מאמר שיטה

שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

28 ביוני 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

תקציר

תעתיק תא בודד חולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה התאית של גוף האדם. תרביות אורגנואידים אנושיות חדישות במעי דק מספקות מערכות מודל ex vivo המגשרות על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מחקרים קליניים. היישום של תעתיק תא בודד למודלים של אורגנואידים במעי אנושי (HIO) חושף ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא היו מוכרים עד כה. פלטפורמות השעתוק המתקדמות של תא בודד משתמשות בחלוקה מיקרופלואידית וברקוד כדי ליצור ספריות cDNA. cDNA ברקודים אלה ניתנים לריצוף בקלות על ידי פלטפורמות ריצוף של הדור הבא ומשמשים כלי הדמיה שונים ליצירת מפות. במאמר זה אנו מתארים שיטות לתרבית ולהבחנה בין HIOs אנושיים במעי דק בפורמטים ונהלים שונים לבידוד תאים בני קיימא מתבניות אלה המתאימות לשימוש בפלטפורמות פרופיל שעתוק של תא יחיד. פרוטוקולים ונהלים אלה מאפשרים שימוש ב- HIOs של המעי הדק כדי להשיג הבנה מוגברת של התגובה התאית של אפיתל המעי האנושי ברמת השעתוק בהקשר של מגוון סביבות שונות.

מבוא

לאפיתל המעי הדק שני אזורים נפרדים: הקריפטה המאחסנת את תאי גזע המעי (ISC) והווילוס המורכב מתאים ממוינים של השושלות המפרישות והספיגה. למורכבות זו מתווספת הספציפיות האזורית של האפיתל המספקת תכונות פונקציונליות ייחודיות בין אזורי המעי הדק. עבודה חלוצית קבעה תנאי תרבית שבהם ניתן ליצור הן את קריפטת המעי הדק האנושית והן את אזורי הווילוס ex vivo מרקמות כירורגיות או ביופסיות רקמות1. תרביות אלה מגשרות על הפער בין מחקרים בבעלי חיים לבין ניסויים קליניים וחושפות ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא הוכרו עד כה. ה-HIOs מופצים כמבנים כדוריים תלת-ממדיים באמצעות מדיה עם גורמי גדילה המקדמים את יכולת הקיום של תאי גזע ומטריצות תמיכה חוץ-תאיות. תנאים אלה יוצרים מודל HIO דמוי קריפטה המורכב בעיקר מאבות ותאי גזע. הסרת גורמי הגדילה מקדמת התמיינות ISC (מודל דמוי וילוס) וייצור תאי אפיתל מעיים בוגרים (גביע, אנטרואנדוקריני, ציצית, אנטרוציט) ביחסים מתאימים יחד עם התרבות והתמיינות תאים, קיטוב, שלמות המחסום, מאפיינים ספציפיים אזוריים ותגובות פיזיולוגיות מתאימות2. תרביות HIO יציבות גנטית וניתן להפיץ אותן ללא הגבלת זמן במצבן דמוי הקריפטה. גישה נוחה למשטח האפי של תרבויות אלה מסופקת על ידי תנאי תרבות המאפשרים צמיחה בפורמט חד-שכבתי3. HIOs מאפשרים גם לכלול בניתוחים ביולוגיים שיקולים של שונות הפרט המארח כגון גנטיקה, גיל, מין, מוצא אתני וסטטוס המחלה. כלי הערכה אנליטיים ופונקציונליים זהים לאלה המשמשים בגישות המתמקדות בקווי תאים מותמרים וכוללים מגוון טכניקות מולקולריות כגון ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה, תעתוק, פרוטאומיקה ומטבולומיקה.

תעתיק תא בודד מחולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה והפיזיולוגיה של המעי הדק על ידי מתן תובנה לגבי התרומות האינדיבידואליות של כל סוג תא לתהליך ביולוגי. עבודה חלוצית באמצעות טכנולוגיה זו סיפקה נוף של סוגי התאים הקיימים במעי האנושי המקומי 4,5,6. פלטפורמות פרופיל שעתוק של תא בודד מאפשרות לחקור את נוף השעתוק של תאים בודדים, ומאפשרות להטרוגניות התא להגיע לחזית המחקר המדעי. בכמה פלטפורמות פרופיל שעתוק של תא בודד, מחיצות מיקרופלואידיות וברקוד משמשים ליצירת ספריות cDNA מ-mRNA פוליאדנילציה תאית, המתקבלות מעד 10,000 תאים לדגימה. על פלטפורמה זו, טיפות המכילות תאים בודדים, אוליגונוקלאוטידים ברקודים, ריאגנטים של שעתוק לאחור ושמן יוצרים שלפוחית תגובה שגורמת לכל cDNA מתא בודד להיות באותו ברקוד. לאחר מכן ניתן לרצף ביעילות את cDNA המקודד באמצעות ריצוף הדור הבא. ניתן לטפל בנתונים שנוצרו באמצעות תוכנה וכלי ויזואליזציה, הממירים את הרצפים המקודדים למפות ויזואליזציה ולפרופילי שעתוק של תא בודד. ניתן לזהות אוכלוסיות תאים באמצעות מאגרי מידע זמינים לציבור של אפיתל המעי הדק האנושי 4,5,6. למרות שמחקרים רבים השתמשו בפלטפורמה זו כדי לחקור אורגנואידים במעי מורין ברמת התא הבודד, הניתוח של תגובות שעתוק של תא בודד של HIOs פיגר מאחורי 7,8,9,10,11,12.

