הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גידול ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לסיסטיק פיברוזיס כדי לחקור פנוטיפים קהילתיים

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66785

⸱

19 באפריל 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מודל ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לארבעה מינים של סיסטיק פיברוזיס (CF), שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים.

תקציר

רוב המודלים במבחנה חסרים את היכולת לחקור באופן מלא פנוטיפים חיידקיים הנובעים מהאינטראקציות המורכבות שנצפו בסביבות בחיים האמיתיים. זה נכון במיוחד בהקשר של זיהומים קשים לטיפול, כרוניים ופולימיקרוביאליים מבוססי ביופילם שזוהו בדרכי הנשימה של אנשים החיים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה גנטית מרובת איברים. בעוד שמחקרי מיקרוביום רבים הגדירו את ההרכבים המיקרוביאליים שזוהו בדרכי הנשימה של אנשים עם CF (pwCF), אף מודל במבחנה עד כה לא שילב באופן מלא תכונות ריאה קריטיות הרלוונטיות ל-CF. לכן, קיים פער ידע משמעותי ביכולת לחקור את המנגנונים המניעים את הפתוגנזה של זיהומי ריאות מסוג CF ממינים מעורבים. במאמר זה אנו מתארים מודל של קהילה מיקרוביאלית של ארבעה מינים שפותח לאחרונה, כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis ו-Prevotella melaninogenica הגדלים בתנאים דמויי CF. באמצעות שימוש במערכת זו, פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית כגון סרבנות מיקרוביאלית של מספר פתוגנים נצפו ונחקרו ברמה המולקולרית. התועלת של מודל זה במבחנה טמונה בזרימת העבודה הסטנדרטית שלו שיכולה להקל על המחקר של אינטראקציות בין מינים בהקשר של דלקות ריאה כרוניות של CF.

מבוא

אסטרטגיות שמטרתן לחסל חיידקים גורמי מחלות כמו אלה שזוהו בדרכי הנשימה של סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה גנטית מרובת איברים, נכשלות לעתים קרובות1. כלומר, נוכחותן של קהילות מיקרוביאליות עמידות דמויות ביופילם הגדלות בסביבת ריאות CF עשירה בריר עלולה לגרום לזיהומים כרוניים הנפרשים על פני עשורים רבים2. יתר על כן, למרות שהשימוש במיקרוביאלים בקו הראשון (Abx) ומודולטורים הביא לתוצאות משופרות אצל אנשים עם CF (pwCF), הגישה הקלינית "באג אחד, זיהום אחד" המיושמת בדרך כלל נגד פתוגנים קנוניים של CF כגון Pseudomonas aeruginosa ו- Staphylococcus aureus לא הייתה יעילה בפתרון זיהומים קשים לטיפול שזוהו בריאות של אנשים אלה 3,4, 5,6,7.

במהלך שני העשורים האחרונים, מחקרים רבים שינו את ההבנה שלנו לגבי מחלת ריאות כרונית של CF8. כלומר, דיווחים מצביעים על כך שזיהומים המתגלים בדרכי הנשימה של pwCF אינם נגרמים אך ורק על ידי פתוגן יחיד אלא הם רב-מיקרוביאליים בטבע8. יתר על כן, למרות שהפתוגנזה של זיהומי ריאות מסוג CF ממינים מעורבים עדיין אינה מובנת היטב, ראיות קליניות מראות כי pwCF הנגועים יחד הן ב- S. aureus והן ב- P. aeruginosa בדרכי הנשימה שלהם החמירו את תפקוד הריאות מאשר אנשים שהתיישבו על ידי אחד משני פתוגנים אלה9.

אינטראקציות בין מינים בין פתוגנים של CF משוערות כסיבה לכך שזיהומים רב-מיקרוביאליים מבוססי ביופילם אינם מוגרים בקלות באמצעות שימוש בטיפולי CF, ובסופו של דבר משפיעים על תוצאות המטופלים3. לתמיכה בכך, מחקרי מבחנה הראו כי אינטראקציות בין חיידקים כגון P. aeruginosa, S. aureus ואחרים יכולות להשפיע על פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית כגון תגובת Abx לתרופות CF בקו הראשון, כולל ונקומיצין וטוברמיצין 6,10,11. לכן, עדיין יש לבחון מחדש את אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות שמטרתן למגר פתוגנים של CF בהקשר של זיהומים ממינים מעורבים.

