מאמר שיטה

בידוד ושימור בהקפאה של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בעלי יכולת קיימא גבוהה מדם שלם: מדריך למתחילים

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג מדריך נגיש לאיסוף, אחסון והפשרה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים המתאימים לניתוחים ותהליכי עבודה במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. קולקציות פלזמה ומעילים באפי מודגמות גם כן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) משמשים בדרך כלל במחקר ביו-רפואי על מערכת החיסון ותגובתה למחלות ופתוגנים. פרוטוקול מפורט זה מתאר את הציוד, האספקה והצעדים לבידוד, שימור הקפאה והפשרה של PBMCs באיכות גבוהה ובת קיימא ביותר מתאי דם שלמים המתאימים ליישומים במורד הזרם כגון ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. מתוארים גם פרוטוקולים לעיבוד פלזמה ופרווה באפי מכל הדם במקביל ובמקביל למרכזיות. פרוטוקול שלב אחר שלב קל לביצוע, המשתמש בצנטריפוגות שיפוע צפיפות כדי לבודד PBMCs, מלווה ברשימת תיוג של אספקה, ציוד ושלבי הכנה. פרוטוקול זה מתאים לאנשים עם ניסיון קודם בטכניקות מעבדה וניתן ליישמו במעבדות קליניות או מחקריות. איכות גבוהה של קיום תאים וריצוף RNA נבעו ממרכזיות שנאספו על ידי מפעילים ללא ניסיון מעבדה קודם בשימוש בפרוטוקול זה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים שיטה וזרימת עבודה נגישה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם שלם. פרוטוקול זה מיועד במיוחד לטכנאי מחקר מתחילים, סטודנטים וצוות מעבדה קלינית במטרה להקל על איסוף ושימור בהקפאה של PBMCs מבלי להניח הכשרה מוקדמת בטכניקות מעבדה.

פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה כדי להפריד את מרכיבי הדם המלא לפי צפיפות. דם שלם מורכב מארבעה מרכיבים עיקריים המפורטים לפי סדר ירידת הצפיפות: תאי דם אדומים/אריתרוציטים (~45% מהנפח), תאי דם לבנים (<1% מהנפח), טסיות דם (<1% מהנפח) ופלזמה (~55% מהנפח)1,2,3,4,5,6. ניתן לחלק את תאי הדם הלבנים לשתי קטגוריות על פי מאפייני הגרעינים שלהם: עגולים או מרובי גרעינים6. PBMCs מוגדרים כתאי דם לבנים עם גרעינים עגולים ומורכבים מסוגי התאים הבאים: לימפוציטים (תאי T, תאי B, תאי NK), תאים דנדריטיים ומונוציטים6. תאי דם לבנים מרובי גרעינים כוללים גרנולוציטים, המורכבים מסוגי התאים הבאים: נויטרופילים, בזופילים ואאוזינופילים6. תאי דם לבנים מרובי גרעינים צפופים יותר מאשר PBMCs6. הצפיפויות של כל מרכיב בדם שלם מפורטות בטבלה 1.

בפרוטוקול זה, דם שלם נאסף בצינורות צנטריפוגות הדרגתיות בצפיפות. צינורות אלה מכילים מדיום שיפוע צפיפות ארוז מראש בעל צפיפות של 1.077 גרם / מ"ל. לאחר צנטריפוגה, תאים צפופים יותר, כולל תאי דם לבנים מרובי גרעינים ואריתרוציטים, מופרדים ממרכזיות מרכזיות ומטסיות דם על-ידי מדיום שיפוע הצפיפות (איור 1A)6,7. לאחר מכן נאספים, נשטפים וצנטריפוגות ה-PBMC והטסיות כדי להסיר טסיות. PBMCs מטוהרים כתוצאה מכך נאספים ומאוחסנים ב -80 ° C או בחנקן נוזלי. PBMCs שמורים בהקפאה עשויים להיות מופשרים באופן בר-קיימא ולשמש ישירות בניתוחים במורד הזרם, או בנוסף מעובדים כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים של רכיבים.

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לריצוף RNA באיכות גבוהה ממרכזיות PBMC בנות קיימא ביותר. במאמר זה, PBMCs בודדו ונשמרו בהקפאה ממטופלים במרפאת חוץ. לאחר מכן, מונוציטים בודדו מ-PBMCs על ידי FACS ונותחו באמצעות ריצוף RNA. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם באופן נרחב לצרכים ניסיוניים אחרים כגון תרבית תאים, עריכת גנים, מחקרים פונקציונליים ex-vivo, אנליזות תא בודד, פנוטיפ על ידי ציטומטריה זרימה או ציטומטריה בזמן הטיסה, בידוד של DNA / RNA או חלבונים, שקופיות עבור immunohistochemistry, בין היתר 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

בנוסף לאיסוף PBMC מצינורות צנטריפוגות שיפוע צפיפות, פרוטוקול זה סוקר כיצד לאסוף פלזמה וציפוי באפי באמצעות צנטריפוגה באמצעות צינור EDTA. לאחר צנטריפוגה, דם שלם מופרד לפלזמה, אריתרוציטים ושכבת ממשק דקה שנקראת מעיל באפי שמכילה לויקוציטים (איור 1B)6. המעיל האפי משמש בדרך כלל למיצוי DNA ולניתוחים גנומיים עוקבים19,20. שכבת הפלזמה מכילה את המרכיבים נטולי התאים של דם שלם וניתן להשתמש בה לבדיקות סמנים ביולוגיים21,22.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המחקר אושר על ידי UCSD ו- KUMC Human Protections Program ותואם את הצהרת הלסינקי. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתפות ואיסוף דם.

1. עיבוד ושימור בהקפאה של PBMCs

  1. יום לפני איסוף הדם, הדפיסו את רשימת החומרים והריאגנטים המפורטים בטבלה 2 והכינו ותייגו בהתאם.
    הערה: פרוטוקול זה תוכנן לאיסוף של 6 צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות. כל צינור מניב כ-12 מיליון PBMCs, מתוכם כ-50% ו-20% לימפוציטים חיים ומונוציטים בהתאמה. התרחב בהתאם לצרכים ניסיוניים. שים לב שהמספר המוחלט של תאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין חולים או מצבי טיפול.
  2. באמצעות טכניקת הפלבוטומיה הסטנדרטית, יש לאסוף דם שלם ב-6 צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות וצינור EDTA אחד עד למילוי, כ-6 מ"ל נפח.
    הערה: אם נדרשות דגימות ממטופלים מרובים או ממצבי טיפול, ניתן לאחסן את הצינורות שנאספו עד 4 שעות ולאחר מכן לעבד אותם בו-זמנית.
  3. לאחר האיסוף, צנטריפוגו את כל הצינורות במהירות של 1,800 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: עיין בסרטון המשלים 1 להדגמה כיצד להפעיל צנטריפוגה.
  4. לאחר הצנטריפוגה, פתח בזהירות את צינור הצנטריפוגה שיפוע הצפיפות. השתמש פיפטה העברה כדי להסיר ולהשליך את השכבה הצהובה השקופה המכילה פלזמה. אין להפריע לשכבת התאים המעורפלת ישירות מעל מדיום שיפוע הצפיפות. יש לטעות בצד הזהירות, ולהשאיר עודפי פלזמה במקום להשליך PBMCs. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
    הערה: לאחר צנטריפוגה של הצינור המכיל את תווך שיפוע הצפיפות, פלזמה ו- PBMCs יהיו מעל תווך שיפוע הצפיפות; אריתרוציטים וגרנולוציטים ישקעו לתחתית. עיינו באיור 1A להמחשה.
  5. עם פיפטת העברה חדשה, פיפטה את הנפח הנותר המכיל תאים ושאריות פלזמה בכל צינור למעלה ולמטה בעדינות מספר פעמים מעל מדיום שיפוע הצפיפות.
  6. לאחר ההשעיה, פיפטה את התוכן resuspended של הצינור לתוך צינור חרוטי מסומן 50 מ"ל. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
  7. יוצקים את תמיסה 1 (RPMI Medium) לתוך צינור 50 מ"ל עד שהוא מגיע לקו 50 מ"ל.
  8. חזור על שלבים 1.4 עד 1.7 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
    הערה: ודא שדגימות שונות אינן מעורבבות והשתמש בפיפטת העברה חדשה כדי למנוע זיהום.
  9. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פרוטוקול איסוף הפלזמה והבאפי המפורט בסעיף 2 עשוי להסתיים במהלך תקופה זו.
  10. השליכו כמה שיותר סופרנאטנט. יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, הגלולה מכילה PBMCs, והסופרנאטנט מכיל טסיות דם ושאריות פלזמה.
  11. יוצקים צינור 15 מ"ל של תמיסה 2 (RPMI בינוני + 12.5% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר Flavopiridol) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את גלולת PBMC. הפוך בעדינות את הצינור כדי להשהות מחדש את גלולת התא.
  12. שאפו 15 מ"ל של תמיסה 3 (RPMI בינוני + 11.25% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר פלבופירידול + 10% DMSO) באמצעות פיפטה העברה. הוסף טיפה לצינור 50 מ"ל.
    הערה: תמיסה 3 מכילה DMSO, שהוא רעיל לתאים בטמפרטורת החדר. אל תוסיף פתרון 3 עד שהוא מוכן לעיבוד מיידי.
  13. הפכו את הצינור בעדינות 3 פעמים כדי לערבב.
  14. מלאו כל קריוביאל מסומן מראש ומקורר מראש ב-1 מ"ל PBMCs באמצעות פיפטה מרובת מנות.
    הערה: עיין בסרטון המשלים 2 כדי להדגים כיצד להפעיל פיפטה מרובת שירותים.
  15. הניחו את הקריובלים בתוך מיכל הקפאה מקורר מראש. לאחר מכן, העבירו את המיכל למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
  16. חזור על שלבים 1.9 עד 1.13 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
  17. שמור את הקריובלים בתוך מיכל ההקפאה למשך 12 שעות לפחות, ולאחר מכן העבר אותם לקופסת אחסון מסומנת בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: לחלופין, העבר את הקריובלים הקפואים לחנקן נוזלי (<-135 ° C) לאחסון לטווח ארוך.

2. עיבוד פלזמה ופרווה באפי מצינורות EDTA

  1. צנטריפוגה במהירות 1,800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, השכבה העליונה מורכבת פלזמה, התחתון מכיל אריתרוציטים, ואת הממשק יהיה מעיל באפי. ראו איור 1B להמחשה.
  2. בעזרת פיפטת העברה חדשה, ציירו כמה שיותר פלזמה מבלי להפריע לשכבת הפרווה הבאפי. לאחר מכן, לחלק 0.5 מ"ל aliquots לתוך cryovials מראש. שאפו את שכבת הפרווה הבאפית והעבירו אותה לקריביאל המסומן כראוי.
    הערה: חלק מהפלזמה והאריתרוציטים עלולים לזהם את אוסף מעילי הבאפי.
  3. חזור על שלב 2.2 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
  4. לאחר האיסוף, יש לאחסן את הקריובלים במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: לחלופין, יש לאחסן בחנקן נוזלי (<-135°C לאחסון לטווח ארוך.

3. הפשרת מרכזיות

  1. יום לפני ההפשרה, הדפיסו רשימת חומרים וריאגנטים המפורטים בטבלה 3 והכינו ותייגו בהתאם.
    הערה: פרוטוקול זה תוכנן להפשרה של צינור 1 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל PBMCs. כל צינור מניב כ-2 מיליון PBMCs, מתוכם כ-50% ו-20% יהיו לימפוציטים חיים ומונוציטים, בהתאמה. התרחב בהתאם לצרכים ניסיוניים. שים לב שהמספר המוחלט של תאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין חולים או מצבי טיפול.
  2. מעבירים PBMC קפואים מהאחסון באמצעות קרח יבש ומפשירים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, או ממש לפני הפשרת גבישי הקרח האחרונה.
    הערה: אם תרצה, ניתן לקחת aliquot עבור ספירת תאים ומדידות כדאיות, כמפורט בסעיף 4.
  3. לאחר ההפשרה, הוסף 1 מ"ל של תמיסה 4 (PBS + 2 mM EDTA) לכל קריוביאלי. לאחר מכן, שפכו את התוכן לתוך צינור 50 מ"ל מסומן מראש המכיל 10 מ"ל של תמיסה 4 עבור כל צינור PBMC מופשר. הקש כדי להסיר טיפות שיורית.
  4. הניחו את מסננת התא על הצינור הריק של 50 מ"ל ולאחר מכן שפכו את תרחיף התא דרך מסננת התא.
    הערה: במידת הצורך, הקש קלות כדי לשבור את מתח פני השטח.
  5. צנטריפוגה כל צינור המכיל את התאים המתוחים ב 400 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לאחר הצנטריפוגה, יוצקים החוצה את supernatant המכיל DMSO. יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות.
  7. יש להשהות מחדש את כדורית התא בתווך הרצוי המתאים לצרכים ניסיוניים במורד הזרם (למשל, מדיה של תרבית תאים, קוקטייל נוגדנים ציטומטריית זרימה וכו').

4. ספירת תאים וכדאיות

  1. מיד לאחר הפשרת PBMCs קפואים בשלב 3.2, פיפטה 20 μL של תאים לתוך צינור 1.5 מ"ל. מוסיפים נפח שווה של 0.4% תמיסת Trypan Blue ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות 3-4 פעמים כדי לערבב.
  2. באמצעות מונה תאים אוטומטי, עקוב אחר פרוטוקול היצרן כדי לספור תאים ולהעריך כדאיות. ודא כי גורם דילול של 2 נלקח בחשבון.
    הערה: כפי שמתואר במקום אחר, ניתן להשתמש בהמוציטומטר כשיטה חלופית להערכת ספירת תאים וכדאיות23.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר איסוף PBMC ושימור בהקפאה, הכדאיות של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים מופשרים מ-56 דגימות ייחודיות הוערכה על-ידי ציטומטריית זרימה באמצעות ריאגנטים המפורטים בטבלה 4 בהתאם להוראות היצרן (איור 2A-F). הושגה כדאיות ממוצעת ± SD של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים של 94 ± 4.0%, 98 ± 1.1% ו-93 ±-5.6%, בהתאמה (איור 2G). מדידת כדאיות על ידי Trypan Blue exclusion הניבה כדאיות ממוצעת של 88 ± 7.5% וספירת תאים של 2.3 x 106 ± 1.9 x 106. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה גם כי מונוציטים חיים היוו 17 ± 5.9% ולימפוציטים היוו 53 ± 13.0% מכלל PBMCs.

לאחר מכן, מונוציטים מוינו ממרכזיות מופשרות מתוך 59 דגימות ייחודיות לפי ציטומטריית זרימה והוגשו להכנת ספרייה וריצוף RNA כמתואר במקום אחר24. ספירת רצף כוללת ממוצעת של ± SD של 18.0 ± 16.3 מיליון הושגה עם יישור קריאה של 93 ± 6.3% ותוכן GC של 49.6 ± 1.4% (איור 3A-B). נמצא אחוז קריאות ממוצע ± SD ממופה באופן ייחודי של 88 ±-3.6% עם תת-קבוצה של 56 דגימות ייחודיות. פרמטרים אלה מראים כי PBMCs קיימא מאוד המתאימים ליישומים במורד הזרם, כולל ריצוף RNA באיכות גבוהה, ניתן להשיג על ידי מפעילים עם כל רמה של הכשרה במעבדה באמצעות פרוטוקול זה.

רכיבצפיפותצִטּוּט
פלזמה1.022 גרם/מ"ל עד 1.026 גרם/מ"ל1
טסיות<1.061 גרם/מ"ל עד >1.070 גרם/מ"ל2
מרכזיות מרכזיות<1.077 גרם/מ"ל6
נויטרופילים בצפיפות נמוכה*<1.077 גרם/מ"ל3
גרנולוציטים (נויטרופילים*, בזופילים ואאוזינופילים)>1.077 גרם/מ"ל6
אריתרוציטים1.11 גרם/מ"ל4

טבלה 1: מרכיבי הדם המלא רשומים לפי סדר ירידה בצפיפות.

רייגנט/חומרכמות (לכל 6 צינורות CPT וצינור EDTA אחד)תשרהצהרות אזהרה
צינורות CPT6יש לתייג בהתאם למזהה המטופל או המדגם.
צינור EDTA1יש לתייג בהתאם למזהה המטופל או המדגם.
50 מ"ל צינור חרוטי2בנוסף למזהה המטופל או הדגימה, סמן צינור 1 עבור PBMCs ו- 1 עבור פסולת.
קריוביאלים39תווית 30 עבור PBMCs, 8 עבור פלזמה EDTA, ו 1 עבור מעיל באפי. לא ניתן להשתמש בכל הקריובלים.
מר פרוסטי2יש למלא עד למחצית הדרך באיזופרופנול ולקרר מראש למשך הלילה בטמפרטורה של -20°C.איזופרופנול הוא חומר מגרה דליק. יש להרחיק מניצוצות / להבות. יש להימנע משאיפה ולטפל עם כפפות וזהירות.
פלבופירידיול100 μL של מלאי 1000Xכדי להכין 1000X flavopiridol מלאי, להשעות 5 מ"ג flavopiridol ב 1.14 מ"ל של DMSO עבור ריכוז של 10 mM. Aliquot 200 μL לתוך מיכלים בודדים ולאחר מכן להקפיא. לשימוש, יש להפשיר אליציטוטים בודדים ולדלל ביחס 1:10 במים מזוקקים נטולי DNase/RNase, ולאחר מכן להשתמש כתמיסת 1000X.Flavopiridol הוא מגרה. טפל עם כפפות וזהירות.
פתרון 150 מ"לסל"ד בינוני.
כדי להפוך 50 מ"ל של פתרון המלאי, להשתמש 50 מ"ל של RPMI בינוני.
פתרון 215 מ"לRPMI בינוני + 12.5% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר פלבופירידול.
כדי להפוך 50 מ"ל של פתרון המלאי, להשתמש 25 מ"ל RPMI בינוני + 25 מ"ל אלבומין סרום אנושי + 50 μL 1000X Flavopiridol.		Flavopiridol הוא מגרה. טפל עם כפפות וזהירות.
פתרון 315 מ"לRPMI בינוני + 11.25% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר פלבופירידול + 10% DMSO.
כדי להפוך 50 מ"ל של פתרון המלאי, להשתמש 22.5 מ"ל RPMI בינוני + 22.5 מ"ל HSA + 5 מ"ל DMSO + 50 μL 1000X Flavopiridol.		פלבופרידול הוא חומר מגרה ו-DMSO רעיל ונספג בקלות דרך העור. טפל עם כפפות וזהירות.

טבלה 2: רשימת תיוג של ריאגנטים וחומרים להכנה ותווית לאיסוף ושימור PBMCs.

רייגנט/חומרכמות (לכל 1 מ"ל aliquot של PBMCs קפואים)תשרהצהרות אזהרה
פתרון 410 מ"לPBS + 2 mM EDTA

כדי לייצר 50 מ"ל של תמיסת מלאי, השתמש ב- 5 מ"ל 10X PBS + 200 מיקרוליטר 0.5M EDTA + 44.8 מ"ל מים מזוקקים ללא DNase/RNase
50 מ"ל צינור חרוטי3בנוסף למזהה המטופל או הדגימה, סמן צינור 1 עבור PBMCs מתוחים מראש, 1 עבור PBMCs לאחר מאמץ ו- 1 עבור פסולת. מלא את הצינור המסומן עבור PBMCs מוכתמים מראש עם 9 מ"ל של תמיסה 4 לכל מ"ל של PBMCs קפואים
צינור 1.5 מ"ל1לספירת תאים; תווית עם מזהה מטופל או מזהה לדוגמה
0.4% תמיסת טריפאן כחול20 מיקרוליטרלספירת תאים; ניתן להוסיף לצינור 1.5 מ"ל מראש יום לפני.טריפאן בלו הוא חומר מסרטן. טפל עם כפפות וזהירות.

טבלה 3: רשימת תיוג של ריאגנטים וחומרים להכנה ותיוג להפשרה וספירה של PBMCs.

מגיב/חומרכמות (למיליון תאים)
כתם חי5 מיקרוליטר
Trustain FcX אנושי5 מיקרוליטר
נוגדן CD35 מיקרוליטר
נוגדן CD195 מיקרוליטר
נוגדן CD565 מיקרוליטר
נוגדן CD66b5 מיקרוליטר
נוגדן HLA-DR5 מיקרוליטר
נוגדן CD145 מיקרוליטר
נוגדן CD162.5 מיקרוליטר
רנ"אסין100 יחידות

טבלה 4: טבלת ריאגנטים לבידוד מונוציטים ממרכזיות לפי ציטומטריית זרימה.

הפרדת רכיבי דם בתרשים צנטריפוגה של שיפוע צפיפות; פלזמה, PBMCs, שכבות מעיל באפי.
איור 1: מרכיבי דם שלמים כפי שהם מופרדים על-ידי צנטריפוגה בצנטריפוגות שיפוע צפיפות או צינורות EDTA. (A) צנטריפוגה של דם שלם בצינורות צנטריפוגות שיפוע צפיפות גורמת להפרדה של פלזמה, טסיות דם ו- PBMCs מעל תווך שיפוע הצפיפות עם ריבוי גרעינים ואריתרוציטים מתחת למדיום שיפוע הצפיפות. (B) צנטריפוגה של דם שלם בצינורות EDTA גורמת להפרדת פלזמה בשכבה העליונה, אריתרוציטים בשכבה התחתונה וציפוי באפי בממשק. נוצר באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עלילות פיזור ציטומטריית זרימה; PBMCs, מונוציטים, לימפוציטים; ניתוח כדאיות, גרף סוג תא.
איור 2: הכדאיות של PBMCs מופשרים בהקפאה הוערכה על-ידי צביעת זרימה חיה/מתה וציטומטריית זרימה. (A) פסולת, המסומנת בכוכבית*, אינה נכללת במרכזיות מרכזיות על ידי גידור פיזור קדימה וצדדית. (B) ניתוח חי / מת מייצג של PBMCs שלמים (C) פאן-מונוציטים מגודרים כחיוביים ושליליים HLA-DR עבור האנטיגנים הבאים המסומנים על פני השטח בתווית FITC: CD3, CD19, CD56 ו- CD66b. (D) ניתוח חי / מת מייצג של מונוציטים. (E) לימפוציטים המגודרים על ידי האנטיגנים הבאים המסומנים על פני השטח של FITC: CD3, CD19, CD56 ו-CD 66b. (F) ניתוח חי / מת מייצג של לימפוציטים. (G) אחוזי הכדאיות של כל סוג תא שכומתו מתוך 56 דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גרפים לניתוח נתונים של FastQC; מיליון רצפים לעומת הפצת תוכן GC ניתנת ליישור.
איור 3: איכות ריצוף RNA של מונוציטים שמוינו לפי PBMCs שמורים בהקפאה. 56 דגימות ייחודיות רוצפו ונוצרו ממוצע ± SD 18.0 ±-16.3 מיליון רצפים בסך הכל. (A) היישור היה גבוה, כאשר 92.5% ±-6.3% מהרצפים התיישרו עם גנום הייחוס. (B) תכולת GC של רצפים אלה הייתה 49.6 ± 1.4%. נוצר באמצעות FastQC25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים 1: הדגמת אופן השימוש בצנטריפוגה אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 2: הדגמה כיצד להפעיל פיפטה מרובת מתקנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה לאיסוף PBMC ושימור בהקפאה יושם בהצלחה על ידי אנשים עם וללא הכשרה קודמת במעבדת מחקר. ביישום שלנו, FACS וריצוף RNA של מונוציטים בני קיימא ביותר שטוהרו מ- PBMCs מאוחסנים הביאו לרצפים באיכות גבוהה.

חוזקה עיקרית של פרוטוקול זה היא נגישותו. הטכניקה המוצגת בפרוטוקול משתמשת בצינורות ארוזים מראש בתווך שיפוע בצפיפות מוצקה. כתוצאה מכך, דם שלם יכול להיאסף ישירות לתוך הצינור ולאחר מכן מעובד מיד כדי לבודד PBMCs. יש צורך במספר קטן יחסית של פתרונות מוכנים מראש וציוד מיוחד, המאפשרים שיתוף פעולה בין מעבדת המחקר, שבה ניתן להכין ריאגנטים, לבין המעבדה הקלינית, שבה נאספות ומעובדות דגימות. הפרוטוקולים הכתובים והווידאו מיועדים למפעילים בכל רמת הכשרה.

בעוד פרוטוקול זה משתמש בדם מלא טרי כדי לבודד PBMCs ולכן יש לו תפוקה צפויה גבוהה יחסית וטוהר של >90%, זה לא יכול להיות מתאים ליישומים המחייבים טוהר גבוה במיוחד של >98% 26,27. יתר על כן, צינורות צנטריפוגות שיפוע צפיפות יכול להיות יקר להשיג, במיוחד אם יש צורך לאסוף מספר רב של דגימות.

שיטות חלופיות לאיסוף PBMC כוללות שימוש בתווך שיפוע צפיפות נוזל או דלדול אימונומגנטי28,29. בקצרה, הראשון כרוך בשכבות מדיום שיפוע צפיפות מוכן מראש תחת דם שלם heparinized ואחריו צנטריפוגה. האחרון משתמש בנוגדנים מתויגים מגנטית כדי לתייג נוגדנים שאינם PBMCs, אשר נשמרים לאחר מכן בעמודה מגנטית בעוד PBMCs לא מסומנים עוברים דרך ללא פגע.

יחסית לפרוטוקול המוצג, השימוש בתווך שיפוע צפיפות נוזל הוא גם פחות יקר וגם דורש הרבה פחות חומר בשל היעדר צינורות צנטריפוגות שיפוע צפיפות; בידוד PBMC יכול להתבצע בצינור סטנדרטי של 50 מ"ל8. עם זאת, טכניקה זו משוכללת יותר, יש זמן עיבוד ארוך יותר, ועשוי להיות כפוף לסיכון גבוה יותר של טעות המשתמש. יש להוסיף הפרין במדויק כדי למנוע דילול יתר ויש לשכב בזהירות את מדיום שיפוע הצפיפות בכמויות הנכונות כדי להבטיח הפרדה טובה של PBMC26.

יחסית לפרוטוקול המוצג, השימוש בדלדול אימונומגנטי מציע תפוקה וטוהר גבוהים יותר, טיפול מופחת עקב חוסר צנטריפוגה, זמן עיבוד מהיר יותר, ודורש הרבה פחות חומר30,31,32. עם זאת, החיסרון העיקרי הוא ששיטה זו היא היקרה ביותר מבין שלוש השיטות המתוארות, במיוחד בקנה מידה.

בעוד פרוטוקול זה חזק, שלבים קריטיים מסוימים עשויים לדרוש תשומת לב נוספת. לאורך כל הפרוטוקול, ודא שהדגימות אינן מעורבבות ומוכנסות לצינורות המסומנים כראוי, במיוחד כאשר עובדים עם מספר מטופלים או מצבים בו זמנית. עבור שלב 1.4, ודא שאף PBMC אינו מושלך; עודף פלזמה רק יפחית את ריכוז ה-PBMCs, שהוא פחות קריטי לשמירה על כדאיות הדגימה ואיכותה. בנפרד, נוכחותם של משקעים ב-PBMCs שנאספו מצביעה על כך שחלקים מתווך שיפוע הצפיפות נעקרו ממקומם. פיפטה בעדינות רבה יותר בשלב 1.5 כדי למנוע בעיה זו. בשלבים 1.10 ו-3.6, ודא שגלולת התא הצנטריפוגה אינה מושלכת. עבודה מהירה היא קריטית לשלב 1.12 ו-3.3 מכיוון שתמיסה 3 מכילה DMSO, שהוא רעיל לתאים בטמפרטורת החדר33. כמו כן, חשוב לציין כי אחסון PBMCs בחנקן נוזלי מומלץ על פני אחסון בטמפרטורה של -80°C. אחסון לטווח ארוך בטמפרטורה של -80°C נקשר לירידה בכדאיות התא ולשינוי בביטוי גנים34,35.

פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם בהתאם לצרכי הניסוי. הוספת פלבופירידול, מעכב סינתזת RNA פולימראז ו-mRNA, בתמיסות 2 ו-3 נועדה למנוע כל טיפול ומאמץ המושרה על ידי ממצא עם ריצוף RNA36. עם זאת, פלבופירידיול עשוי להיות מושמט אם מחקרים פונקציונליים או ex vivo באמצעות PBMCs רצויים.

פלזמה שנאספה מצינורות EDTA תזדהם ב-EDTA, חומר כלאטי. כתוצאה מכך, פלסמת EDTA אינה מתאימה לבדיקות המערבות קרישה או יוני סידן37,38. אם תרצה, שכבת הפלזמה בצינורות הבינוניים שיפוע הצפיפות לאחר הצנטריפוגה יכולה במקום זאת להיאסף בשלב 1.4. צינורות אלה מכילים הפרין נתרן כנוגד קרישה אשר ניתן להסיר עם תוספת של הפרינאז39. יש לציין כי הפרין מעכב שעתוק לאחור והגברת PCR, מה שהופך את הפלזמה שנאספה ללא מתאימה לניסויי PCR ללא תוספת של חומר חוסם הפרין40.

המעיל האפי שנאסף מצינורות EDTA אינו מאוחסן בתמיסה המכילה DMSO או פלבופירידול. DMSO חשוב בהפחתת היווצרות גבישי קרח ומוות תאים41. פלבופירידיול חשוב לעיכוב סינתזת RNA36. לפיכך, המעיל האפי אינו מתאים לניתוחים אקס ויוו ותעתיקים. אם תרצה, שלבים 1.6 עד 1.15 יכולים להתבצע באמצעות מעיל באפי שנאסף על מנת למקסם את כדאיות התא ולעכב סינתזת RNA.

בעוד פרוטוקול זה תוכנן עבור ריצוף RNA, יישומים פוטנציאליים נוספים של PBMCs שנאספו ונשמרו בהקפאה באמצעות פרוטוקול זה כוללים תרבית תאים, עריכת גנים, מחקרים פונקציונליים ex-vivo, אנליזות תא בודד, פנוטיפ על ידי ציטומטריה זרימה או ציטומטריה בזמן הטיסה, בידוד של DNA / RNA או חלבונים, שקופיות עבור אימונוהיסטוכימיה, בין היתר.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים כספיים או לא פיננסיים רלוונטיים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לחולים שהתנדבו את הסכמתם, זמנם ותרומתם של דגימות הדם. אנו מודים גם לד"ר פטריק מוריארטי, ג'ולי-אן דאטון ומארק מק'קלן מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס על שיתוף הפעולה שלהם ועל יישום פרוטוקול זה באתר מרוחק. CY קיבלה תמיכה מחקרית ממענק NIH 1K08HL150271.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1000 ומיקרו; טיפים LGilsonF174501כ-3 טיפים הדרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
15 מ"ל שפופרתBiopioneeerCNT-15כדי להחזיק פתרונות 2/3
2 דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
2 מ"ל CryovialsGlobe Scientific3012כ-40 קריוביאלים דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
20 ומיקרו; L טיפיםגילסוןF174201לשימוש בספירת תאים; הנפח הדרוש תלוי בשיטת ספירת התאים בה נעשה שימוש. יש צורך בטיפ אחד לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
50 מ"ל צינור חרוטיCEM Corporation50-187-76832 דרוש לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
3 דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
CD14 נוגדןBiolegend325621
CD16 נוגדןBiolegend360723
CD19 נוגדןBiolegend363007
CD3 נוגדן Biolegend300405
CD56 נוגדןBiolegend318303
CD66b נוגדןBiolegend305103
מסננת תאיםBiopioneeerDGN2583671 דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
CPT צינור הכנת תאים חד גרעינייםBD Biosciences3627536 צינורות הדרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעילים של באפי
קופסת מקפיא קריו תוכנתמעבדה דרומיתSB2CC-81מכילה 81 צינורות
1 דרוש לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
מתלה Cryotube Fisherbrand05-669-45מכיל עד 50 קריוביאלים
DMSOInvitrogen15575020כ-2.5 מ"ל דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעילי באפי
10977015כ-2 מ"ל דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעיל באפי
כ-9 מ"ל דרושים לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים להפשרה
צינורות EDTABD Biosciences366643שפופרת אחת הדרושה לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/אוסף מעילי באפי
פלבופירידולסיגמא-אולדריץ'F3055-5MG
HLA-DR נוגדןBiolegend307609
סרום אנושי אלבומיןGeminiBio800-120כ-25 מ"ל דרוש לכל מטופל או מצב טיפול לאוסף PBMC/פלזמה/באפי Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-Kלשימוש במדפסת תוויות מר פרוסטי
PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
מר פרוסטיתרמו סיינטיפיק5100-0001מחזיק עד 18 צינורות.
2 מר פרוסטיס דרוש לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense PipetteTips Brandtech705744כ-3 טיפים הדרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 פיפטהגילסוןF144056Mלשימוש בספירת תאים; הנפח הדרוש תלוי בשיטת ספירת התאים בה נעשה שימוש.
תוויות מדפסתPhomemoPM-M110-3020כ -45 תוויות דרושות לכל מטופל / מצב טיפול עבור PBMC / פלזמה / באפי Coat Collection
כ -5 תוויות דרושות לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים ללא מאגר להפשרה
RNase ללא EDTA (0.5 מ ')InvitrogenAM9260Gכ 40 ומיקרו; L דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים להפשרה
ללא RNase-PBS (10X)InvitrogenAM9625כ-1 מ"ל דרוש לכל 1 מ"ל של PBMCs קפואים להפשרה
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVכ-80 מ"ל דרוש למטופל או למצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי
פיפטות העברתפישרברנד13-711-7Mכ-5 דרושים לכל מטופל/מצב טיפול עבור PBMC/פלזמה/באפי מחזיק צינור איסוף מעילים
אנדיקוט-סימור14-781-15מחזיק עד 80 צינורות CPT/EDTA
מעילים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PBMCBuffy CoatEDTARNA

מאמרים קשורים