מאמר שיטה

מיצוי DNA והשוואה בין דגימות זבוב נקרופילי ישן וטרי

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66737

⸱

3 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, Hainan Gongping Forensic Center, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA של זבוב נקרופילי טרי וישן באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

תקציר

בסך הכל נבחרו חמש דגימות של Chrysomya megacephala - שלוש דגימות טריות, דגימה אחת שאוחסנה באלכוהול במשך שנתיים, ודגימה אחת שאוחסנה באחסון אטום יבש במשך שנתיים המוגנת מפני אור בלבד - כדי לחקור אם ערכת מיצוי DNA בדם יכולה להפיק DNA מזבובים נקרופיליים ולקבוע אם אלכוהול יכול להאריך את שימור הדנ"א של זבובים נקרופיליים. ראשית, ערכת מיצוי הדנ"א בדם שימשה להפקת דנ"א מרקמות בית החזה שלהם. לאחר מכן, טוהר הדנ"א וריכוזו נבדקו באמצעות קורא מיקרו-צלחות ופלואורומטר. לבסוף, הגברה PCR ואלקטרופורזה של הדנ"א שחולץ נעשו עם פריימרים ספציפיים לזבוב נקרופילי הממוקם ברצף הגן CO I המיטוכונדריאלי. התוצאות הראו כי טוהר הדנ"א של כל הדגימות היה גדול מ-2.0. ריכוז הדנ"א נצפה בסדר הבא: דגימות טריות > דגימות ישנות שהשתמרו באלכוהול > דגימות ישנות שלא טופלו. לכל הדגימות היו רצועות אלקטרופורטיות ספציפיות לאחר הגברה של PCR. לסיכום, ניתן להשתמש בערכת מיצוי DNA בדם כדי לחלץ דנ"א מזבובים נקרופיליים בהצלחה, וריכוז הדנ"א של דגימות זבובים טריים גדול מזה של דגימות זבובים ישנים. הזבובים יכולים להיות מאוחסנים באלכוהול במשך זמן רב.

מבוא

היקש זמן המוות היה מאז ומתמיד אחד הנושאים המרכזיים והקשים לפתרון בפרקטיקה השיפוטית. בפרקטיקה של מדע פורנזי, עבור תיק פלילי, קביעת מרווח לאחר המוות משחקת תפקיד מכריע בהסקת זמן הפשע, נעילת החשוד וצמצום היקף החקירה. שיטות מסורתיות להסיק את זמן המוות מבוססות בעיקר על תופעות מוקדמות לאחר המוות, אשר בדרך כלל ניתן להשתמש בהן רק כדי להסיק את זמן המוות בתוך 24 שעות. עם זאת, זמן המוות הארוך אינו יכול להיקבע על ידי תופעות שלאחר המוות. כיום מקובל בקהילת המדע הפורנזי כי לאנטומולוגיה משפטית יש פוטנציאל להיות שיטה יעילה להסיק זמן מוות ארוך יותר.

חרקים נקרופגיים נקראים על שם הזחלים שלהם הניזונים מגוויות. ביניהם, בכל פעם שיש גופה, הזבובים הנקרופיליים הבוגרים יהיו הראשונים להגיע לגופה ולהטיל את ביציהם או זחליהם. הזחלים ניזונים מרקמת הגופה ומבשילים לגלמים, המתגלגלים לבוגרים. זבובים נקרופיליים ממלאים תפקיד עצום בפועל של מדע פורנזי בגלל מחזור החיים הרגיל שלהם ותפוצה גיאוגרפית, למשל, ניכוי זמן המוות וקביעת מקום המוות 1,2. עם זאת, המחסום לשימוש בזבובים נקרופיליים בפרקטיקה משפטית הוא זיהוי מינים. שיטות מורפולוגיות עדיין משמשות כשיטה המוסמכת לזיהוי מינים של זבובים נקרופיליים. עם זאת, זיהוי מינים מורפולוגיים דורש רמה גבוהה של שלמות חרקים. אם הזבובים היו בשלבי התפתחות שונים, או עקב שינויים מורפולוגיים שנגרמו כתוצאה מבחירות סביבתיות, כל אלה מקשים על הבדיקה המורפולוגית. בפרט, המורפולוגיה של גלמים וקליפות גולמים, אשר נמצאים לרוב בזירת הפשע, בקושי ניתן לזיהוי. עובדה זו, יחד עם מיעוטם של מומחים מורפולוגיים, מקשה מאוד על זיהוי המינים מבחינה מורפולוגית. לכן, התפתחה שיטת הביולוגיה המולקולרית לזיהוי מינים של זבובים, המפחיתה את הקושי בזיהוי מורפולוגי ואינה תלויה בשלב ההתפתחותי 3,4,5,6,7.

