מאמר שיטה

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

6 בספטמבר 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

תקציר

מיקרוגליה, כמקרופאגים השוכנים במוח, חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס במוח. הם מעצבים מעגלים עצביים במהלך ההתפתחות, סוקרים את סביבתם לאיתור פסולת או תאים מתים, כמו גם מגיבים לזיהום ופציעה במוח, בין פונקציות רבות אחרות. עם זאת, תפקידם החשוב בפיתוח עצבי ופלסטיות סינפטית ופתופיזיולוגיה לא הוגדר במלואו, מה שמדגיש את הצורך בחקירה נוספת. כדי לקבל הבנה מקיפה יותר של תפקיד תאי המיקרוגליה בתהליכים האלה, עלינו לבודד תאי מיקרוגליה ולאפיין אותם גנטית, מטבולית ותפקודית. אולם הבידוד של תאי מיקרוגליה מעכברים בוגרים, במיוחד ממבני מוח קטנים, הוא מאתגר מכיוון שהם מייצגים אחוז קטן מכלל תאי המוח, והתשואה של תאי מיקרוגליה מבודדים היא לעתים קרובות נמוכה מדי. כאן, הבידוד המגנטי של תאי מיקרוגליה באמצעות מיקרו-כדוריות CD11b+ מאפשר לנו למיין תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של מוח עכבר בוגר שזה עתה נוקב. השיטה הנוכחית מאפשרת לנו להגיע לטוהר ותנובה גבוהים יחסית בתקופה קצרה תוך שמירה על כדאיות התא.

מבוא

מיקרוגליה מהווים 5-20% מכלל התאים העצביים והם תאי הגליה היחידים שמקורם באבות אריתרומיאלואידים בשק החלמון ומתחילים ליישב את המוח המתפתח סביב היום העוברי E9.5 1,2. מדובר בתאים מאריכי חיים בעלי יכולת התחדשות עצמית איטית, ללא תלות בתאים שמקורם במח עצם3. כחלק מהתאים הדינמיים ביותר, הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים מגוונים בתגובה לרמזים הקשריים וסביבתיים 2,4. בין האותות המסוגלים לווסת את פעילותם, נזק למערכת העצבים המרכזית (CNS), פעילות עצבית, כמו גם חומרים מזינים, הם החזקים ביותר. גוף הולך וגדל של מחקרים הוכיח את התפקיד המרכזי של תאי מיקרוגליה בפציעות, מחלות נוירודגנרטיביות והשמנת יתר 2,5,6. עם זאת, התפקיד המדויק של מיקרוגליה הן בתהליכים פיזיולוגיים והן בפתופיזיולוגיה דורש מחקר נוסף. לכן, אפיון השעתוק, חילוף החומרים והתפקוד שלהם בתנאים שונים הוא בעל חשיבות רבה ומחייב את בידודם, שכן מחקרים באתרם מתאימים ללוקליזציה של DNA, RNA וחלבונים והשוואות איכותניות, כמו גם אפיון מורפולוגי של מיקרוגליה.

ישנן טכניקות שונות המתוארות לבידוד מיקרוגליה, ביניהן שיטת שיפוע פרקול7, מיון תאי ציטומטריה זרימה (FACS)8, ומיון תאים מופעלים מגנטית (MACS). בחירת השיטה המתאימה תלויה במטרות המחקר וברמת הטוהר הנדרשת ליישומים במורד הזרם. הבידוד של תאי מיקרוגליה טהורים ממוחו של עכבר בוגר, במיוחד ממבני מוח קטנים כמו ההיפותלמוס, הוא מאתגר בשל המספר המוגבל של תאי מיקרוגליה. הדיסוציאציה האוטומטית והעדינה של ההיפותלמוס באמצעות טכנולוגיית Miltenyi מאפשרת טיהור של תפוקת מיקרוגליה גבוהה יחסית בזמן קצר עם היכולת להמשיך עד שמונה דגימות בו זמנית עם דיסוציאטור Octo עדין של MACS.

הומוגניזציה של רקמות מלווה בטיהור מיקרוגליה באמצעות טכנולוגיה מבוססת עמודות MACS וחרוזי CD11b+ בגודל ננומטרי סופר-מגנטי. לכן, כל הדגימות מעובדות בדיוק באותו אופן ומניבות תאי CD11b + שלמים. ראוי לציין כי CD11b אינו קיים באופן בלעדי במיקרוגליה, אלא מתבטא גם בתאי שושלת מיאלואידים אחרים, כולל מקרופאגים ומונוציטים9. כדי להגביל זאת, זילוח המוח עם תמיסת מלח קרה כקרח לפני מיצוי ההיפותלמוס (ראה פרוטוקול שלב 2.6) מבטיח חיסול של רוב התאים המיאלואידים, משאיר רק חלק קטן פוטנציאלית של מקרופאגים תושבים או אלה שנצמדו לכלי הדם. המקרופאגים והמונוציטים של מערכת העצבים המרכזית במצב יציב ובריא מהווים אחוז קטן מכלל תאי החיסון במוח (~10% ו-<2% בהתאמה)10,11. לכן, כאשר תאי המוח ממוינים עם חרוזי CD11b+, ניתן לבודד גם מיקרוגליה וגם מקרופאגים, אם כי רובם המכריע הם מיקרוגליה.

