מחקר זה מתאר הדמיית תהודה מגנטית משולבת (MRI) ופרוטוקול אולטרסאונד ממוקד פועם בעוצמה נמוכה (FUS), תוך שימוש בחולדות חיות עם צנתור וריד צוואר כדי לנטר את פתיחת מחסום הדם-מוח (BBB).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניטור פתיחת מחסום דם-מוח בחולדות באמצעות מערכת אולטרסאונד ממוקדת פרה-קלינית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
למוח יש מחסום דם חדיר למחצה סלקטיבי ביותר, המכונה מחסום דם-מוח (BBB), המונע העברת חומרים מקרו-מולקולריים טיפוליים למוח. השילוב של אולטרסאונד ממוקד פועם בעוצמה נמוכה (FUS) מונחה MR עם הזרקה מוקדמת של מיקרו-בועות הוא טכניקה מבטיחה לאפנון BBB לא פולשני ולא רעיל. MRI יכול להציע ניגודיות מעולה של רקמות רכות והערכות כמותיות שונות, כגון חדירות כלי דם, זלוף והתפלגות מרחבית-זמנית של חומרי ניגוד MRI. יש לציין כי טכניקות MRI משופרות ניגודיות עם חומרי ניגוד MR מבוססי גדוליניום הוכחו כתקן הזהב לזיהוי פתחי BBB. מחקר זה מתאר מתודולוגיה מקיפה הכוללת פרוטוקולי MRI ונהלים בבעלי חיים לניטור פתיחת BBB במודל חולדות. מודל החולדות מספק את היתרון הנוסף של ניצול צנתר וריד הצוואר, המאפשר מתן תרופות מהיר. מתמר FUS פרה-קליני מונחה סטריאוטקטי מקל על חידוד וייעול של נהלים בבעלי חיים ופרוטוקולי MRI. השיטות המתקבלות מאופיינות בשחזור ובפשטות, ומבטלות את הצורך במומחיות כירורגית מיוחדת. מחקר זה מנסה לתרום לאופטימיזציה של הליכים פרה-קליניים עם מודלים של חולדות ולעודד חקירה נוספת של אפנון ה-BBB כדי לשפר את ההתערבויות הטיפוליות בהפרעות נוירולוגיות.
מבוא
ה-BBB מווסת את תנועת היונים, המולקולות והתאים בין כלי הדם לרקמות המוח1. פונקציה זו מאפשרת שמירה על תפקוד ובריאות עצביים תוך מניעת אספקה של חומרים מקרומולקולריים טיפוליים לרקמות המוח. החדירות המוגבלת של ה-BBB עלולה לגרום להפחתת היעילות והיעילות של טיפולים בגידולי מוח ומחלות ניווניות, כגון מחלת פרקינסון, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת אלצהיימר2. לפיכך, גישות שונות, כגון אספקה משופרת בהסעה, זריקות תוך גולגולתיות ישירות, הפרעה אוסמוטית ועיצוב תרופות משופר, נחקרו כדי לעקוף את ה-BBB לאספקה מבוקרת של חומרים טיפוליים3,4,5.
עם זאת, לגישות אלה יש מגבלות מהותיות כגון פולשניות, סיכון לזיהום, סיכון לדימום, הטרוגניות ושטף מהיר של תרופות. אולטרסאונד ממוקד פועם בעוצמה נמוכה (FUS) עם הזרקת מיקרו-בועות הוא טכניקה מבטיחה ולא פולשנית המאפשרת הפרעה מקומית והפיכה של BBB. ההשפעות המכניות של אולטרסאונד בשילוב עם מיקרו-בועות יכולות לשנות באופן חולף את החדירות של ה-BBB (כלומר, פתיחת BBB)6,7. להתקדמות נוספת ביישומי טיפול באמצעות פתיחת BBB, ניסויים בבעלי חיים קטנים הם חיוניים.