הצעד הראשון בזיהוי מינים של זבובים נקרופיליים המבוסס על שיטות ביולוגיה מולקולרית הוא מיצוי יעיל של DNA, בעוד ערכות מיוחדות למיצוי DNA של חרקים אינן זמינות כיום בדרך כלל. וכיצד להשתמש בערכות דם נפוצות למיצוי DNA של זבובים נקרופיליים הופך רלוונטי יותר מבחינה משפטית. זבובים נקרופיליים שנמצאו בזירות פשע מושחתים לעתים קרובות או עברו ריקבון והשפלת DNA. דגימות זבובים אינן זמינות באופן מיידי למיצוי DNA לאחר הרכישה, או במידת האפשר, יש לשמור דגימות שלמות עקב דרישות שימור ראיות. בהתבסס על הדרישות לעיל, במחקר זה, יישמנו את ערכת הדנ"א של הדם המבוססת על עיכול פרוטאינאז K, ובחרנו שלוש דגימות טריות של Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (איור 1), דגימה ישנה אחת של C. megacephala שהושמה באלכוהול במשך שנתיים, ודגימה אחת של C. megacephala שהושמה באחסון מוגן אור במשך שנתיים, שקלנו כל אחת מחמש הדגימות, בחר את רקמת בית החזה של החרק למיצוי DNA. השוואת האיכות והטוהר של הדנ"א שהופק מהדגימות הישנות והחדשות, הגברה PCR ואלקטרופורזה של הדנ"א שחולץ בוצעו באמצעות פריימרים ספציפיים לזבוב נקרופילי הממוקמים ברצף הגן CO figure-introduction-1 מיטוכונדריאלי.

פרוטוקול

הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בסך הכל בחמש דגימות של C. megacephala – שלוש דגימות טריות (Fresh 1, Fresh 2 ו-Fresh 3), דגימה אחת שאוחסנה באלכוהול במשך שנתיים (Old 1), ודגימה אחת שאוחסנה באחסון יבש אטום למשך שנתיים כשהיא מוגנת מפני אור בלבד (Old 2). הדגימות חייבות להיות מסומנות בהתאם לדרישות הניסוי.

