בעכברים הנגועים היה 40.3 שעות לאחר מתן E. coli (קבוצת הביקורת PBS ממוצעת 52.7 שעות), התרחש ב-E18.5 בהשוואה ללידה לטווח ארוך של קבוצת הביקורת PBS ב-E19.531. אחוז הגורים שנולדו חיים לכל המלטה ירד (מ-100% ל-71.4%) עם זיהום, וכך גם ההישרדות שלהם במשך 7 ימים לאחר הלידה (איור 5)25. כאשר משתמשים בחיידקים ביולומינסנטיים, הדמיה יכולה לעקוב אחר התפשטות הזיהום בסכרים ובגורים. חיידקים נצפו ברחם, בקרומי העובר, בשליה, ובחלק מהעוברים תוך 18 שעות ממתן החיסון (איור 6), ומתווכים דלקתיים, שנמדדו על ידי qPCR ו-ELISA, היו מווסתים ברקמות אלה, כמו גם ברקמות הגורים סביב הלידה, כגון המוח, הריאות והמעיים 25,29,31.

סוללה של הערכות נוירופתולוגיה, כגון הערכת מורפולוגיה, מוות תאי, הפעלת מיקרוגליה והפעלת אסטרוציטים, בוצעה על העוברים והיילודים באמצעות היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה 25,31,33. ניתן גם להעריך רקמת ריאה (איור 4 ואיור 7). צביעה חיובית עבור TUNEL מרמזת על פירוק DNA, שלב מאוחר יותר של מוות תאים34. אנו רואים עלייה משמעותית בצביעת TUNEL בקליפת המוח, בקליפת המוח הפיריפורמית, בקפסולה החיצונית, בהיפוקמפוס ובתלמוס במוחם של גורים שנחשפו לזיהום E. coli במהלך ההריון (איור 8A,B)31. ניתן לסווג את תאי המיקרוגליה המסומנים ב-IBA-1, תאי החיסון השוכנים במוח, לפי מצבם המורפולוגי, לפיו ההסתעפות מרמזת על פנוטיפ במנוחה, בעוד שתאים פעילים ופגוציטים הופכים לאמבואידים או מעוגלים בצורתם35. לכן, במקום לכמת תאי מיקרוגליה, אנו מציגים אסטרטגיה להערכת הפנוטיפ שלהם כאינדיקציה למצבם. אנו רואים עלייה בהשלכות IBA1+ בקליפת המוח החיצונית ובסטריאטום של גורי E. coli, בהשוואה לקבוצת PBS (איור 8C,D)31. אסטרוציטים ריאקטיביים המסומנים על ידי GFAP, שיכולים להיות קשורים לדלקת ולפגיעה נוירולוגית, גדלו בקליפת המוח הפיריפורמית ובקפסולה החיצונית בגורי E. coli (איור 8E,F)31,36,37. צביעת ניסל מאפשרת להעריך שינויים מורפולוגיים גסים במבנה המוח; סגול קרזיל הוא כתם היסטולוגי סטנדרטי לנוירונים ומסמן הן גרגירי RNA גרעיניים נוספים והן גרעיני תאים. בקבוצת E. coli, אנו רואים עובי מופחת של קליפת המוח (איור 9)31. באופן דומה, H&E, אשר צובעים בהתאמה את הגרעין והציטופלזמה של התאים, מאפשר הערכה של מורפולוגיה של הריאות (איור 4)31. אנו רואים מרחב אוויר מוגבר בעכברים שנחשפו לאי קולי, כמו גם עלייה במספר הנויטרופילים Ly6G+, אינדיקציה לדלקת (איור 7)31.

עבור ניתוחי נתונים, זמן המסירה נותח על ידי מבחן t לא מזווג אם הנתונים הופצו באופן נורמלי. עבור נתוני האחוזים עבור גורים שנולדו בחיים, תחילה נדרשה טרנספורמציה של שורש ריבועי ארקסינוס כדי להפוך התפלגות פרופורציונלית (תחומה בטווח 0 עד 1) להתפלגות נורמלית, שהיא אחת הדרישות כדי להיות מסוגל לבצע מבחן t. הישרדות הגורים נותחה על ידי מבחן Log-rank (Mantel-Cox). עבור היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, נעשה שימוש במבחן Mann-Whitney U או בבדיקות t מרובות עם תיקון וולשי, בהתאם לסוג הנתונים והאם הם הופצו כרגיל. לקבלת עוצמה סטטיסטית מספקת, אנו ממליצים להשתמש במינימום של חמישה סכרים לכל קבוצת טיפול.

