מאמר שיטה

הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

DOI:

10.3791/66741

⸱

3 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh, University of Pittsburgh School of Medicine, 2North Allegheny High School, 3Wright State University Boonshoft School of Medicine, 4College of Engineering, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ככל שתחום הריפוי הגנטי ממשיך להתפתח, יש צורך הולך וגובר בשיטות חדשניות שיכולות להתמודד עם אתגרים אלה. כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמה של מפעל תאים, העומדים בתקני האיכות למחקרי in vivo .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר פרה-קליני בריפוי גנטי, במיוחד במודלים של מכרסמים ובעלי חיים גדולים, מחייב ייצור של וקטורי AAV בעלי תפוקה וטוהר גבוהים. גישות מסורתיות במעבדות מחקר כוללות לעתים קרובות שימוש נרחב בצלחות תרבית תאים לגידול תאים HEK293T, תהליך שיכול להיות מייגע ובעייתי כאחד. כאן מוצגת שיטה פנימית ייחודית, המפשטת תהליך זה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ספציפית (או מחסניות תאים, CF10). שילוב של פוליאתילן גליקול/חלוקה דו-פאזית מימית עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול משפר הן את התפוקה והן את הטוהר של וקטורי AAV שנוצרו. טוהר וקטורי ה-AAV מאומת באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף, בעוד שהיחס בין חלקיקים מלאים לריקים נקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM). גישה זו מציעה פלטפורמה יעילה לייצור וקטורי AAV בתפוקות גבוהות, יחד עם שיטת טיהור משופרת כדי לענות על דרישות האיכות למחקרי in vivo .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הפכו לכלי חיוני במחקר ריפוי גנטי, ומציעים שילוב ייחודי של יעילות ובטיחות להעברת גנים1. שיטות מסורתיות ליצירת AAVs בסביבות מעבדה היו מרכזיות בקידום ההבנה והיישום שלנו של ריפוי גנטי2. עם זאת, שיטות אלה, למרות שהן בסיסיות, מציגות מגבלות ואתגרים מסוימים, במיוחד במונחים של תפוקה, יעילות זמן ואיכות הווקטורים המיוצרים, בעיקר היחס בין חלקיקים מלאים לריקים3.

ההליך הקונבנציונלי לייצור AAV כולל בעיקר טרנספקציה של תאי HEK2934. תהליך זה, המתבצע בדרך כלל בצלחות תרבית תאים, דורש מהתאים להיות נגועים בפלסמיד המכיל את הגן המעניין יחד עם פלסמיד עוזר ופלסמיד קפסיד AAV 5,6. לאחר ההדבקה, התאים מייצרים חלקיקי AAV, אשר לאחר מכן נקצרים ומטוהרים 5,6. תהליך הטיהור כולל לעתים קרובות אולטרה-צנטריפוגה, שלב קריטי בהשגת וקטורי AAV בעלי טוהר גבוה7. אולטרה-צנטריפוגה, במיוחד באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) או שיפוע יודיקסנול, היא שיטה סטנדרטית להפרדת חלקיקי AAV מפסולת תאית וזיהומים אחרים8. שלב זה חיוני להשגת הטוהר והריכוז הרצויים של וקטורי AAV, אשר משפיע ישירות על יעילותם בהעברת גנים8. למרות השימוש הנרחב שלה, אולטרה צנטריפוגה מסורתית יש חסרונות שלה. לדוגמה, התפוקה של וקטורי AAV משיטה זו יכולה להיות משתנה ולעתים קרובות נמוכה, מה שמציב אתגרים משמעותיים כאשר יש צורך בכמויות גדולות של וקטורים בעלי טיטר גבוה, במיוחד עבור מחקרי in vivo או מודלים של בעלי חיים גדולים9.

היבט קריטי נוסף של איכות וקטור AAV הוא היחס בין חלקיקים מלאים לריקים10. תכשירי AAV מכילים לעתים קרובות תערובת של חלקיקים אלה; עם זאת, רק החלקיקים המלאים מכילים את החומר הגנטי הטיפולי. נוכחות של שיעור גבוה של חלקיקים ריקים יכולה להפחית באופן משמעותי את היעילות של העברת גנים10. הערכה ואופטימיזציה של היחס בין חלקיקים מלאים לריקים היא אפוא פרמטר מפתח בהערכת היעילות של וקטורי AAV. שיטות מסורתיות, בעוד שהן מסוגלות לייצר וקטורי AAV, מתקשות לעתים קרובות לשלוט ביחס זה באופן עקבי, מה שמוביל לשינויים בעוצמה הווקטורית10.

כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ללא שימוש בתרביות תאי HEK293T עתירות עבודה בצלחות תאים, תוך שילוב פוליאתילן גליקול/חלוקה דו-פאזית מימית עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול. טוהר וקטור AAV מאושר באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף, ויחס החלקיקים המלא לריק נקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), העומד בתקני האיכות של מחקרי in vivo 11.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרטי הריאגנטים, הפלסמידים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים. הרכב המאגרים בהם נעשה שימוש מופיע בקובץ משלים 1.