תקן הזהב בניהול זיהומי ריאות CF מבוססי חיידקים מסתמך במידה רבה על השימוש בבדיקות רגישות מיקרוביאליות (AST) כדי להנחות התערבויות קליניות12. עם זאת, AST נעשה בדרך כלל באמצעות מונוקולטורות חיידקיות הגדלות בתרביות עשירות ומעורבות היטב, אשר אינן משקפות את תנאי הגידול המיקרוביאליים שזוהו בדרכי הנשימה של CF 3,13. בהתחשב בנתק המשמעותי בין תוצאות המטופלים לבין הצלחת הטיפול, דוחות קליניים תומכים כעת בפיתוח גישות חדשניות המשלבות תכונות קריטיות של ריאה CF12,14.

מחקרים מעטים פיתחו מערכות מבחנה חיידקיות רלוונטיות ל-CF המכילות יותר משני פתוגנים 15,16. עם זאת, מודלים אלה (1) אינם משקפים לחלוטין את האופי הפולימיקרוביאלי ודמוי הביופילם של ריאת CF ו-(2) אינם משתמשים בתנאים תזונתיים וסביבתיים הקרובים לאלה שזוהו בנתיב האווירCF 15,16. באמצעות כרייה של מערכי נתונים גדולים של 16S rRNA שמקורם ב-CF-ריאה וחישוב, ז'אן-פייר ועמיתיו פיתחו לאחרונה מודל תרבית משותפת במבחנה המשלב את התכונות הנ"ל10. מערכת זו כוללת P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. ו- Prevotella spp. גדל בתנאים דמויי דרכי נשימה CF ויציב עד 14 יום. המחברים דיווחו גם על צמיחה ספציפית לקהילה של Prevotella spp. וכמה שינויים בתגובת Abx של פתוגנים CF אלה באמצעות מנגנונים שנותרו לזיהוי10. מערכת מבחנה זו הציעה גם את האפשרות להתעמק בשאלות ממוקדות מכניסטית הקשורות לסרבנות Abx של גרסה נפוצה של P. aeruginosa המתגלה לעתים קרובות בדרכי הנשימה של pwCF10. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק לקהילת המחקר של CF זרימת עבודה ניסיונית סטנדרטית לגידול ביופילם במבחנה שיש לו פוטנציאל להתרחב עוד יותר כדי להתמודד עם מספר שאלות רלוונטיות ל-CF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיום כיח מלאכותי

הערה: לאורך פרוטוקול זה, מדיום כיח מלאכותי (ASM) מוגדר כמדיום הרלוונטי ל-CF שונה מ-SCFM2, שפורסם בעבר על ידי טרנר ועמיתיו17. להלן תיאור השלבים להכנת מדיום זה. ראה טבלת חומרים להכנת פתרונות מלאי ותנאי אחסון. גרסה זו של ASM שונה מטרנר ואחרים,17 מכיוון שקיבולת האגירה בגרסה המקורית אינה מאפשרת pH יציב לאורך זמן. כלומר, פעילות התסיסה המבוצעת על ידי סטרפטוקוקוס spp. ואנאירובים כמו Prevotella spp. גורמת להחמצה של מדיום הגידול (תצפיות שלא פורסמו). לכן, ריכוז 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) הותאם מ-10 mM ל-100 mM.

הערה: הכנת תמיסת מלאי 2x ASM base (ASMb) מאפשרת הוספה של רכיבים כגון מוצין, אגר, מים וכו ', מבלי להשפיע על הריכוז הסופי של מולקולות הקיימות ב- ASM10,18. ניתן להכין מראש את 2x ASMb ולאחסן ב 4 ° C למשך עד שבועיים במקום חשוך. אם המדיום הופך צהוב, להשליך.