figure-results-1
איור 1: מתן תוך נרתיקי של Escherichia coli וציר הזמן של הטיפול לגרימת לידה מוקדמת ותחלואה בילודים בעכברים. (A) E. coli [1], ואחריו 20% ג'ל פלורוני F127 [2], מוזרק לנרתיק העכבר באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 מיקרוליטר. אבקת כינין מתווספת לאינטרויטוס [3]. (B) E. coli מועבר לנרתיק ביום העוברי 16.5. ניתן לאסוף רקמות, כגון הריאות והמוח, במהלך תקופת העובר או היילוד. קיצור: EN = יום עוברי N; PN = היום שלאחר הלידה N; PBS = מי מלח עם חוצץ פוספט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אזורים במוח שהוערכו עבור נוירופתולוגיה. דוגמה לצביעה של Nissl של מוח גור יילוד והאזורים שניתן להעריך עבור נוירופתולוגיה. ניתן להעריך את כל אזורי המוח עבור TUNEL, IBA-1 ו-GFAP. בחרנו להעריך את המורפולוגיה של קליפת המוח וההיפוקמפוס באמצעות Nissl. הגדלה: פי 1. סרגל קנה מידה = 1.5 מ"מ. קיצורים: TUNEL = טרמינל דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז dUTP תיוג קצה ניק; IBA-1 = גורם דלקתי אלוגרפט 1; GFAP = חלבון חומצי סיבי גליה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הערכת מדד צביעה והסתעפות חיובית של IBA-1. כדי לכמת את מדד ההסתעפות של תאי IBA-1+ , ספרו את מספר גופי התאים בתוך הרשת ואת מספר הענפים הממוצע החוצים את קווי הרשת האופקיים והאנכיים. קיצור: IBA-1 = גורם דלקתי אלוגרפט 1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מדידות מרחב אוויר בריאות גורים (צביעת H&E). (A) מתאר את המרחבים האוויריים ומדוד באמצעות הכלי ביד חופשית ב-ImageJ. (B) שטח המרחב האווירי הממוצע גדל בגורים שנחשפו ל-E. coli בהשוואה ל-PBS. (C) תמונות מייצגות של H&E של ריאות גורים שנחשפו ל-PBS ו-E. coli ברחם. הגדלה: פי 40. סרגל קנה מידה = 59.5 מיקרומטר. קיצורים: H = המטוקסילין; E = אאוזין. n = 2 מתוך 4 המלטה. *עמ' < 0.05. איור זה אומץ מ-Boyle et al.31. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: השפעות של E. coli תוך נרתיקי על זמן הלידה והישרדות הגורים. (A) זמן ההמלטה מצטמצם בנוכחות E. coli. (B) אחוז הגורים שנולדים בחיים פוחת באופן משמעותי, ו-(C) הישרדות הגורים פוחתת בגורים שנחשפו ל-E. coli. זמן הלידה: n = 8-10 ליטרים לקבוצה; גורים שנולדו חיים: n = 10-17 המלטות לקבוצה; הישרדות גורים: n = 10-12 המלטות לקבוצה. *עמ' < 0.05, ***עמ' < 0.001. איור זה אומץ מ-Boyle et al.31. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: הדמיית ביולומינסנציה לניטור התפשטות E. coli . (A) E. coli ביולומינסנט עולה מהנרתיק לתוך קרני הרחם תוך 48 שעות. (B) קרני רחם מנותחות מראות זיהום ב-E. coli תוך 18 שעות, (C) וכך גם השליה וקרומי העובר. איור זה אומץ מ-Suff et al.25 ו-Boyle et al.31. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: צביעת Ly6G לנויטרופילים בריאות העובר. (A) צביעה עבור Ly6G (חיובי: ראשי חץ), להערכת זרם נויטרופילים, בעוברים שנחשפו ל-PBS ו-E. coli . (B) המספר הממוצע של תאי Ly6G+ גדל באופן משמעותי בעוברי E. coli . הגדלה: פי 40. סרגל קנה מידה = 59.5 מיקרומטר. n = 10 מ-5 ליטרים לקבוצה. *עמ' < 0.05. קיצורים: Ly6G = קומפלקס אנטיגן לימפוציטים 6 לוקוס G6D. איור זה אומץ מ-Boyle et al.31. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: דוגמאות לצביעה של TUNEL, IBA1 ו-GFAP. (A) צביעת TUNEL עבור מוות תאי במוח של גור לאחר לידה שנחשף ל-PBS או E. coli. (B) המספר הממוצע של תאי TUNEL+ גדל בקליפת המוח, בקליפת המוח הפיריפורמית, בקפסולה החיצונית, בהיפוקמפוס ובתלמוס. (C) אימונוהיסטוכימיה IBA1 עבור מיקרוגליה בקבוצות PBS ו-E. coli . (D) מדד ההסתעפות, כמדד להפעלת מיקרוגליה, מוגבר בקפסולה החיצונית ובסטריאטום בגורי E. coli . (E) צביעת GFAP לאסטרוציטים, (F) אשר מוגברת בקליפת המוח הפיריפורמית ובקפסולה החיצונית בגורי E. coli . סרגל קנה מידה = 59.5 מיקרומטר. קיצורים: GFAP = חלבון חומצי סיבי גליה; TUNEL = תיוג קצה קצה של dUTP deoxynucleotidyl transferase dUTP; Pyr = קליפת המוח הפיריפורמית; EC = קפסולה חיצונית; Str = סטריאטום; ירך = היפוקמפוס; thal = תלמוס; סה"כ = כל האזורים; CA = קורנו אמוניס; OLV = ערכי בהירות אופטית. ניתוחים אימונוהיסטוכימיים: n = 5-7 מ-5 ליטרים לקבוצה. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. - לא מובהק. איור זה אומץ מ-Boyle et al.31. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: דוגמה לצביעה חיובית ושלילית של Nissl והערכות מורפולוגיה. (A) צביעת Nissl של מוח הגור לאחר הלידה כדי להעריך את מבנה הרקמה והמורפולוגיה. (B) אין השפעה על רוחב המוח, אולם (C) עובי קליפת המוח מופחת אצל גורים שנחשפים ל-E. coli. (D) אין הבדל בנפח ההיפוקמפוס. הגדלה: פי 1. סרגל קנה מידה = 1.5 מ"מ. n = 5-7 מ-5 ליטרים לקבוצה. **עמ' < 0.01. איור זה אומץ מ-Boyle et al.31. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן ראשונידילולנוגדנים/דילול משנידילול
ארנב נגד GFAP1:6000עיזים נגד ארנב1:100
ארנב נגד IBA11:1000עיזים נגד חולדות1:100
עכבר אנטי-Ly6G1:1000עיזים נגד ארנב1:100