התשואה הסופית של תאי מיקרוגליה ושמירה על יכולת הקיום שלהם מאפשרים לנו לבצע ex vivo, כמו גם בדיקות במבחנה, עם היתרון של ניתוח אזורי עניין ספציפיים במוח. הראיות האחרונות הראו כי אוכלוסיית תאי המיקרוגליה הטרוגנית מאוד, ומייצגת ביטוי גנים ספציפיים לאזור ומאפיינים מורפולוגיים ותפקוד 2,12,13. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד לבודד ולנתח מיקרוגליה בוגרים באופן ספציפי לאזור. ואכן, אנו יכולים לאפיין את הפרופילים הגנטיים, השעתוק והתרגומים של מיקרוגליה היפותלמית בוגרת באמצעות שיטות כמו RT-qPCR וריצוף RNA, כמו גם ביצוע ניתוח פונקציונלי במבחנה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו נערכו תוך ציות קפדני להמלצות האיחוד האירופי (2013/63/EU) ואושרו על ידי הוועדה האתית המקומית של אוניברסיטת בורדו (CEEA50) והמשרד הצרפתי להשכלה גבוהה, מחקר וחדשנות (סיכום לא טכני של הפרויקט המאושר NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

הפרוטוקול הבא מבוצע על עכברי C57BL/6 בוגרים בגיל ממוצע של 2-4 חודשים. עם זאת, זה יכול להתבצע בכל הגילאים והתנאים של עכברים תוך התחשבות בכך שנוף תאי החיסון של מערכת העצבים המרכזית עשוי להשתנות ואחוז המקרופאגים והמונוציטים המקומיים עשוי להיות מוגבר (למשל בהזדקנות וניוון עצבי).

1. הכנת פתרונות

הערה: אמצעי האחסון והפתרונות הבאים מופנים אך ורק לבידוד של תאי Cd11b+.

  1. קבע את הנפח הכולל של D-PBS/0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) הנדרש בהתבסס על מספר הדגימות. הכן את התמיסה באמצעות D-PBS הזמין מסחרית עם סידן ומגנזיום ואבקת BSA (ראה טבלת חומרים).
  2. הכינו צינורות דיסוציאציה מסומנים (C-Tubes) ומלאו כל אחד מהם ב-1,900 מיקרוליטר של חיץ Z, המסופק בערכת הדיסוציאציה של רקמת המוח הבוגרת (ראו טבלת חומרים). הפשירו את האנזימים ושמרו אותם על קרח, יחד עם כל המאגרים הדרושים בשלבים הבאים.
  3. הכינו והניחו על קרח את הנפח המתאים של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראו טבלת חומרים) הדרוש לזילוח (שלב 2.6). חישוב 10 מ"ל עבור כל חיה בתוספת 10% עודף.
  4. לניתוח RT-qPCR, הכינו חיץ qPCR לכל דגימה: 2.5 μL של thioglycerol + 250 μL של חיץ ליזיס, באמצעות ערכה זמינה מסחרית לטיהור RNA (ראה טבלת חומרים).
  5. לכימות חלבונים, הכינו את חיץ הליזה על ידי דילול קוקטייל מעכבי פוספטאז וקוקטייל מעכבי פרוטאז ביחס 1:100 במאגר מיצוי יונקים (ראו טבלת חומרים).
  6. לזיהוי מיני חמצן תגובתי (ROS) ובדיקת פגוציטוזה, הכינו HBSS 1x מ-10x HBSS הזמין מסחרית (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, הכן מאגר FACS על ידי הוספת 0.2% BSA ל- 1x HBSS.

