Method Article

צינור למחקר אנטומי תלת-ממדי רב-ממדי בקנה מידה של לב האדם

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג צינור מקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים המשתרעים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר מפורט של לבבות אנושיים שאינם נכשלים ונדחו להשתלה מספק הזדמנות ייחודית לבצע ניתוחים מבניים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי. טכניקות אלה כוללות ניקוי רקמות (הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית (3D) של איברים שסולקו ממס וצביעה אימונוהיסטוכימית. הליכי בדיקה מזוסקופית כוללים דיסקציה סטריאוסקופית וסריקה טומוגרפית מיקרו-ממוחשבת (CT). הליכי בדיקה מקרוסקופיים כוללים דיסקציה גסה, צילום (כולל אנאגליפים ופוטוגרמטריה), CT והדפסה תלת ממדית של הלב המנותח פיזית או כמעט מלאה. לפני בדיקה מקרוסקופית, ניתן לבצע קיבוע זילוח לחץ כדי לשמור על הארכיטקטורה התלת-ממדית ועל המורפולוגיה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית של הלב. היישום של טכניקות אלה בשילוב לחקר הלב האנושי הוא ייחודי וחיוני להבנת הקשר בין תכונות אנטומיות מובהקות כגון כלי דם כליליים ועצבוב שריר הלב בהקשר של ארכיטקטורה תלת ממדית של הלב. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את המתודולוגיות וכולל תוצאות מייצגות כדי להמחיש את ההתקדמות במחקר האנטומיה של הלב האנושי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכיוון שתפקוד עוקב אחר צורה, הבנת הארכיטקטורה של הלב היא בסיסית להערכת הפיזיולוגיה שלו. למרות שמחקרים רבים גילו אנטומיה לבבית ממיקרו למאקרו 1,2,3, שאלות רבות נותרו בלתי פתורות, במיוחד אלה הקשורות לאנטומיה של הלב האנושי. הסיבה לכך היא שמחקרים בסיסיים שהתמקדו באנטומיה פונקציונלית השתמשו בדרך כלל בלבבות בעלי חיים 4,5,6, אשר לעתים קרובות נבדלים מלבבות אנושיים 1,7,8. יתר על כן, כל מחקר בנפרד, אפילו אלה המשתמשים בדגימות לב אנושיות, נוטים להתמקד במבנים ספציפיים מאוד, מה שמקשה על יישום הממצאים בהקשר של הלב כולו. הדבר נכון שבעתיים אם המבנים הממוקדים נמצאים במיקרו או במזוסקאלה, כגון perinexus9 ומקלעת גנגליון10.

בהקשר זה, מחקר מבני מערכתי של הלב האנושי שנדחה להשתלה מספק הזדמנות ייחודית ונדירה לקבל אטלס מקיף של מבני לב הממוקדים בסקאלות מיקרוסקופיות ומקרוסקופיות11. פרוטוקולי בדיקה מיקרוסקופיים כוללים ניקוי רקמות (הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית (3D) של איברים שסולקו ממס, iDISCO+)12,13 וצביעה אימונוהיסטוכימית. פרוטוקולי בדיקה מזוסקופית כוללים דיסקציה סטריאוסקופית, צילום מאקרו וסריקה טומוגרפית מיקרו-ממוחשבת (CT). פרוטוקולי בדיקה מקרוסקופיים כוללים דיסקציה גסה14, צילום (כולל אנאגליפים ופוטוגרמטריה) 15,16,17, CT, דיסקציה וירטואלית 18, והדפסה תלת ממדית של הלב המנותח פיזית או כמעט שלמה17. כהכנה לבדיקה מקרוסקופית, מתבצע קיבוע זילוח לחץ כדי לשמור על הארכיטקטורה התלת-ממדית והמורפולוגיה הרלוונטית פיזיולוגית של הלב 14,19,20,21. היישום המשולב של טכניקות אלה הוא ייחודי וחיוני כדי להתאים תכונות אנטומיות שונות בהקשר של ארכיטקטורת 3D של הלב האנושי.