טבלה 1: נוגדנים לאימונוהיסטוכימיה.

צעדמגיבזמן (דקות)
1כתם NISSL10
2מים מזוקקים טריים2
3מים מזוקקים טריים2
470% EtOH2
590% EtOH2
696% EtOH2
796% EtOH עם 3-5 טיפות חומצה אצטית קרחונית2-5 (בדוק כל הזמן)
8100% EtOH2
9איזופרופנול2
10קסילן2
11קסילן2
12קסילן2

טבלה 2: נוהל ניסל.

דיון

כאן, אנו מתארים אינדוקציה של מודל עכבר חדש של לידה מוקדמת ותחלואה בילודים באמצעות עלייה נרתיקית חיידקית. בחרנו ב- E. coli K1 מכיוון שהוא גורם שכיח לאלח דם בילודים ודלקת קרום המוח ומועבר אנכית מהאם לעובר 38,39,40. המפתח להצלחת מודל זה הוא השימוש בג'ל פלורוני רגיש לחום, המונע דליפה של תרחיף החיידקים מהנרתיק, ומאפשר לזיהום להתבסס ולעלות לרחם. מכיוון שמודל זה משתמש בחיידקים חיים שמקורם באלח דם מבודד, חיוני לעקוב מקרוב אחר הסכרים27. אם בעלי החיים מסרבים לזוז או לאכול או אינם מטפלים בגורים שלהם (למשל, מזניחים קינון והאכלה), יש להקריב אותם באופן אנושי באופן מיידי.