  1. כדי להכין 2x ASM בסיס מלא, בתוך נקייה המכילה 400 מ"ל של diH2O, להוסיף את הדברים הבאים תוך כדי ערבוב:
    1. הוסף 6.50 מ"ל של 0.2 מ 'NaH2PO4. H2O מלאי; 6.25 מ"ל של מניית 0.2 M Na2HPO4 ; 348 μL של 1 M KNO3 מניה; 1.084 מ"ל של מניית 0.25 M K2SO4 .
    2. להוסיף 4.0 גרם של שמרים נשירה סינתטית ללא טריפטופן; 3.032 גרם של NaCl; 20.92 גרם של MOPS; 1.116 גרם של KCl ו- 0.124 גרם של NH4Cl.
    3. הוסף 9.30 מ"ל של 1 M L-חומצה לקטית ציר; 2.70 מ"ל של מלאי גלוקוז 1.1 מ '; 1.75 מ"ל של 1 M CaCl 2.2H 2O מניה; 1.20 מ"ל של מלאי N-אצטילגלוקוזאמין 0.25 מ"ל ו-1.00 מ"ל של מלאי FeSO4.7H 2O של 3.6 מילימול.
    4. הוסף 660 μL של מלאי טריפטופן 0.1 M; 606 μL של 1 M MgCl2.6H 2O מלאי; 0.60 גרם של חומצה deoxyribonucleic מזרע הרינג; 400 μL של 250 מ"ג/מ"ל 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) מלאי.
    5. לאחר הוספת כל הרכיבים, התאם את ה- pH ל- 6.80 עם מלאי NaOH של 5 M. השלם עד 500 מ"ל עם diH2O. יש לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, ולאחסן ב-4°C.
  2. להכנת ציר מוצין במינון 10 מ"ג/מ"ל (2x), השתמשו בבקבוק זכוכית נקי המכיל 250 מ"ל של diH2O ותוך כדי ערבוב:
    1. הוסף 5.0 גרם של mucin מן הבטן חזיר - סוג II. מערבבים את המתלים במשך 10 דקות. השלם עד 500 מ"ל עם diH2O.
    2. יש לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C עד לניצול.
  3. להקים מחדש את ASM.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע ביום הניסוי.
    1. ערבבו יחס נפח של 1:1 בין מלאי ASMb 2x לבין מלאי מוצין 10 מ"ג/מ"ל.
    2. יש לערבב היטב לפני השימוש.

2. הכנת מדיה סלקטיבית קהילתית רב-מיקרוביאלית

הערה: להלן הכמויות הדרושות להכנת נפח של 1 ליטר מדיה.

  1. להכנת אגר מלח מניטול (MSA) ואגר בידוד פסאודומונס (PIA), פעל לפי הוראות היצרן.
  2. כדי להכין אגר סלקטיבי Prevotella (PSA), בבקבוק זכוכית נקי, הוסף את הדברים הבאים:
    1. 30.0 גרם של מרק סויה טריפטי (TSB). 15.0 גרם של אגר. 5.00 גרם של תמצית שמרים. 0.50 גרם של L-ציסטאין הידרוכלוריד.
    2. 10.0 מ"ל של 0.5 מ"ג / מ"ל מלאי המין. 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל מלאי menadione.
    3. מוסיפים 940 מ"ל של diH2O ומערבבים. יש לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות.
    4. כאשר מקורר (כלומר, ניתן להחזיק את הבקבוק יחף), מוסיפים תוך כדי ערבוב: 50.0 מ"ל של דם כבשים מנותק. 2.00 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל מלאי קנמיצין. 150 μL של 50 מ"ג / מ"ל מלאי vancomycin. 500 μL של 10 מ"ג / מ"ל פולימיקסין B מלאי.
  3. כדי להכין אגר סלקטיבי סטרפטוקוקוס (SSA), בבקבוק זכוכית נקי, הוסף את הדברים הבאים:
    1. 30.0 גרם של TSB. 15.0 גרם של אגר.
    2. מוסיפים 950 מ"ל של diH2O ומערבבים. יש לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות.
    3. כאשר מקורר (כלומר, ניתן להחזיק את הבקבוק יחף), מוסיפים תוך כדי ערבוב: 50.0 מ"ל של דם כבשים מנותק. 1.00 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פולימיקסין B מלאי. 1.00 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל מלאי חומצה אוקסולינית.
      הערה: יוצקים לצלחות ושומרים על טמפרטורה של 4°C למשך חודש אחד לכל היותר. לפני השימוש, תנו לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר עד 24 שעות מראש לפני שהן מחוסנות. PSA אומת עם P. melaninogenica ו - Prevotella intermedia. SSA אומת עם S. sanguinis, וקבוצת Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, ו - Streptococcus anginosus, המסומנים כ- SMG). מומלץ מאוד דה נובו לאמת את המדיה הסלקטיבית הזו אם רוצים לבדוק זנים חדשים.