2. הסרת המוח

  1. להרגיע את החיה עם מינון של 20 מ"ג / ק"ג של Xylazine; לאחר מכן, להרדים את העכבר עם מנת יתר של 400 מ"ג / ק"ג של pentobarbital ומניחים אותו שכיבה במגש ניתוח.
    הערה: שילובי הרדמה אחרים כדי להרדים את בעל החיים יכול גם לעבוד.
  2. ממלאים מזרק 10 מ"ל עם 10 מ"ל של PBS 1x קר כקרח ומחברים אותו למחט פרפר 21 גרם.
  3. ברגע שהעכבר מורדם לחלוטין (יש לוודא על ידי צביטת הכפות כדי להבטיח חוסר תגובה), הנשימה נעצרת, והלב נמצא בפרפור, אוהל את העור במלקחיים ופותחים את חלל בית החזה במספריים, בגובה הצלעות האחרונות ועצם החזה.
  4. השתמש במספריים כדי לבצע חתך עמוק לאורך הצדדים של כלוב הצלעות לכיוון החלק העליון של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
  5. הכנס את מחט 21 G לחלק הדיסטלי של החדר השמאלי (ודא כי כ 1/3 מהמחט נמצאת בתוך החדר). מיד לבצע חתך דרך אטריום ימין באמצעות מספריים.
  6. יש להחדיר 10 מ"ל של PBS 1x קר כקרח כדי לנקות את המוח מכל תאי מערכת החיסון במחזור.
    הערה: בדקו ויזואלית את המוח כדי לוודא שהוא נקי ומחורר היטב.
  7. חותכים את ראש העכבר, מוציאים בזהירות את המוח ומניחים אותו על צלחת פטרי מלאה בקרח ומכוסה ברדיד אלומיניום.
    הערה: צלחת הפטרי ונייר הכסף עוזרים לראות את חלקי המוח. כדאי לשמור על סביבה קרירה במהלך חיתוך חתיכות המוח כדי להגביל את הפעילות המטבולית.
  8. בודד את ההיפותלמוס באמצעות מלקחיים לחתוך אותו לחתיכות קטנות עם סכיני גילוח.
    1. כדי לזהות ולנתח את ההיפותלמוס, מקמו את המוח הפוך כך שקליפת המוח תהיה גחונית וההיפותלמוס ייראה באופן דורסלי על פני השטח העליונים. להפריד את ההיפותלמוס, אשר ממוקם בחלק התחתון של המוח משני צידי החדר השלישי, באמצעות מלקחיים מעוקלים. המשקל הממוצע של ההיפותלמוס מעכברים בוגרים C57BL/6 הוא 15 מ"ג.
      הערה: חלקי המוח חייבים להיות קטנים ככל האפשר (<0.5 מ"מ). חיתוך לחתיכות קטנות הוא צעד קריטי מכיוון שהוא מאפשר דיסוציאציה טובה יותר ותשואה גבוהה יותר של תאים.
  9. אספו את חתיכות ההיפותלמוס בצינורות דיסוציאציה (C-Tubes) שמולאו בעבר ב-1,900 מיקרוליטר של חיץ Z (שלב 1.2).
    הערה: כדי לקבל תפוקה טובה של תאי מיקרוגליאה שמספיקה לביצוע בדיקות, אגרו לפחות שניים (לכימות חלבונים) או שלושה (לכימות qPCR ו-RNAseq) היפותלמי לכל צינור.

3. דיסוציאציה של רקמות

הערה: יש לבצע את כל השלבים על קרח. אין לערבל את השעיית התא בכל שלב; יש לערבב בזהירות רק עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.

  1. הכינו תערובת אנזימים 2 לפי טבלה 1 (חישוב הנפח הכולל של כל הצינורות + 10% עודף). בכל צינור C, הוסף 50 μL של האנזים הכלול בתערובת 1 (ראה טבלה 1) ו- 30 μL של תערובת אנזימים 2. כל האנזימים מסופקים בערכת הדיסוציאציה של רקמת המוח הבוגרת (ראו טבלת חומרים).
  2. סגרו את צינורות C והניחו אותם הפוכים בדיסוציאטור עם תושבות החימום בהתאם להוראות היצרן. הפעל את התוכנית 37C_ABDK_02.
  3. הכינו שפופרות הצמדה של 15 מ"ל (ראו טבלת חומרים) ומעליהן מסננות של 70 מיקרומטר. להרטיב את המסננת עם 2 מ"ל של D-PBS.
  4. כאשר תוכנית הדיסוציאציה/העיכול מסתיימת, רוקן את צינור C על המסננת ושרט עם קצה של 200 μL כדי להפחית את אובדן התאים על ידי הגברת סינון התאים והפחתת היצמדות הרקמה הומוגנית על המסנן.
  5. יש לשטוף את הצינור עם 2 x 5 מ"ל של D-PBS, לרוקן את השטיפות על המסננת, ולגרד עם קצה 200 μL בין השטיפות.
  6. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant לחלוטין. בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא עם נפח מתאים של D-PBS קר על פי טבלה 1.
  7. יש לערבב מיד בזהירות עם 450 μL של מגיב שיפוע צפיפות (Debris Removal Solution, ראה טבלת חומרים) ולכסות בעדינות רבה עם 2 מ"ל של D-PBS קר (ראה טבלה 1).
    הערה: כדי לקבל את שכבות שיפוע הצפיפות השונות, יש לכסות את D-PBS בעדינות טיפה אחר טיפה, עם מינימום "הפרעה" אפשרית, 1 מ"ל בכל פעם עם פיפטה של 1 מ"ל.
  8. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4°C עם האצה איטית ובלם איטי (אם 9 שווה ערך למלא, השתמש ב-5).
  9. נוצרים שלושה שלבים. שאפו את שני השלבים העליונים לחלוטין והשליכו אותם. הקפידו לא לשאוף לשלב התחתון השלישי.
  10. מלאו ב-1800 מיקרוליטר של D-PBS קר והפכו בעדינות את הצינור 3 פעמים.
  11. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם האצה מלאה ובלם מלא ושאפו את הסופרנאטנט לחלוטין. בזהירות להשהות מחדש את גלולת התא על ידי pipeting איטי למעלה ולמטה עם 2 מ"ל של D-PBS/BSA.