לרוב, תסמינים הקשורים לזיהום מתפוגגים תוך 24 שעות מהלידה. כמו כן, חיוני להיות מודע לכך שלסרוטיפים שונים של E. coli וזנים אחרים של חיידקים יהיו השפעות שונות על אורך ההריון, היקף הזיהום/דלקת ותוצאות היילוד. אנו מציעים לבצע ניסויי מינון ראשוניים עם CFUs שונים בעת שימוש בסרוטיפים/זנים חדשים של חיידקים כדי לקבוע את הריכוז המינימלי הדרוש לפנוטיפ הרצוי וקביעת נקודות קצה אנושיות קפדניות למניעת סבל. יש לנקוט משנה זהירות בעת העברת פתוגן חי; לאפשר לספרות להנחות את השימוש הנכון באורגניזמים אלה בעת מידול זיהום עולה.

זן העכברים חשוב גם הוא, מכיוון שמערכת החיסון שלהם שונה. לדוגמה, לתזמון ול-CFUs המשמשים במודל זה אין את אותן תוצאות כאשר הם מבוצעים בעכברי C57BL/6. בחרנו להשתמש בעכברי C57BL/6 Tyrc-2J מכיוון שניסויי מהלך הזמן הראו יותר זיהום משמעותי בזן זה בהשוואה ל-CD-1, BALB/c ו-C57BL/6. בנוסף, ישנן עדויות לכך שפרווה שחורה מרווה אותות ביולוגיים, שהיא תוצאה שימושית הניתנת למדידה במודל זה29. יום ההריון האופטימלי למתן חיידקים עשוי להיות שונה גם עם פתוגן וזן עכברים. יש הטרוגניות עצומה במודלים פרה-קליניים של PTB; לכן, חשוב לקחת בחשבון משתנים אלה על מנת לפתח תוצאות הניתנות לשחזור17.

שיקול נוסף הוא משך הזמן שבו בעלי החיים נחשפים להרדמה. מכיוון שחשיפה מוגזמת במהלך ההריון קשורה לרעילות עצבית אצל גורים, חיוני לשמור על זמן ההרדמה למינימום (למשל, מקסימום 5 דקות) ולכלול תמיד בקרות שנחשפו לאותה סביבה וטופלו בחומר רכב 41,42,43. קבוצות ביקורת נוספות השימושיות למודל זה כוללות אספקה תוך נרתיקית לא מטופלת של ג'ל פלורוני בלבד, והרדמה בלבד.

אימונוהיסטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב ככלי ניסיוני לזיהוי חלבונים ותאים שונים, וניתן להשתמש בה כדי לאפיין מבנה וקישוריות במוח. כאן, אנו מתארים כיצד לנתח תאי מפתח של מערכת העצבים המרכזית שקשורים לדלקת עצבית ולפגיעה נוירולוגית. אנו מציגים גם שיטות להערכת אפופטוזיס תאים וכתמים היסטולוגיים שימושיים למדידת מורפולוגיה של המוח והריאות. שיקולים חשובים להבטחת הצלחת הפרוטוקולים הללו מתחילים בשימוש זהיר בעט PAP; אם עט ה-PAP נוגע ברקמה, הצביעה תיכשל, אך אם הפרמטר רחב מדי, החלקים עלולים להתייבש בן לילה. באופן דומה, יש לשמור על תא הלחות דamp כדי למנוע ייבוש החלקים.

בעת ביצוע צביעת ניסל, שלב החומצה האצטית הקרחונית הוא הקריטי ביותר; יש לבדוק את החלקים כל הזמן. כאשר המבנים העיקריים של המוח נראים לעין, צריך להעביר את החלקים מיד לתוך EtOH כדי לעצור את התגובה. בחרנו להעריך את קליפת המוח וההיפוקמפוס, שכן עובי קליפת המוח מופחת ונפח היפוקמפוס מופחת דווחו ביילודים פגים אנושיים ובמודלים אחרים של בעלי חיים, אך ניתן להעריך אזורים אחרים לשינויים מורפולוגיים 44,45,46,47. יש להקדיש תשומת לב רבה גם להתפתחות צביעת DAB. זה צריך להיות מתוזמן ולשמור על עקביות בין הניסויים.

ניתוח נתונים הוא המגבלה הנפוצה ביותר של אימונוהיסטוכימיה בשל הקושי לכמת את התוצאות, שלעתים קרובות נחשבות סובייקטיביות. בעוד שניתוח GFAP מבוצע באמצעות מדידות בהירות אופטיות בעזרת מחשב, צביעה לא עקבית יכולה להשפיע על מדידות אלו. בנוסף, הערכות המורפולוגיה של המוח והריאות כוללות מדידות ידניות ביד חופשית המסתמכות על שיקול דעתו של הצופה. כדי למנוע חוסר עקביות, אנו חוזרים על הערכות אלה פעמיים ובפרק זמן קצר. כדי להפחית עוד יותר כל הטיה, חשוב שהמעריך יהיה עיוור לקבוצות הטיפול. תגובתיות חיסונית נמוכה יכולה גם להיות גורם מגביל. חוסר אות יכול להצביע על כך שהאנטיגן המעניין נעדר או שזה יכול להיות בגלל כשל בפרוטוקול. כדי לטפל בכך, אנו כוללים דגימת רקמה שיכולה לשמש כבקרה חיובית במידת האפשר וחוזרים על הליך הצביעה כאשר אנו צופים באות נמוך או נעדר כדי להבטיח שזו לא הייתה תוצאה של שגיאת ניסוי.

בנוסף לפרוטוקולים המתוארים, ניתוחים אימונולוגיים של רקמות האם, העובר והיילוד יכולים להתבצע על ידי qPCR ו-ELISA. ראינו עלייה ברמות mRNA וחלבון דלקתיות בבעלי חיים שנחשפו לזיהום 25,31,48. אנו משערים כי הנוירופתולוגיה של היילודים שאנו מדגימים מבחינה היסטולוגית יכולה להיות תוצאה של דלקת במוח, בריאות ובמעיים של העובר25,31. הערכות נוירופתולוגיה אחרות שביצענו כוללות חלבון בסיסי של מיאלין (MBP) לחקירת מיאלינציה ו-NeuN לצביעה של גרעיני עצב25,31. בנוסף לכך, ניתן להעריך סמנים אחרים עבור נויטרופילים ומיקרוגליה כדי להבין טוב יותר את הפנוטיפ וההתנהגות של תאים אלה לאחר חשיפה לזיהום ברחם49,50. בנוסף, ניתן לבצע בדיקות התנהגותיות כדי לקבוע את ההשפעה ארוכת הטווח על הצאצאים.

מודל זה אינו חף ממגבלות. לדוגמה, אנו רואים שונות בפתולוגיה הן בין המלטות והן בתוכן. זו יכולה להיות תוצאה של שימוש בחיידק חי, שבו לא ניתן לשלוט בהתפשטות הזיהום. כתוצאה מכך, הדפוס והטווח של זיהום עולה לקרני הרחם משתנים ולעתים קרובות הם אסימטריים. מגבלה נוספת היא הפתוגניות של E. coli, שיכולה לפעמים לגרום לסכרים להיות חולים מכדי לטפל בגורים שלהם. עכברים הם גם לא המודל הטוב ביותר לפגיעה בריאות, בגלל המכתשית המתרחשת לאחר הלידה, ולא לפני הלידה, כמו בבני אדם51. לא הצלחנו לנפח את רקמות הריאות שלנו כאשר הדגימות נאספו, מה שיכול היה להשפיע על התוצאות שלנו. עם זאת, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם השינויים שנצפו במודלים של בעלי חיים עם הפרעת אישיות גבולית בילודים52,53.

מודל זה מסכם את המצב האנושי המשוער לפיו זיהום חיידקי עולה מהנרתיק לתוך הרחם, וממריץ לידה מוקדמת. בעקבות הפרסום הראשוני של מודל זה, אחרים שכפלו או ייצרו מודלים דומים, והדגישו עוד יותר את יכולת השחזור והרלוונטיות של מתודולוגיה זו19,54. באופן מכריע, מודל זה מציג את התחלואה השכיחה שחווים פגים, בעוד שמודלים אחרים נכשלו. זה יכול להיות בגלל השימוש בזן חיידקי הקשור ספציפית לאלח דם בילודים. LPS, המשמש לרוב לגרימת לידה מוקדמת במודלים של בעלי חיים, הוא קטלני לגורים, ולכן לא ניתן למדוד את תוצאות היילודים18. מודלים אחרים של זיהום עולה התקשו גם הם ביצירת גורים ששרדו או בהדגמת תחלואה בילודים 19,20,21,22,23,24,55,56. מודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים, כמו זה שאנו מתארים, הם בסיסיים להבנת הפתופיזיולוגיה של לידה מוקדמת ולפיתוח התערבויות חדשניות שישפרו את תוצאות היילודים.