1. אחסון דגימות כללי והכנות

  1. בחירת דוגמאות והכנתן
    הערה: הקפד לעבוד במכסה האדים בעת מריחת אתיל אצטט לביצוע זבובים נקרופגיים. הסר את הנוזל מפני השטח של הזבוב לפני השקילה.
    1. דגימות טריות: הניחו שלוש דגימות זבובים שנאספו בבקבוקוני גז לאחר שהרגו אותן עם אתיל אצטט. שקלו וקראו לדגימות בשם Fresh 1, Fresh 2 ו-Fresh 3 והשתמשו בהן מיד בניסויים.
      הערה: דגימות הזבוב הטרי בפרוטוקול זה היו בעלות מסות של 56.8 מ"ג, 49.3 מ"ג ו-52.1 מ"ג.
    2. דוגמה ישנה 1: הוציאו דגימות זבובים שנהרגו על ידי אתיל אצטט ואוחסנו בצינורות צנטריפוגות מלאות אלכוהול במשך שנתיים בהכלה אטומה, מוגנות מפני אור בטמפרטורת החדר. לשקול את המדגם לאחר ספיגת נוזל פני השטח עם נייר מסנן; תקראו לזה ישן 1.
      הערה: המסה של Old 1 הייתה 42.3 מ"ג בפרוטוקול זה.
    3. דגימה ישנה 2: הוציאו את דגימת הזבוב שנהרגה על ידי אתיל אצטט ואוחסנו בצינור צנטריפוגה במשך שנתיים בהכלה אטומה, מוגנת מפני אור בטמפרטורת החדר. לשקול ולקרוא לזה ישן 2.
  2. הכנה לפני מיצוי
    1. מוסיפים כמות קטנה של חנקן נוזלי כדי לקרר מיכל נירוסטה; המתן עד שכל החנקן הנוזלי יתאדה.
    2. שים מדגם זבוב במיכל; שפכו פנימה את החנקן הנוזלי באיטיות כדי למנוע מהחנקן הנוזלי להתיז ולהשפיע על דגימת החרק.
    3. מקפיאים את הדגימות בחנקן נוזלי. הסר דגימות לאחר שהחנקן הנוזלי מתאדה.
    4. מפרידים את בית החזה בנפרד, מניחים בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל וחותכים לפרוסות הקטנות ביותר האפשריות.
      הערה: חתכו את הדגימה לחתיכות קטנות כדי שניתן יהיה לבקע אותה במלואה, וניתן יהיה לשחרר דנ"א בכמויות גדולות.
    5. חזור על השלבים לעיל עבור כל זבוב, הקפא בנפרד, ולאחר מכן הסר לצינור צנטריפוגה חדש כדי למנוע זיהום צולב DNA.

2. מיצוי DNA

הערה: כל שלבי הצנטריפוגה חייבים להתבצע בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) במיקרוצנטריפוגה. כל השלבים חייבים להתבצע תוך הקפדה על עקרונות האספסיס וכדי למנוע זיהום צולב.

  1. ליזה רקמתית
    1. הוסף 180 μL של חיץ ליזה רקמות לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל המכיל דגימה חתוכה.
    2. מוסיפים 20 μL של פרוטאינאז K. מערבבים היטב על ידי ערבול ב 3,000 סל"ד במשך 10 שניות ודגרים ב 56 ° C עד רקמות החרק הם lysed לחלוטין.
      הערה: להוסיף עוד פרוטאינאז K צריך להיות אם הרקמה אינה מתעכלת במלואה. ליזיס הוא בדרך כלל להשלים בתוך 1-3 שעות, גם יכול להאריך את זמן ליזה בן לילה.
  2. משקעים DNA
    1. מערבולת ב-3,000 סל"ד למשך 15 שניות. הוסיפו חיץ ליזה של 200 μL לדגימה, וערבבו היטב על ידי מערבולות ב-3,000 סל"ד במשך 15 שניות.
    2. מוסיפים 200 μL אתנול (96-100%) ומערבבים שוב ביסודיות על ידי ערבול ב-3,000 סל"ד במשך 15 שניות.
      הערה: ניתן לחבר מראש חיץ ליזיס ואתנול יחד בשלב אחד כדי לחסוך זמן. משקע לבן עשוי להיווצר על תוספת של חיץ ליזיס ואתנול.
  3. יש להכניס את התערובת לעמודת ספיחת הדנ"א הממוקמת בצינור איסוף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב-6,000 × גרם למשך דקה. יש להשליך את הזרימה ואת צינור האיסוף.
  4. הניחו את עמודת ספיחת הדנ"א מהשלב הקודם בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל, הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ להסרת חלבונים וצנטריפוגה ב-6,000 × גרם למשך דקה אחת. יש להשליך את הזרימה ואת צינור האיסוף.
  5. מעבירים את עמודת ספיחת הדנ"א לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל, מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ התפלה, וצנטריפוגות ב-20,000 × גרם למשך 3 דקות כדי לייבש את קרום עמודת ספיחה הדנ"א. יש להשליך את הזרימה ואת צינור האיסוף.
    הערה: שלב צנטריפוגה זה מבטיח הסרה של כל שאריות אתנול לפני ההדבקה הבאה. אם יש סחבת כלשהי של אתנול, צנטריפוגה שוב ב 20,000 × גרם למשך דקה אחת.
  6. מניחים את עמודת ספיחת הדנ"א בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 2 מ"ל, מזרימים ישירות 100 מיקרוליטר של חיץ אלוציית DNA על קרום העמודה, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, ואז צנטריפוגה ב 6,000 × גרם למשך דקה אחת כדי ללוטש.
    הערה: Elution עם 100 μL (במקום 200 μL) מגדיל את ריכוז ה- DNA הסופי ב- eluate אך גם מקטין את תפוקת ה- DNA הכוללת. כדי למקסם את תפוקת הדנ"א, חזור על ההדחה פעם אחת כמתואר בשלב 2.8.
  7. אחסנו את דגימות הדנ"א בטמפרטורה של 4°C (עד שבוע) או -80°C לאחסון לטווח ארוך.