כאן, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב לבידוד תאים בני קיימא מתאי HIO של מעי דק לצורך עיבוד בפלטפורמות פרופיל של תא בודד (איור 1). אנו מספקים הנחיות לגידול ובידול יחד עם רכיבי מדיה שהותאמו לבידול אפיתל. אנו מתארים שיטות שחזור תאים עבור שלושה פורמטים שונים של תרביות: תרביות תלת ממדיות (3D) וחד-שכבתיות על פלסטיק או על תוספות תרבית תאים ממברנה. אנו מספקים נתוני אשכולות לדוגמה המתקבלים באמצעות תוכנת קוד פתוח כדי לגזור גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בכל אשכול.

פרוטוקול

קווי האורגנואידים המשמשים כאן התקבלו מהמרכז הרפואי למחלות עיכול של טקסס GEMS Core. בקצרה, כדי להקים בתחילה קווי אורגנואידים, דגימות רקמת התורם נשטפו ועוכלו אנזימטית כדי לשחרר את קריפטים המעי. הקריפטות הוטמעו בקרום מרתף ותורבתו בתווך. ועדת הביקורת המוסדית במכללת ביילור לרפואה אישרה את פרוטוקול המחקר לקבלת דגימות רקמה שמהן נקבעו קווי אורגנואידים, והתקבלה הסכמה מדעת מכל התורמים לקבוע קווי אורגנואידים מהרקמה שנתרמה.

1. העברת HIOs תלת ממדיים להתרחבות לצורך בידול

  1. הסר והשלך מדיום מבארות אורגנואידים הגדלים בצלחות של 24 בארות (סביב קרום המרתף המוצק) עם פיפט P1000. הוסף 300 μL של 0.05% Trypsin-EDTA לבאר ולפרק באופן מכני אורגנואידים על ידי pipetting עם צינור P1000 למעלה ולמטה 5x.
  2. דגירה על צלחת ב 37 ° C במשך 4 דקות. הוסף 500 μL של מדיה שלמה ללא גורמי גדילה (CMGF - בינוני) עם 10% FBS לכל באר (טבלה 1). השתמשו בפיפט P1000 ופיפט CMGF בינוני ובתערובת HIO, פי 10 הלוך ושוב בבאר. מעבירים את כל עוצמת הקול לצינור של 15 מ"ל. שלב מעבר מבארות מרובות לתוך אותו צינור 15 מ"ל. אין לשלב יותר מ -10 בארות לכל צינור.
  3. סובב תאים כלפי מטה ב- 4 ° C באמצעות צנטריפוגת רוטור נדנדה ב- 100 x גרם למשך 5 דקות. הסר את כל המדיום, שמירה על הגלולה בתחתית הצינור. שמור את הצינור על קרח.
  4. חשב את כמות קרום המרתף הדרוש למספר ציפוי HIO, והשהה מחדש את גלולת HIO ב 30 μL / באר של קרום המרתף באמצעות קצות פיפט P200 קרים. פיפטה תערובת קרום מרתף HIO כטיפה למרכז צלחת 24 בארות באמצעות קצוות פיפט P200 קרים.
  5. מעבירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תן לקרום המרתף להתמצק למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן הוסף 500 μL של מדיום שלם בטמפרטורת החדר המכיל WNT, R-spondin, noggin, EGF ומעכב ROCK (WRNE+Y; טבלה 1) לכל באר ותרבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. רענן את התרבות עם WRNE+Y פעם ביומיים במשך 7 ימים.
    הערה: HIO בריא יהיה ציסטי בצורתו עם אפיתל ניצני מבריק (איור 2). תאים באמצע הציסטה לא ניתן לדמיין. HIO לא בריא ייראה משעמם ובעל אפיתל עבה עם אמצע מוצק. המאפיין החשוב ביותר הוא המראה המבריק.