1. הכנת פלסמיד

  1. התמירו פלסמידים (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) ב-E. coli.
    הערה: ניתן להשתמש בכל זן E.coli להגברת פלסמיד. עבור פלסמידים מסוימים, תאים מוכשרים מיוחדים כגון יציב NEB יכולים לשפר את תשואת הפלסמיד. שלושת הפלסמידים המשמשים בפרוטוקול זה הם pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 ו-pAAV-Cap: pAAV-RC6.
  2. לגדל חיידקים במדיה LB המכילה את האנטיביוטיקות הסלקטיביות המתאימות בנפח אופטימלי של 37 ° C למשך 16-18 שעות.
    הערה: בעת שימוש בתאים יציבים NEB, תרבית ב 30 ° C במשך 18-20 שעות.
  3. קצרו DNA פלסמיד על ידי צנטריפוגה של E. coli. תרבית בינונית ב 4000 x גרם, 4 ° C, במשך 15 דקות.
  4. שפכו בזהירות את נוזל העל מבקבוק הצנטריפוגה למיכל פסולת וטיהרו את הדנ"א של הפלסמיד מהגלולה בעזרת ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה גדול ללא אנדוטוקסין.
    הערה: הקפידו לשפוך אותו לאט ולהימנע מהתזה.
  5. למדוד את ריכוז הדנ"א ואת טוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    הערה: בדוק את טוהר ה- DNA על-ידי בדיקת יחס OD260/OD280 . היחס לדנ"א טהור הוא כ-1.8. ריכוז ה- DNA צריך להיות מעל 1 מיקרוגרם / μL עבור שלב מאוחר יותר co-transfection. צור מלאי גליצרול חיידקי על ידי הוספת 500 μL של תרבית לילה ל 500 μL של 50% גליצרול ב cryovial ולאחסן ב -80 ° C.

2. הכנת תאי HEK293T

  1. זרעו HEK293T תאים עם מדיה גבוהה של גלוקוז DMEM המכילה 10% FBS למפעל תאים בן 10 שכבות (CF10) ותנו לתאים לגדול באינקובטור בן לילה.
    הערה: המעברים של תאי 293T צריכים להיות פחות מ-10 כדי לקבל את המצב האופטימלי לייצור AAV חזק. במידת האפשר, אל תוסיפו אנטיביוטיקה לאמצעי התרבות בשלב זה. שטח הפנים של CF10 גדול בערך פי 42 מזה של צלחת תרבית תאים בקוטר 150 מ"מ. זרעו את אותה צפיפות תאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 150 מ"מ כדי לאפשר בדיקת גדילת התאים תחת מיקרוסקופ. הכינו תרחיף תאים של 1075 מ"ל, הוסיפו תרחיף תאים של 25 מ"ל לצלחת של 150 מ"מ והוסיפו את הנותרים ל-CF10.
  2. בדוק את מפגש התאים למחרת לפני הטרנספקציה.
    הערה: תאים צריכים להגיע למפגש של 80%-90% בזמן הטרנספקציה על ידי התבוננות תחת מיקרוסקופ.

3. טרנספקציה משולשת של פלסמידים AAV

  1. חשב את כמות כל פלסמיד הדרוש (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-סרוטיפ) כדי לקבל יחס מולארי של 1.2: 1: 1 עם 2.5-5 מ"ג של DNA כולל לכל CF10.
    הערה: היחס המולרי של שלושת הפלסמידים עשוי להיות משתנה לקבלת יעילות הטרנספקציה האופטימלית. עדיף לבדוק אותו בקנה מידה קטן לפני המעבר להגדרה זו של CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 ו- pAAV-RC6 משמשים לייצור וירוס AAV6-CMV-GFP כדוגמה. נוסחת מחשבון PEI מופיעה בטבלה 1.
  2. Aliquot 350 מ"ל של OptiMEM לתוך בקבוק סטרילי 500 מ"ל.
  3. הוסף את כל שלושת הדנ"א של פלסמיד לבקבוק המכיל את Opti-MEM. מערבבים היטב.
  4. הוסף 15 מ"ל של תמיסת פוליאתילנימין (PEI) 1 מ"ג/מ"ל (יחס DNA למיקרוגרם PEI) 1:3 מיקרוגרם). נערו את תערובת OptiMEM/DNA/PEI מעלה ומטה במרץ במשך 30 שניות.
    הערה: זה בסדר לעשות בועות.
  5. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
    הערה: דגירה ארוכה יותר עלולה להפחית את יעילות הטרנספקציה.
  6. הוסף את תמיסת OptiMEM/DNA/PEI לבקבוק 1 ליטר המכיל 700 מ"ל של גלוקוז נמוך DMEM עם 10 mM HEPES ו-2% FBS. מערבבים היטב.
    הערה: במחקר זה, גלוקוז נמוך ב- DMEM הראה ייצור וקטורי AAV טוב יותר לאחר טרנספקציה משותפת. תוספת של HEPES מסייעת לשמור על התאים במצב טוב יותר. מערבבים על ידי סיבוב הבקבוק באיטיות. הימנעו מיצירת יותר מדי בועות.
  7. הוציאו את CF10 מהאינקובטור ושאבו את המדיה החוצה לתוך מיכל פסולת.
    הערה: הניחו את CF10 על המשטח בתוך מכסה המנוע והרימו בהדרגה צד אחד למעלה, שאבו באיטיות את המדיה החוצה מבלי לנתק את התאים.
  8. הוסיפו בזהירות את תערובת המשקפים ל-CF10. ודא שכל עשר השכבות מכוסות במדיה.
    הערה: יש להוסיף 25 מ"ל של תערובת מדבקת לצלחת בקוטר 150 מ"מ. עקוב אחר התאים מדי יום עד הקציר. הוסיפו את שארית תערובת הזיהומים ל-CF10 על ידי מזיגה איטית. סובבו את CF10 בזהירות רבה והבטיחו נפח שווה לכל שכבה.
  9. להחזיר את CF10 לאינקובטור למשך 72-96 שעות.
    הערה: בדוק את צלחת הצג בקוטר 150 מ"מ כדי להחליט מתי לקצור את וקטורי ה-AAV. כאשר התאים מתנתקים בקלות רבה עם עומס מלא של AAV, הגיע הזמן לקצור.