3. זיהוי ריכוז DNA

  1. קבע את הערכים של OD 260 ו- OD 280 כדי להשוות את טוהר ה- DNA וריכוז חומצות הגרעין באמצעות קורא מיקרו-צלחות. חזור על הפעולה שלוש פעמים בכל דגימה.
  2. קבע את ריכוז הדנ"א המופק על ידי פלואורומטר באמצעות הערכה הנלווית לו, עם שלושה עותקים משוכפלים לכל דגימה.
    1. קח 190 μL של פתרון עבודה לתוך שני צינורות צנטריפוגות 0.5 מ"ל, לקחת 10 μL כל אחד של תקן #1 ותקן #2, להוסיף אותם פתרונות עבודה, ולהרחיק אותם מאור במשך לא פחות מ 15 דקות.
      הערה: תקן #1 ותקן #2 מכוילים במדויק עבור ריכוז מסוים של DNA. פתרונות סטנדרטיים צריכים להיות מוגדרים במדויק כדי להבטיח היווצרות של עקומה סטנדרטית מדויקת. תקן #1 הוא דגימת DNA דו-גדילי (dsDNA) בגודל 0.2 ng/μL; תקן #2 הוא 2,000 ננוגרם/מיקרוליטר. פתרון העבודה הוא צבע שנקשר במיוחד ל- dsDNA.
    2. קח 2 μL של DNA הבדיקה וערבב אותו עם 198 μL של פתרון עבודה בצינור צנטריפוגה 0.5 מ"ל, ולשמור הרחק מאור במשך לא פחות מ 15 דקות.
      הערה: אם ריכוז הדנ"א נמוך, הוסף 5 μL של DNA בדיקה עם 195 μL של פתרון עבודה.
    3. לאחר 15 דקות, הפעל את המכשיר ובחר מדידת ריכוז dsDNA | טווח ארוך. ראשית, בדוק תקן #1, ולאחר מכן, תקן #2 כדי להשיג את העקומה הסטנדרטית.
      הערה: יש להשתמש בפתרון הסטנדרטי באותו יום לאחר הגדרתו; השארתו למשך זמן רב מדי תגרום לשגיאה גדולה בעקומה הסטנדרטית.
    4. הניחו את הדגימות לבדיקה בבארות הבדיקה בזו אחר זו, התאימו את נפח זינוק הדנ"א ל-2 מיקרוליטר, חזרו על המדידה שלוש פעמים, קחו את הערך הממוצע ורשמו.

4. PCR וזיהוי אלקטרופורטי

הערה: רצף הגן CO figure-protocol-1 מיטוכונדריאלי באורך של 278 bp נלקח להגברת PCR עם פריימר קדמי C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG, ופריימר הפוך C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, ולאחר מכן 2% אלקטרופורזה ג'ל אגרוז נעשה כדי לאמת את אפקט ההגברה ואת אורך מוצרי ההגברה אומת.

  1. הגדר 20 μL של מערכת הגברה PCR על ידי הוספת 10 μL של 2x תערובת Taq, 1 μL של כל פריימר, 5 μL של ddH2O, ו 3 μL של DNA תבנית; מערבבים היטב 10 שניות בצנטריפוגה.
  2. השתמש בפרמטרים הבאים של מחזור PCR: predenaturation 95 °C למשך 10 דקות; דנטורציה 95 ° C עבור 30 שניות, חישול 48 ° C עבור 30 שניות, הארכה 72 ° C עבור 45 s עבור סך של 40 מחזורים; והארכה סופית 72°C למשך 10 דקות.
  3. יש להעביר את המוצרים לאחר PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 2%, ולאחר אלקטרופורזה, להניח אותם על מערכת הדמיה ג'ל לניתוח תמונות.