2. בידול HIO: פורמט תלת מימד

  1. השתמש באר אחת של HIOs 3D עבור 3 בארות של HIOs מובחנים 3D 1 שבוע לאחר תרבית.
  2. הסר מדיה מבארות. פזרו את קרום המרתף ואת ה-HIOs באמצעות צינור P1000 והוסיפו 500 מיקרוליטר קר של CMGF לכל באר וצינור למעלה ולמטה לפחות פי 5. סובב HIOs ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגת רוטור נדנדה ב 100 x גרם במשך 5 דקות. מוציאים את כל המדיום ושומרים את הגלולה בתחתית הצינור.
  3. הוסף 30 μL של קרום מרתף לכל באר של HIOs להיות מצופה. פיפטה טיפת 30 μL של קרום מרתף עם HIOs לתוך באר של צלחת 24 באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות. הוסף 500 μL של מדיה מסוג WRNE+Y/Diff (50/50).
  4. החליפו את המדיום למדיום בידול לאחר 24 שעות למשך 3 ימים נוספים, רעננו את המדיום אחת ליומיים. הכינו 3 בארות לכל דגימה לאיגום כדי להפחית את השונות הטכנית.

3. בידול HIO: פורמט מונושכבתי

  1. מצפים את תרבית תאי הממברנה או בארות של צלחת 96 בארות עם 100 μL / באר של קולגן שליה אנושי IV (1mg / ml ב 100mM חומצה אצטית) מדולל קר H2O (1: 30). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1.5 שעות לפחות או מקסימום למשך הלילה. להכנסת תרבית תאי ממברנה, הוסיפו H2O סטרילי בחלל הצלחת כדי ללחלח את הצלחת; עבור צלחת 96 בארות, להוסיף סטרילי H2O בארות שאינן בשימוש.
  2. אספו HIOs תלת-ממדיים שגודלו בתרבית ב-WRNE במשך 7 ימים על ידי הסרת המדיה ושחזור קרום המרתף והתאים על ידי הוספת 500 μL/well של 0.5 mM EDTA קר (0.5 M EDTA מדולל 1:1000 ב-PBS סטרילי). השתמש בפיפט P1000 כדי לצנרת אורגנואידים ותמיסה למעלה ולמטה פי 5 ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 15 מ"ל. אין לארוז יותר מ-10 בארות אורגנואידים לכל צינור. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם ברוטור דלי מתנדנד ב 4 ° C.
    הערה: כדי להכין 3 בארות על צלחת של 96 בארות, השתמש בבאר אחת של HIO תלת מימדי. כדי להכין תוספת תרבית תאי ממברנה אחת, השתמש בבאר אחת של HIOs תלת ממדיים (צפיפות הזריעה של תאים בודדים היא בערך 1-2 x 105 תאים / באר עבור צלחת 96 באר, 2.5-3 x 105 תאים / באר עבור תוספת תרבית תאי ממברנה).
  3. הסר 500 μL של מדיה, משאיר את הגלולה בתחתית הצינור. נתק את HIOs על ידי הוספת 500 μL של 0.05% טריפסין/0.5 mM EDTA ודגרה במשך 4-5 דקות ב 37 ° C. פיפטה נמרצת למעלה ולמטה עבור ~ 50x באמצעות P1000. הימנע יצירת בועות על ידי pipeting על הצד של הצינור.
  4. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל של CMGF המכיל 10% FBS. סנן גושים גדולים של תאים לא מעוכלים על ידי הרטבת מסננת תאים של 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של CMGF - המכיל 10% FBS והוספת התאים לחלק העליון של מסננת התא. השתמשו בכוח הכבידה כדי לאפשר לתאים לעבור דרך המסננת והשליכו את מסננת התאים המכילה גושי תאים.
  5. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר.
  6. הוציאו את הנוזל מתרבית תאי הממברנה המצופה בקולגן או מהצלחת בעלת 96 הקידוחים. יש להשהות מחדש את גלולת HIO ב-100 μL/well של WRNE המכילה 10 μM Y-27632, ולאחר מכן פיפטה לתוך התא העליון של תרבית תאי הממברנה או לתוך צלחת 96 בארות. להחדרת תרבית תאי ממברנה, יש להוסיף 600 μL של WRNE המכיל 10 μM Y-27632 לתא התחתון של הבאר.
  7. הסר את המדיום לאחר 24 שעות הן מהחלק העליון והן מהחלק התחתון של תרבית תאי הממברנה או מהצלחת 96 בארות והחלף במדיום התמיינות למשך 5 ימים. הכינו 3 בארות לכל דגימה לאיגום כדי להפחית את השונות הטכנית.