4. בידוד מגנטי של תאי CD11b+

  1. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant לחלוטין. בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא ב 90 μL של חיץ D-PBS/BSA.
  2. מוסיפים 10 μL של תערובת CD11b-microbead ומערבבים היטב עם פיפטה.
  3. לדגור במשך 15 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס במקרר, לא על קרח; לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של D-PBS/BSA וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C; שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין. יש להשהות בזהירות ב-500 מיקרוליטר של D-PBS/BSA.
  4. הפעל את תוכנית POSSEL2 במפריד בהתאם להוראות שעל המסך. מקמו את העמודות הקטנות (ראו טבלת חומרים) בשדה המגנטי.
    הערה: ניתן לבחור עמודות קטנות או גדולות למיון תאים מגנטיים, בהתאם למספר התאים הממוצע הצפוי. לעמודות קטנות יש קיבולת של עד 1 × 107 תאים מסומנים ועמודות גדולות עד 1 × 108. כאשר מבודדים תאים ממבנים קטנים, כגון ההיפותלמוס, עמודות קטנות מומלץ. אמצעי האחסון של ריאגנטים שונים בעת שימוש בעמודות גדולות (ראה הוראות יצרן).
  5. הרטיבו את העמודות (ראו טבלת חומרים) ב-500 μL של D-PBS/BSA. אם החלק השלילי של התאים (CD11b-) נחוץ לניתוח נוסף, מקם לוחית איסוף מתחת לעמודות ולאחר מכן החל את השעיית התאים בעמודות.
  6. בצע שלושה שלבי כביסה על-ידי הוספת 500 μL של D-PBS/BSA בכל פעם בעמודה, ובכל פעם המתין עד שהמאגר יעבור דרך העמודה.
    הערה: חשוב למנוע התייבשות של החלק העליון של העמוד, ולכן מומלץ לא לחכות עד שכל החיץ יעבור.
  7. להעביר את סך השפכים של CD11b - חלק מן הבארות של צלחת האיסוף צינורות 15 מיליליטר.
  8. הסר את העמודה מהמפריד, הנח אותה על צינור 5 מ"ל, ופיפטה 1 מ"ל של D-PBS/BSA לתוך העמודה.
  9. שטוף מיד את מקטע התא המסומן מגנטית על ידי יישום חזק של הבוכנה שסופקה עם העמודה.
  10. בסופו של דבר, לספור תאי CD11b + עם hemacytometer או כל שיטה אחרת; צפו ~15,000 תאים להיפותלמוס.
  11. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.

5. ניתוחים

  1. לניתוח RT-qPCR, השהה מחדש את כדורי התא עם מאגר qPCR (להכנה, ראה שלב 1.3) ואחסן את הצינורות ב - 80 ° C עד מיצוי mRNA. בודד את סך הרנ"א, ולאחר מכן עבד ונתח אותו בהתאם להנחיות MIQE14. לבסוף, לסנתז cDNA ולבצע qPCR באמצעות מכשיר RT-PCR. עיין בטבלת החומרים עבור כל הערכות המסחריות שבהן נעשה שימוש.
  2. לכימות חלבונים, שטפו את כדורי התא עם D-PBS (ללא BSA) לפחות פי 2 כדי לסלק BSA. לאחר מכן, להשעות מחדש את כדורי התא משני היפותלאמי עם 20 μL של חיץ ליזיס. המשך בכימות חלבונים עם ערכת בדיקת חלבון (ראה טבלת חומרים).
    הערה: פעלנו לפי הוראות היצרן15 כדי לכמת חלבונים לביצוע בדיקת פעילות סרין/תראונין קינאזות.
  3. לזיהוי מיני חמצן תגובתי (ROS) בתאי מיקרוגליה, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1x HBSS. טפל בתאים בהתאם לפרוטוקול היצרן של הערכה לבדיקת Flow Cytometry Assay (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, השהה מחדש תאים מטופלים ב -200 מיקרוליטר של חיץ FACS (להכנה, ראה שלב 1.5) ובצע FACS כדי לזהות תאים בסטרס חמצוני.
  4. לבדיקת פאגוציטוזיס, יש לדגור על התאים הממוינים ב-D-PBS/BSA עם חרוזי לטקס פלואורסצנטיים (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות. התאימו את מספר החרוזים כך שיהיו לכם 4 חרוזים לתא בממוצע. לאחר מכן צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C, להשהות מחדש ב 200 μL של מאגר FACS, ולקרוא את פליטת פלואורסצנטיות על ידי FACS (λex 575 ננומטר; λem 610 ננומטר).