4. קצירת וקטורי AAV

  1. קצרו את הנגיף 3-4 ימים לאחר ההדבקה על ידי ניעור נמרץ של CF10. יוצקים את התקשורת לתוך צינורות חרוטי 250 מ"ל ולסובב את הנגיף ב 4000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
    הערה: עבור סרוטיפ AAV6 המשמש בפרוטוקול זה, 80% AAV יישאר קשור ברובו לחומר תאי בכדורית. ו-20% AAV הופרשו לתקשורת. פרופורציות אלה עשויות להיות שונות עבור סרוטיפים אחרים AAV.
  2. סנן סופרנאטנט מובהר עם יחידת סינון של 0.45 מיקרומטר ושמור אותו למשקעים.
  3. שטוף את CF10 עם 500 מ"ל של DPBS, חיץ אחד וצנטריפוגה במהירות 4000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C.
  4. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות מערכת ואקום ופיפטה שואפת. הוסף 20 מ"ל של חיץ ליזיס AAV לכל CF10 ב -80 ° C עד לטיהור.
    הערה: העבר ליזט AAV לצינור חרוטי של 50 מ"ל למיצוי AAV מאוחר יותר.
  5. הוציאו את הסופרנאטנט המסונן, הוסיפו 40% תמיסת PEG-2.5M NaCl לריכוז סופי של 8% PEG, ודגרו בחדר קר על מסובב אורביטלי למשך 3 שעות או לילה לפחות.
    הערה: עבור 100 מ"ל supernatant, להוסיף 25 מ"ל 40% PEG-2.5 M NaCl פתרון.
  6. לזרז את הנגיף על ידי צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
    הערה: מעבירים את התערובת לצינורות חרוטיים בנפח 250 מ"ל לצנטריפוגה.
  7. שואפים להסיר supernatant ולהוסיף 5-10 מ"ל של חיץ מתלה AAV HEPES כדי להשהות את הכדורים. מעבירים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל כדי להמשיך את הטיהור במורד הזרם, או לאחסן אותו ב -80 ° C.

5. מיצוי AAV

  1. הפשיר את גלולת הנגיף באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות עם שייקר.
    הערה: מערבלים את הליזט AAV כדי להמיס לחלוטין.
  2. מקפיאים באמבט 100% אתנול בטמפרטורה של -80°C למשך 20-30 דקות.
    הערה: לחלופין, מחזור ההקפאה יכול להיעשות עם אתנול 100% קרה מוקפת קרח יבש.
  3. יש להקפיא/להפשיר 3-4 פעמים, ולערבל בין לבין במידת הצורך.
    הערה: ניתן להשהות מחזור זה בשלב ההקפאה. אחסן את הליזט AAV ב -80 ° C עד לעבודה במורד הזרם.
  4. הפשירו ליזה AAV (משלב 5.3) והשעו מחדש AAV (משלב 4.7)" באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות עם שייקר, ומערבולת.
    הערה: הקפידו להמיס לחלוטין ולערבב.
  5. הוסף נוקלאז בנזונאז (250 יחידות/μL) ל-AAV ליזט ו-AAV מושעה מחדש לקבלת ריכוז סופי של 50 יחידות/מ"ל. מערבולת את הפתרון.
  6. יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות למשך 30 דקות.
    הערה: הוציאו 10% נתרן deoxycholate aliquots באמבט מים כדי לאפשר זמן להתמוסס, להתחמם ולערבב היטב.
  7. הוסיפו 10% נתרן דאוקסיכולאט לקבלת ריכוז סופי של 0.5% ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם שייקר למשך 30 דקות.
    הערה: נתרן deoxycholate שימש כדי לשפר את שחרור AAV מהתאים.
  8. הפץ את תמיסת ה- AAV הגולמית בצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל ובצנטריפוגות ב- 14,000 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C.
  9. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל.
    הערה: השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי להעביר את supernatant. השליכו את הכדורים.
  10. מוסיפים כמות שווה של כלורופורם וממצים AAV על ידי ערבול במשך 1-2 דקות.
    הערה: התמיסה צריכה להיות אטומה, לבנה, דמוית חלב.
  11. מעבירים את התמיסה החלבית לצינורות צנטריפוגות בנפח 2 מ"ל ומפזרים באופן שווה. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  12. בזהירות פיפטה החוצה את השכבה הוורודה העליונה ולהעביר אותו צינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
    הערה: אין להפריע לשכבות הכלורופורם/החלבון.
  13. מדדו את עוצמת הקול הסופית באמצעות פיפטה. על פי תרשים הנפח הגולמי AAV-PEG-סולפט (טבלה 2), ערבבו נפחים מתאימים של 50% (NH4)2SO4 ו-40% תמיסת PEG. מערבולת במשך 2 דקות.
  14. מעבירים את התערובת לצינורות צנטריפוגות של 2 מ"ל לפיזור שווה. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C
  15. לאסוף את השכבה התחתונה באמצעות מחט 22 G מזרק 3 מ"ל. לאסוף את AAV בצינור חרוטי 50 מ"ל ולאחסן אותו ב 4 ° C עבור יודיקסנול הדרגתי מאוחר יותר ultracentrifugation.