מכיוון שההזדמנות לקבל דגימת לב אנושי לא פתולוגית מוגבלת ביותר, גישה רב-ממדית המתוארת כאן ממקסמת את השימוש בדגימה. על ידי יישום הליכים שונים המתוארים להלן, תוצאות מייצגות ימחישו לקורא כיצד ניתן להשתמש בממצאים למטרות רבות, כולל גילוי במחקר מדעי11 (ניתוחים מקיפים של עצבוב לבבי, התפלגות מקלעי גנגליון), שיפור פרוצדורות קליניות (סימולציה לגישות כירורגיות והתערבותיות) וחינוך אנטומי (הדגמה תלת ממדית אמיתית של אנטומיה לבבית).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה השתמש בדגימות רקמה לא מזוהות שנאספו מלבבות אנושיים של תורמים שאינם נכשלים ואושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). דגימות נלקחו מלבבות לא כושלים שנדחו להשתלה. הלבבות היו מחוררים בלחץ, קובעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA), וצולמו לפני עיבוד רקמות בשיטות הבאות. איור 1 מסכם את תרשים הזרימה של סדר המחקר. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בדיקה בקנה מידה מיקרו

  1. ניקוי רקמות באמצעות הדמיה תלת-ממדית התומכת בהתוויה חיסונית שונה של איברים מנוקים בממס (iDISCO+).
    1. יש לנתח רקמה מקובעת 4% PFA עם אזמל כדי להתאים לתא 3 מ"מ × 16 מ"מ × 25 מ"מ למיקרוסקופ קונפוקלי. כדי לצלם רקמות עבות יותר, ניתן לערום תאים ו/או ספייסרים נוספים על השקופית.
    2. יש לייבש דגימות באמצעות סדרת מתנול מדורגת (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% ו-100% MeOH ב-H2O שעבר דה-יוניזציה [vol/vol]) למשך שעה אחת כל אחת בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה.
    3. יש לשטוף עם 100% MeOH למשך שעה אחת ב-RT ולטבול ב-66% דיכלורומתאן/33% MeOH ב-RT עם תסיסה למשך הלילה.
    4. למחרת, יש לשטוף פעמיים ב-MeOH (100%) למשך שעה אחת ב-RT, לצנן ב-4°C ולטפל עם 5% H2O2 ב-MeOH (vol/vol) למשך הלילה ב-4°C.
    5. יש להחזיר לחות עם סדרת MeOH מדורגת (80%, 60%, 40% ו-20% MeOH) ולשטוף ב-PBS של 0.01mol/L למשך שעה אחת כל אחד ב-RT עם תסיסה.
    6. שטפו את הרקמות פעמיים ב-PBS של 0.01mol/L עם 0.2% Triton X-100 למשך שעה אחת ב-RT.
    7. יש להתכונן לתיוג חיסוני על-ידי חדירה ב-PBS של 0.01mol/L, 20% dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.2% Triton X-100 ו-0.3mol/L גליצין למשך יומיים ב-37°C עם תסיסה.
    8. חסום פנימה PBS 0.01mol/L עם 10% DMSO, 0.2% Triton X-100 וסרום חמור רגיל 5% למשך יומיים נוספים ב-37°C עם תסיסה.
    9. תווית עם נוגדן ראשוני התואם ל-MeOH מצומד לפלואורופורים מדוללים ב-PBS של 0.01mol/L עם 10 מ"ג/מ"ל הפרין (PTwH), 0.2% Tween-20, 5% DMSO ו-3% סרום חמור רגיל למשך 3-4 ימים ב-37°C עם תסיסה.
    10. לחדש את פתרון נוגדנים לדגור עוד 3-4 ימים ב 37 ° C עם תסיסה.
    11. לאחר דגירה של שבוע בתמיסת נוגדנים ראשונית, יש לשטוף 4 עד 5 פעמים ב-PTwH למשך הלילה ב-RT.