תוצאות

הערכת התשואה הסופית מסתמכת על רמת הטוהר והכמות של תאים מבודדים והיא יכולה להיקבע על ידי RT-qPCR, ספירת תאים וכימות חלבונים. טוהר התאים המגנטיים המבודדים מההיפותלמוס אושר על-ידי ניתוח ביטוי גנים של CD11b, C1qa, Gad1 ו-GFAP עם RT-qPCR (איור 1). CD11b ו- C1qa מבוטאים בעיקר על ידי מיקרוגליה במצב יציב, CNS16 ו- Gad1 ו- GFAP משמשים כסמן עצבי ואסטרוציטי בהתאמה. ה-cDNA הכולל מהיפותלמוס אחד נע בין 55 ל-98 ננוגרם. ראוי לציין כי רק החלק החיובי הציג ביטוי CD11b ו- C1qa, המציין את היעדר כל אובדן פוטנציאלי של תאי מיקרוגליאה בחלק השלילי. פריימרים מופיעים בטבלה 2.

יתר על כן, הרמות הקטנות של הסמנים העצביים והאסטרוציטיים מבטיחות שהרוב המכריע של התאים המבודדים הם מיקרוגליה, שכן מקרופאגים ומונוציטים חיים מהווים רק 10% מכלל נוף תאי החיסון של מוח בריא 10,11. תוצאות אלה מוכיחות את יעילות הברירה המגנטית וסוללות את הדרך ליישום RT-qPCR להערכת רמות הביטוי של כל הגנים המעניינים בתאי מיקרוגליאה היפותלמיים ממוינים טריים. באופן דומה, ניתוח RNAseq יכול להתבצע על מיקרוגליה ממוינת היפותלמוס כדי לקבל תצוגה מקיפה של התמליל שלהם.

כמות התאים המבודדים נקבעה על ידי ספירת תאים ונמצא כי היא ~15,000 תאים להיפותלמוס (שהוזכרה בשלב פרוטוקול 4.10). נוסף על כך, ריכוז החלבונים במיקרוגליה ממוינת כומת, וחשף ריכוז ממוצע של 0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר בתאי CD11b+ שבודדו משני היפותלאמי מאוגמים (איור 2). ידע זה מאפשר לבצע בדיקות שונות בהתאם לסף חלבון מינימלי. יתר על כן, על ידי איגום יותר היפותלמי, ניתן להשיג ריכוז גבוה יותר, המרחיב את היקף הניתוחים הפוטנציאליים. החלבונים המופקים ממיקרוגליה היפותלמית מאפשרים טכניקות מגוונות, כולל בדיקות חיסוניות של AlphaLISA ומבחני פעילות קינאז.

יתר על כן, הפרוטוקול המתואר מאפשר לחוקרים לבצע מספר ניתוחי ex vivo , המאפשרים לחקור את פעילות המיקרוגליאה ואת תפקידם בהיפותלמוס בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. הכימות של ייצור ROS מייצג היבט מכריע של התגובה החיסונית של מיקרוגליה17. לכן, לאחר ההפרדה, מיקרוגליה יכולה להיות מטופלת עם ריאגנטים זמינים מסחרית המאפשרים זיהוי של ROS בתאים חיים על ידי הצגת אות פלואורסצנטי מוגבר עם חמצון. תאי מיקרוגליה מבודדים מגנטית משלושה היפותלאמי מאוגמים מספיקים כדי לזהות ROS באמצעות FACS, כפי שמוצג באיור 3A, אף על פי שהתוצאות שלנו מראות שונות גבוהה למדי של ייצור ROS תאים בין התנאים שניתחנו. ראוי לציין כי עם הערכה המסחרית שהוזכרה לעיל (ראה טבלת החומרים), הצלחנו גם להעריך את הכדאיות של תאי Cd11b + ממוינים, הודות לכתם תאים מתים אטום לתא המציג עלייה בפלואורסצנטיות בעת קשירת DNA. באופן ספציפי, הנתונים שלנו מראים ש-99% מהתאים חיים (איור 3B). אסטרטגיות Gating שימשו כדי להבחין בין תאים חיים ומתים, כמו גם תאים בעלי עקה חמצונית ותאים שאינם בסטרס, בהתבסס על התכונות הפלואורסצנטיות שלהם.