במחקר זה, הצגנו פרוטוקולי MRI ונהלים של בעלי חיים כדי לנטר את פתיחת ה-BBB במודל של חולדות. הפרוטוקול כלל מודל של חולדה עם קטטר וריד צוואר שהועבר על ידי ארגון מסחרי (ראה טבלת חומרים). למודל חולדות של צנתור וריד צוואר יש את היתרונות הפוטנציאליים של מתן תרופות מהיר, בדיקות ניטור המודינמיות וצנתור יציב. פתיחת BBB הושגה באמצעות מערכת FUS פרה-קלינית. מערכת זו, שתוכננה במיוחד עבור פתיחת BBB בדגמי בעלי חיים קטנים כגון חולדות ועכברים, משלבת רכיבים חיוניים, כגון מערכת שולחנית, מחשב בקרה, מתמר, מסיר מים ואביזרים נלווים. השימוש במערכת FUS פרה-קלינית מונחית סטריאוטקטית זו לא רק משפר את הדיוק, אלא גם מייעל הליכים בבעלי חיים ופרוטוקולי MRI, ותורם לשחזור ולפשטות של פרוטוקול הניסוי הכולל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו (UCSF). במחקר זה נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley זכרים (200-250 גרם). חולדות שוכנו וטופלו על פי הנחיות המשרד הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים בעכברים וחולדות. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת בעלי חיים
הערה: לצורך פרוצדורות פנימיות, החיות הועברו לחדר ההכנה והנהלים נערכו כדלקמן:
- הניחו את החולדות בנפרד בתא לוסיט וחשפו איזופלורן (2%-3%) מעורבב עם חמצן המופק ממיכל חמצן רפואי עד שהן מאבדות את ההכרה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
הערה: הרדמה באמצעות איזופלורן מאפשרת יישום של פרוטוקול MRI ארוך טווח. - הסר את החולדות מהתא וגלח שיער מהאזורים הקדמיים והאחוריים של הצוואר באמצעות קרם להסרת שיער (אפילטורי).
- יש למרוח משחת סיכה על העיניים.
- הנח את האף לתוך חרוט האף כדי לשמור על הרדמה עם נשימה ספונטנית (מכשיר אידוי איזופלורן בין 2%-2.5%, מד זרימת חמצן ל-1-1.5 ליטר לדקה).
- הניחו את החולדה המורדמת על שולחן כירורגי מחומם ואשרו בעזרת צביטה בבוהן.
הערה: פרוטוקול ה-MRI כלל רצפים משופרים בניגודיות, כגון הדמיית הד שיפוע משוקלל T1 והדמיית הד ספין משוקלל T2. רצפים אלה נערכו לפני ואחרי הזרקת חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום (GAD) כדי להעריך את חדירות מחסום הדם-מוח (BBB). זה כרוך במתן חומרי ניגוד GAD בזמן שהחולדה נמצאת בסורק MRI7. כדי להקל על תהליך זה, נעשה שימוש בצינורות קטטר המשתרעים מהקטטר המקונטל בחולדה. ההארכה כללה מחבר קטטר וצינורות פוליאתילן בגודל 30 ס"מ. כדי להבטיח סבלנות ולמנוע דליפה, צינורות ההארכה נשטפו בגליצרול הפריני (250 יחב"ל הפרין/1 מ"ל גליצרול).
2. מערכת אולטרסאונד ממוקדת מונחית סטריאוטקטית
הערה: החיות הועברו והונחו על שולחן במערכת FUS סטריאוטקטית. האף של החולדה הוכנס לתוך חרוט האף כדי לשמור על הרדמה. מערכת FUS כוללת מחולל פונקציות, מגבר RF ואוסילוסקופ. לפני הגדרת המתמר, דאגנו לחיבור תקין של כל המכשירים למערכת. הגדרת המתמר הושלמה באמצעות השלבים הבאים:
- הניחו מצביע חד במיקום הברגמה בגולגולת ושמרו את המיקום. ניתן לזהות את מיקומה של ברגמה על ידי הצבעה על מיקומו של 9.0 מ"מ לפני למבדה בקו האמצע8. ניתן למצוא את הלמבדה במרכז הקו בין עור התוף הדו-צדדי9.
- הנח ג'ל אולטרסאונד על ראש החולדה, שקית צימוד המים והמתמר (תדר 1 מגה-הרץ). ודא שאין בועות אוויר בין עור החולדה, שקית צימוד המים והמתמר.
- חבר כבל BNC קואקסיאלי של המתמר לכניסה של מודול מערכת FUS.
- במחשב בקרה) לחץ על הטעינה לתמונות חולדה שנרשמו מראש; נבחרים מספר נקודות מוקד ולחץ אקוסטי.
- במחשב בקרה) לחץ על מבחן התנועה במודול הטיפולכדי להבטיח שהמתמר יכול לעבור בין כתמים בתוך תקופת פרץ.
- הגדר את פרמטרי הסוניקציה המתוארים בשלב 3.
3. עירוי מיקרו-בועות וסוניקציה
- הפעל את המיקרו-בועה.
הערה: המיקרו-בועה ששימשה במחקר זה אופיינה בקוטר של 1.7 מיקרומטר וריכוז של 0.2 × 109 חלקיקים למיליליטר10. בקבוקון המיקרו-בועה הופעל על סמך הוראות המרשם שסופקו על ידי הספק ודוח שפורסם בעבר11.- הכן מזרק של 5 מ"ל עם קצה נעילת לואר ומלא ב-5 מ"ל של הזרקת נתרן כלורי 0.9% ללא תוספים.
- הסר את המכסה הירוק וחבר את המזרק לסיכת החלוקה המאווררת (ראה טבלת חומרים) על ידי הברגתו בכיוון השעון.
- הסר את מגן הסיכה והנח אותו במרכז פקק הגומי של הבקבוקון. לחץ כלפי מטה בחוזקה עד שהדוקרן מוכנס במלואו לפקק.
- רוקן את כל מזרק ה-5 מ"ל לתוך הבקבוקון על ידי לחיצה על מוט הבוכנה.
- לנער את הבקבוקון במרץ במשך 20 שניות כדי לערבב את כל התוכן. נוזל לבן וחלב עקבי יראה שנוצרו מיקרוספירות ליפידים של גופרית הקספלואוריד.
- כדי להשיג את המינון הנדרש, הפוך את המזרק ומשוך לאט את הנפח המיועד של המתלה למזרק של 5 מ"ל.
- השתמש במשאבת עירוי.
הערה: גישת העירוי12 שימשה להעברת מיקרו-בועות לחולדות באמצעות משאבת מזרק. מזרק המכיל מיקרו-בועות חובר למחבר קטטר שהוכנס לחולדה. מיקרו-בועות הועברו דרך צינורות פוליאתילן, וקצב זרימת משאבת העירוי הוגדר ל-0.66 מ"ל לדקה. קצב עירוי זה מאפשר הזרקה של 2 מ"ל מיקרו-בועות ממזרק של 3 מ"ל במשך 3 דקות. העירוי התחיל לפני הסוניקציה למשך דקה אחת ונמשך לאורך כל תקופת הסוניקציה של 2 דקות. - בצע סוניקציה.
הערה: במחקר זה, פולסים של FUS נבחרו עם הפרמטרים הבאים: (1) אזור יעד: היפוקמפוס שמאלי; (2) מספר הכתמים: 6 כדי לכסות את ההיפוקמפוס במוח; (3) אורך פרץ: 10 אלפיות השנייה; (4) תקופת פרץ: 1200 אלפיות השנייה; (5) לחץ אקוסטי: 0.65 מגה פיקסל; (6) 'מצב פרץ' בתפריט מצב הסוניקציה במערכת FUS; (7) זמן סוניקציה: 120 שניות.
4. הליך MRI באמצעות סורק פרה-קליני 3T
- לאחר סוניקציה, העבירו את החיות לשולחן בסורק פרה-קליני 3T נטול קריוגן.
- מקם את החולדות במצב שכיבה. שמור על טמפרטורת כרית החימום בסורק, ועקוב אחר קצב הנשימה באמצעות חיישן כרית פנאומטי. בצע את פרוטוקול ה-MRI לבדיקת סוגים שונים של הדמיית MRI (טבלה 1).
- כלול טכניקות הדמיה כמותיות אחרות, כגון הדמיה משוקללת דיפוזיה (DWI), מיפוי T2*, מיפוי T1 ו-MRI דינמי משופר ניגודיות (DCE), בנוסף ל-MRI משופר ניגודיות, כדי להדגים את המעשיות הפוטנציאלית שלו למחקרי הדמיה מגוונים. עיין בטבלה 1 לפרוטוקולי ה-MRI ששימשו במחקר זה.
- הזרקת חומרי ניגוד MRI מבוססי GAD (Gadavist, 1 ממול/ק"ג) לאחר רצף ההד של שיפוע MR משוקלל T1, ורכישת תמונות לאחר GAD.
הערה: עבור חולדה במשקל 200 גרם, הזרקנו 200 מיקרוליטר של חומר הניגוד MRI ואחריו תמיסת מלח של 200 מיקרוליטר כדי לשטוף את הצינור.