6. טיהור AAV על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול

  1. הכינו את שיפועי היודיקסנול טריים לפני טעינת ה-AAV בהתאם למספר צינורות האולטרה-צנטריפוגה שבהם נעשה שימוש (טבלה 3).
    הערה: פנול אדום שימש כדי לצפות בשכבות.
  2. שכבו כל תמיסה לתוך צינור פוליפרופילן אולטרה-צנטריפוגה עגול ואטימה מהירה באיטיות באמצעות מזרק 10 מ"ל המחובר עם מחט ארוכה מנוקבת 16 גרם. הימנעו מבועות.
  3. הוסף בזהירות עד 17 מ"ל של תמיסת AAV על גבי שיפוע עם מזרק 22 G. השתמש במאגר דיאליזה AAV כדי לקלף את הצינור.
    הערה: הוסף את תמיסת ה- AAV על-ידי טעינת טיפות על הקיר בצינור האולטרה-צנטריפוגה. אין להפריע לשכבות מעבר הצבע.
  4. אטמו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות באמצעות אוטם חשמלי.
    הערה: אזנו את הצינורות לפני שליחתם לאולטרצנטריפוגה בהפרש של 0.2 גרם ±.
  5. צנטריפוגה ב 350,000 x גרם במשך 2 שעות ברוטור Ti70 ב 4 ° C.
  6. בזהירות להסיר את צינורות מן הרוטור ומניחים אותם במתלה צינורות ultracentrifuge.
    הערה: ודא שהמעברים ההדרגתיים אינם מופרעים.
  7. אסוף שברי AAV לפי השלבים הבאים:
    1. ייצבו את הצינור על מחזיק מעמד.
    2. נקב את צינורות אולטרה צנטריפוגה מעט מתחת לממשק 40%-60% עם מחט 19 G המחוברת מזרק 10 מ"ל.
      הערה: פתח המחט צריך להיות כלפי מעלה, מול שיפוע של 40%.
    3. ניקוב חור בחלק העליון של הצינור עם מחט 16 גרם.
    4. לאסוף עד 5 מ"ל לכל צינור. הימנעו מאיסוף זיהום החלבון בממשק של 25%-40%.
    5. חזור על הפעולה עבור כל צינור אולטרה-צנטריפוגה.
      הערה: העבר את שברי AAV לצינור חרוטי של 50 מ"ל.

7. סיבוב שני יודיקסנול הדרגתי אולטרה-צנטריפוגה

הערה: שלב זה הוא אופציונלי. שלב זה הוא להפחית את יחס AAV הריק לקבלת קפסיד AAV מלא באיכות גבוהה יותר.

  1. דילול AAV >1:1 עם חיץ דיאליזה AAV.
    הערה: AAV שנאסף מהסבב הראשון של אולטרה-צנטריפוגה היה בשכבת יודיקסנול של 40%. זה צריך להיות מדולל על ידי לפחות 50% כדי להיות מסוגל להיות טעון על גבי שכבת 30% יודיקסנול.
  2. הניחו כל תמיסה (טבלה 4) לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה באמצעות מחט מנוקבת של 16 G וחברו באיטיות מזרק בנפח 10 מ"ל. הימנעו מבועות.
  3. בזהירות להוסיף 20 מ"ל של פתרון AAV מדולל על גבי שיפוע עם מזרק 22 גרם. השתמש במאגר דיאליזה AAV כדי לקלף את הצינור.
  4. חזור על השלבים 6.4 עד 6.7.