3. הכנת מדיה נוזלית חיידקית ותנאי גידול

  1. כדי לגדל באופן שגרתי P. aeruginosa ו - S. aureus, השתמש במדיום סטרילי עשיר (למשל, מרק ליזוגני (LB) או TSB).
    1. התחל נוזל לילה על ידי בחירת מושבה אחת שגדלה בעבר על צלחת אגר LB/TSB במשך 20-24 שעות ב 37 ° C.
    2. הגדילו את תרביות המרק בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה עם ניעור ב-250 סל"ד למשך 16-18 שעות.
  2. כדי לגדל סטרפטוקוקוס spp., השתמשו במרק טוד יואיט סטרילי בתוספת תמצית שמרים 0.5% (THB-YE).
    1. התחל תרבית נוזלית בן לילה ממושבה אחת שגודלה בעבר על צלחת אגר TSB בתוספת דם כבשים 5% (צלחת אגר דם) למשך 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO2.
    2. לגדל את תרביות THB-YE באופן אנאירובי או ב 37 ° C + 5% CO2 לילה מבלי לרעוד במשך 18-22 שעות.
  3. כדי לגדל Prevotella spp., להכין 1 ליטר של Prevotella growth medium (PGM) על ידי הוספת הדברים הבאים לבקבוק נקי:
    1. 30.0 גרם של TSB. 5.00 גרם של תמצית שמרים. 0.50 גרם של L-ציסטאין הידרוכלוריד. 10.0 מ"ל של מלאי האמין של 0.5 מ"ג/מ"ל ו-100 מיקרוליטר של מלאי מנדיון של 10 מ"ג/מ"ל.
    2. הוסף 990 מ"ל של diH2O. לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות. עטפו את הבקבוק ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.
    3. לגדל מושבות Prevotella spp. על צלחת אגר דם מודגר אנאירובית ב 37 ° C במשך 48 שעות.
    4. יש לחסן מושבה אחת ב-PGM ולגדול במשך הלילה מבלי לרעוד בטמפרטורה אנאירובית של 37°C למשך 24 שעות.
      הערה: PGM יכול להישמר בטמפרטורת החדר עד שבועיים. מומלץ מאוד לבצע בדיקות סטריליות בכל מדיום גידול לפני השימוש. אם לא משתמשים בתא אנאירובי, ייתכן שיהיה צורך להתחיל לילה נוזלי של Prevotella spp. מ טלאי של מושבות.

4. הכנת ניסוי בתרבות משותפת

הערה: איור 1 מתאר זרימת עבודה ניסיונית מסוכמת. הגדרת הניסוי יכולה להיעשות בתנאים אוקסיים אם זמן ההכנה לוקח פחות מ 1 שעה. אם זה צפוי לקחת יותר זמן מזה, מומלץ מאוד לבצע את הניסוי באמצעות תא אנאירובי (עם 10% CO2, 10% H2, ו 80% N2 גז מעורב). ניתן להשתמש בצנצנות אנאירוביות גם כדי לדגור על דגימות הניסוי.