4. הכנת מתלים של תא בודד מ- HIOs תלת ממדיים ממוינים עבור תעתיק תא בודד

  1. יש להניח מגיב עיכול תאים אנזימטי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO2 כדי להפשיר ולחמם 30 דקות לפני תחילת העיכול של HIO תלת-ממדי. בדוק את HIOs באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ב 10x כדי להבטיח את בריאות התא.
  2. הסר את המדיה מהבארות והוסף 500 μL של תמיסת שחזור תאים קרים לבארות. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשחרר את התאים מקרום המרתף באמצעות פיפטה P1000 וקצוות פיפטה סטנדרטיים. העבר את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: השימוש בבארות משוכפלות מבטיח מספרי תאים נאותים ומפחית את השונות בין באר לבאר. אין לשלב בארות לפני שלב 4.7 להלן.
  3. לדגור על צינורות התאים על קרח במשך 10 דקות, pipeting למעלה ולמטה כל 5 דקות. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x גרם ב 4 ° C.
  4. הסר את הנוזל מן הצינור, בזהירות לא להפריע את כדור התא. להשהות מחדש את התאים ב 500 μL של מגיב עיכול תאים אנזימטי שחומם מראש. פיפטה למעלה ולמטה עם P1000 לפחות פי 10.
  5. לדגור את HIOs במשך 30 דקות ב 37 ° C באינקובטור CO2 . כל 10 דקות, פיפטה את כל נפח 10x באמצעות פיפטה P1000 כדי לעזור לנתק את התאים. הימנעו מהחדרת בועות אוויר לתרחיף התא.
  6. גלולה את התאים במשך 3 דקות ב 400 x גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיה התמיינות ולאחסן על קרח.
    הערה: מנקודה זו ואילך, HIOs חייבים תמיד להישמר על קרח.
  7. פיפטה את התאים למעלה ולמטה פי 50 במהירות באמצעות P1000 כדי להבטיח HIOs מנותקים לתאים בודדים. היזהר לא להציג בועות אוויר בשלב זה, כפי שהוא יגרום אובדן תאים.
  8. סנן את כל עוצמת הקול דרך מסננת קצה של 70 מיקרומטר באמצעות קצה פיפטה P1000. השתמש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל כדי לאסוף את הפולט.
    הערה: קצה המסנן לא ייסתם אם זמן העיכול מספיק. השתמש בעצות מסנן מרובות אם המסנן נסתם; אל תכפה את עוצמת הקול דרך המסנן.
  9. חזור על שלב 4.8 עם מסננת קצה 40 מיקרומטר. אחסנו דוגמאות על קרח.
  10. ספירת תאים בודדים קיימא על תא ספירת תאים באמצעות הרחקת כחול טריפאן על ידי הוספת 5 μL של 0.4% כחול טריפאן ל 5 μL של השעיית תאים. יש לדלל את הדגימה לפי הצורך ל-1000 תאים/μL. אם צפיפות התא נמוכה מ-1000 תאים/μL, תאי גלולה למשך 2 דקות ב-400 x גרם ב-4°C, הסירו את המדיה המקורית והשהו מחדש במדיית תרבית תאים. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 5 x 105-1 x 106 תאים.
    הערה: הכנת תרחיף באיכות גבוהה (90% תאים בני קיימא ו-90% תאים בודדים) חיונית לנתונים באיכות גבוהה של תא בודד. עם זאת, הניסיון מצביע על כדאיות נמוכה של עד 75% שניתן לקבל במקרים בהם טיפול, כגון זיהום או יישום מולקולות קטנות, משפיע על הכדאיות.
  11. הכן ספריות DNA עבור פלטפורמות פרופיל שעתוק של תא בודד בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. עבד את הנתונים בהתאם לפרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לניתוח נתוני scRNAseq13,14.