גילויים

למחברים אין גילויים רלוונטיים.

תודות

Escherichia coli K1 A192PP-luxABCDE הוענק במתנה על ידי פרופסור פיטר טיילור, יוניברסיטי קולג' לונדון. איור 1 ואיור 3 נוצרו בשנת BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי מלגת פיתוח קריירה למחקר קליני של וולקאם 222970/Z/21/Z (N.S.), מענק מחקר רפואי ו-Borne GN2647 (N.S., S.N.W., ו-D.P.); ומענק רווחת נשים RG2365 (A.K.B., N.S., M.H., S.N.W. ו-D.P.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי-GFAP, ארנבאג'ילנט טכנולוגיותZ033429-2
אנטי-IBA1, rabbit וואקו019-19741
אנטי-Ly6G, עכברביולג'נד127601
מצלמת AVT-Horn 184 3CCDסוני
ביוטין-16-DUTPמרק11093070910
כיסויי זכוכית בורוסיליקטית מלבנייםפישר-סיינטיפיק12363128
אצטט קרסיל ויולטתרמופישר סיינטיפיק405760100
קריוסטאט CM1900לייקה
קובטה מזכוכית  מרקBR472700
דיאמינובנזידין (DAB)ג'נרון40480004-3
מלקחיים לניתוח, נירוסטה, 10 ס"מ, משונן, מעוקלוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטס בע"מ15915
מלקחיים לניתוח, נירוסטה, 10 ס"מ, משוננים, ישריםוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטס בע"מ15914
מספריים לניתוח, באורך 10 ס"מ, ישרוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטס בע"מ14393
DPX מרק100579
אאוסיןסיגמא-אלדריץ'HT110116
תמיסת פורמלדהיד 4% ממוגנתמרק100496
נוגדן IgG אנטי-ארנבי עז (H+L), ביוטינילטמעבדות וקטורBP-9100-50
נוגדן IgG אנטי-עכברוש של עזים (H+L), ביוטינילטמעבדות וקטורBA-9400-1.5
GraphPad Prism v.8 תוכנת GraphPad
H2O2סיגמא-אלדריץ'7722-84-1
המטוקסיליןסיגמא-אלדריץ'MHS16
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות
איזופלורן (איזופלו)זואטיס50019100
IVIS Lumina II מערכת הדמיה ב-Vivo/תוכנת תמונות חיותפרקין אלמר/רבוויטי
מיקרוסליידסVWRISO8037/I
אופטימאס 6.51 Media Cybernetics Inc.
פאראפורמלדהידסיגמא-אלדריץ'158127
סליין ממוגן בפוספט (PBS) תרמו פישר סיינטיפיק (Life Technologies)14190094
Pluronic F-127 סיגמא-אלדריץ'P2443
כיניןציוד מעבדה מדעיתQ0132
עט פאפ מחסום הידרופובי ReadyProbesתרמו פישר סיינטיפיק R3777
נתרן הידרוקסידהוניוולS8045
נתרן פוספט מונו-בסיסי אנהידרוספישר-סיינטיפיקBP329-1
סוקרוזהמרקS9378
טרמינל טרנספראז';מרק3333574001
ערכת VECTASTAIN ABC-HRP, פרוקסידאזמעבדות וקטורPK-4000
קסילנים (דרגה היסטולוגית) סיגמא-אלדריץ'534056