  1. הכנת המונוקולטורה והתרבויות המשותפות
    הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. עבור התרביות המשותפות, ערבבו את דגימות החיידקים רגע לפני חיסון צלחות 96 הבארות. בדרך כלל, נפח של 1 מ"ל עבור זנים P. aeruginosa ו - S. aureus נאספים מתרביות הלילה. עבור Streptococcus spp. ו - Prevotella spp., נפחי הלילה עשויים לנוע בין 2-4 מ"ל. ניתן לכוונן אמצעי אחסון אלה בהתאם למספר התנאים שיש לבדוק.
    1. באמצעות הנוזל החיידקי מתרביות הלילה, בצע את השלבים הבאים:
      1. עבור הזנים P. aeruginosa ו-S. aureus, יש לשטוף פעמיים באמצעות מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS).
      2. עבור Streptococcus spp. ו - Prevotella spp., יש לשטוף פעם אחת עם PBS סטרילי.
        הערה: השתמשו בפיפט כדי להשליך בזהירות סופרנאטנטים, מכיוון שהכדורים יכולים ללכת לאיבוד בקלות.
      3. לאחר השטיפה, יש להשהות מחדש כל גלולה ב-1 מ"ל של 1x ASMb מדולל במים.
      4. בצע דילול של 1:10 של כל דגימה ב- PBS סטרילי ומדוד את OD600.
      5. התאם את כל התרביות ל- OD600 של 0.2 ב- ASM.
      6. באמצעות תרחיפים OD600 = 0.2, לדלל ב- ASM את דגימות החיידקים ל- OD600 סופי של 0.01 (עבור כל מיקרוב) עבור מונוקולטורה ותרביות משותפות.
      7. מערבולת ביסודיות במשך 5 שניות.
        הערה: לדוגמה, כדי להכין סך של 1 מ"ל של תרחיף ASM מונוקולטורה P. aeruginosa ב- OD600 = 0.01, הוסף 50 μL של P. aeruginosa ב- OD600 = 0.2 לנפח של 950 μL של ASM. עבור תרבית משותפת, לקחת 50 μL של כל P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. ו Prevotella spp. suspension ב OD600 = 0.2 ולהוסיף 800 μL ASM.
      8. בעזרת פיפטה, הוסף 100 μl של מתלי מונוקולטורה ותרבות משותפת בשלוש בארות נפרדות של צלחת פלסטיק סטרילית שטוחה 96 בארות.
      9. לדגור על הצלחת (ללא טלטול) במשך 24 שעות ב 37 ° C בתנאים אנוקסיים.
        הערה: מתחי חמצן אחרים (למשל, מיקרוקסיה, נורמוקסיה) יכולים לשמש גם כאן. עם זאת, המודל פותח ואומת עם תנאים אנוקסיים. אשרו את החיסון ההתחלתי על ידי דילול סדרתי של תרחיפים חיידקיים מונו ותרבית משותפת, וציפוי על PIA, MSA, SSA ו- PSA מומלץ מאוד. ריכוז ההתחלה הממוקד עבור כל מין חיידקים הוא 1 × 107 CFU/mL (P. aeruginosa), 3.5 × 106 CFU/mL (S. aureus), 1.2 × 106 CFU/mL (Streptococcus spp.), ו- 4.6 × 106 CFU/mL (Prevotella spp). חיסון חיידקי יכול גם להיות שונה, כפי שתואר על ידי ז'אן-פייר ועמיתיו10.
  2. החלף את המדיה לאחר היווצרות ביופילם.
    1. לאחר 24 שעות של דגירה, להסיר את התאים unconnected (planktonic) על ידי שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    2. לחדש את הביופילמים שנוצרו מראש עם 100 μL של ASM טרי או הטיפול הרצוי (למשל, אנטיביוטיקה, מטבוליטים, וכו ').
    3. לדגור על הצלחת במשך 24 שעות נוספות ב 37 ° C בתנאים אנוקסיים.
      הערה: ניתן לבצע צעדים אלה באופן אירובי אם הם מבוצעים במהירות (כלומר, פחות מדקה). אחרת, אנא השתמש בתא אנאירובי.

5. איסוף וציפוי הדגימות

  1. לאחר 24 שעות נוספות של הדגירה, שואפים את התאים שאינם מחוברים (פלנקטוניים) עם פיפטה רב ערוצית.
    הערה: ניתן לשמור את החלק הפלנקטוני, לדלל אותו סדרתית ולצפות אותו על מדיה סלקטיבית או להשליך אותו.
  2. שטפו בעדינות את הביופילמים פעמיים באמצעות 125 מיקרוליטר של PBS סטרילי והשליכו את הכרכים.
  3. הוסף 50 μL של PBS סטרילי ונתק את הביופילמים על ידי גירוד עדין של התאים מהצלחת באמצעות משכפל של 96 פינים.
  4. מעבירים את תאי הביופילם המרחפים לשורה A של צלחת סטרילית חדשה בת 96 בארות.
    הערה: לוח 96 הקידוחים יכיל PBS סטרילי בשורות B עד H.
  5. בצע דילול סדרתי פי 10 של שברי הפלנקטוניק (במידת הצורך) והביופילם.
  6. צלחת 3-5 μL של כל דגימת דילול על PIA, MSA, SSA ו- PSA.
  7. הניחו לכתמי החיסון להתייבש.

6. דגירה על לוחות סלקטיביים וספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU)

  1. עבור P. aeruginosa ו - S. aureus, לדגור ב 37 ° C במשך 18-20 שעות.
  2. עבור סטרפטוקוקוס spp, לדגור ב 37 ° C בתנאים אנוקסיים במשך 24 שעות.
  3. עבור Prevotella spp, לדגור ב 37 ° C בתנאים anoxic במשך 48 שעות.
  4. לאחר הדגירה, לספור את המושבות (~ 10-35 לכל נקודה) ולחשב את CFU לכל מ"ל.
  5. התווה את הנתונים באמצעות כלי תצוגה חזותית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמיוצג באיור 2, דווחו מספר פנוטיפים, כולל (1) ירידה במספר ספירות התאים בנות קיימא של P. aeruginosa ו-S. aureus כאשר גדלו קהילות פלנקטוניות מעורבות בהשוואה למונוקולטורה, (2) עלייה בצמיחה רב-מיקרוביאלית של תאי S. sanguinis , ו-(3) גידול קהילתי מעורב של P. melaninogenica כפי שדווח בעבר על-ידי ז'אן-פייר ועמיתיו10.

יתר על כן, כפי שמתואר באיור 1, המערכת במבחנה יכולה לש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התועלת של מערכת תרבית משותפת במבחנה זו, בעלת מידע קליני, טמונה ביכולתה לזהות תפקודים חיידקיים ספציפיים לחיידקים רב-מיקרוביאליים. כלומר, באמצעות השימוש במודל הזה דיווחנו על פנוטיפים מיקרוביאליים החל מגידול ספציפי לקהילה של Prevotella spp. (איור 2) ועד שינויים ברגישות ל-CF Abx בקו הקדמי של P. aeruginosa, S. aureus ו-S. sanguinis (איור 3). יתר על כן, אף על פי שהנתונים המוצגים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אינם חושפים.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר ג'ורג' א' אוטול ולד"ר תומס ה' המפטון על תפקידם המשמעותי בעיצוב ופיתוח מודל הקהילה הפולימיקרוביאלית במבחנה . אנו מודים לד"ר סופי רוביטייל על הערותיה המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן סיסטיק פיברוזיס JEAN21F0 ל- F.J-P. איור 1 של כתב היד נוצר באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928הכינו ציר של 250 מ"ג/מ"ל בכלורופורם ישירות בבקבוק. שמור על -20°C. ריכוז סופי 200μ גרם/מ"ל בבסיס ASM 2x.
3-מורפולינופרופאן-1-חומצה סולפונית (MOPS)SigmaM1254ריכוז סופי 200 מ"מ בבסיס 2X ASM.
משכפל 96 פיניםפישר סיינטיפיק05-450-9ניתן להשתמש גם במשכפלים חד פעמיים. חתול #NC1567338.
צלחת סטנדרטית סטרילית 96 בארות עם מכסהפישר סיינטיפיק62406-081
אגרפישר סיינטיפיקDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 ליטר צנצנת מלבניתפישר סיינטיפיק23-246-385
CaCl2*2H2O פישר סיינטיפיקC79-500הכן מלאי של 1 M במים ועיקור מסנן עם 0.22 μ מסנן M. ריכוז סופי 3.5 מ"מ בבסיס ASM 2x.
כבשים נטול פריבריןלהכנת צלחות גדילה לסטרפטוקוקוס ופרבוטלה.
חומצה דאוקסיריבונוקלאית מזרע הרינגSigmaD7290ריכוז סופי 1.2 מ"ג/מ"ל בבסיס ASM 2x.
FeSO4*7H2O פישר סיינטיפיקAA1449830הכינו ציר של 1 מ"ג/מ"ל (3.6 מ"מ) במים וסיננו לעקר עם 0.22 μ מסנן M. שמור עטוף בנייר אלומיניום. ריכוז סופי 0.0072 מ"מ בבסיס ASM 2x.
GasPaksFisher ScientificB260678
גלוקוזפישר סיינטיפיקD16-3מכינים כ-20% ציר (1.1 מ') במים ומעקרים על ידי חיטוי. ריכוז סופי 6 מ"מ בבסיס ASM 2x.
HeminSigma51280ממיסים 100 מ"ג של המין ב-2 מ"ל של 1 M NaOH ולאחר מכן מעלים את הנפח ל-200 מ"ל עם מים. יש לאחסן בבקבוק ענבר או בבקבוק רגיל עטוף בנייר אלומיניום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
K2SO4FisherScientific P304-500הכינו מלאי של 0.25 מ' במים וסננו לעקר עם 0.22 μ מסנן M. ריכוז סופי 0.54 מ"מ בבסיס ASM 2x.
קנמיציןהכינו תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל במים. מסנן לעקר עם 0.22 μ m מסנן ושומר ב -4 מעלות צלזיוס.