5. הכנת תרחיפים חד-תאיים מ-HIOs ממוינים על גבי תרבית תאי ממברנה

  1. יש להניח מגיב עיכול תאים אנזימטי בטמפרטורה של 37°C באינקובטורCO2 כדי להפשיר ולחמם 30 דקות לפני תחילת העיכול של תרבית תאי HIO membrane. חלק את מגיב העיכול האנזימטי האנזימטי שחומם מראש ל -200 μL aliquots בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, צינור אחד לכל תוספת תרבית תאים ממברנה. שמור את הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לשימוש.
  2. הכן PBS-EDTA על ידי הוספת 5 μL של 0.5 M EDTA ל- 5 מ"ל PBS. Aliquot 500 μL של PBS-EDTA לתוך צלחת 24 באר, 1 באר לכל תרבית תא ממברנה להוסיף.
  3. שטפו את התאים עם PBS-EDTA: העבירו את תרבית תאי הממברנה מבארות המכילות מצע גידול לבארות המכילות PBS-EDTA. הסר את מדיית תרבית התאים מהצד האפי והחלף אותה ב- 100 μL של PBS-EDTA. היזהר לא להפריע לשכבת התא.
  4. יש להשליך מיד את ה-PBS-EDTA שנוסף לצד האפי של תרבית תאי הממברנה. הסר את תרבית תאי הממברנה מהכנס מן הבאר, כתם אותו על ידי נגיעה עדינה בקצה מגבת נייר, ולאחר מכן להפוך אותו על הספסל. השתמש בלהב אזמל חד כדי להסיר את הקרום מהחדרה על ידי חיתוך סביב ההיקף הפנימי של הממברנה. יש לפעול במהירות למניעת התייבשות.
  5. השתמש במלקחיים כדי להעביר את הממברנה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל שחומם מראש מלא בריאגנט עיכול תאים אנזימטי וודא שהממברנה שקועה לחלוטין. חזור על הפעולה עבור כל התוספות הנוספות של תרבית תאי ממברנה.
    הערה: הגדלת נפח מגיב העיכול האנזימטי של התאים ל-500 מיקרוליטר עשויה לסייע בניתוק חד-שכבות צפופות.
  6. נתק את התאים על ידי דגירה צינורות עם ממברנות ב 37 ° C באינקובטור CO2 . מערבבים בעדינות את כל הנפח 5x עם פיפטה של 200 μL כל 10 דקות למשך 30 דקות בסך הכל. הימנעו מבועות ויניקה של הממברנה כדי לשמר את הכדאיות.
  7. העבר aliquot קטן של תאים (1-2 μL) לשקופית זכוכית כל 10 דקות כדי להעריך דיסוציאציה על ידי הערכה איכותית של אחוז תאים בודדים. זה עשוי לקחת עד 50 דקות עם פיפטינג נוסף כדי להשיג 80%-90% תאים בודדים, בהתאם לסוג HIO. גרדו בעדינות את הממברנה עם קצה פיפטה במהלך שלבי הערבוב כדי לעודד דיסוציאציה, במיוחד עבור תאים קשים לניתוק, אולם גירוד עלול להשפיע על הכדאיות.
  8. שלב 3 בארות משוכפלות לכל מצב בצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מ"ל (600 מיקרוליטר בסך הכל). הוסף 400 μL של מדיה תרבית תאים (diff) + 10 μM ROCKi (1 מ"ל נפח כולל). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.
    הערה: השימוש בבארות משוכפלות מבטיח מספרי תאים נאותים ומפחית את השונות בין באר לבאר. יש לאגד בארות בשלב זה.
  9. סננו את כל עוצמת הקול דרך מסננת קצה של 70 מיקרומטר באמצעות קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל. אספו את הזרימה בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: קצה המסנן לא ייסתם אם זמן העיכול מספיק. השתמש בעצות מסנן מרובות אם המסנן נסתם; אין להעביר את עוצמת הקול בכוח.
  10. חזור על שלב 5.9 עם מסננת קצה 40 מיקרומטר. אחסנו דוגמאות על קרח.
  11. ספירת תאים בודדים קיימא על תא ספירת תאים באמצעות הרחקת כחול טריפאן על ידי הוספת 5 μL של 0.4% כחול טריפאן ל 5 μL של השעיית תאים. יש לדלל דגימה לפי הצורך ל-1000 תאים/μL. אם צפיפות התא נמוכה מ- 1000 תאים/ μL, סובב 2 דקות ב- 400 x g ב- 4 °C כדי לגלגל את התאים, להסיר את המדיה המקורית ולהשהות מחדש ב- WRNE+Y בצפיפות התא הרצויה. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 4 x 105 - 6 x 105 תאים.
    הערה: הכנת תרחיף באיכות גבוהה (90% תאים בני קיימא ו-90% תאים בודדים) חיונית לנתונים באיכות גבוהה של תא בודד. עם זאת, הניסיון מצביע על כדאיות נמוכה של עד 75% שניתן לקבל במקרים בהם טיפול, כגון זיהום או יישום מולקולות קטנות, משפיע על הכדאיות.
  12. הכן ספריות DNA עבור פלטפורמות פרופיל השעתוק של תא בודד בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. עבד את הנתונים בהתאם לפרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לניתוח נתוני scRNAseq13,14.