8. דיאליזה AAV וריכוז

  1. להעביר את וירוס AAV לתוך קלטת דיאליזה באמצעות מחט חדשה 18 G מזרק 10 מ"ל. לאט לאט להזריק את הנגיף לתוך קלטת ולהוציא אוויר ממנו.
  2. הוסיפו לכוס ערבוב המכילה חיץ דיאליזה AAV והניחו על צלחת ערבוב.
  3. הכניסו את קלטת הדיאליזה למאגר הדיאליזה בעזרת מצוף ציפה. יש לערבב ב-4°C. שנה פי 2-3 את מאגר הדיאליזה AAV.
    הערה: השתמש במאגר מספיק כדי לאפשר לקלטת לצוף ולבצע את החלפת המאגר. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום.
  4. באמצעות מזרק 10 מ"ל מחובר עם מחט 18 גרם, לאסוף את הנגיף מן הקלטת לתוך יחידת מסנן צנטריפוגלי.
  5. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15-30 דקות ב 4 ° C.
    הערה: יש לשטוף את ה-AAV עם חיץ דיאליזה AAV 2-3 פעמים. רכז את ה- AAV עד ~ 200 μL של הנותר על גבי המסנן.
  6. אסוף את ה- AAV המרוכז מיחידת הסינון. שטפו את המסנן עם עוד 300 μL של מאגר דיאליזה AAV והעבירו אותו ל-AAV המרוכז.
  7. סנן את הנגיף דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 1 מ"ל שחפת להחליק. כדי להבטיח אובדן נפח מינימלי, השתמש במזרק 10 מ"ל כדי לדחוף אוויר דרך המסנן 2-3 פעמים.
  8. אחסן את נגיף AAV מטוהר ב 4 ° C באופן זמני לטיטרציה.
    הערה: טיטרט את הנגיף, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C בתוך שבוע אחד.

9. טיטרציה של נגיף AAV

הערה: תגובת שרשרת פולימראז כמותית TaqMan (qPCR) שימשה לטיטרציה של AAV מטוהר.

  1. יש לטפל בווקטורים AAV עם DNase I ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.
    הערה: כדוגמה לתגובה של 10 μL, נעשה שימוש בדגימת וירוס AAV של 2 μL, 1 μL DNase, מאגר DNase של 1 μL ו- 6 μL H2O. זה יכול להתבצע thermocycler עם צינורות PCR.
  2. הכינו את ערכות הפריימר המתמקדות באזור הוספת AAV.
    הערה: המטרות יכולות להיות המקדם, הטרנסגן והכתב במבנה AAV. הפריימרים מפורטים בטבלה 5.
  3. הכינו תקני פלסמיד DNA (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ו- 0.0001 pg/μL) ובקרה שלילית (H2O).
  4. הכינו את תערובת האב qPCR, כולל פריימרים, בהתאם להוראות היצרן.
  5. הניחו את התקנים והדגימות בשילוש על לוחית PCR. הוסף את תערובת qPCR לתקנים ולדגימות. אטמו את הצלחת ובצעו את תגובת ה-qPCR בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: תנאי התגובה תלויים בחומרים/ריאגנטים ובמכשיר. מחזורי PCR מהירים וקונבנציונליים ישימים.
  6. חישוב טיטר וירוס AAV.
    הערה: ריכוז הדגימה בפרוטוקול זה הוא דילול של 1/10 מהדגימות המקוריות.
  7. Aliquot וירוס AAV בצינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב 4 ° C עד חודש אחד לאחסן ב -80 ° C לטווח הארוך.
    הערה: הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה עבור האחסון. כאשר משתמשים בניסויי in vivo , אין להשתמש בהפשרה מעל פעמיים aliquots.

10. בקרת איכות של AAV

הערה: נגיפי AAV אופיינו לטוהר על ידי כתם כסף SDS-PAGE באמצעות ג'ל SDS-PAGE והוכתמו באמצעות ערכת צביעה מסחרית.

  1. Denature 3 x 109 vg של דגימת וירוס AAV עם מאגר Laemmli.
    הערה: השתמש בווירוס AAV הפניה כפקד. נעשה שימוש בקפסיד מלא לייחוס AAV6-CMV-GFP.
  2. טען את ה-AAV המפורק על ג'ל SDS-PAGE הדרגתי של 4%-20% והפעל במתח של 180 וולט למשך 50 דקות.
  3. מוציאים את הג'ל מצלחת האלקטרופורזה. מכתימים את הג'ל בערכת צביעה כסופה בהתאם להוראות היצרן.
  4. בדוק את חלבוני הקפסיד AAV VP1, VP2 ו- VP3.
    הערה: וירוס AAV טהור מכיל רק VP1, VP2 וחלבון קפסיד VP3. אם לא טהור, רצועות חלבון אחרות ייראו על הג'ל.
    הערה: מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של נגיפים רקומביננטיים רקומביננטיים מוכתמים שליליים בוצע כדי להעריך שלמות מורפולוגית ויחס מלא/ריק.
  5. הרימו רשת EM עם פינצטה והניחו על הספסל כשהצד המבריק של הרשת פונה כלפי מעלה.
  6. פיפט 5 μL של דגימת AAV על הרשת ולאפשר לה להתייבש על ידי אידוי.
    הערה: יש לדלל את ה-AAV במידת הצורך. 1012 vg / mL הוא titer ממוצע. זה עלול לקחת 30-60 דקות כדי לייבש את הרשת.
  7. לשטוף את הרשת על ידי pipetting, טיפה אחר טיפה, עם כ 200 μL של H2O על הרשת.
  8. הסר את עודפי המים על-ידי הנחת נייר כרומטוגרפיה אנכית ליד הרשת.
  9. Pipet 5 μL של 2% תמיסת אצטט Uranyl על הרשת. דוגרים במשך 5 דקות ומנדפים כאמור. הניחו לרשת להתייבש.
  10. דמיינו את חלקיקי ה-AAV תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (בהגדלה של פי 50,000). קפסידים נגיפיים בעלי גנום ויראלי יופיעו כמשושים לבנים הומוגניים, בעוד שקפסידים ריקים יופיעו כמשושים בעלי שפה לבנה אך מרכז כהה.
  11. ספור באופן אקראי לפחות 100 חלקיקים כדי לקבוע את האחוז המשוער של מלא לעומת . חלקיקי AAV ריקים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול מפורט זה, שלב אחר שלב, מודגמת פלטפורמה סטנדרטית לייצור וירוס AAV איכותי ואיכותי עם CF10 במסגרת מעבדת מחקר בקנה מידה גדול. בהשוואה לצלחות קונבנציונליות של תרביות תאים, CF10 מספק דרך נוחה לתרבית כמויות גדולות של תאים ולייצר וירוס AAV (איור 1). מספר תנאי תרבית נבדקו כדי לקבוע אם תאים בסביבה אופטימלית יכולים לקדם ייצור ויראלי. DMEM דל גלוקוז בתוספת HEPES של 10 mM ו- 2% FBS הראה את ייצור ה- AAV הטוב ביותר.

מספר פרוטוקולים נבדקו כדי לטהר AAVs. לרוב ההליכים יש תפוקת וירוסים נמוכה וטומאה של קפסידים AAV. כאן פותח פרוטוקול טיהור מתוקן, המשלב את ה-AAV הן מכדוריות התאים והן ממדיית התרבית (איור 2). מצאנו ש-80% מה-AAV היה בתאים, ועוד 20% מה-AAV היה בתרבית, שהופרשו מהתאים. שני חלקי AAV טופלו ב- DNase כדי להסיר את ה- DNA החופשי. נתרן דאוקסיכולאט שימש לשחרור נוסף של AAV מהתאים. לאחר מכן הופקו AAV עם מיצוי כלורופורם ואחריו חלוקה דו-פאזית מימית. צעדים אלה אפשרו להסיר את רוב מזהמי החלבון. AAV נשאר מסיס בשלב האמוניום גופרתי.

שאר המזהמים הוסרו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לא רציפה של יודיקסנול (איור 3A). השיפוע סייע גם בהסרת הקפסידים הריקים של AAV, במיוחד בסבב השני של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול.

טוהר נגיף ה-AAV נקבע על ידי כתמי כסף. כאשר התקבלו שלושה פסים עיקריים המתאימים לחלבון קפסיד AAV, VP1, VP2 ו-VP3, עם טוהר של יותר מ-90%, וירוס ה-AAV התאים לשימוש in vivo (איור 3B). TEM (איור 3C) ניגש ליחס הקפסיד המלא לקפסיד הריק של AAV (איור 3C). רק קפסיד מלא עם תוספת טרנסגן יאפשר ביטוי של טרנסגן ברקמת היעד. חלק גבוה של הקפסיד הריק יכול גם לגרום לתגובה חיסונית לקפסיד AAV. בדיקות איכות אלה נחוצות עבור כל וירוס AAV המיוצר ומטוהר לפני השימוש.

figure-results-1
איור 1: המחשה סכמטית של ייצור AAV על-ידי HEK293T תאים בשיטת טרנספקציה משולשת. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: המחשה סכמטית של טיהור AAV. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: טיהור AAV על-ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואימות טוהר נגיף AAV. (A) שכבות שיפוע יודיקסנול ומיקום המחט לקציר. (B) ג'ל מייצג להערכת תכולת הקפסיד וטוהרו. M: סמן מולקולרי; R: התייחסות AAV6 קפסיד מלא; S1: קפסיד AAVDJ תוצרת בית עם סיבוב אחד של אולטרה-צנטריפוגה; S2: קפסיד AAVDJ תוצרת בית עם שני סבבים של אולטרה-צנטריפוגה; S3: קפסיד AAV6 תוצרת בית. (C) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של AAV. וירוס שנאסף לאחר טיהור. קפסידים נגיפיים המכילים גנום ויראלי מופיעים כמשושים לבנים הומוגניים, בעוד שקפסידים ריקים מופיעים כמשושים בעלי שפה לבנה אך מרכז כהה. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מחשבון PEI עבור אריזות AAV. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: תרשים נפח גולמי AAV-PEG-סולפט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: הכנת שיפוע יודיקסנול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: הכנת שיפוע יודיקסנול סיבוב שני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 5: פריימרים לטיטרציה AAV. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: הרכבי המאגרים ששימשו למחקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, פרוטוקול מתקדם מבחינה טכנית לייצור בקנה מידה גדול של וקטורי AAV באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים (CF10) מוצג, המייצג שיפור משמעותי לעומת שיטות צלחת תרבית תאים קונבנציונליות. השימוש במפעלי תאים מפשט את תהליך טיפוח כמויות גדולות של תאים, ומקל על ייצור נגיפי AAV בצורה יעילה יותר1. כמו כן, על ידי אופטימיזציה של תנאי התרבית, במיוחד עם DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10 mM HEPES ו 2% FBS, ייצור ויראלי משופר באופן משמעותי אושר, המציין את התפקיד המכריע של הסביבה התאית בתפוקת הנגיף.