5. בדיקה מקרוסקופית של מוח החולדה
הערה: לאחר סריקת ה-MRI, הוזרקו 2 מ"ל של תמיסה כחולה של אוונס (2% מדוללת עם מי מלח עם פוספט), והחולדה הורשתה לנוח לפחות 30 דקות כדי לאפשר לתמיסה להתפשט ולהסתובב בכל הגוף. לאחר מכן, החולדות הורדמו באמצעות מנת יתר של איזופלורן (5%) לבדיקה מקרוסקופית של המוח (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). כדי לאשר המתת חסד, היה צורך באגרוף בהונות והחיה נבדקה להפסקת נשימה למשך דקה אחת לפחות. הליך הזלוף בוצע, ולאחריו נבדקה מוח החולדה. הליך הזלוף מסוכם כדלקמן:
- בצע כריתת בית חזה באמצעות מספריים כירורגיים כדי לחשוף איברים בחזה ולדמיין את אזור הלב.
- חתך (~5 מ"מ) את הפרוזדור הימני.
- הכניסו תמיסת מלח לחדר השמאלי למטרות זלוף.
- פתח את עצם הגולגולת עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף ולהציג את המוח.
הערה: זלוף מספיק אמור לגרום למראה בהיר אחיד של המוח, בעוד שאזורים כחולים מתמשכים מצביעים על דליפת אלבומין הקשורה ל-BBB, כפי שזוהה על ידי כחול אוונס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מחקר זה מציג פרוטוקול פרה-קליני לניטור פתיחת מחסום הדם-מוח (BBB) במודל חולדה באמצעות מערכת FUS מסחרית לבעלי חיים. מערכת ה-FUS הותקנה על שולחן מעבדה או על עגלה גדולה (איור 1). החולדות הורדמו באמצעות איזופלורן מעורבב עם חמצן דרך קונוס אף במסגרת עם מחזיק המתמר. הידרופון בעל תדר תהודה של 500 kHz לזיהוי קוויטציה אקוסטית הוכנס לתוך מתמר ה-FUS בעל תדר תהודה של 1.0 MHz.
כפי שמוצג ב-איור 2, מערכת ה-FUS כוללת הגדרות סוניקציה ויכולת להתאמת מיקומ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פותח פרוטוקול ונוהל בעלי חיים המשתמש במודל חולדה של צנתור וריד צוואר למחקרי פתיחת BBB. בעוד שקיימים פרוטוקולים פרה-קליניים רבים, פרוטוקול זה משלב מערכת FUS זמינה מסחרית ומודל חולדות, ממזער את הליכי ההכנה לבעלי חיים ובכך מבטיח שחזור ניסיוני.
בפרוטוקול זה, בחירת המיקרו-בועות התבססה על יציבותה ואחסון טמפרטורת החדר. מיקרו-בועות מסחריות אחרות עשויות להיחשב כחלופות. Kotopoulis et al. חקרו והשוו סוגים שונים של מיקרו-בועות לסונופורציה בעצימות נמוכה של סרטן הלבלב10. בהתבסס על תו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים רלוונטיים להצהיר עליהם.
תודות
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק K99DE032397 של המכון הלאומי לחקר שיניים וגולגולת פנים (NIDCR), מענק זרעים של מחלקת UCSF (מס' 7504831), מענק UCSF RAP (PI: Kazim Narsinh, MD) וקרן המחקר הגרמנית (DFG, GA 3535/1-1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 מ"ל | BD פלסטיפק | ||
| 20 מ"ל, נתרן כלורי 0.9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| מזרק 3 מ"ל מזרק | BD פלסטיפק | ||
| 5 מ"ל BD | פלסטיפק | ||
| מחט קהה, 21 גרם | טכנולוגיות עירוי SAI | B21-50 | |
| 21 גרם | SAI טכנולוגיות | CC-25-25 | |
| פתרון נעילת קטטר | טכנולוגיות עירוי SAI | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) גליצרול |
| אוונס כחול | סיגמא אולדריץ' | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., ישראל | ||
| גדביסט | באייר | 2068062 | |
| GE וופורייזר איזופלורן | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS משאבת מזרק | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurane USP | Vet אחד | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| חולדות Sprague-Dawley זכר (200– 250 גרם) | צ'ארלס ריבר | ||
| , 18 גרם | BD Precisionglide | ||
| מי מלח חוצץ פוספט | Mediatech | 21-030-CVR | |
| צינורות פוליאתילן | BD אינטרמדיק | ||
| פרה-קליני 3T ללא קריוגן סורק Bruker Biospin | Bruker | Biospec3T | |
| Rat עם צנתור וריד הצוואר | מעבדות | ||
| RK-50 מתמר אולטרסאונד ממוקד | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 מערכת אולטרסאונד ממוקדת ספסל | FUS Instruments | ||
| Sonic | Concepts Sonic Concepts Inc., WA, ארה"ב | ||
| סיכת חלוקה מאווררת | B Braun | 4550560 |
מקורות
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