מקורות

  1. WHO. WHO: recommended definitions, terminology and format for statistical tables related to the perinatal period and use of a new certificate for cause of perinatal deaths. Modifications recommended by FIGO as amended October 14, 1976. Acta Obstet Gynecol Scand. 56 (3), 247-253 (1977).
  2. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: an updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388 (10063), 3027-3035 (2016).
  3. Chawanpaiboon, S., et al. regional, and national estimates of levels of preterm birth in 2014: a systematic review and modelling analysis. Lancet Glob Health. 7 (1), e37-e46 (2019).
  4. Unicef. Levels and trends in child mortality report 2017. , Unicef. (2017).
  5. Blencowe, H., et al. National, regional, and worldwide estimates of preterm birth rates in the year 2010 with time trends since 1990 for selected countries: a systematic analysis and implications. Lancet. 379 (9832), 2162-2172 (2012).
  6. Jung, E., et al. The fetal inflammatory response syndrome: the origins of a concept, pathophysiology, diagnosis, and obstetrical implications. Semin Fetal Neonatal Med. 25 (4), 101146(2020).
  7. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: consequences for the neonate. Semin Immunopathol. 42 (4), 451-468 (2020).
  8. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Norman, J. E., Stock, S. J. Preterm birth: inflammation, fetal injury and treatment strategies. J Reprod Immunol. 119, 62-66 (2017).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  11. Jones, H. E., et al. Differing prevalence and diversity of bacterial species in fetal membranes from very preterm and term labor. PLoS One. 4 (12), e8205(2009).
  12. Cobo, T., et al. Characterization of vaginal microbiota in women with preterm labor with intra-amniotic inflammation. Sci Rep. 9 (1), 18963(2019).
  13. Romero, R., et al. Microbial invasion of the amniotic cavity in patients with suspected cervical incompetence: prevalence and clinical significance. Am J Obstet Gynecol. 167 (4 Pt 1), 1086-1091 (1992).
  14. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58(2013).
  15. DiGiulio, D. B., et al. Prevalence and diversity of microbes in the amniotic fluid, the fetal inflammatory response, and pregnancy outcome in women with preterm pre-labor rupture of membranes. Am J Reprod Immunol. 64 (1), 38-57 (2010).
  16. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Semin Fetal Neonatal Med. 17 (1), 2-11 (2012).
  17. Miller, F. A., Sacco, A., David, A. L., Boyle, A. K. Interventions for infection and inflammation-induced preterm birth: a preclinical systematic review. Reprod Sci. , (2022).
  18. Migale, R., et al. Specific lipopolysaccharide serotypes induce differential maternal and neonatal inflammatory responses in a murine model of preterm labor. Am J Pathol. 185 (9), 2390-2401 (2015).
  19. Spencer, N. R., et al. Development of a mouse model of ascending infection and preterm birth. PLoS One. 16 (12), e0260370(2021).
  20. Pavlidis, I., et al. Cervical epithelial damage promotes Ureaplasma parvum ascending infection, intrauterine inflammation and preterm birth induction in mice. Nat Commun. 11 (1), 199(2020).
  21. Vornhagen, J., et al. Group B streptococcus exploits vaginal epithelial exfoliation for ascending infection. J Clin Invest. 128 (5), 1985-1999 (2018).
  22. Bernardini, R., et al. Neonatal protection and preterm birth reduction following maternal group B streptococcus vaccination in a mouse model. J Matern Fetal Neonatal Med. 30 (23), 2844-2850 (2017).
  23. Tantengco, O. A. G., et al. Modeling ascending Ureaplasma parvum infection through the female reproductive tract using vagina-cervix-decidua-organ-on-a-chip and feto-maternal interface-organ-on-a-chip. Faseb J. 36 (10), e22551(2022).
  24. Randis, T. M., et al. Group B streptococcus β-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J Infect Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  25. Suff, N., et al. Ascending vaginal infection using bioluminescent bacteria evokes intrauterine inflammation, preterm birth, and neonatal brain injury in pregnant mice. Am J Pathol. 188 (10), 2164-2176 (2018).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J Antimicrob Chemother. 56 (1), 160-165 (2005).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Winson, M. K., et al. Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs. FEMS Microbiol Lett. 163 (2), 193-202 (1998).
  29. Suff, N. The use of cervical gene therapy for the prevention of infection-related preterm birth [Ph. D. Thesis]. , University College London. (2017).