תוצאות

השתמשנו בקורא מיקרו-צלחות כדי למדוד את הערכים של OD260 ו-OD280 של תמיסת הדנ"א שחולצה, ולאחר מכן קיבלנו את ערכי OD260/OD280 כדי להעריך את טוהר הדנ"א. OD260/OD280 של כל הדגימות הטריות והמדגם הישן 1 היה גדול מ- 2. הערך המרבי של OD260/OD280 של מדגם 2 הישן היה 2.187 למרות שהממוצע היה 1.753, ושלוש המדידות שלו השתנו מאוד בגלל הערכים הקטנים (≤0.01) של OD280 ו-OD280 (טבלה 1). בהתבסס על הערך של OD260 שהתקבל, הערכנו את ריכוז הדנ"א. ריכוז הדנ"א של השלושה היה בסדר העדיפויות: דגימות טריות > דגימה ישנה 1 > דגימה ישנה 2, שנמדדה באמצעות קורא המיקרו-צלחות, אך ההבדל בין הדגימות הטריות לדגימות הישנות היה קטן, רק ~10-20 ננוגרם/מיקרוליטר (טבלה 1), בעוד שריכוז הדנ"א של שלוש הדגימות הטריות שנמדדו על ידי פלואורומטר קיוביט היה גדול מזה שנמדד על ידי קורא המיקרו-צלחות ב-125-130 ננוגרם/מיקרוליטר, עם הבדל של 15 ng/μL במדגם ישן 1 ורק 1.3 ng/μL במדגם ישן 2. ריכוז הדנ"א של הדגימות הטריות > דגימה ישנה 1 > דגימה ישנה 2 (טבלה 2).

DNA המופק בשיטת המיצוי הנהוגה כיום מכיל את כל רכיבי הדנ"א ממקורות שונים בדגימה. משמעות הדבר היא שתמיסת הדנ"א לא הייתה רק פתרון של דנ"א גנומי של זבובים. הפריימרים להגברה ספציפית של מקטעי גן CO figure-results-1 מיטוכונדריאלי של זבובים נבחרו על ידי התייעצות עם הספרות ואומתו על ידי NCBI-Blast Primer. התוצאות הראו כי הפריימר הקדמי C1-J-2495 והפריימר ההפוך C1-N-2800 של הגן CO figure-results-2 מיטוכונדריאלי היו פריימרים ספציפיים לזבוב עם פולימורפיזם רצף וכיסו מיני זבובים רבים. תוצאות ההגברה לא הראו גנים אנושיים. הם היו זוג סמנים ביולוגיים אמינים של DNA לזיהוי זבובים נקרופיליים ונבחרו לאימות תוצאות ניסוי זה.

כל הדגימות השונות הראו רצועות אלקטרופורטיות ברורות באורכים הנעים בין 250 bp-400 bp. הפסים היו בהירים יותר בדגימות הטריות מאשר בדגימות הישנות, והדגימות הישנות שהונחו על אלכוהול (איור 2, Old1) היו בהירות יותר מהדגימות הישנות שלא טופלו (איור 2, Old2), אולם לדגימות הישנות היו גם שתי להקות במיקומים שונים. לבקרה הריקה לא היו פסים (איור 2).

figure-results-3
איור 1: תמונות של Chrysomya megacephala מזוויות שונות. (A) זכר; (B) נקבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 2: אלקטרופרוגרמה של מוצרי הגברה של PCR. שלושת הפסים הראשונים משמאל הם תוצרי הגברה PCR של DNA מדגימות זבובים טריים. הרצועה האלקטרופורטית הרביעית היא תוצר PCR של DNA מדגימת הזבוב הישנה שנשמרה באלכוהול. הרצועה החמישית היא תוצר PCR של DNA מדגימת הזבוב הישנה ללא כל שימור מיוחד. הרצועה השישית היא שליטה ריקה; הוא נקי, ומוכיח כי לא התרחש זיהום במהלך הגברת PCR. בקצה הימני נמצא סולם הדנ"א, שבו סימנו מיקומי דנ"א באורכים של 250 bp ו-400 bp. הפסים האלקטרופורטיים של כל מוצרי ה-PCR של הדגימות היו מעט מעל 250 bp ופחות מ-400 bp סולמות. מיקום זה תואם את אורכו של גן המטרה 278 bp. לעין בלתי ברור יותר שרצועות הדנ"א המייצגות דגימות טריות בהירות יותר מאלו של דגימות ישנות. הדגימות הישנות מורכבות מפסי דנ"א אחרים שנמצאים שם בגנים פחות אינטנסיביים, לא מטרה, באורכים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לדוגמהפרש1פרש2פרש3ישן1ישן2
OD260/OD2802.354±0.0362.245±0.0272.060±0.0382.143±0.0121.753±0.421
DNA(ng/μL)119.91±1.686116.084±4.96595.239±3.40186.845±6.1410.151±0.168

טבלה 1: מדידת טוהר וריכוז דנ"א באמצעות קורא מיקרו-צלחות.

לדוגמהפרש1פרש2פרש3ישן1ישן2
DNA(ng/μL)243.333±1.528237.667±2.082226.000±2.000101.000±0.00011.433±0.058

טבלה 2: מדידת ריכוז DNA באמצעות פלואורומטר.

דיון

מיצוי DNA הוא החוליה הקריטית ביותר בזיהוי מולקולרי של זבובים נקרופיליים, ושיטת המיצוי שלו ואיכות הדנ"א המופק משפיעים ישירות על הגילוי לאחר מכן. בניסוי זה חילצנו בהצלחה דנ"א מזבובים נקרופיליים באמצעות ערכת דם נפוצה, ללא צורך ברכישת ערכת מיצוי דנ"א מיוחדת של חרקים, מה שמקל על מיצוי דנ"א של חרקים.

פני השטח של הזבובים עשירים בכיטין, במיוחד בשלבי הזחל והגולם שבהם הכיטין האפידרמלי יכול להגיע ל 60-70%, מה שהופך את מיצוי ה- DNA מזבובים נקרופיליים לקשה9. במהלך תהליך המיצוי מצאנו שאם הדגימה הייתה רטובה, למרות שגזזנו את הדגימה כראוי, הדגימה נשארה ג'לטינית כאשר פרוטאינאז K הוחל לעיכול. זה מנע מהנוזל הנוסף לעבור חזרה דרך עמוד הספיחה. כדי לפתור בעיה זו, השתמשנו תחילה בחנקן נוזלי כדי להקפיא במהירות את הדגימות כדי להפוך את הזבובים לשבירים וקלים לטחינה, כמו גם קלים לעיכול מלא. אם חנקן נוזלי אינו זמין לטחינה ועדיין יש לשפר את יעילות מיצוי הדנ"א, ניתן להניח את דגימות הזבוב באזור מאוורר למשך כ-48 שעות. ניתן לאפשר לדגימות להתייבש לפני שהן נחתכות כראוי ולאחר מכן מופקות DNA.

בהתחשב בכך שהתפרקות הדנ"א של דגימות ישנות הייתה דאגה גדולה יותר, דגימות בית החזה של הזבובים נבחרו למיצוי DNA בניסוי זה בגלל תכולת הדנ"א הגבוהה של בית החזה. עם זאת, השימוש בבית החזה משבש מדי את שלמותו המורפולוגית של הזבוב מכדי לשמר לחלוטין את הראיות הבאות ואת הצורך בזיהוי מורפולוגי. קשה לחלץ את הדגימות כאשר בית החזה נרקב. אם הדגימות טריות, מיצוי DNA של כף הרגל והכנף עשוי להיות עדיף. כף הרגל והכנף מפוזרות באופן סימטרי ודו-צדדי, וניתן לשמור על מאפיינים מורפולוגיים שלמים יותר לאחר חילוץ הרקמה מצד אחד. עם זאת, ריכוז הדנ"א המופק מהכנף ומכף הרגל נמוך יחסית, דבר המסוכן למחקרים הבאים. בנוסף, הדגימות היו קטנות ואיבדו בקלות10.

