הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66726

⸱

21 ביוני 2024

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 3Department of Biology, Washburn University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להעברת טרופוזואיטים Naegleria gruberi עם מבנה הנשמר לאורך טרופוזואיטים חולפים במבחנה, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות.

תקציר

כל הגנים הריבוזומליים של Naegleria trophozoites נשמרים ב-DNA ריבוזומלי חוץ-כרומוזומלי סגור (rDNA) המכיל יסוד (CERE). בעוד שמעט ידוע על CERE, ניתוח רצף גנום מלא של שלושה מיני Naegleria מראה בבירור כי אין rDNA cistrons בגנום הגרעיני. יתר על כן, מקור DNA יחיד של שכפול מופה ב- N. gruberi CERE, מה שתומך בהשערה כי CERE משתכפל ללא תלות בגנום הגרעיני. מאפיין CERE זה מצביע על כך שייתכן שניתן יהיה להשתמש ב- CERE מהונדס כדי להחדיר חלבונים זרים לטרופוזואיטים Naegleria . כצעד הראשון בחקר השימוש ב-CERE כווקטור בנגלריה, פיתחנו פרוטוקול להעתקת N. gruberi עם שיבוט מולקולרי של N. gruberi CERE המשובט לתוך pGEM7zf+ (pGRUB). לאחר הטרנספקציה, pGRUB זוהה בקלות ב- N. gruberi trophozoites במשך שבעה קטעים לפחות, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות. כביקורת, טרופוזואיטים הודבקו בווקטור עמוד השדרה, pGEM7zf+, ללא רצפי N. gruberi (pGEM). pGEM לא זוהה לאחר המעבר הראשון לאחר טרנספקציה לתוך N. gruberi, מה שמצביע על חוסר יכולתו להשתכפל באורגניזם אאוקריוטי. מחקרים אלה מתארים פרוטוקול טרנספקציה עבור Naegleria trophozoites ומראים כי רצף פלסמיד חיידקי ב- pGRUB אינו מעכב העברה ושכפול מוצלחים של שיבוט CERE הנגוע. יתר על כן, פרוטוקול טרנספקציה זה יהיה קריטי להבנת הרצף המינימלי של CERE המניע את השכפול שלו בטרופוזואיטים, כמו גם בזיהוי אזורים רגולטוריים ברצף הלא ריבוזומלי (NRS).

מבוא

הסוג Naegleria מכיל מעל 45 מינים, אם כי לא סביר שכל בני המין זוהו1. Naegleria יכול להתקיים בצורות שונות: כמו trophozoites (אמבות), כמו flagellates, או, כאשר המשאבים מוגבלים מאוד, כמו ציסטות 1,2,3,4. הסוג Naegleria מוכר בזכות מין אחד מסוכן במיוחד, Naegleria fowleri, המכונה "אמבה אוכלת מוח" (נסקר ב-1,2,3,4,5,6,7), שהיא הגורם לדלקת קרום המוח האמבית הראשונית הקטלנית כמעט באופן אוניברסלי.

Naegleria מקודדים את rDNA שלהם על CERE הממוקם בגרעין. ריצוף מלא של הגנום של שלושה מיני Naegleria מאשר את היעדר rDNA בגנום הגרעיני 8,9,10,11. בהתבסס על רצפי CERE מוגבלים באורך מלא, אורך CERE נע בין 10 kbp ל- 18 kbp בקירוב. CERE מכל מין של Naegleria נושא rDNA cistron יחיד (המכיל את ה- DNA הריבוזומלי 5.8, 18 ו- 28S) על כל אחד מכ- 4,000 CERE לכל תא 12,13,14. מלבד rDNA, לכל CERE יש רצף גדול שאינו rDNA (NRS). גדלי CERE משתנים בין מינים; ההבדלים נובעים בעיקר מהאורך המשתנה של ה-NRS, שכן רצפי ה-rDNA שמורים מאוד בסוג 1,15,16,17,18,19,20. המיפוי של מקור יחיד של שכפול DNA בתוך N. gruberi CERE NRS21 מספק תמיכה חזקה להשערה כי Naegleria CERE משכפל ללא תלות בגנום הגרעיני.