  30. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Rossi, A. G., Saunders, P. T. K., Norman, J. E. Repurposing simvastatin as a therapy for preterm labor: evidence from preclinical models. Faseb J. 33 (2), 2743-2758 (2019).
  31. Boyle, A. K., et al. Ascending vaginal infection in mice induces preterm birth and neonatal morbidity. Am J Pathol. 195 (5), 891-906 (2025).
  32. Kendall, G. S., Robertson, N. J., Iwata, O., Peebles, D., Raivich, G. N-methyl-isobutyl-amiloride ameliorates brain injury when commenced before hypoxia ischemia in neonatal mice. Pediatr Res. 59 (2), 227-231 (2006).
  33. Rocha-Ferreira, E., et al. Curcumin: novel treatment in neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Front Physiol. 10, 1351(2019).
  34. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods Mol Biol. 887, 41-47 (2012).
  35. Lier, J., Streit, W. J., Bechmann, I. Beyond activation: characterizing microglial functional phenotypes. Cells. 10 (9), (2021).
  36. Schmidt-Kastner, R., Wietasch, K., Weigel, H., Eysel, U. T. Immunohistochemical staining for glial fibrillary acidic protein (GFAP) after deafferentation or ischemic infarction in rat visual system: features of reactive and damaged astrocytes. Int J Dev Neurosci. 11 (2), 157-174 (1993).
  37. Pekny, M., Pekna, M. Astrocyte reactivity and reactive astrogliosis: costs and benefits. Physiol Rev. 94 (4), 1077-1098 (2014).
  38. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent imaging reveals novel patterns of colonization and invasion in systemic Escherichia coli K1 experimental infection in the neonatal rat. Infect Immun. 83 (12), 4528-4540 (2015).
  39. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology (Reading). 148 (Pt 9), 2745-2752 (2002).
  40. Bonacorsi, S., Bingen, E. Molecular epidemiology of Escherichia coli causing neonatal meningitis. Int J Med Microbiol. 295 (6-7), 373-381 (2005).
  41. Hartling, L., Liang, Y., Lacaze-Masmonteil, T. Chorioamnionitis as a risk factor for bronchopulmonary dysplasia: a systematic review and meta-analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (1), F8-F17 (2012).
  42. Liang, G., et al. Isoflurane causes greater neurodegeneration than an equivalent exposure of sevoflurane in the developing brain of neonatal mice. Anesthesiology. 112 (6), 1325-1334 (2010).
  43. Yang, B., et al. Comparison of neurodegeneration and cognitive impairment in neonatal mice exposed to propofol or isoflurane. PLoS One. 9 (6), e99171(2014).
  44. Schmitz-Koep, B., et al. Decreased cortical thickness mediates the relationship between premature birth and cognitive performance in adulthood. Hum Brain Mapp. 41 (17), 4952-4963 (2020).
  45. Nagy, Z., Lagercrantz, H., Hutton, C. Effects of preterm birth on cortical thickness measured in adolescence. Cereb Cortex. 21 (2), 300-306 (2011).
  46. Dimitrova, R., et al. Preterm birth alters the development of cortical microstructure and morphology at term-equivalent age. Neuroimage. 243, 118488(2021).
  47. Dada, T., et al. Mouse model of intrauterine inflammation: sex-specific differences in long-term neurologic and immune sequelae. Brain Behav Immun. 38, 142-150 (2014).
  48. Suff, N., et al. Cervical gene delivery of the antimicrobial peptide, human beta-defensin (HBD)-3, in a mouse model of ascending infection-related preterm birth. Front Immunol. 11, 106(2020).
  49. McKenna, E., et al. Neutrophils: need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  50. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  51. Jackson, C. M., et al. Pulmonary consequences of prenatal inflammatory exposures: clinical perspective and review of basic immunological mechanisms. Front Immunol. 11, 1285(2020).
  52. Durrani-Kolarik, S., et al. miR-29b supplementation decreases expression of matrix proteins and improves alveolarization in mice exposed to maternal inflammation and neonatal hyperoxia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (2), L339-L349 (2017).
  53. Nguyen, L., et al. Sex-differences in LPS-induced neonatal lung injury. Sci Rep. 9 (1), 8514(2019).
  54. Zhang, Y., Edwards, S. A., House, M. Cerclage prevents ascending intrauterine infection in pregnant mice. Am J Obstet Gynecol. , (2023).
  55. Kammala, A. K., et al. Extracellular vesicles-mediated recombinant IL-10 protects against ascending infection-associated preterm birth by reducing fetal inflammatory response. Front Immunol. 14, 1196453(2023).
  56. Tantengco, O. A. G., et al. Inflammatory response elicited by Ureaplasma parvum colonization in human cervical epithelial, stromal, and immune cells. Reproduction. 163 (1), 1-10 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Escherichia Coli
מידול זיהום נרתיקי עולה, לידה מוקדמת ותחלואה בילודים בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.