6. הכנת מתלים חד-תאיים מ-HIOs המתמיינים כחד-שכבות של 96 בארות

  1. יש להניח מגיב עיכול תאים אנזימטי בטמפרטורה של 37°C באינקובטורCO2 כדי להפשיר ולחמם 30 דקות לפני תחילת העיכול החד-שכבתי של HIO.
  2. הכן PBS-EDTA על ידי הוספת 5 μL של 0.5 M EDTA ל- 5 מ"ל PBS. השליכו את מדיית תרבית התאים מהצלחת בעלת 96 הקידוחים והחליפו אותה ב-100 μL של PBS-EDTA. היזהר לא להפריע לשכבת התא.
  3. נתק את התאים: השליך את PBS-EDTA והוסף 100 μL של מגיב עיכול תאים אנזימטי חם לכל באר. מניחים את הצלחת בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO2 ומערבבים בעדינות את כל הנפח פי 5 עם קצה פיפטה של 200 μL כל 10 דקות למשך 20-30 דקות. הימנעו מבועות כדי לשמור על כדאיות.
    הערה: הגדלת נפח מגיב העיכול האנזימטי של תאים ל-500 מיקרוליטר עשויה לסייע בניתוק חד-שכבות צפופות.
  4. העבר aliquot קטן של תאים (1-2 μL) לשקופית זכוכית כל 10 דקות כדי להעריך דיסוציאציה. ייתכן שיחלפו עד 50 דקות כדי להשיג 80%-90% תאים בודדים, בהתאם לסוג HIO. גרדו בעדינות את הצלחת עם קצה פיפטה במהלך שלבי הערבוב כדי לעודד דיסוציאציה, במיוחד עבור תאים קשים לנתק; עם זאת, גירוד עשוי להשפיע על הכדאיות.
  5. שלב 3 בארות משוכפלות לכל מצב בצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מ"ל (300 מיקרוליטר בסך הכל). הוסף 700 μL של מדיה תרבית תאים (diff) + 10 uM ROCKi (1 מ"ל נפח כולל). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.
    הערה: השימוש בבארות שגדלו בהעתקה מבטיח מספרי תאים נאותים ומפחית את השונות בין באר לבאר.
  6. סננו את כל עוצמת הקול דרך מסננת קצה של 70 מיקרומטר באמצעות קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל. אספו את הזרימה בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: קצה המסנן לא ייסתם אם זמן העיכול של מגיב עיכול תאים אנזימטי מספיק. השתמש בעצות מסנן מרובות אם המסנן נסתם; אין להעביר את עוצמת הקול בכוח.
  7. חזור על שלב 6.6 עם מסננת קצה של 40 מיקרומטר. אחסנו דוגמאות על קרח.
  8. ספירת תאים בודדים קיימא על תא ספירת תאים באמצעות הרחקת כחול טריפאן על ידי הוספת 5 μL של 0.4% כחול טריפאן ל 5 μL של השעיית תאים. לדלל לפי הצורך עד 1000 תאים/μL. אם צפיפות התא נמוכה מ- 1000 תאים/μL, יש לסובב 2 דקות ב- 400 x g 4 °C כדי להניף את התאים, להסיר את המדיה המקורית ולהשהות מחדש במדיה של תרבית תאים + ROCKi בצפיפות התא הרצויה. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 2 x 105 - 6 x 105 תאים.
    הערה: הכנת תרחיף באיכות גבוהה (90% תאים בני קיימא ו-90% תאים בודדים) חיונית לנתונים באיכות גבוהה של תא בודד. עם זאת, הניסיון מצביע על כדאיות נמוכה של עד 75% שניתן לקבל במקרים בהם טיפול, כגון זיהום או יישום מולקולות קטנות, משפיע על הכדאיות.
  9. הכן ספריות DNA בהתאם לפרוטוקולים של יצרן פלטפורמת השעתוק התא הבודד. עבד את הנתונים בהתאם לפרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לניתוח נתוני scRNAseq13,14.

תוצאות

מתלים חד-תאיים אוחדו מ-2-3 בארות של תרבית תאים ממברנה, חד-שכבתית ותלת-ממדית HIOs כדי להבטיח תפוקת תאים מספקת ולהפחית את השונות בין תאים לבאר. ספריות תאים בודדים הוכנו באמצעות ריאגנטים ספציפיים לפלטפורמת פרופיל התא הבודד. ורצף עם קריאות קצה מזווג בפלטפורמת ריצוף של הדור הבא, 30,000 קריאות לתא. הקריאות מופו, נספרו ונותחו באמצעות כלים אנליטיים לגנומיקה של תא בודד. תאים באיכות נמוכה עם יותר מ -20% קריאה מיטוכונדריאלית, או פחות מ -200 גנים שנספרו הוצאו מהניתוח. כדי להעריך את איכות התאים שרטטנו את מספר הגנים, ה-UMI ואחוז הקריאות במיטוכונדריה בכל תא (איור 3); תאים באיכות גבוהה מכילים כ-3500 גנים, 15,000 UMI ו-10% קריאות מיטוכונדריאליות. לאחר הסינון, השגנו 4000 עד 9500 תאים בודדים בהתאם לפורמט הגידול של HIO. אשכולות לא מפוקחים והפחתת ממד UMAP זיהו צבירים נפרדים המייצגים סוגי תאים צפויים, כולל אנטרוציטים סופגים ותאים מפרישים (איור 4).