פרוטוקול הטיהור המתוקן, המשלב AAV הן מכדורי תאים והן ממדיות תרבית, מטפל בבעיה הנפוצה של תפוקת וירוסים נמוכה וטומאה הנראית בפרוטוקולים קיימים רבים. השלבים של מיצוי כלורופורם וחלוקה דו-פאזית מימית מסירים ביעילות את רוב מזהמי החלבון, כאשר AAV נשאר מסיס בשלב האמוניום גופרתי. ניתן לייחס את השיפור הן בתפוקה והן בטוהר של וקטורי AAV באמצעות חלוקה דו-פאזית PEG/מימית בשילוב עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול, בניגוד לשיטות אולטרה-צנטריפוגות מסורתיות של שיפוע, להפרדה ראשונית משופרת עם חלוקה דו-פאזית PEG/מימית, טוהר מזוקק עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול והפחתה בטיהור משותף של מזהמים12. ראשית, הכנסת חלוקה דו-פאזית PEG/מימית לפני אולטרה-צנטריפוגה משפרת באופן משמעותי את ההפרדה הראשונית של חלקיקי AAV מפסולת תאית ומזהמים אחרים. PEG, פולימר בעל משקל מולקולרי גבוה, כאשר הוא מעורבב עם תמיסה מימית, יוצר שני שלבים נפרדים13. לווקטורים AAV יש נטייה להתחלק באופן מועדף לאחד השלבים הללו (בדרך כלל השלב העשיר ב-PEG), בעוד שמזהמים וזיהומים רבים מחולקיםל-13 האחרים. חלוקה סלקטיבית זו מרכזת ביעילות את חלקיקי ה-AAV ומסירה חלק ניכר מהזיהומים עוד לפני האולטרה-צנטריפוגה, ובכך מגדילה את התפוקה ומפחיתה את עומס המזהמים הנכנס לשלב13 של האולטרה-צנטריפוגה. שנית, אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול מעדנת עוד יותר את הטוהר של וקטורי AAV. יודיקסנול, תווך שיפוע איזו-אוסמולרי לא יוני, מאפשר הפרדה עדינה ומבוקרת יותר בהשוואה לשיפועי CsCl מסורתיים14. בשיפוע זה, חלקיקי AAV נודדים למיקום בשיפוע המתאים לצפיפות הציפה שלהם14. חשוב לציין, תהליך זה יעיל בהפרדת קפסידים AAV מלאים (המכילים את המטען הגנטי) מקפסידים ריקים (חסרי חומר גנטי), שהוא גורם מכריע באיכות הווקטור. אופיו האיזו-אוסמולרי של יודיקסנול גם שומר על שלמות הקפסידים AAV טוב יותר מאשר סוכנים היפראוסמולרים כמו CsCl, מה שעשוי להוביל לתפוקה גבוהה יותר של וקטורים שלמים ופונקציונליים14. לבסוף, שיטות אולטרה-צנטריפוגות מסורתיות, במיוחד אלה המשתמשות בשיפועי CsCl, יכולות לפעמים לטהר במשותף מזהמים בעלי צפיפות ציפה דומה לווקטורים AAV15. על ידי שימוש במחיצות PEG כשלב מקדים, העומס של מזהמים כאלה מופחת באופן משמעותי לפני אולטרה-צנטריפוגה13. הפחתה זו בעומס המזהמים פירושה ששיפוע היודיקסנול יכול לעבוד בצורה יעילה וסלקטיבית יותר בטיהור וקטורי AAV, מה שמוביל לטוהר גבוה יותר15.

הטוהר והאיכות של וקטורי AAV מוערכים בקפדנות באמצעות צביעת כסף ו- TEM11. התצפית של שלושה פסים עיקריים המתאימים לחלבוני קפסיד AAV VP1, VP2 ו- VP3, עם טוהר העולה על 90%, מצביעה על התאמתם של וקטורי AAV אלה לשימוש in vivo . ניתוח TEM לקביעת יחס קפסיד מלא לריק הוא חיוני במיוחד, שכן שיעור גבוה של קפסידים ריקים יכול להוביל ליעילות מופחתת של העברת גנים ולתגובות חיסוניות פוטנציאליות11. בדיקת איכות זו, למרות שהיא חיונית, מוסיפה למורכבות הפרוצדורלית ועשויה לדרוש מומחיות טכנית נוספת.