מאפיין עיקרי נוסף של פעילות מיקרוגליאה הוא פגוציטוזה, תהליך דינמי ומווסת היטב הממלא תפקיד מפתח במעקב חיסוני, תיקון רקמות והומאוסטזיס כללי של מערכת העצבים המרכזית18. למרבה הפלא, תאי Cd11b+ הממוינים בחרוזים מצומדים מגנטיים יכולים להיות מתורבתים במשך 24 שעות ולאחר מכן מודגרים עם מיקרו-כדוריות לטקס פלואורסצנטיות בנקודות זמן שונות כדי להעריך, בין אם על ידי FACS או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שינויים בפעילות הפאגוציטית בתנאים שונים. מיקרוגליה ממוינת טרייה יכולה גם להיחשף לחרוזים פלואורסצנטיים או לכל סוג של חלקיקים מצומדים ל-pHrodo (למשל, סינפטוזומים) ישירות בתוך הצינור, וניתן להעריך פגוציטוזה על ידי ניתוח FACS.

באופן ספציפי, דגרנו ישירות בצינור המכיל תרחיף תאים ממוין, מיקרוגליה שבודדה משני היפותלאמי או מוח שלם עם חרוזי לטקס פלואורסצנטיים. מיקרוגליה שפאגוציטית לפחות חרוז פלואורסצנטי אחד יכולה להיות מובחנת מתאים שאינם פגוציטיים על ידי ציטומטריית זרימה, שכן מיקרוגליה פגוציטית תציג פלואורסצנטיות משופרת. בקרות שליליות, שלא הודגרו עם חרוזים, שימשו לגידור. בשני תנאי הניסוי שלנו (עכברים שניזונו מצ'או לעומת תזונה עתירת שומן (HFD)) ראינו אחוז נמוך מאוד של מיקרוגליה פגוציטית (איור 4A). אולם התוצאה הזו מוצגת כאן כדי להדגים את יעילותה של השיטה הזו, אשר, למרבה הפלא, מאפשרת גם להבדיל בין תאים שעשו פאגוציטים של 1 חרוזים, 2 חרוזים, 3 חרוזים וכן הלאה (איור 4B). לבסוף, כל גישות האומיקס יכולות להיות מיושמות על מיקרוגליה היפותלמית מבודדת. אנו מציעים איגום שלושה היפותלאמי כדי שיהיו מספיק תאים לביצוע בדיקות אלה.

figure-results-1
איור 1: הערכת טוהר תאי CD11b+ על-ידי RT-qPCR. כימות בתאים ממוינים של ביטוי mRNA של אינטגרין CD11b, משלים תת-רכיב C1q תת-יחידה A C1q, חומצה גלוטמית decarboxylase Gad1 וחלבון גליה פיברילרי חומצי GFAP מנורמל על רמות mRNA של גנים משק בית Eef1a1 ו - Sdha. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: כימות חלבונים מתאי ההיפותלמוס לאחר מיון תאים. כימות ריכוז החלבונים בתאי CD11b+ ו-CD11b. גם תאי CD11b + וגם CD11b עברו ליזה ב-20 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זיהוי ROS בתאים חיים מיקרוגליאליים. כימות של (A) תאים בעלי עקה חמצונית ו-(B) תאים חיים באוכלוסייה של תאי Cd11b+ ממוינים, עם תרשימי מתאר FACS יחסיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: כימות הפעילות הפאגוציטית של מיקרוגליה. (A) כימות של תאים פגוציטיים בתאי Cd11b+ שמוינו משני היפותלאמי או מוח אחד, עם קווי מתאר יחסיים של FACS. (B) אחוז התאים הפאגוציטיים לפי מספר החרוזים בעלי קווי המתאר היחסיים של FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תערובת אנזימים 2
אנזים Aחיץ Yאנזים P
10 מיקרוליטר20 מיקרוליטר50 מיקרוליטר
די-PBSפתרון לפינוי פסולתשכבת-על D-PBS
מבנה 15-100 מ"ג1000 מיקרוליטר450 מיקרוליטר2 מ"ל

טבלה 1: הכנת תערובת הדיסוציאציה (נפחים מתייחסים למדגם יחיד) ושכבות העל של מעבר הצבע.

גניםחלבוןקדימההפוך
איצגםאינטגרין אלפא M (CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
סדההסוקצינאט דהידרוגנאז קומפלקס פלבופרוטאין תת-יחידה ACCCTCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qaרכיב משלים 1, תת-רכיב q, פוליפפטיד אלפאCGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
גד1גלוטמט דקרבוקסילאז 1GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAGCTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
Gfapחלבון גליה פיברילרי חומציAGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

טבלה 2: רצפי פריימר RT-qPCR.