N. gruberi היא אמבה לא פתוגנית המשמשת לעתים קרובות לחקר ביולוגיה Naegleria . פיתחנו מתודולוגיה לשינוי N . gruberi trophozoites עם שיבוט CERE מאותו מין כדי לבחון את ההשערה כי Naegleria amoebae לסבול ולשכפל באופן עצמאי CERE בתוך trophozoites. זה הושג על ידי הפיכת N. gruberi עם שיבוט באורך מלא של N. gruberi CERE לטרופוזואיטים ובעקבות גורלו של שיבוט CERE התורם על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). סקירה כללית של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. הנתונים המוצגים כאן מראים כי ניתן לאתר את השיבוט התורם באמצעות לפחות שבעה מעברים בתרבית רקמה, כמו גם להישמר באמצעות אנציסטמנט וריגוש. מחקרים אלה מהווים את הבסיס לאמצעי לנתח כיצד CERE משתכפל, כמו גם לחקור את השימוש בו כווקטור כדי להדביק Naegleria.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרטי המינים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. הרצף של מבנה pGRUB של 17,004 זוגות בסיסים מסופק בקובץ משלים 1.

1. טיפוח trophozoites

  1. הפשירו טרופוזואיטים קפואים של N. gruberi בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.
  2. יש לחסן את הטרופוזואיטים בצלוחיות T25 בתמצית פפטון/שמרים מעובדת/חומצת גרעין/חומצה פולית/האמין עם מדיה של 10% סרום עגל עוברי (PYNFH) בתוספת חיץ של 2% (דיסודיום פוספט, אשלגן דימימן פוספט).
  3. תרבית את הטרופוזואיטים בטמפרטורה של 25°C עד ~80% במפגש, שם הם מציגים מורפולוגיה של אמבואידים (איור 2A).
    הערה: כאשר מחיים בתחילה תרבות של trophozoites ממצבם הקפוא, זה יכול לקחת עד 5-7 ימים עבור T25 להיות confluent. דקנט מדיה כל 3-4 ימים ולהחליף במדיה טרייה.
  4. הניחו את הצלוחיות על קרח למשך 5-10 דקות כדי לשחרר את הטרופוזואיטים המודבקים מהפלסטיק. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי לעקור את התאים הדבקים שנותרו. לטרופוזואיטים יש כעת מורפולוגיה "מעוגלת" (איור 2B).
  5. חלקו את התרביות 1:2 עד 1:4 לצלוחיות תרבית רקמה חדשות.
  6. הסר את PYNFH והחלף אותו במדיה אנציסטמנטית סטרילית (120 mM נתרן כלורי, 0.03 mM מגנזיום כלורי, 1 mM דיסודיום פוספט, 1 mM אשלגן דימימן פוספט, 0.03 mM סידן כלורי, 0.02 mM ברזל כלורי, pH 6.8)22 כדי encyst N . gruberi.
    הערה: רוב הטרופוזואיטים מתכווצים עד 72 שעות (איור 2C). יש להשלים את ההתרגשות תוך 72 שעות.
  7. הסר ציסטות מצלוחיות, צנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 10 דקות ב 20 ° C, והשהה מחדש ציסטות במדיה PYNFH עם 10% סרום עגל עובר כדי להוציא את התאים. לדגור ב 25 ° C במשך 24 שעות עד trophozoites מתחילים להופיע.