לסיכום, הפרוטוקול מציע התקדמות טכנית משמעותית בייצור וקטורים AAV, במיוחד במונחים של מדרגיות וטוהר. עם זאת, המורכבויות הקשורות לתהליך הטיהור והצורך בציוד ומומחיות מיוחדים עשויים עדיין להוות מגבלה קלה ליישומו במסגרות מחקר מסוימות. חידוד נוסף ופישוט של טכניקות אלה יכול להפוך גישה זו לנגישה יותר וישימה באופן נרחב בתחום המחקר של ריפוי גנטי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TZ תכנן את הניסויים. TZ, VD, SB ו-JP ביצעו את הניסויים. TZ ו-VD הפיקו נתונים וניתחו את הנתונים. TZ ו-YX כתבו את כתב היד. TZ ו-GG תיקנו את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים לילדים UPMC בפיטסבורג.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
293T/17 תאיםATTCCRL-11268
0.5 מ' EDTAMilliporeSigma324506-100 מ"ל
1 מ"ל מזרק Henke-Jectפישר סיינטיפיק14-817-211
10% תמיסה פלורונית F68פישר סיינטיפיק24-040-032
10x Tris/Glycine/SDS BufferBiorad1610732
1M HEPESפישר סיינטיפיק15-630-080
2% תמיסת אורניל אצטטמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית22400-2
4%– 20% ג'ל חלבון טרומייםbiorad4561094
תמיסת 40% PEGSigmaP1458-50ML
AAV6 התייחסות לקפסידים מלאים מעבדותנהר צ'ארלסRS-AAV6-FL
פתרון ניתוק תאים AccutaseFisher ScientificA6964-100ML
BenzonaseSigmaE1014-25KU
תרבית תאים BioLite כלים מטופלים 150 מ"מפישר סיינטיפיק12-556-003
יחידת סינון צנטריפוגליMilliporeSigmaUFC905024
קורנינג  מסנני מזרק PESפישר סיינטיפיק09-754-29
קלטות דיאליזה, 10 K MWCOFisher ScientificPI66810
יחידות מסנן PES חד פעמיות 1 ליטר 0.2 ומיקרו; mFisher ScientificFB12566506
יחידות סינון PES חד פעמיות 1 ליטר 0.45 ומיקרו; mFisher ScientificFB12566507
יחידות סינון PES חד פעמיות 500 מ"ל 0.2 ומיקרו; mפישר סיינטיפיקFB12566504
DMEM גלוקוז גבוהפישר סיינטיפיק10-569-044
DMEM גלוקוז נמוךפישר סיינטיפיק10567022
DNaseNEBM0303S
DPBS 1xפישר סיינטיפיק14-190-250
סרום בובין עוברי (FBS)BiowestS1620
Formvar/Carbon 300 Mesh, CuElectron Microscopy SciencesFCF300-Cu-50
גליצרולSigmaG5516-1L
KClSigmaP9541-500G
LB אגרסיגמאL2897-250G
מרק LBפישר סיינטיפיקBP9732-500
MgCL2· 6H2OSigmaM9272-100G
NEB תאים מוכשרים יציביםNEBC3040H
Nest Biofactory 10 חדריםMidSci771302
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel740424
Opti-MEMFisher Scientific31-985-088
OptiPrep צפיפות שיפוע בינוניMillipore SigmaD1556-250 מ"ל
pAAV-CMV-GFPAddgene105530
pAAV-DJCell BioLabVPK-420-DJ
pAAV-RC6Cell BioLabVPK-426
pAdDeltaF6Addgene112867
PEG 8000PromegaV3011
PEI MaxPolysciences, Inc49553-93-7
Pen-StrepFisher Scientific15-140-163
פנול אדוםMillipore Sigma1.07242.0100
ערכת כתמי כסף פירסתרמו פישר סיינטיפיק24612
צינור QuickSealFisher ScientificNC9144589
נתרן כלוריסיגמא1162245000
נתרן דאוקסיכולאט Millipore SigmaD6750-100G
Taqman מהיר מתקדם מאסטר מיקסתרמו פישר מדעי4444557
סוג 70 Ti רוטור טיטניום זווית קבועהבקמן קולטר337922
מצע ספיגה מערביתThermoFisher ברקוד 32209

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
  2. Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy. Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).
  3. Bilal, A. S., et al. Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production. Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).
  4. Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene. Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).
  5. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  6. Challis, R. C., et al. Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).
  7. Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14(2012).
  8. Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration. Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).
  9. Berns, K. I., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases. Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).
  10. Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).
  11. Chen, H. Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy. Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).
  12. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  13. Kato, M., et al. In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects. Commun Biol. 6 (1), 508(2023).
  14. Sena-Esteves, M., Gao, G. Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638(2020).
  15. Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient. Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AAV VectorsCell Factory PlatformHigh Titer ProductionHEK293T CellsIodixanol GradientPolyethylene Glycol PurificationSDS PAGE AnalysisTransmission Electron MicroscopyViral PurityGene Therapy

מאמרים קשורים