KClFisher ScientificP217-500ריכוז סופי 30.0 מ"מ בבסיס ASM 2x.
KNO3Fisher ScientificP263-500הכינו מלאי של 1 מ' במים וסינון עיקרו עם 0.22 μ מסנן M. ריכוז סופי 0.70 מ"מ בבסיס ASM 2x.
L-ציסטאין הידרוכלורידFisher ScientificAAA1038922
חומצה לקטית SigmaL1750הכן ציר של 1 M במים ומסנן לעקר עם 0.22 μ מסנן M. pH מותאם ל-7.0. ריכוז סופי 18.6 מ"מ בבסיס ASM 2x.
L-TryptophanSigmaT0254הכן מלאי של 0.1 M ב-0.2 M NaOH ועקר מסנן עם 0.22 μ מסנן M. שומרים בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות; C עטוף בנייר אלומיניום. ריכוז סופי 0.132 מ"מ בבסיס ASM 2x.
מניטול מלח אגרפישר סיינטיפיקB11407הכן באמצעות המלצות היצרן.
MenadioneSigmaM5625הכן תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל מומסת באתנול 96-100%. חיסכון ב-4 מעלות; C עטוף בנייר אלומיניום. מערבולת לפני השימוש.
MgCl2*6H2O פישר סיינטיפיקAA12288A9הכינו מלאי של 1 מ' במים ועיקרו מסננים עם 0.22 μ מסנן M. ריכוז סופי 1.21 מ"מ בבסיס ASM 2x.
מוצין מקיבת חזיר - סוג II SigmaM2378הכינו ציר של 10 מ"ג/מ"ל (2x) במים; ערבבו היטב לפני החיטוי. שמור על 4 מעלות צלזיוס.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500הכן מלאי של 0.2 מ' במים ועקר מסנן עם 0.22 μ מסנן M. ריכוז סופי 2.5 מ"מ בבסיס ASM 2x.
N-אצטיל גלוקוזאמין סיגמאA8625הכן מלאי 0.25 מ' במים ומסנן לעקר עם 0.22 μ מסנן M. שמור את המלאי בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
NaClFisher ScientificS271-500ריכוז סופי 103.7 מ"מ בבסיס ASM 2x.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500הכן מלאי של 0.2 מ' במים ומסנן לעקר עם 0.22 μ מסנן M. ריכוז סופי 2.6 מ"מ בבסיס ASM 2x.
NaOHFisher ScientificS318-500הכן תמיסת מלאי של 5 M. השתמש כדי להתאים את ה-pH של מלאי בסיס 2x ASM.
NH4ClFisher ScientificA661-500ריכוז סופי 4.6 מ"מ בבסיס ASM 2x.
חומצההכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל 0.5 M NaOH. מסנן לעקר עם 0.22 μ m מסנן ושומר ב -4 מעלות צלזיוס.
פולימיקסין Bמכינים תמיסת ציר של 10 מ"ג/מ"ל במים. מסנן לעקר עם 0.22 μ m מסנן ושומר ב -4 מעלות צלזיוס.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1הכן באמצעות המלצות היצרן.
טוד יואיט מרקפישר מדעיDF0492-17-6הכן באמצעות המלצות היצרן.
מרק סויה טריפטיפישר מדעיDF0370-17-3הכן באמצעות המלצות היצרן.
ונקומיציןהכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל במים. מסנן לעקר עם 0.22 μ m מסנן ושומר ב -4 מעלות צלזיוס.
תמצית שמריםFisher ScientificB11929
נשירה סינתטית של שמרים ללא טריפטופן SigmaY1876ריכוז סופי 8.0 מ"ג/מ"ל בבסיס ASM 2x.
דם אוקסולינית

מקורות

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317(2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258(2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604(2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423(2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822(2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ביופילם של סיסטיק פיברוזיסמודל של קהילה מיקרוביאליתמודל במבחנהPseudomonas AeruginosaStaphylococcus AureusStreptococcus SanguinisPrevotella Melaninogenicaעמידות לאנטימיקרוביאלייםאינטראקציות של מיקרוביומה
גידול ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לסיסטיק פיברוזיס כדי לחקור פנוטיפים קהילתיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.