figure-results-1
איור 1: מתווה שלבי הפרוטוקול. סכמות המתארות את השלבים העיקריים בציפוי HIOs בתבניות שונות לזרימת עבודה של נתונים של תא יחיד. תמונה זו נוצרה באמצעות Biorender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות שדה בהיר. HIOs מוכנים לעיבוד צולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 5. משמאל, אורגנואידים תלת-ממדיים; צלחת אמצעית, 96 בארות; נכון, טרנסוול. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: בקרת איכות של נתונים. מדדים לדוגמה של תאים בודדים שנותחו מ-HIOs ג'ג'ונליים שגדלו כחד-שכבות על לוחות של 96 בארות. תרשימי כינור מראים את מספר הגנים (nFeature_RNA), UMI (nCount_RNA) ואחוז הקריאות המיטוכונדריאליות (percent.mt) לכל תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: UMAPs של תאים בודדים שנותחו. (A) בסך הכל 9952 תאים בודדים בודדו מ-HIOs ג'ג'ונליים ממוינים שגודלו בלוחות של 96 בארות. (B) בסך הכל בודדו 5623 תאים בודדים מתאי HIO ג'ג'ונליים ממוינים שגודלו על תוספות תרבית תאי ממברנה. (C) בסך הכל בודדו 4402 תאים בודדים מ-HIO תלת-ממדי ממוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מדיום צמיחה WRNEמדיום בידול
רכיבנפחריכוז סופימדיום WRNE ללא מדיום מותנה L-WRN, ניקוטינאמיד SB202190
*Y-27632 (5 מילימטר) אופציונלי200 מיקרוליטר10 מיקרומטר
A 83-01 (500 מיקרומטר)100 מיקרוליטר500 נאנומטר
DMEM/F12 מתקדם45 מ"ל
B272 מ"ל
EGF (50 מיקרוגרם/מ"ל)100 מיקרוליטר50 נ"ג/מ"ל
גסטרין (10 מיקרומטר)100 מיקרוליטר10 נאנומטר
GlutaMax (פי 100)1 מ"ל
HEPES 1 מטר1 מ"ל
L-WRN Con- מדיה50 מ"ל~50%
N21 מ"ל
N-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול)100 מיקרוליטר500 מיקרומטר
ניקוטינאמיד 1 מטר1 מ"ל10 מ"מ
SB202190 (10 מ"מ)100 מיקרוליטר10 מיקרומטר
נפח כולל100 מ"ל
CMGF- בינוני
DMEM/F12 מתקדם500 מ"ל
גלוטמקס5 מ"לפי 100
1 מטר Hepes5 מ"ל

טבלה 1: הרכב של מדיות שונות בשימוש.

דיון

באמצעות פלטפורמות גנומיקה של תא בודד, ניתן לפרק מערכות ביולוגיות מורכבות, כגון תרביות HIO שמקורן ברקמה המדמה את אפיתל המעי, כדי להניב תרומות תאיות בודדות לתגובה ביולוגית כוללת 4,5,6. ניתן לזהות ולחקור גם הטרוגניות תאית ואוכלוסיות תאים נדירות. הקלט הסלולרי צריך להיות ממוטב כדי למקסם את הפלט באמצעות פלטפורמות מבוססות תעתיק תא יחיד. כאן אנו מתארים פרוטוקולים שיניבו מתלים של תאים בודדים באיכות גבוהה ובאיכות טובה שיגדילו את הסבירות לקבלת נתוני תמלול באיכות גבוהה במורד הזרם. היכרות עם הפרוטוקול היא בעלת חשיבות עליונה, ומומלץ לבצע מספר ריצות תרגול לפני שממשיכים בהכנת הספרייה. השגה ניתנת לשחזור של מתלים בני קיימא של תא בודד מוצעת לפני השימוש בתאים להכנת הספרייה. המהירות שבה מיושם הפרוטוקול היא בעלת חשיבות עליונה מכיוון שהמהירות עומדת ביחס ישר לתוצאות הכדאיות. בהתבסס על כך, מומלץ להגביל את מספר הדגימות המטופלות בו זמנית. מומלץ להתממשק עם הגורם שיכין את הספריות לפני הפעלת פרוטוקולים אלה לסיוע בפתרון בעיות.

כדאיות HIO משפיעה ישירות על ספריית הדנ"א הנשלחת לריצוף. יכולת הקיום של התא של HIO תלויה במספר שלבים בהכנת המתלה של התא הבודד, כולל דיסוציאציה, צנטריפוגה, חוצצים, פיפטינג ודיוק ספירה. מטרת הכנת ה-HIOs לפלטפורמה היא לאזן בין שמירה על כדאיות התא לבין איכות הדגימה. קריטי להשגת נתונים באיכות גבוהה הוא מזעור של אגרגטים תאיים, תאים מתים, חומצות גרעין לא תאיות ומעכבים ביוכימיים של שעתוק לאחור. תאים גוססים מגבירים את רעש חומצות הגרעין ותורמים להיווצרות תאים, מה שמוביל לכשלי נתונים ופלטפורמות 7,8,9,10,11,12. סינון עם גודל מסנן מתאים יכול לסייע בהסרת צברים גדולים ובשיפור איכות הנתונים.