2. הדבקת trophozoites

  1. צלחת trophozoites לתוך צלחת 6 היטב תחתית שטוחה רקמה צלחת (1 מ"ל של 1 x 106 trophozoites / מ"ל) ותרבית ב 25 ° C.
  2. להדביק את התאים כאשר הם מגיעים 70%-80% confluent (~ 10.4 x 104 תאים / ס"מ2 באשכולות 6 בארות). חממו את מגיב הטרנספקציה לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. הכן את תערובת מגיב פלסמיד transfection כדלקמן: 75 ng של DNA פלסמיד ו 0.225 μL של מגיב transfection ב 200 μL של מדיה PYNFH ללא FBS. הכינו תערובת מגיב פלסמיד מספקת לביצוע טרנספקציה כפולה.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בפלסמיד חיידקי המכיל שיבוט באורך מלא של N. gruberi CERE (pGRUB). פלסמיד ריק (pGEM) שימש כבקרה שלילית (איור 3).
  4. לדגור על תערובת מגיב פלסמיד transfection בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  5. הסר ~ 800 μL של מדיום מן monolayers trophozoite ממש לפני transfection.
  6. שים את תערובת מגיב transfection פלסמיד על trophozoites.
  7. מערבלים בעדינות את הצלחת כל 15 דקות כדי למנוע הצטברות המדיה בשולי הצלחת.
  8. לשטוף את monolayers פעם אחת עם 2 מ"ל של מדיום הצמיחה לאחר 1 שעה דגירה ב 25 °C (75 °F).
  9. יש לטפל בחד-שכבות עם 10 U DNase ב-1 מ"ל של חיץ DNase 10x למשך 15 דקות ב-37°C כדי להסיר שאריות DNA פלסמיד, לשטוף פעם אחת עם מצע צמיחה, להוסיף 2 מ"ל של מדיה טרייה ולהניח בטמפרטורה של 25°C. דוגרים על הצלחת במשך 24-36 שעות.
  10. מניחים את הצלחת על קרח למשך 10 דקות כדי לשחרר תאים.
  11. פיצול באר אחת (1:2) לשתי בארות חדשות.
  12. לאסוף trophozoites מן הבארות הנותרות למטרות ניסיוניות.
    הערה: כל התרבויות מבוצעות בכפילות. עבור כל מצב, באר אחת משמשת למעבר, ו -1 משמשת לבידוד CERE.

3. בידוד CERE מ Naegleria

  1. חשב את מספר trophozoites בכל באר המשמש לבידוד CERE על ידי טריפאן כחול הרחקה צביעה hemocytometer23.
  2. מניחים את trophozoites בצינור 2.0 מ"ל.
  3. לשטוף trophozoites פעם ב 100 mM נתרן כלורי (pH 7.5) באמצעות צנטריפוגה (600 x גרם, 10 דקות, 4 ° C).
    הערה: נתרן כלורי מונע מהטרופוזואיטים להיצמד לדפנות הצינור.
  4. הסר את supernatant ו resuspend cell pellets ב 100 μL של 100 mM EDTA (pH 7.5).
  5. הניחו את הצינור בבלוק חום למשך 15 דקות בטמפרטורה של 98°C כדי לשקוע בתאים ולהשבית את האנזימים בטרופוזואיטים.
    הערה: שלב זה משבית DNases, אשר נמצאים בשפע ב Naegleria trophozoites. DNases עלול להפריע ליכולת לזהות CERE מקורי ואת השיבוט המולקולרי בשלב 4. תפוקת הדנ"א יורדת כאשר בשלב 3.4 משתמשים ביותר מ~3 x 106 תאים .
  6. צנטריפוגה את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (16,000 x גרם) ב 4 ° C במשך 10 דקות כדי להשליך את הפסולת.
  7. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינור חדש.
  8. אתנול מזרז את supernatants עם 0.5 נפחים של 7.5 M אמוניום אצטט (pH 7.5), 3 נפחים של אתנול מוחלט, ו 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל גליקוגן כנשא.
  9. הפוך את הצינור מספר פעמים ומקם את הצינור ב -80 ° C לפחות 1 שעה או לילה.
  10. מחממים את הדגימות לטמפרטורת החדר.
  11. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 16,000 x גרם.
  12. מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים את הגלולה עם 70% אתנול בצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 16,000 x גרם (בטמפרטורת החדר).
  13. מוציאים אתנול ומייבשים את הגלולה באוויר למשך 5 דקות.
  14. יש להשהות מחדש את הגלולה המיובשת במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (DI). נרמול נפח ל 10,000 trophozoites לכל μL.
  15. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש ב-PCR.

4. זיהוי PCR של trophozoites שעבר טרנספורמציה

  1. השתמש ב-20,000 תאים מקבילים לדנ"א, פריימרים של 600 ננומטר (טבלה 1) ו-Taq פולימראז ובצע את ה-PCR24.
    הערה: פריימרים המבחינים בין CERE מקורי לבין CERE משוכפל מפורטים בטבלה 1, וכך גם תנאי ה-PCR. איור 3 מראה את מיקום הפריימרים על המבנים. PCR ידרוש אופטימיזציה בהתאם לפריימרים המשמשים, כמו גם לתמהיל ה- PCR הספציפי בו נעשה שימוש.
  2. יש לחמם במיקרוגל 0.8% אגרוז בבסיס טריס אחד, חומצה אצטית וחיץ EDTA (TAE) עד להמסת האגרוז.
  3. מצננים את האגרוז ל~50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר.
  4. יוצקים את התמיסה לתוך מגש יציקת ג'ל המכיל מסרק כדי ליצור בארות.
  5. הניחו לג'ל לשבת בטמפרטורת החדר עד להתייצבות.
  6. מניחים את הג'ל במנגנון האלקטרופורזה.
  7. יש להכניס 1x TAE לתא האלקטרופורזה עד לכיסוי הג'ל.
  8. הסירו את המסרק.
  9. הוסיפו 6x צבע (0.25% ברומפנול כחול, 0.25% קסילן ציאנול, 30% גליצרול) לדגימות והעמיסו את הג'ל. השתמש בסולם DNA כדי לקבוע את גודל מוצר ה- PCR.
  10. חבר את האלקטרודה, הפעל את ספק הכוח והפעל את הג'ל ב 80 V למשך ~ 1.5-2 שעות.
  11. כבה את החשמל והסר את הג'ל.
  12. הכתימו את הג'ל בצבע DNA (למשל, 10 μL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד) ב-100 מ"ל של מי DI למשך 10 דקות.
  13. יש להכתים את הג'ל למשך 20 דקות במי DI.
  14. דמיינו ג'ל על מערכת אור אולטרה סגול (UV) ותיעדו את התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

PCR של טרופוזואיטים שעברו טרנספורמציה עם pGRUB מדגים שה-CERE הנגוע מזוהה דרך לפחות שבעה מעברים של הטרופוזואיטים, כמו גם אנציסטמנט והתרגשות (איור 4). הפריימרים המשמשים ב-PCR מתאימים הן לווקטור pGEM והן לרצף CERE, ובכך מבטיחים שה-PCR לא יזהה CERE מקורי. PCR בעקבות טרנספקציה של pGEM לטרופוזואיטים הצביע על כך ש-pGEM היה שלילי (איור 4), מה שמצביע על כך שהפלסמיד הריק לא נשמר על ידי האמבות. איור 4 מראה ש-pGEM אבד בקטע הראשון – הקטעים הבאים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט מאוד, אם כי סביר להניח שכל מבנה ידרוש מידה מסוימת של אופטימיזציה, במיוחד של יחס מגיב DNA-transfection, בהתאם לאופי המבנה והמין של Naegleria בשימוש. בדקנו רק מגיב טרנספקציה אחד זמין מסחרית באמצעות פרוטוקול זה, אך סביר להניח שכמה אחרים עשויים להיות יעילים. בהתחשב בכך שיבוט באורך מלא של CERE משמש, המכיל מקור פונקציונלי של שכפול ובכך לשכפל באופן אוטונומי, המבנה מחזיק בכל מכונות השכפול האיקריוטיות הדרושות. אם שיבוט חלקי היה מוכנס לווקטור pGEM, השיבוט הנגוע היה צפוי ללכת לאיבוד זמן קצר מא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים כספי.

תודות

מחקרים אלה מומנו חלקית על ידי מענק מקרן ג'ורג' פ. האדיקס מאוניברסיטת קרייטון (KMD). איור 1 נוצר ב-biorender.com, ואיור 3 נוצר ב-benchling.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgaroseBio Rad161-3102
אמוניום אצטטסיגמא אולדריץ'A-7330
סידן כלוריסיגמא אולדריץ'C-4901
צלוחיות תרבית
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0.5 מ'Affymetrix15694
מכשיר ג'ל אלקטרופרזיסאמרשם ביוסיינסס80-6052-45
צינורות אפנדורף, 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-129
צינורות אפנדורף, 2 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-138
אתנול, 100%Decon Laboratories2716
אתידיום ברומידסיגמא אולדריץ'E-8751
סרום בקר עובריGibco26140
חומצה פוליתסיגמא אולדריץ'F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus סולםתרמו מדעיSM1331
חומצה אצטית קרחוניתפישר סיינטיפיקUN2789
GoTaq ירוק PCR מאסטר מיקסPromegaM7122
חימום בלוקתרמו מדעי88871001
HemacytometerHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
ברזל כלורידסיגמא אולדריץ'372870-256
ליגאזNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
מיקרוסקופNikonTMS
N. gruberiATCC30224
Nucleic Chem Impex Int' l#01625
פפטוןגיבקו211677
pGEMPromegaP2251
אשלגן פוספטסיגמא אולדריץ'P0662-500G
PowerPac HC אלקטרופרזיס יחידת אספקת חשמלביו ראד1645052
נתרן כלוריMCB ריאגנטיםSX0420
נתרן פוספט, דו-בסיסיSigma AldrichS2554
צנטריפוגה שולחניתeppendorf5415R
Tris, בסיסSigma AldrichT1503-1KG
טריפן כחול, 0.4%Gibco15250-061
ViaFect ReagentPromegaE4981
משקלמשקל Denver InstrumentsAPX-60
תמצית שמריםגיבקו212750
קרח כתוש, צלחת תרבית T-75 Thermo Scientific 130190, 6 בארות קורנינג 3506

מקורות

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
  3. Fulton, C. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).
  4. Grace, E., Asbill, S., Virga, K. Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).
  5. Moseman, E. A. Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri. PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).
  6. Marciano-Cabral, F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).
  7. Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. Naegleria fowleri. Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).
  8. Zysset-Burri, D. C., et al. Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri. BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).
  9. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri. BMC Genom. 19, 654-665 (2018).
  10. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri. Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).
  11. Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology. Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).
  12. Clark, C. G., Cross, G. A. M. rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid. Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).
  13. Clark, C. G., Cross, G. A. M. Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae. J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).
  14. Dao, F. Y., et al. Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique. Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).
  15. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA. Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).
  16. Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element. Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).
  17. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know. Plasmid. 115, 102567(2021).
  18. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397). Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).
  19. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400). Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).
  20. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh). Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).
  21. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element. Protist. 170, 141-152 (2019).
  22. Sohn, H. J., et al. Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae. Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).
  23. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  25. Jeong, S. R., et al. Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro. Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).
  26. Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns. Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).
  27. De Jonckheere, J. F. Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist. 149 (3), 221-228 (1998).
  28. Rawal, P., et al. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).
  29. Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

DNA ריבוסומלישכפול CEREטרנספקציה של שיבוט מולקולריתרבית טרופוזואיטיםטרנספקציה של פלסמידפרוטוקול התגבשות (Encystment)אנליזת PCRאלקטרופורזה של ג'ל אגרוזמקור השכפול
טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.