בעת שימוש בערכת מיצוי DNA למיצוי DNA, ערכי OD260/OD280 שנמדדו על-ידי קורא המיקרו-לוחות היו גדולים מ-2 למעט מדגם ישן 2. ראשית, ניתן לקבוע כי החלבון הוסר בצורה יסודית יותר, אך ייתכן זיהום RNA, שברים דו-גדיליים של DNA עקב צנטריפוגות חוזרות, או התפרקות DNA בדגימות הישנות11. שנית, זה עשוי גם להצביע על כך שאלכוהול מאריך את שימור הרנ"א.

ריכוז הדנ"א מחושב מתוך ערך OD260 של קורא המיקרו-לוחות, בעוד שפלואורומטר קיוביט משמש תחילה לקביעת עקומה סטנדרטית, ולאחר מכן למדידת ערך הספיגה כדי לחשב את ריכוז הדנ"א. שתי השיטות יכולות לממש את מדידת ריכוז הדנ"א העקבות, אך לכל אחת מהן יתרונות וחסרונות: קורא המיקרו-צלחות מיישם OD260 כדי לחשב את ריכוז הדנ"א, אך שיטת החישוב שלו היא גם אומדן. אם הדגימה מעורבבת עם מספר רב של נוקלאוטידים או חלבונים וחומרים אחרים שיכולים לספוג אור אולטרה סגול, השגיאה הפוטומטרית תהיה גדולה יותר, ולכן עלינו לנסות להסיר אותם מראש.

קוראי מיקרו-צלחות וספקטרופוטומטרים UV משתמשים בספיגת UV לצורך זיהוי, שאינה יכולה להבחין בין DNA, RNA, חומצות גרעין מפורקות, נוקלאוטידים חופשיים וזיהומים אחרים, והספיגה מושפעת מאוד גם מזיהום של חומרים אחרים, מה שהופך את הקריאות שלה לבלתי אמינות יחסית. בזמן דגימות קוצים, אשר נמדדות בדרך כלל בטיפות, הדגימות נלקחות ישירות ללא דילול או עיבוד, מה שמאפשר מדידה בו זמנית של דגימות מרובות וחישוב ישיר של טוהר ה- DNA ממדידות OD260/OD280. פלואורומטר קיוביט, לעומת זאת, נועד למדוד רק את ריכוז הדנ"א הדו-גדילי על ידי יישום שתי תמיסות סטנדרטיות של ריכוז ידוע כדי לקבוע עקומה סטנדרטית ויישום המאפיינים של צבעים פלואורסצנטיים הנקשרים במיוחד לדנ"א דו-גדילי. עם זאת, כל דגימה צריכה להיות מטופלת בנפרד ולאחר מכן נמדדת בנפרד, דבר מסורבל עבור יישומי דגימת אצווה, ולא ניתן למדוד את טוהר הדנ"א שחולץ. ביישום הספציפי של השניים ניתן לבחור על פי הצרכים שלהם לבדיקת איכות של DNA 12,13,14.

ריכוז הדנ"א של דגימות טריות היה גדול מזה של דגימות ישנות שהונחו באלכוהול וגדול מזה של דגימות ישנות שלא טופלו, בין אם ריכוז הדנ"א נמדד על ידי קורא מיקרו-צלחות או פלואורומטר קיוביט. לאחסון לטווח ארוך, הדגימות יכולות להיות שקועות באלכוהול כדי למנוע צמיחה של חיידקים ופטריות15,16.

שיטות המדידה השונות השפיעו פחות על מדידות הדנ"א של דגימות ישנות ללא כל טיפול, כנראה משום שדגימות ישנות היו מפורקות יותר, במיוחד חלבונים ורנ"א עשויים להתפרק מהר יותר מהדנ"א. לעומת זאת, דגימות טריות הכילו יותר חלבון ורנ"א ולכן הייתה להן השפעה גדולה יותר על התוצאות. אם משווים רק ריכוזי דנ"א דו-גדילי, עלינו להשתמש בתוצאות פלואורומטר קיוביט, ותוצאות הניסויים שלנו יצרו גם שיפוע ריכוז דנ"א משמעותי בדגימות הישנות והחדשות.

תכולת הדנ"א של דגימות טריות וישנות, לאחר מיצוי DNA, יכולה לשמש לניתוח ביולוגיה מולקולרית לאחר מכן. כמו בניסוי זה, הפריימרים שנבחרו עבור הגן CO figure-discussion-1 המיטוכונדריאלי היו רק 278 bp, ואת כולם ניתן היה להגביר בהצלחה על ידי DNA. הגן CO figure-discussion-2 מיטוכונדריאלי הוא, בתורו, מוקד המוכר בזבובים בשל פוטנציאל ברקוד הדנ"א שלו, ובכך מאפשר זיהוי של מיני זבובים נקרופיליים על ידי ניתוח ריצוף עוקב17. הביולוגיה המולקולרית של דגימות שהשתמרו זמן רב יותר יכולה להיות מושגת בהצלחה על ידי בחירת פריימרים עבור רצפי דנ"א קצרים אחרים. יש לציין כי הפסים האלקטרופורטיים של הדגימות הישנות היו בעלי שני פסים בעלי מיקומים שונים ורצפים קצרים יותר, ככל הנראה בשל הגברה לא ספציפית של הפריימרים שנגרמה כתוצאה מהתפרקות הדנ"א יחד עם טמפרטורת החישול הנמוכה.

עם זאת, בניסוי זה, פחות דגימות נשמרו במשך תקופה ארוכה כדי לספק את הצורך בניסויים חוזרים, בעוד שהתוצאות דרשו רק דגימות מייצגות. לכן, לא ערכנו בדיקת חזרתיות, שעשויה להיות גישוש לשימור דגימות ישנות וחדשות אך אינה משפיעה על מיצוי מוצלח של דגימות זבוב נקרופילי.

לסיכום, השימוש בערכת מיצוי DNA בדם יכול לסייע גם בהפקת DNA של זבוב נקרופילי. ניתן לחלץ בהצלחה דגימות ישנות וחדשות, וניתן להשתמש בכל הדנ"א שחולץ לניתוח הבא. אלכוהול הוא גם חיובי לשימור לטווח ארוך של דגימות DNA זבוב.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82060341,81560304) ועל ידי פרויקט המחקר המדעי של פלטפורמת החדשנות האקדמית של מחוז האינאן (YSPTZX202134).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מאגר AEמאגר פליטת DNAQiagen172026832
מאגרמאגר 172028374 מאגר ליזהQiagen
מאגר ATL מאגר ליזהרקמות Qiagen172028162
מאגר AW1מאגר הסרת חלבוןQiagen172028760
מאגר מאגרהתפלה
AW2 Qiagen 57203108C1-J-2495Taihe ביוטכנולוגיהTW21109216פריימר פורוורד
C1-N-2800Taihe ביוטכנולוגיהTW21109217פריימר הפוך
D2000 סולם DNAזמנים אמיתיים (בייג'ינג) ביוטכנולוגיהRTM415מדוד את המיקום של להקות אלקטרופורטיות
DNeasy מיני עמוד ספיןQiagen166050343עמוד ספיחת DNA
חממת אמבטיה יבשהMiulabDKT200-2Dהמשמש לחימום
MIX-30S מיני מיקסרMiulabMUC881206פעולת תנודה
Proteinase KQiagen172026218השבתת נוקלאזות תוך-תאיות וחלבונים אחרים
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher Scientific2321611188
Speed מיקרו-צנטריפוגהScilogex9013001121צנטריפוגה
סטנדרטית#1תרמו פישר סיינטיפיק2342797
תקן#2תרמו פישר סיינטיפיק2342797
טאנון 3500R ג'ל הדמיהטאנון16T5553R-455הדמיית ג'ל
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020APCR רגיל
Thermo Fisher Scientific2342797
AL של של פתרון עבודה

מקורות

  1. Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
  2. Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
  3. Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
  4. Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
  5. Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
  6. Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
  7. Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
  8. Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
  9. Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
  10. Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
  11. Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
  12. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
  13. Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
  14. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
  15. Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
  16. Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
  17. Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66737

תגיות

Chrysomya megacephalaDNADNADNAPCR

מאמרים קשורים