הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ושימור בהקפאה של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בעלי יכולת קיימא גבוהה מדם שלם: מדריך למתחילים

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג מדריך נגיש לאיסוף, אחסון והפשרה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים המתאימים לניתוחים ותהליכי עבודה במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. קולקציות פלזמה ומעילים באפי מודגמות גם כן.

תקציר

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) משמשים בדרך כלל במחקר ביו-רפואי על מערכת החיסון ותגובתה למחלות ופתוגנים. פרוטוקול מפורט זה מתאר את הציוד, האספקה והצעדים לבידוד, שימור הקפאה והפשרה של PBMCs באיכות גבוהה ובת קיימא ביותר מתאי דם שלמים המתאימים ליישומים במורד הזרם כגון ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. מתוארים גם פרוטוקולים לעיבוד פלזמה ופרווה באפי מכל הדם במקביל ובמקביל למרכזיות. פרוטוקול שלב אחר שלב קל לביצוע, המשתמש בצנטריפוגות שיפוע צפיפות כדי לבודד PBMCs, מלווה ברשימת תיוג של אספקה, ציוד ושלבי הכנה. פרוטוקול זה מתאים לאנשים עם ניסיון קודם בטכניקות מעבדה וניתן ליישמו במעבדות קליניות או מחקריות. איכות גבוהה של קיום תאים וריצוף RNA נבעו ממרכזיות שנאספו על ידי מפעילים ללא ניסיון מעבדה קודם בשימוש בפרוטוקול זה.

מבוא

פרוטוקול זה מדגים שיטה וזרימת עבודה נגישה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם שלם. פרוטוקול זה מיועד במיוחד לטכנאי מחקר מתחילים, סטודנטים וצוות מעבדה קלינית במטרה להקל על איסוף ושימור בהקפאה של PBMCs מבלי להניח הכשרה מוקדמת בטכניקות מעבדה.

פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה כדי להפריד את מרכיבי הדם המלא לפי צפיפות. דם שלם מורכב מארבעה מרכיבים עיקריים המפורטים לפי סדר ירידת הצפיפות: תאי דם אדומים/אריתרוציטים (~45% מהנפח), תאי דם לבנים (<1% מהנפח), טסיות דם (<1% מהנפח) ופלזמה (~55% מהנפח)1,2,3,4,5,6. ניתן לחלק את תאי הדם הלבנים לשתי קטגוריות על פי מאפייני הגרעינים שלהם: עגולים או מרובי גרעינים6. PBMCs מוגדרים כתאי דם לבנים עם גרעינים עגולים ומורכבים מסוגי התאים הבאים: לימפוציטים (תאי T, תאי B, תאי NK), תאים דנדריטיים ומונוציטים6. תאי דם לבנים מרובי גרעינים כוללים גרנולוציטים, המורכבים מסוגי התאים הבאים: נויטרופילים, בזופילים ואאוזינופילים6. תאי דם לבנים מרובי גרעינים צפופים יותר מאשר PBMCs6. הצפיפויות של כל מרכיב בדם שלם מפורטות בטבלה 1.

בפרוטוקול זה, דם שלם נאסף בצינורות צנטריפוגות הדרגתיות בצפיפות. צינורות אלה מכילים מדיום שיפוע צפיפות ארוז מראש בעל צפיפות של 1.077 גרם / מ"ל. לאחר צנטריפוגה, תאים צפופים יותר, כולל תאי דם לבנים מרובי גרעינים ואריתרוציטים, מופרדים ממרכזיות מרכזיות ומטסיות דם על-ידי מדיום שיפוע הצפיפות (איור 1A)6,7. לאחר מכן נאספים, נשטפים וצנטריפוגות ה-PBMC והטסיות כדי להסיר טסיות. PBMCs מטוהרים כתוצאה מכך נאספים ומאוחסנים ב -80 ° C או בחנקן נוזלי. PBMCs שמורים בהקפאה עשויים להיות מופשרים באופן בר-קיימא ולשמש ישירות בניתוחים במורד הזרם, או בנוסף מעובדים כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים של רכיבים.

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לריצוף RNA באיכות גבוהה ממרכזיות PBMC בנות קיימא ביותר. במאמר זה, PBMCs בודדו ונשמרו בהקפאה ממטופלים במרפאת חוץ. לאחר מכן, מונוציטים בודדו מ-PBMCs על ידי FACS ונותחו באמצעות ריצוף RNA. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם באופן נרחב לצרכים ניסיוניים אחרים כגון תרבית תאים, עריכת גנים, מחקרים פונקציונליים ex-vivo, אנליזות תא בודד, פנוטיפ על ידי ציטומטריה זרימה או ציטומטריה בזמן הטיסה, בידוד של DNA / RNA או חלבונים, שקופיות עבור immunohistochemistry, בין היתר 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

בנוסף לאיסוף PBMC מצינורות צנטריפוגות שיפוע צפיפות, פרוטוקול זה סוקר כיצד לאסוף פלזמה וציפוי באפי באמצעות צנטריפוגה באמצעות צינור EDTA. לאחר צנטריפוגה, דם שלם מופרד לפלזמה, אריתרוציטים ושכבת ממשק דקה שנקראת מעיל באפי שמכילה לויקוציטים (איור 1B)6. המעיל האפי משמש בדרך כלל למיצוי DNA ולניתוחים גנומיים עוקבים19,20. שכבת הפלזמה מכילה את המרכיבים נטולי התאים של דם שלם וניתן להשתמש בה לבדיקות סמנים ביולוגיים21,22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר אושר על ידי UCSD ו- KUMC Human Protections Program ותואם את הצהרת הלסינקי. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתפות ואיסוף דם.

1. עיבוד ושימור בהקפאה של PBMCs

  1. יום לפני איסוף הדם, הדפיסו את רשימת החומרים והריאגנטים המפורטים בטבלה 2 והכינו ותייגו בהתאם.
    הערה: פרוטוקול זה תוכנן לאיסוף של 6 צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות. כל צינור מניב כ-12 מיליון PBMCs, מתוכם כ-50% ו-20% לימפוציטים חיים ומונוציטים בהתאמה. התרחב בהתאם לצרכים ניסיוניים. שים לב שהמספר המוחלט של תאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין חולים או מצבי טיפול.
  2. באמצעות טכניקת הפלבוטומיה הסטנדרטית, יש לאסוף דם שלם ב-6 צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות וצינור EDTA אחד עד למילוי, כ-6 מ"ל נפח.
    הערה: אם נדרשות דגימות ממטופלים מרובים או ממצבי טיפול, ניתן לאחסן את הצינורות שנאספו עד 4 שעות ולאחר מכן לעבד אותם בו-זמנית.
  3. לאחר האיסוף, צנטריפוגו את כל הצינורות במהירות של 1,800 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: עיין בסרטון המשלים 1 להדגמה כיצד להפעיל צנטריפוגה.
  4. לאחר הצנטריפוגה, פתח בזהירות את צינור הצנטריפוגה שיפוע הצפיפות. השתמש פיפטה העברה כדי להסיר ולהשליך את השכבה הצהובה השקופה המכילה פלזמה. אין להפריע לשכבת התאים המעורפלת ישירות מעל מדיום שיפוע הצפיפות. יש לטעות בצד הזהירות, ולהשאיר עודפי פלזמה במקום להשליך PBMCs. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
    הערה: לאחר צנטריפוגה של הצינור המכיל את תווך שיפוע הצפיפות, פלזמה ו- PBMCs יהיו מעל תווך שיפוע הצפיפות; אריתרוציטים וגרנולוציטים ישקעו לתחתית. עיינו באיור 1A להמחשה.
  5. עם פיפטת העברה חדשה, פיפטה את הנפח הנותר המכיל תאים ושאריות פלזמה בכל צינור למעלה ולמטה בעדינות מספר פעמים מעל מדיום שיפוע הצפיפות.
  6. לאחר ההשעיה, פיפטה את התוכן resuspended של הצינור לתוך צינור חרוטי מסומן 50 מ"ל. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
  7. יוצקים את תמיסה 1 (RPMI Medium) לתוך צינור 50 מ"ל עד שהוא מגיע לקו 50 מ"ל.
  8. חזור על שלבים 1.4 עד 1.7 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
    הערה: ודא שדגימות שונות אינן מעורבבות והשתמש בפיפטת העברה חדשה כדי למנוע זיהום.
  9. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פרוטוקול איסוף הפלזמה והבאפי המפורט בסעיף 2 עשוי להסתיים במהלך תקופה זו.
  10. השליכו כמה שיותר סופרנאטנט. יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, הגלולה מכילה PBMCs, והסופרנאטנט מכיל טסיות דם ושאריות פלזמה.
  11. יוצקים צינור 15 מ"ל של תמיסה 2 (RPMI בינוני + 12.5% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר Flavopiridol) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את גלולת PBMC. הפוך בעדינות את הצינור כדי להשהות מחדש את גלולת התא.
  12. שאפו 15 מ"ל של תמיסה 3 (RPMI בינוני + 11.25% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר פלבופירידול + 10% DMSO) באמצעות פיפטה העברה. הוסף טיפה לצינור 50 מ"ל.
    הערה: תמיסה 3 מכילה DMSO, שהוא רעיל לתאים בטמפרטורת החדר. אל תוסיף פתרון 3 עד שהוא מוכן לעיבוד מיידי.
  13. הפכו את הצינור בעדינות 3 פעמים כדי לערבב.
  14. מלאו כל קריוביאל מסומן מראש ומקורר מראש ב-1 מ"ל PBMCs באמצעות פיפטה מרובת מנות.
    הערה: עיין בסרטון המשלים 2 כדי להדגים כיצד להפעיל פיפטה מרובת שירותים.
  15. הניחו את הקריובלים בתוך מיכל הקפאה מקורר מראש. לאחר מכן, העבירו את המיכל למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
  16. חזור על שלבים 1.9 עד 1.13 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
  17. שמור את הקריובלים בתוך מיכל ההקפאה למשך 12 שעות לפחות, ולאחר מכן העבר אותם לקופסת אחסון מסומנת בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: לחלופין, העבר את הקריובלים הקפואים לחנקן נוזלי (<-135 ° C) לאחסון לטווח ארוך.

2. עיבוד פלזמה ופרווה באפי מצינורות EDTA

  1. צנטריפוגה במהירות 1,800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, השכבה העליונה מורכבת פלזמה, התחתון מכיל אריתרוציטים, ואת הממשק יהיה מעיל באפי. ראו איור 1B להמחשה.
  2. בעזרת פיפטת העברה חדשה, ציירו כמה שיותר פלזמה מבלי להפריע לשכבת הפרווה הבאפי. לאחר מכן, לחלק 0.5 מ"ל aliquots לתוך cryovials מראש. שאפו את שכבת הפרווה הבאפית והעבירו אותה לקריביאל המסומן כראוי.
    הערה: חלק מהפלזמה והאריתרוציטים עלולים לזהם את אוסף מעילי הבאפי.
  3. חזור על שלב 2.2 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
  4. לאחר האיסוף, יש לאחסן את הקריובלים במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: לחלופין, יש לאחסן בחנקן נוזלי (<-135°C לאחסון לטווח ארוך.

3. הפשרת מרכזיות

  1. יום לפני ההפשרה, הדפיסו רשימת חומרים וריאגנטים המפורטים בטבלה 3 והכינו ותייגו בהתאם.
    הערה: פרוטוקול זה תוכנן להפשרה של צינור 1 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל PBMCs. כל צינור מניב כ-2 מיליון PBMCs, מתוכם כ-50% ו-20% יהיו לימפוציטים חיים ומונוציטים, בהתאמה. התרחב בהתאם לצרכים ניסיוניים. שים לב שהמספר המוחלט של תאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין חולים או מצבי טיפול.
  2. מעבירים PBMC קפואים מהאחסון באמצעות קרח יבש ומפשירים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, או ממש לפני הפשרת גבישי הקרח האחרונה.
    הערה: אם תרצה, ניתן לקחת aliquot עבור ספירת תאים ומדידות כדאיות, כמפורט בסעיף 4.
  3. לאחר ההפשרה, הוסף 1 מ"ל של תמיסה 4 (PBS + 2 mM EDTA) לכל קריוביאלי. לאחר מכן, שפכו את התוכן לתוך צינור 50 מ"ל מסומן מראש המכיל 10 מ"ל של תמיסה 4 עבור כל צינור PBMC מופשר. הקש כדי להסיר טיפות שיורית.
  4. הניחו את מסננת התא על הצינור הריק של 50 מ"ל ולאחר מכן שפכו את תרחיף התא דרך מסננת התא.
    הערה: במידת הצורך, הקש קלות כדי לשבור את מתח פני השטח.
  5. צנטריפוגה כל צינור המכיל את התאים המתוחים ב 400 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לאחר הצנטריפוגה, יוצקים החוצה את supernatant המכיל DMSO. יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות.
  7. יש להשהות מחדש את כדורית התא בתווך הרצוי המתאים לצרכים ניסיוניים במורד הזרם (למשל, מדיה של תרבית תאים, קוקטייל נוגדנים ציטומטריית זרימה וכו').

4. ספירת תאים וכדאיות

  1. מיד לאחר הפשרת PBMCs קפואים בשלב 3.2, פיפטה 20 μL של תאים לתוך צינור 1.5 מ"ל. מוסיפים נפח שווה של 0.4% תמיסת Trypan Blue ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות 3-4 פעמים כדי לערבב.
  2. באמצעות מונה תאים אוטומטי, עקוב אחר פרוטוקול היצרן כדי לספור תאים ולהעריך כדאיות. ודא כי גורם דילול של 2 נלקח בחשבון.
    הערה: כפי שמתואר במקום אחר, ניתן להשתמש בהמוציטומטר כשיטה חלופית להערכת ספירת תאים וכדאיות23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר איסוף PBMC ושימור בהקפאה, הכדאיות של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים מופשרים מ-56 דגימות ייחודיות הוערכה על-ידי ציטומטריית זרימה באמצעות ריאגנטים המפורטים בטבלה 4 בהתאם להוראות היצרן (איור 2A-F). הושגה כדאיות ממוצעת ± SD של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים של 94 ± 4.0%, 98 ± 1.1% ו-93 ±-5.6%, בהתאמה (איור 2G). מדידת כדאיות על ידי Trypan Blue exclusion הניבה כדאיות ממוצעת של 88 ± 7.5% וספירת תאים של 2.3 x 106 ± 1.9 x 10<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה לאיסוף PBMC ושימור בהקפאה יושם בהצלחה על ידי אנשים עם וללא הכשרה קודמת במעבדת מחקר. ביישום שלנו, FACS וריצוף RNA של מונוציטים בני קיימא ביותר שטוהרו מ- PBMCs מאוחסנים הביאו לרצפים באיכות גבוהה.

חוזקה עיקרית של פרוטוקול זה היא נגישותו. הטכניקה המוצגת בפרוטוקול משתמשת בצינורות ארוזים מראש בתווך שיפוע בצפיפות מוצקה. כתוצאה מכך, דם שלם יכול להיאסף ישירות לתוך הצינור ולאחר מכן מעובד מיד כדי לבודד PBMCs. יש צורך במספר קטן יחסית של פתרונות מוכנים מראש וצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כספיים או לא פיננסיים רלוונטיים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לחולים שהתנדבו את הסכמתם, זמנם ותרומתם של דגימות הדם. אנו מודים גם לד"ר פטריק מוריארטי, ג'ולי-אן דאטון ומארק מק'קלן מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס על שיתוף הפעולה שלהם ועל יישום פרוטוקול זה באתר מרוחק. CY קיבלה תמיכה מחקרית ממענק NIH 1K08HL150271.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1000 ומיקרו; טיפים LGilsonF174501כ-3 טיפים הדרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
15 מ"ל שפופרתBiopioneeerCNT-15כדי להחזיק פתרונות 2/3
2 דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
2 מ"ל CryovialsGlobe Scientific3012כ-40 קריוביאלים דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
20 ומיקרו; L טיפיםגילסוןF174201לשימוש בספירת תאים; הנפח הדרוש תלוי בשיטת ספירת התאים בה נעשה שימוש. יש צורך בטיפ אחד לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
50 מ"ל צינור חרוטיCEM Corporation50-187-76832 דרוש לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
3 דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
CD14 נוגדןBiolegend325621
CD16 נוגדןBiolegend360723
CD19 נוגדןBiolegend363007
CD3 נוגדן Biolegend300405
CD56 נוגדןBiolegend318303
CD66b נוגדןBiolegend305103
מסננת תאיםBiopioneeerDGN2583671 דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
CPT צינור הכנת תאים חד גרעינייםBD Biosciences3627536 צינורות הדרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעילים של באפי
קופסת מקפיא קריו תוכנתמעבדה דרומיתSB2CC-81מכילה 81 צינורות
1 דרוש לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
מתלה Cryotube Fisherbrand05-669-45מכיל עד 50 קריוביאלים
DMSOInvitrogen15575020כ-2.5 מ"ל דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעילי באפי
10977015כ-2 מ"ל דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
כ-9 מ"ל דרושים לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים להפשרה
צינורות EDTABD Biosciences366643שפופרת אחת הדרושה לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעילי באפי
פלבופירידולסיגמא-אולדריץ'F3055-5MG
HLA-DR נוגדןBiolegend307609
סרום אנושי אלבומיןGeminiBio800-120כ-25 מ"ל דרוש לכל מטופל או מצב טיפול לאוסף PBMC/פלזמה/באפי Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-Kלשימוש במדפסת תוויות מר פרוסטי
PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
מר פרוסטיתרמו סיינטיפיק5100-0001מחזיק עד 18 צינורות.
2 מר פרוסטיס דרוש לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense PipetteTips Brandtech705744כ-3 טיפים הדרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 פיפטהגילסוןF144056Mלשימוש בספירת תאים; הנפח הדרוש תלוי בשיטת ספירת התאים בה נעשה שימוש.
תוויות מדפסתPhomemoPM-M110-3020כ -45 תוויות דרושות לכל מטופל / מצב טיפול עבור PBMC / פלזמה / באפי Coat Collection
כ -5 תוויות דרושות לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
RNase ללא EDTA (0.5 מ ')InvitrogenAM9260Gכ 40 ומיקרו; L דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים להפשרה
ללא RNase-PBS (10X)InvitrogenAM9625כ-1 מ"ל דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים להפשרה
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVכ-80 מ"ל דרוש למטופל או למצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי
פיפטות העברתפישרברנד13-711-7Mכ-5 דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי מחזיק צינור איסוף מעילים
אנדיקוט-סימור14-781-15מחזיק עד 80 צינורות CPT/EDTA
מעילים

מקורות

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בידוד PBMCסבב צנטריפוגה במדרג צפיפותהקפאת תאים (קריו-שימור)שכבת Buffy Coatפלזמת EDTAציטומטריית זרימהריצוף RNAחיוניות תאיםמיון מונוציטים
בידוד ושימור בהקפאה של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בעלי יכולת קיימא גבוהה מדם שלם: מדריך למתחילים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.