מיון תאי ציטומטריה של זרימה (FACS)מיון תאים מופעל מגנטית (MACS)
נוגדנים ביוכימיים עם תיוג פלואורסצנטיחרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים
התמיינות מעבר לסמני פני התאהתמיינות רק על פי סמני פני התא
תשואה ראשונית משמעותיתתשואה ראשונית צנועה
איטי יותר מ- MACS לטיפול בו זמנית בדגימות רבותמהיר יותר מ-FACS לטיפול סימולטני בדגימות רבות
פחות עדין מ-MACSעדין יותר מ-FACS

טבלה 3: ייצוג מאפיינים ומגבלות של FACS ו- MACS

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מציג את הבידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה נוקב על ידי מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. התוצאות שהוצגו לעיל מאשרות את הטוהר והכדאיות של תאים מבודדים, כמו גם את יעילותה של שיטה זו לאפיון פונקציונלי של מיקרוגליה ex vivo, למשל באמצעות פעילות פגוציטית וכימות ייצור ROS. שיטות קלאסיות לבידוד אוכלוסיית תאים מסוימת יכולות לשמש גם עבור תאי מיקרוגליה. שבירת שיפוע צפיפות היא שיטה ידועה להפרדת תאים שונים וחלקיקיהם בהתאם לגודלם ו/או צפיפותם. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עבור בידוד ותרבית של מיקרוגליה ראשונית. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה בוגרים דורש מיון נוסף של תאי המוח המבודדים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטיים או אימונומגנטיים.

באופן ספציפי, FACS מסתמך על נוגדנים ביוכימיים מתויגים פלואורסצנטיים כדי לתייג את התאים ולהבדיל ביניהם על פי מספר רב של משתנים החורגים מסמנים על פני השטח, כגון גודלם ומצבם המטבולי. עם זאת, תהליך טיהור התאים יכול להיות איטי יותר ולא עדין, להגדיל את מספר התאים המתים, כמו גם לדרוש תפוקה ראשונית משמעותית. לכן, המספר הקטן של מיקרוגליה היפותלמית הוא כבר גורם מגביל. MACS משתמש בחרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים מסוימים כנגד אפיטופים ספציפיים של תאים ויכול לעבוד עם תפוקה התחלתית צנועה המאפשרת את המחקרים הספציפיים לאזור על דינמיקה מיקרוגליאלית. בשל השדה המגנטי החזק של המיקרו-חרוזים, נדרש תיוג מינימלי; לפיכך, הוא עדין יותר מאשר FACS, הבטחת שמירה על שלמות התא. בנוסף, MACS מהיר יותר מ- FACS כאשר יש צורך בטיפול בו זמנית בדגימות רבות. זה מספק את היתרון המובהק של שמירה על כדאיות תאים גבוהה שיכולה לנבוע גם מתשואה התחלתית קטנה (טבלה 3).

האתגרים העיקריים בבידוד תאי מיקרוגליה מההיפותלמוס, שניתן לטפל בהם ביעילות באמצעות טכנולוגיית MACS, כוללים השגת תפוקה סופית מספקת והבטחת שימור שלמות התא. כמות התאים הנדרשת תלויה באופי הניתוח שנבחר לאחר הבידוד. לדוגמה, חקר התפקיד התפקודי של מיקרוגליה במבחנה דורש מספר משמעותי של תאים. זה מדגיש את החשיבות של מאגר ראשוני של אותו אזור במוח מעכברים שונים עם תנאים זהים לפני שממשיכים בתהליך הבידוד. לעומת זאת, טכניקות כגון ריצוף חד-תאי ברמת דיוק גבוהה אינן מחייבות אוכלוסיית תאים גדולה, ובתמורה אין צורך באיגום מספר עכברים.

כדי למקסם את תפוקת התא, חיוני לדבוק בשלבים ספציפיים בפרוטוקול. דיסוציאציה יעילה היא יזומה על ידי חיתוך ההיפותלמוס לחתיכות קטנות, ולאחר מכן על ידי הבטחת כי הם נשמרים בחיץ בתחתית הצינור במהלך התהליך. לאחר מכן, שילוב של דיסוציאציה מכנית עם פירוק אנזימטי של המטריצה החוץ תאית מבטיח תפוקת תאים גבוהה משמעותית. עם זאת, עלינו להיות זהירים ביותר עם פרשנות התוצאות מכיוון שהדיסוציאציה האנזימטית המבוצעת ב 37 מעלות צלזיוס עלולה לגרום לשינויים שעתוק ותרגום19. כדי למנוע שינויים בתיווך טכני, ניתן להשתמש בבקרות המתאימות עם מעכבי שעתוק ותרגום19. ניתן גם להמשיך לדיסוציאציה האנזימטית בטמפרטורה נמוכה יותר, כגון בחדר קר (היעילות עשויה להיות מופחתת), אם כי דיסוציאציה עשויה להסתמך יותר על אפקט מכני מאשר אנזימטי. לאחר הדיסוציאציה, מתלה התא נשטף מראש ומועבר למסננות, ומבוצעות שתי שטיפות יסודיות יותר של הצינורות כדי למנוע אובדן תאים. צעד קריטי נוסף הוא הסרת פסולת ומיאלין המושגת על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות והיווצרות שכבות שונות. לפיכך, השגת תפוקה סופית ניכרת מחייבת טיפול קפדני הן ברקמת ההיפותלמוס והן בתרחיף התא, ושמירה עליהם תמיד על קרח כדי להאט את חילוף החומרים ולשמור על הפנוטיפ in vivo שלהם.