יש לקחת בחשבון מספר גורמים כדי למזער את מוות תאי HIO בעת הכנת מתלים של תא בודד. השגת לפחות 80% תאים קיימא היא הכרחית, ו >90% קיימא הוא אפילו יותר רצוי. ניתן לשפר דגימות עם מספר גבוה של תאים שאינם בני קיימא באמצעות אסטרטגיות להסרת תאים מתים, כגון מיקרו-כדוריות מבוססות עמודה, אם כי אלה דורשות יותר תאים ראשוניים ונפחי דגימה גדולים יותר עקב אובדן במהלך הטיפול. HIOs רגישים במיוחד למאגרים ויעברו מוות תאי אם יישארו זמן רב מדי ב-RT במאגרים מסוימים. מדיה אורגנואידית גורמת לכמות הקטנה ביותר של אובדן תאים והיווצרות מצטברת. פיפטינג יכול גם להשפיע על כדאיות HIO במהלך דיסוציאציה. קצוות משעממים רגילים יכולים לגזור אורגנואידים, ולעזור להתנתק לתרחיפים של תא בודד; עם זאת, צנרת מהירה מדי עם קצה משעמם רגיל עלולה לגרום נזק לתאי HIO מכוחות הגזירה. צנרת איטית עם קצוות משעממים רחבים ממזערת את הלחץ על תאי HIO ומשפרת מאוד את מספר התאים הקיימים במורד הזרם. צנטריפוגה, שטיפה והשעיה מחדש הם גורמים אחרים שיכולים להשפיע על איכות מתלי התאים הבודדים של HIO. צנטריפוגת דלי מתנדנדת גורמת לכדוריות עדינות יותר של תאי HIO, וכתוצאה מכך מספר נמוך יותר של תאים מתים תוך מזעור אובדן תאים. לבסוף, דיוק הספירה כדי לקבוע את הריכוז חיוני כדי להבטיח שמספר התאים המרבי יגיע לפלטפורמה לסינתזה של ספריות. תשומת לב לפרטים אלה תביא למזעור הלחץ על תאי HIO במהלך תהליך הבידוד ותבטיח את ההסתברות הגבוהה ביותר להחזרת נתונים לאחר העיבוד.

למרות שתעתיק תא בודד הוא כלי רב עוצמה לניתוח פרופילים ותגובות ביולוגיים ברמת התא הבודד 4,5,6, ישנן מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת יישום הטכנולוגיה לניתוח תרביות אורגנואידים במעיים אנושיים. ראשית, יכולה להיות שונות תמלול משמעותית בגלל שונות טכנית שהוכנסה במהלך הכנת הספרייה וריצוף או עקב השפעות אצווה הנובעות מהכנת הדגימה. בנוסף, ריצוף יכול לגרום להטיית כיסוי כאשר יש עומק ריצוף לא אחיד בין גנים או תאים. זה גורם לאתגרים בעת זיהוי גנים בעלי ביטוי נמוך או זיהוי אוכלוסיות תאים נדירות. שנית, זיהוי סוגי תאים יכול להיות קשה בשל ההטרוגניות התאית והשעתוק של תרביות האורגנואידים ופרופיל תאי פחות ממוין בהשוואה לאפיתל המעי הטבעי. צימוד תגובות שעתוק לפנוטיפים פונקציונליים הוא גם אתגר ודורש אימות נוסף באמצעות גישות או בדיקות אחרות. שלישית, גישה זו אינה כוללת התייחסות להקשר המרחבי או לדינמיקה הטמפורלית של התאים. הליך הדיסוציאציה מסיר את היכולת להסיק אינטראקציות תא-תא מנתוני השעתוק. הוא מספק רק תמונת מצב אחת בזמן של המצב התאי ולא רצף ביולוגי. לבסוף, גישות שעתוק של תא בודד יכולות להיות יקרות ודורשות כלים חישוביים מיוחדים ומומחיות בביואינפורמטיקה. עם זאת, גישה זו נותרה עדיין כלי דומיננטי ומתקדם להבנת ההטרוגניות התאית ולזיהוי סוגי תאים חדשים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מודים למענקי U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, מענקי U19 AI116497 והודעת הסכם שיתוף הפעולה של נאס"א / TRISH NNX16AO69A.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 ננומטר
0.05% טריפסין-EDTAInvitrogen25300054
0.4% טריפן כחולMillipore-SigmaT8154
0.5 מ' EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 מ"מ TranswellCostar3412
24 באר צלחת תרבית רקמות משטח דלתא NunclonThermo Scientific142475
40 ומיקרו; מסננת תאים mFalcon352340
40 ומיקרו; m מסננת קצה FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 ומיקרו; m מסננת קצה FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 צלחת בארCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
תוסף B27Invitrogen17504-0441X
כרום הבא GEM תא יחיד 3' GEM, ספרייה & ערכת חרוזי ג'ל v3.110x גנומיקהPN-1000128
קולגן IVסיגמא-אולדריץ'C5533-5MG33 ומיקרו; g/mL
פתרון לשחזור תאי קורנינג VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 מ"מ
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 מ"מ
L-WRN מדיה ממוזגתATCCCRL-3276
Matrigel, GFR,עכבר 356231
רקומביננטי EGFInvitrogenPMG804350 ננוגרם/מ"ל
תוסף N2Invitrogen17502-0481X
N-אצטיל-ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'A9165-5G500 ומיקרו; M
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'N063610 מ"מ
SB202190סיגמא-אולדריץ'S706710 ומיקרו; M
TranswellCorning3413
Y27632טכנולוגיות תאי גזע7230810 ומיקרו; מ
קורנינג ללא פנול

מקורות

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים