שיקוע רטוב של מחטי מיקרו-הזרקה תוך ניצול לחץ אוויר קבוע למשוב על פתיחת המחט

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הרכבה של מערכת פנאומטית להעברת אוויר בלחץ למחט במהלך תהליך שיקוע המחט. הפרוטוקול מתאר גם את תהליך השיקוע ליצירת מחטי מיקרו-הזרקה חדות וכיצד לאמוד את גודל הפתיחה היחסי של המחט.

תקציר

מחטי מיקרו-הזרקה הן כלי קריטי בהעברת ריאגנטים לשינוי גנום, רכיבי CRISPR (רנ"א מנחה, חלבון Cas9 ותבנית תורם), ורכיבי מערכת טרנספוזון (פלסמידים וטרנספוזאז mRNA) לעוברי חרקים מתפתחים. מחטי מיקרו-הזרקה חדות חשובות במיוחד במהלך הלידה של חומרים משנים אלה מכיוון שהן מסייעות למזער את הנזק לעובר המוזרק, ובכך להגדיל את הישרדותם של עוברים אלה בהשוואה להזרקה עם מחטים שאינן משופעות. יתר על כן, שיקוע המחטים מייצר מחטים עקביות יותר ממחט למחט בהשוואה למחטים הנפתחות על ידי שבירה אקראית של קצה המחט על ידי הברשה של קצה המחט כנגד חפץ (צד של כיסוי, פני השטח של העובר שיש להזריק וכו '). תהליך השיקוע הרטוב של מחטי מיקרו-הזרקה עם אוויר בלחץ קבוע המועבר למחט מאפשר לאדם המשופע את המחט לדעת מתי המחט פתוחה (נוכחות של בועות) וגם נותן אינדיקציה יחסית לגודל פתח המחט שנוצר. ניתן לקבוע את גודל הפתח היחסי במחט על ידי התאמת לחץ האוויר המועבר למחט עד להשגת שיווי משקל ובועות מפסיקות לזרום מקצה המחט. ככל שהלחץ שבו מגיעים לשיווי המשקל נמוך יותר, כך גודל המחט גדול יותר; ולהפך, ככל שהלחץ גבוה יותר, כך גודל המחט קטן יותר.

מבוא

שינוי גנטי של חרקים הוא תהליך שפותח במקור בדרוזופילה על ידי רובין וספרדלינג, ובמהלך השנים תהליך זה שונה ליצירת שינויים גנטיים במינים אחרים¹. התהליך מסתמך על מסירה מדויקת של רכיבי שינוי המוזרקים במיקרו לעוברים בחלון זמן ומיקום מסוים בתוך העובר ^{המתפתח 2,3,4}. מחטי מיקרו-הזרקה חדות הן כלי קריטי בתהליך השינוי הגנטי של חרקים מסוימים, כגון יתושים 4,5,6,7,8,9 וזבובי חול¹⁰, בעוד שהן פחות קריטיות עבור חרקים אחרים, כגון תולעי משי¹¹. מחטים חדות הן לעתים קרובות גורם מפתח בין הצלחה לכישלון כאשר מנסים ליצור חרק מהונדס גנטית ^2,4. בדרך כלל, מחטי זכוכית מיקרו-קפילריות נמשכות על ידי חימום זכוכית עד לנקודה שבה הזכוכית הופכת אלסטית, מה שמאפשר למשוך את הנימים לתוך מחט קצה סגורה מחודדת. לפני שניתן להשתמש במחט יש לפתוח אותה באופן שיוצר קצה חד להזרקה. באופן מסורתי, מחטים נפתחות על ידי צחצוח קצה המחט בעדינות כנגד משהו (קצה המגלשה / הכיסוי, או העובר, וכו ') שגורם כמות קטנה של זכוכית להתנתק מן הקצה, באופן אקראי יצירת קצה חד ^2,3. תהליך קצת פחות אקראי הוא שיפוע יבש, שבו המחט יורדת במהירות על פלטה שטוחה אופטית, מסתובבת שוחקת לפרק זמן קצר, מה שגורם לכמות קטנה של זכוכית להישבר מקצה המחט וליצור קצה חד. שיקוע יבש הוא קצת פחות אקראי מאשר צחצוח קצה המחט כנגד משהו. הפרוטוקול המתואר להלן לוקח את תהליך השיקוע צעד אחד קדימה על ידי אספקת אוויר דחוס למחט המשופעת ושיקוע אותה מתחת לשכבה נוזלית כך שבועות גלויות ברגע שהמחט נפתחה. פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור מחטי מיקרו-הזרקה חדות באופן אמין. שיקוע מתחת לשכבה נוזלית מהווה שיפור לעומת שבירה אקראית של המחט כפי שתואר לעיל, ושיקוע יבש מכיוון שהמשתמש מקבל משוב על תהליך השיקוע, המאפשר לאדם המשופע לדעת מתי המחט פתוחה ויחסית מה גודל פתח המחט. ידיעת גודל הפתיחה היחסי של קצה המחט יכולה לאפשר לאדם המשופע ליצור מחטים עם גדלי פתיחה שונים. לגדלים שונים של פתיחת מחטים יש יתרונות שונים; לדוגמה, גדלי פתיחת מחטים גדולים יותר יכולים להכיל תערובות הזרקה בעלות צמיגות גבוהה, בעוד שמחטי פתיחה קטנות יותר גורמות פחות נזק לעובר המוזרק.

האוויר מסופק למחט באמצעות וסת ומערכת צינורות אורתן המבוססת על מערכת הזרקה מווסתת לחץ אוויר שונה². בעוד האוויר מסופק למחט בלחץ קבוע, המחט משופעת מתחת לשכבת נוזל. תהליך השיקוע מורכב מתהליך חוזר בן חמישה שלבים: 1) הורדת המחט למשטח השוחק, 2) מתן אפשרות למחט להתקע לפרק זמן קצר, 3) הרמת המחט הרחק מהצלחת השוחקת תוך שמירתה מתחת לפני השטח של שכבת הנוזל, 4) עצירת הסחרור של הצלחת השוחקת כדי לבדוק את הופעת הבועות. אם אין בועות, שלבים 1 עד 4 חוזרים על עצמם עד להופעת בועות; 5) ברגע שיש בועות, ניתן לכוונן את לחץ האוויר כדי לקבוע את גודל הפתיחה היחסי של המחט. ככל שהלחץ הדרוש לעצירת היווצרות הבועות נמוך יותר, כך הפתח בקצה המחט גדול יותר.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול כמתואר להלן משתמש במיקרו-נימי Sutter BV-10 משופע. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה לשימוש עם כל מודל microcapillary משופע.

1. הרכבה של ווסת, מד לחץ וצינורות אספקת אוויר

1. חותכים קטע של צינורות אורתן לחיבור מאספקת האוויר לבסיס הרגולטור (R; סעיף 1, איור 1). אורכו של סעיף זה יהיה תלוי במרחק מאספקת האוויר לרגולטור, אשר ימוקם ליד המשופע.
2. החלק מהדק צינור על צינור השופכן, ולאחר מכן דחף מחבר צינור לקצה הצינור. ודא שמחבר הצינור הוכנס במלואו על-ידי הצבת מחבר הצינור על משטח קשיח. בעת החזקת הצינור קרוב למחבר הצינור, לחץ את הצינור בחוזקה לתוך הצינור עד להחדרת מחבר הצינור במלואו. יחד, מהדק הצינור ומחבר הצינור יוצרים את החיבור HC (איור 1).
3. החלק את מהדק הצינור כלפי מעלה לקצה הצינור שבו מוכנס מחבר הצינור. סובב את מהדק הצינור מעל קצה המוט שהוכנס כך שייצור חיבור אטום.
4. הברג את מחבר הצינור לבסיס הרגולטור (R) ביד, ולאחר מכן סיים להדק את החיבור באמצעות מפתח ברגים קטן. ודא שהחיבור אטום אך אינו הדוק מדי.
5. ביציאה הצדדית של הרגולטור, הברג מחבר T (T) ביד, ולאחר מכן השתמש במפתח ברגים קטן כדי לסיים את ההידוק.
6. חתכו חתיכה קטנה של צינור אורתן (איור 1, סעיף 2), באורך של כ-3-5 ס"מ. הניחו שני מהדקי צינור על חתיכת הצינור, ואז הכניסו מחבר צינור לכל קצה של הצינור וסיימו את החיבורים (HC) כמתואר בשלבים 1.2-1.4 עבור כל קצה של הצינור.
7. הברג קצה אחד של הצינור הקצר לבסיס מד הלחץ, ולאחר מכן סיים את ההידוק עם מפתח ברגים כמו בשלב 1.5.
8. הברג את הקצה השני של הצינור הקצר לאחת היציאות במחבר T (T) המחובר לווסת בשלב 1.5.
9. חתכו קטע של צינור אורתן (איור 1, סעיף 3) לחיבור בין הרגולטור למחזיק המחט (NH). גודלו של סעיף זה יהיה תלוי במרחק מן שיפוע למיקום של הרגולטור.
10. הנח מהדק צינור על קטע הצינור ולאחר מכן הכנס מחבר צינור כמתואר בשלבים 1.2-1.4.
11. בצד השני של חלק זה של צינורות, מקם את מחבר הלואר הנשי (LC) המסופק עם מחזיק המחט (NH).
12. הסירו את מהדק התמך ואת מכונת הניילון (איור 2, f) מהמניפולטור. מהדק התמך ומכונת הכביסה נועדו להחזיק מיקרו-נימי זכוכית בלבד, הם אינם מיועדים להחזיק את המשקל הנוסף של מחזיק מיקרו-נימי, מוט מושחל וצינור אספקת אוויר.
13. חותכים פיסה מלבנית של יריעת אריזת גומי בגודל 1.5 ס"מ x 2 ס"מ כדי לעטוף את המוט המושחל במהדק פנדר האופניים. זה יעזור להחזיק את המוט המושחל ומחזיק המחט בצורה בטוחה יותר במהדק פנדר האופניים. בעזרת שתי צבת אף מחט, פותחים את תפס האופניים ומקפלים את פיסת אריזת הגומי המלבנית מעל המוט המושחל 3.5 ס"מ מקצה אחד של המוט כך שהוא יוצר U מעל המוט. הכנס את המוט המושחל המכוסה ביריעות גומי למהדק פנדר האופניים הפתוח והשתמש בצבת כדי לסגור את המהדק סביב המוט ויריעת הגומי. התקן את מהדק האופניים ומכלול מוטות הברגה על בורג המניפולטור, החלף את מהדק התמך ללא מכונת הכביסה מניילון, והדק את מהדק התמך עד שהוא מחזיק היטב את מכלול מוט ההברגה.
14. השחילו את מחזיק המחט על מוט ההברגה. ודא שמחבר הלואר מסתיים במיקום שלא יקשור את צינור השופכן כאשר הוא מחובר (איור 2, g).
15. חברו את מחבר הלואר הנקבי למחבר הלואר הזכרי (איור 2, g) של מחזיק המחט (איור 2, d).
16. חבר את הקצה החופשי של איור 1, צינור קטע 1 לאספקת האוויר (חיבור זה ישתנה בהתאם לאספקת האוויר שבה נעשה שימוש). אספקת האוויר צריכה להיות נקייה, אוויר יבש וללא שאריות שמן. אספקת האוויר יכולה להיות ממקור אוויר ביתי או גליל גז, אוויר דחוס או חנקן.

2. מחטי בורוסיליקט משופעות

1. משוך מחטי מיקרו-הזרקה באמצעות נימי מיקרו זכוכית בורוסיליקט עם ההגדרות הבאות במכשיר: חום: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, עם זמן לולאה של 12.24.
2. הרכיבו את מכלול השחזה בהתאם להוראות היצרן, המורכב מהצלחת השוחקת וטבעת התמך עם מגנטים¹².
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לעטוף את הצלחת השוחקת ברצועה דקה של סרט שקוף כדי למנוע דליפה מוקדמת של פוטו-פלו (חומר הרטבה) מהצלחת השוחקת. זה נחוץ רק אם תמיסת חומר ההרטבה דולפת בטרם עת לתוך שמן הדום, מה שגורם לצלחת הטחינה להפסיק להסתובב. חומר ההרטבה מפחית את הסיכון לסימני ייבוש על מחטי הזכוכית לאחר שיקוע. השימוש בחומר הרטבה אינו קריטי לתהליך השיקוע, וניתן להחליף מים.
3. יש להניח 10 טיפות שמן על המשטח האופטי השטוח של הכן ולהניח עליו את מכלול הטחינה. התחל את מכלול השחזה.
4. הפעל את מקור האור כדי להאיר את פני השטח. ודא שמקור האור ממוקם מאחורי המשופע ומאיר בזווית של 45° לצלחת ולמחט השוחקות. זווית ההארה נחוצה כך שניתן יהיה לראות בקלות צל של המחט. בהגדלה של פי 90, סובבו את ראש המיקרוסקופ למקומו. עצרו לרגע את סיבוב הצלחת השוחקת ומקדו את המיקרוסקופ על פני השטח של הצלחת השוחקת.
5. הוסיפו לפתיל חומר הרטבה 1% עד שהפתיל רטוב לחלוטין. הוסיפו חומר הרטבה 1% לפני השטח של הצלחת השוחקת. יש לוודא שחומר ההרטבה מכסה את המשטח השוחק אך אינו דולף לטבעת התמך השחורה.
6. הניחו את הפתיל הרטוב מראש על פני הצלחת השוחקת בזמן שהיא מסתובבת. ודא שהפתיל נמצא בצד שמאל של הצלחת השוחקת (כשאתה מסתכל למטה מלמעלה) ונמתח משעה 11 עד 6 (עם הצלחת כפני שעון). ודא שהפתיל אינו רוכב על החלק השחור של טבעת התומך.
7. הכניסו מחט למחזיק המחט (איור 2, d) והדקו את טבעת התמך כדי להחזיק את המחט במקומה. פתחו את הרגולטור (איור 1, R) והגבירו את הלחץ ל-24 psi.
8. הרימו את מחזיק המחט על-ידי סיבוב ידית כוונון המסלול (איור 2, א) ודאו שהמחט מוגבהת מספיק גבוה כך שהיא גבוהה יותר מפני השטח של הצלחת השוחקת המסתובבת, ואז סובבו את כל המניפולטור כך שהמחט תתנדנד למקומה מעל הצלחת השוחקת המסתובבת. המחט שיש לשקוע צריכה להיות ממוקמת על הצלחת השוחקת המסתובבת כך שסיבוב הצלחת יתרחק מקצה המחט (איור 3A)
9. בהתבוננות מהצד, השתמשו בידית הכוונון הגסה (איור 2, a) כדי להוריד את המחט לכיוון משטח הצלחת השוחק. עצור כאשר המחט כמעט נוגעת בפני השטח של הנוזל.
10. השתמש בזום כדי להקטין את ההגדלה של המיקרוסקופ, ולאחר מכן הזז את המיקרוסקופ כך שהמחט תהיה במרכז שדה הראייה. ברגע במרכז הראייה, להגדיל את ההגדלה, התאמת המיקום של מניפולטור כך קצה המחט נשאר במרכז הראייה. פעם אחת בהגדלה מקסימלית, עצרו את צלחת השחזה ומקדו את המיקרוסקופ על פני השטח של הצלחת השוחקת, ואז מיד הפעילו מחדש את סיבוב הצלחת ברגע שהמשטח נמצא בפוקוס. ייתכן שהמחט אינה נראית לעין בשלב זה.
11. באמצעות ידית הכוונון הגסה של המניפולטור, הורידו את המחט לכיוון הצלחת השוחקת. בשדה הראייה, תמונה של המחט וצל (ים) של המחט יהיה גלוי. כאשר המחט והצל של המחט קרובים למגע, עברו לידית הכוונון העדינה של המניפולטור והמשיכו להוריד את המחט עד שנראה שהמחט והצללים שלה נוגעים. בשלב זה, קראו את הקליפר (איור 2, c) ושימו לב לקריאה. פני השטח של הלוח השוחק נמצאים בקריאת קליפר זו או מתחתיה.
    הערה: קשה לראות מתי המחט נוגעת בפני השטח של הצלחת השוחקת המסתובבת, כך שייתכן שהמחט לא נוגעת בצלחת השוחקת בשלב זה.
12. אפשר למחט להישאר ברמה זו של קריאת קליפר במשך 5-10 שניות.
13. באמצעות ידית הכוונון העדינה של המניפולטור, הרימו את המחט, וודאו שהיא נשארת מתחת לפני השטח של חומר ההרטבה. עצור את סיבוב הצלחת השוחקת למשך מספר שניות והתבונן אם בועות בורחות מקצה המחט. אם קיימות בועות, המשך לשלב 2.15. אם לא קיימות בועות, המשך לשלב 2.14.
14. החזירו את המחט לקריאת הקליפר באמצעות ידית הכוונון העדין של המניפולטור, ואז הזיזו אותה מעט נמוך יותר ובצעו קריאת קליפר חדשה, ואז חזרו על שלבים 2.12-2.13.
15. הפעל שוב את הצלחת השוחקת כדי לראות אם ניתן להבחין בהיווצרות בועות בזמן שהצלחת מסתובבת. אם עדות להיווצרות בועות נראית לעין במהלך סיבוב הצלחת, סביר להניח שפתח קצה המחט גדול מדי עבור מיקרו-הזרקות רגישות של עוברים, כגון זריקות עובר יתוש. אם היווצרות הבועות אינה נראית לעין במהלך סיבוב צלחת שוחקת, פתח המחט אידיאלי לשימוש בהליכים הדורשים מחט פתיחה חדה וקטנה.
16. השתמש בידית ההתאמה של מסלול המניפולטור כדי להרים את המחט מעל הצלחת השוחקת למצב גבוה מספיק מעל הצלחת כך שהמחט לא תפגע בשום דבר מכיוון שכל המניפולטור מסובב כדי להרחיק את המחט מהצלחת השוחקת והמיקרוסקופ.
17. ברגע שהמחט נמצאת במצב שבו ניתן להסיר אותה מבלי לפגוע בשום דבר, מורידים את לחץ האוויר לאפס, מוציאים את המחט ומניחים אותה בקופסת אחסון מחטים (צלחת פטרי עם סרט דבק כפול או חימר דוגמנות שיחזיק את המחטים המשופעות) עד לשימוש.

3. קביעת גודל הפתיחה היחסי של המחט המשופעת

הערה: קביעת גודל הפתיחה היחסי של המחט המשופעת נעשית בשלב 2.13. השלבים הבאים מתארים תהליך זה עוד יותר.

1. ברגע שנצפו בועות בשלב 2.13, כאשר הצלחת השוחקת אינה מסתובבת, הפחיתו לאט את לחץ האוויר על-ידי סיבוב ידית הכוונון של הווסת (איור 1, R) עד שהבועות יפסיקו לזרום מקצה המחט. שימו לב ללחץ שבו בועות מפסיקות לזרום מהקצה.
2. הגדל את לחץ האוויר עד שבועות זורמות שוב מקצה המחט. ככל שהלחץ גבוה יותר, כך פתח המחט קטן יותר.
3. המשך עם הזזת המחט למצב שבו ניתן להסיר אותה בבטחה שלבים 2.16-2.17.

תוצאות

ההליך המתואר לעיל מייצר מחטי מיקרו-הזרקה חדות באופן עקבי. מחטים חדות מאופיינות בכך שהן מסוגלות להחדיר לעוברי חרקים כוריון רכים, כגון עוברי יתושים, עם התנגדות מועטה או ללא התנגדות מקרום העובר. כאשר עוברים של יתושים מוזרקים במיקרו לצורך שינוי גנטי, קרום העובר אלסטי יחסית. דחיפת מחט עמומה כנגד קרום העובר תגרום לו להיכנס פנימה (איור 4B). כאשר המחט נמשכת לאחור, הקרום חוזר לצורתו. עם מספיק לחץ, המחט העמומה בסופו של דבר תקרע את הממברנה, והעובר צפוי לדלוף החוצה. ככל שהמחט חדה יותר, כך מתרחשת פחות הזחה כאשר המחט נלחצת כנגד קרום העובר (איור 4E). במקום להיקרע לתוך הממברנה, מחט חדה תחליק דרך הממברנה, ותגרום נזק מועט, אם בכלל, לעובר. עם מחט אידיאלית, כמעט ולא תהיה כניסה של קרום העובר כאשר המחט מחליקה לתוך העובר.

מתקן טרנספורמציית החרקים של אוניברסיטת מרילנד (UM-ITF) הוא מתקן שירות היוצר חרקים מהונדסים גנטית עבור לקוחות באקדמיה ובתעשייה. המתקן משתמש במחטים משופעות למיקרו-הזרקה של עוברי יתושים. במהלך התקופה שבין ינואר 2023 לדצמבר 2023, UM-ITF הזריק 12,795 עוברי Aedes ב-56 פרויקטים של לקוחות (טבלה 1). השימוש במחטים משופעות סייע ל-UM-ITF לשמור על בקיעה ממוצעת לאחר הזרקה של 31% בפרויקטים שונים (טבלה 2). יתר על כן, ה- UM-ITF הצליח לשמור על שיעור הצלחה בהזרקה של 96%, כפי שנקבע על ידי מעקב לאחר הפרויקט עם לקוחות (טבלה 2). הצלחת ההזרקה היא מדד לשאלה האם חומרי ההזרקה (מדריכי קריספר, חלבון Cas9, פלסמידים וקטוריים טרנספוזונים וכו') שהוזרקו הועברו לעוברים של הפרויקט באופן שבו חומרים אלה הצליחו ליצור שינוי גנטי, בעצם, האם הייתה עדות ליצירת CRISPR Indel, החדרת וקטור מבוסס טרנספוזון ללקוחות או החדרת וקטור בקרת איכות הזרקה (טרנספוזון מסתיים בסמן פרומוטור פלוס). במילים אחרות, האם הזריקות היו טובות מספיק כדי לייצר שינוי גנטי, אם הרכיבים המוזרקים פעלו כראוי. ישנם גורמים רבים התורמים להצלחת פרויקט שינוי גנטי, ומיקרו-הזרקות איכותיות עם מחטים חדות הן גורם מפתח להצלחה. מחטים משופעות באמצעות ההליך המתואר בפרוטוקול לעיל מאפשרות ל- UM-ITF לייצר מחטי מיקרו-הזרקה חדות באיכות עקבית, ובכך מאפשרות ל- UM-ITF לתת זריקות מוצלחות באופן עקבי.

איור 1: תרשים סכמטי של רכיבי מערכת האוויר והחיבור למיקרו-נימים. האוויר מועבר למחט הנימים דרך מערכת של צינורות אורתן מאספקת אוויר (אוויר ביתי או גליל אוויר). צינורות האורתן מחוברים לווסת (R) ולמד הלחץ על ידי חיבורי צינור (HC), המורכבים ממחבר צינור ומהדק צינור. חיבור הצינור מתברג לחיבור נשי של 10-32 חוטים בבסיס הרגולטור (R) ומד הלחץ. מחבר T (T) מחובר לווסת (R) כדי לשפוך אוויר בין מד הלחץ לבין מחזיק המחט (NH). צינור השופכן מחובר למחזיק המחט על ידי מחבר luer (LC) המסופק עם מחזיק המחט (NH). החיבור לאספקת האוויר ישתנה בהתאם לאספקת האוויר בה נעשה שימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: חלקי מניפולטור והגדרת אוויר. חלקי מניפולטור: א. ידית כוונון גסה, ב. ידית כוונון עדינה, ג. קאליפר, ד. מחזיק מחט WPI, ה. מד זווית, ו. מהדק תומך ותפס פנדר אופניים, ג. מתאם Luer ומחבר צינור luer, וח. צינורות אורתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מיקום המחט ביחס לסיבוב הצלחת השוחקת. (A) מיקום נכון של המחט במהלך שיקוע. המחט שיש לשקוע צריכה להיות ממוקמת על הצלחת השוחקת המסתובבת המכוונת איפשהו בין ניצב לסיבוב ובקו אחד עם הסיבוב, שם הסיבוב מתרחק מקצה המחט. (B) מיקום לא נכון של המחט. סיבוב הצלחת השוחקת בכיוון זה גורם למשטח הצלחת השוחק לדחוף על קצה המחט ולא מתחת ומעבר לקצה. בכיוון זה, ייתכן ששיקוע לא יתרחש בצורה חלקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה בין החדרת מחטים על ידי מחטים לא חדות וחדות. (A-C) מחט לא חדה ומחט חדה (D-F). (א) ו-(ד) נתפסו לפני שהמחט יצרה מגע עם העובר; (B) ו-(E) נמצאים בדיוק בנקודה שלפני שהמחט מנקבת את קרום העובר, ו-(C) ו-(F) נמצאים מיד אחרי פירסינג המחט. החץ הלבן ב-(B) מציין את כניסת קרום העובר מכיוון שיש להפעיל לחץ גדול יותר כדי שמחט לא חדה תחדור פנימה. החץ השחור ב-(E) מציין את חוסר ההזחה עקב פירסינג המחט שנעשה בקלות בגלל מחט חדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פרויקטים של UM-ITF Aedes מינואר 2023 עד דצמבר 2023. רשימת פרויקטים של מיקרו-הזרקה של UM-ITF Aedes עם מספר העוברים שהוזרקו לכל פרויקט, מספר הזחלים שבקעו מעוברים מוזרקים אלה, ואחוז הזחלים שבקעו לכל עובר מוזרק בסך הכל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: תוצאות פרוייקט UM-ITF Aedes. UM-ITF הוא מתקן שירות המספק שירותי מיקרו-הזרקה לשינוי גנטי של חרקים. הטבלה מפרטת את מספר הפרויקטים של Aedes שהוזרקו על ידי ITF מינואר 2023 עד דצמבר 2023. מספר הלקוחות שנענו לבקשות מעקב אחר הפרויקט שבהן המענה הצביע על הצלחה או כישלון של פרויקט ההזרקה. מספר הפרויקטים המוצלחים, שבהם פרויקט מוצלח היה כזה שבו חומרי ההזרקה הוזרקו במיקרו בזמן ובמקום לעובר המתפתח כך שהזריקות היו מסוגלות לייצר שינוי גנטי, ומספר הפרויקטים שנחשבו לא מוצלחים בגלל חוסר שינוי גנטי. שיעור הבקיעה הממוצע לפרויקטים של מיקרו-הזרקה של Aedes בתקופה שבין ינואר 2023 לדצמבר 2023. שיעור הצלחת הפרויקט ושיעור תגובת הלקוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

שינוי גנטי של יתושים מסתמך על מיקרו-הזרקה מדויקת של חומרי השינוי (פלסמידים, רנ"א מנחה או חלבונים) לעוברים קדם-בלסטודרם 3,4,5,6,7,8. קריטיות לתהליך זה הן מחטים חדות המנקבות בקלות את העובר במהלך הזרקה ^2,4. מחט חדה מסוגלת להחליק דרך הממברנה, להעביר את חומרי השינוי, ולהישלף מהעובר מבלי ששום דבר מהפלסמה העוברית ידלוף החוצה באתר ההזרקה לאחר המיקרו-הזרקה (השגחה אישית).

מחטי מיקרו-הזרקה נסגרות כאשר הן נמשכות לראשונה ויש לפתוח אותן לפני הזרקה². באופן מסורתי, מחטים למיקרו-הזרקה נפתחו על ידי הברשה עדינה של המחט כנגד משהו כמו קצה הכיסוי או מגלשת זכוכית שמחזיקה את העוברים, כנגד העובר עצמו, או חומר אחר². עם זאת, פתיחת המחט על ידי הברשתה כנגד חפץ מספקת תוצאה לא עקבית (התבוננות אישית). לעיתים, המחט תישבר באופן שהופך אותה לחדה, ואילו פעמים אחרות, המחט הופכת עמומה מאוד, מה שכאמור יכול לפגוע בעוברים המוזרקים, לגרום להם לא להשתנות או, במקרה הרע, להרוג את העובר. לחלופין, ניתן לפתוח מחטים גם על ידי החדרת המחט לעובר. תהליך זה יכול לפתוח את המחט, מה שהופך אותו מוכן להזרקה. עם זאת, הוא גם מייצר תוצאות אקראיות שלעיתים יוצרות מחט חדה מאוד, אך לעתים קרובות יותר סותמות את המחט בחומר עוברי לפני שניתן להשתמש בה להזרקה. למרות שמחטים משופעות דורשות זמן ומאמץ נוספים, התהליך מייצר מחטים חדות באופן עקבי יותר.

שינוי גנטי של יתושים הוא גם תהליך תלוי זמן הדורש את העוברים להיות מוזרק מיקרו לפני העובר המתפתח צלולרי 4,5,6,7,8. בעת פתיחת מחטים על ידי צחצוח המחט כנגד משהו או על ידי החדרת המחט לעובר, הזמן שלוקח לפתוח ולמצוא מחט חדה נלקח כאשר העוברים כבר מוכנים להזרקה וממשיכים להתפתח. במקרה הטוב, התהליך של פתיחת מחט והפקת מחט חדה לוקח רק דקה או שתיים, אבל פעמים אחרות, זה עשוי לקחת מספיק זמן כי הביציות שנקבעו עבור אותו סבב של הזרקה הם מבוגרים מדי עד מחט טובה נעשה. היתרון של שיקוע הוא שהוא נעשה מראש, והמחטים מוכנות לשימוש ברגע שהעוברים מוגדרים להזרקה, מה שמבטיח שהעוברים נמצאים בשלב ההתפתחותי המושלם להזרקה.

למרות שהפרוטוקול הנ"ל פותח עבור ומשתמש בשיפוע Sutter BV-10, ניתן לשנות את הפרוטוקול לשימוש עם כל משופע. הגורם העיקרי הוא משטח שיקוע חייב להיות מסוגל להחזיק נפח קטן של נוזל שמתחתיו המחט משופעת.

לשיקוע מחטי מיקרו-הזרקה בעוד מקור אוויר מספק אוויר דחוס לחלק האחורי של המחט יש שני יתרונות. ראשית, לחץ האוויר עוזר לייצר מחטים עקביות. מחטים חדות באופן עקבי מיוצרות כאשר תהליך השיקוע מתחיל באותו לחץ אוויר מסופק, ושיקוע נעצר כאשר בועות מופיעות לראשונה. קריטי שעל מנת לצפות בהיווצרות הראשונית של הבועות, יש לעצור את הצלחת השוחקת לרגע, כך שסיבוב הצלחת השוחקת לא יסווה את היווצרות הבועות הראשונית. אם עדות לבועות נראית רק כאשר הצלחת השוחקת בתנועה, פתח המחט עשוי להיות גדול מדי. זה קריטי שהלחץ של האוויר המסופק יהיה זהה בכל פעם שהשיקוע מתחיל, שהשיקוע ייפסק ברגע שבועות מתחילות לברוח (דמיינו כאשר הצלחת אינה בתנועה), ושבועות לא ייראו כאשר הצלחת בתנועה היתרון השני הוא שברגע שהמחט נפתחת, ניתן למדוד את גודל הפתח באופן יחסי על ידי הפחתת לחץ האוויר המסופק עד שהבועות מפסיקות לברוח מקצה המחט. על ידי ציון הלחץ שבו בועות מפסיקות לזרום מהקצה, ניתן להסיק גודל פתיחה יחסי. ככל שהלחץ שבו הבועות מפסיקות לזרום נמוך יותר, כך הפתח בקצה המחט גדול יותר, וככל שהלחץ גבוה יותר, כך גודל פתח הקצה קטן יותר. ידיעת גודל הפתיחה היחסי יכולה להיות שימושית בעת שימוש בתערובת הזרקה צמיגית יותר, ולכן סביר יותר שתסתם את מחט ההזרקה. שימוש במדידת גודל פתיחה יחסית זו מאפשר יצירת מחטים שיכולות לספק תערובות הזרקה בעלות צמיגות גבוהה יותר. כמובן, יש כמה פשרות שנעשו בעת שימוש במחטים עם גדלי פתיחה גדולים יותר. באופן ספציפי, עוברים מוזרקים עשויים להיות בעלי סיכוי גבוה יותר לדלוף לאחר ההזרקה, ושיעורי ההישרדות של עוברים מוזרקים עשויים להיות נמוכים יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.0 מ"מ OD מיקרו-נימים	World Precision Instruments
Beveler הדום שמן	Sutter Instruments	008
קליפ פגוש אופניים	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
בום סטנד מיקרוסקופ	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED בום מעמד סטריאו מיקרוסקופ או שווה ערך
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
צלחת שוחקת יהלום	Sutter Instruments	104F	- עדינה במיוחד (0.2 ומיקרו; עד 1.0 ומיקרו וגדלי קצה)
אטם, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	משמש לאיטום חיבור במחברי T  או L, אם עדיין לא כלול בחלקים אלה
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
מחבר צינור	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	צריך 5 מחברי צינור
מחזיק מחט מיקרו-הזרקה	World Precision Instruments	MPH3-10	מחזיק מחט עבור מיקרו-נימים בקוטר חיצוני 1 מ"מ
P-2000	Sutter Instruments		כל חולץ מחט
Photo-Flo 200 פתרון	B& H תמונה, וידאו ואודיו	BH #KOPF200P  MFR #1464510	חומר הרטבה
מד לחץ	מעבדת מכשירי קליפרד, בע"	PG-100	0-100 psi מד
פתיל ייחוס	Sutter Instruments	X050300
מחזיק פתיל ייחוס	Sutter Instruments	M100019
	Regulator Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	צריך #10-32 יציאות לחיבורים
גיליון אריזת גומי 6 אינץ' 6	בדנקו	דגם # 59849
T מתאים	למעבדת מכשירי קליפרד, בע"מ.	מוט
הברגה			החוטים חייבים להיות 10-32.
צינורות אורטן	מעבדת מכשירי קליפארד בע"	URH1-0804-BLT-050