יתר על כן, ישנן נקודות מסוימות שעלינו להיות זהירים ביותר כדי להשיג את הטוהר הגבוה ביותר של מיקרוגליה ולשמור על פנוטיפ תאי מיקרוגליה. בתחילה, זילוח המבוצע ב 4 ° C, הוא חיוני לחיסול כל תאי CD11b + במחזור המבטיחים את טוהר מיקרוגליה הפוטנציאל הגבוה ביותר. עם זאת, במקרה של הפרעה במחסום הדם-מוח, אחוז גבוה יותר של תאי חיסון במחזור הדם יכול ליישב את המוח ולהפריע לחקר תאי המיקרוגליה עצמם. כדי להקל על בעיה זו, גישה חלופית כוללת יישום סבב משני של בידוד מגנטי באמצעות מיקרו-כדוריות המצומדות לנוגדן CD45. CD45 הוא סמן פני התא המציג ביטוי גבוה במקרופאגים20 והזרימה הבאה של סבב זה כוללת רק את תאי המיקרוגליה. אסטרטגיה זו של שימוש בשני סבבים של בידוד מגנטי משפרת את הספציפיות של התהליך; עם זאת, זה לוקח זמן נוסף, אשר מהווה סיכון פוטנציאלי של הפרעה שלמות התא ו / או פנוטיפ מיקרוגליה. לפיכך, גורם מכריע לשימור המאפיינים התפקודיים והשלמות של התאים כרוך בבידוד מהיר של רקמת המוח והשארתה על קרח עד לתחילת תהליך הדיסוציאציה. לסיכום, גישה אנליטית זו משפרת את ההבנה של תפקוד והתנהגות מיקרוגליאליים, ומספקת תובנות חשובות לגבי תגובותיהם הדינמיות בהיפותלמוס.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

AN נתמך על ידי המכון האוניברסיטאי של צרפת (IUF), אוניברסיטת בורדו, הקרן הצרפתית לחקר המוח (FRC), GLN (קבוצת תזונת שומנים) והסוכנות הלאומית למחקר (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA נתמכה על ידי Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon Europe של האיחוד האירופי במסגרת MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging ומחלות הקשורות לגיל, ETERNITY.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת דיסוציאציה של מוח למבוגריםMiltenyi130-107-677הערכה מכילה בופר Z, מאגר Y, אנזימים A ו- P, תמיסת פינוי פסולת, מאגר A (להמסת אנזים A).
אלבומין בקר FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (מיקרוגליה) מיקרו-חרוזים, אדם ועכבר - גודל קטןMiltenyi130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10492
צינור צנטריפוגה, מכסה Snap-Pop 15 מ"לCellTreat978449
DPBS, סידן, מגנזיום, גלוקוז, פירובטGibco14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator עם מחממיםMiltenyi130-096-427
קוקטייל מעכב פוספטאז עצור (100x)Thermofisher78420
קוקטייל מעכב פרוטאז להפסיק, ללא EDTA (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), סידן, מגנזיום, ללא פנול אדוםThermofisher14065056
חרוזי לטקס, פוליסטירן מעובד בקרבוקסילט, אדום פלואורסצנטיSigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR ירוק I מאסטררוש 4707516001מגיב זה שימש לביצוע PCR.
מסננות MACS SmartStrainers (70 ומיקרו; m)Miltenyi130-110-916
ערכת בדיקת חלבון Micro BCAThermofisher23235
M-PER מאגר מיצוי יונקיםThermofisher78503
MS עמודותMiltenyi130-042-201המכונה עמודות קטנות בפרוטוקול. 
מפריד MultiMACS Cell24 פלוסMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177הערכה שימשה לסינתזה של cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011הערכה מכילה 1-תיוגליצרול ומאגר BL (המכונה מאגר ליזה בפרוטוקול) והיא שימשה לבידוד RNA כולל.
ואקוטיינר בטיחות-לוק 21 גרםבקטון דיקינסון367282

מקורות

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD11b
בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.