    12. לדגור עם נוגדן משני מצומד פלואורופורים מדולל PTwH, 3% סרום חמור רגיל במשך 3 ימים ב 37 ° C עם תסיסה.
    13. לחדש את פתרון נוגדנים משני לדגור עוד 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
    14. לאחר דגירה של 6 ימים בתמיסת נוגדנים משנית, יש לשטוף ב-PTwH 4-5 פעמים למשך הלילה ב-RT.
    15. התייבש עם סדרת MeOH מדורגת (20%, 40%, 60%, 80%, 100% ו-100% MeOH). ניתן לאחסן את הדגימה למשך הלילה ב- RT.
    16. דגרו ב-66% דיכלורומתאן / 33% MeOH במשך 3 שעות ב-RT עם תסיסה.
    17. יש לשטוף פעמיים ב-100% דיכלורומתאן במשך 15 דקות ב-RT בעצבנות.
    18. לדגור ולאחסן דגימות באתר בנזיל. מלאו את הצינורית כדי למזער את האוויר מחמצון הדגימה.
  2. הדמיה של דגימה מנוקה רקמות
    1. הדביקו תא המכיל דבק למגלשה ומרחו לק מסביב להיקף החדר. עבור רקמות עבות יותר, תאים נוספים ו / או ספייסרים עשויים להיות מוערמים על המגלשה.
    2. מניחים רקמות מנוקות בתא, ממלאים באתר בנזיל ומורחים כיסוי.
    3. יש למרוח לק סביב הכיסוי ליצירת אטימה.
    4. קבל תמונות בסריקת אריחים ובערימת Z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ישר לסריקת לייזר עם עדשת 5x או 10x לתמונה בעומק עד למרחק העבודה של העדשה.
    5. תמונה ברזולוציה של 1024 x 1024 באמצעות קווי לייזר המתאימים לספקטרום הפליטה של פלואורופורים בשימוש. אוטופלואורסצנטיות שרירים נראית באמצעות קו לייזר 488 ננומטר.
    6. ודא שגודל המדרגה של ציר z תואם לדגימת Nyquist בהתבסס על הצמצם המספרי של המטרה שצוינה11.
    7. תפר תמונות והשתמש בתוכנה להדמיה תלת-ממדית.
    8. צור איורים באמצעות תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) של ערימות Z עבור ערוצים בודדים וערוצים ממוזגים (איור 2).
  3. אימונוהיסטוכימיה
    הערה: לאחר שהרקמה משובצת פרפין22, ההליך הבא משמש ליצירת שקופיות למחקר אימונוהיסטוכימי.
    1. הכנת פתרון התאמת אינדקס שבירה (RIMS).
      1. הכינו חיץ פוספט 0.1mol/L על ידי הוספת 10.9 גרם של Na2HPO4 (נטול מים) ו-3.1 גרם של NaH2PO4 (מונוהידראט) ל-H2O שעבר דה-יוניזציה לנפח כולל של 1 ליטר (pH 7.4). סנן וחטא את הפתרון ואחסן אותו ב- RT.
      2. לדלל את מאגר הפוספט ל 0.02 mol/L.
      3. יש להמיס את ההיסטודנץ ב-30 מ"ל של חיץ פוספט 0.02mol/L על ידי ערבוב התמיסה למשך 10 דקות עם מוט ערבוב מגנטי בבקבוק האחסון הסופי שניתן לאטום כדי למזער אידוי וזיהום.
      4. הוסף נתרן אזיד לריכוז כולל של 0.01% (w/v) וכוונן את ה- pH ל- 7.5 עם NaOH.
      5. כוונן את RI על ידי שינוי הריכוז הסופי של Histodenz.
      6. אחסן את ה- RIMS ב- RT למשך חודשים. יש להשליך אם צוין זיהום מיקרוביאלי.
        הערה: אין לבצע אוטוקלאבים של תמיסות המכילות נתרן אזיד.
    2. הכנת שקופיות למחקר אימונוהיסטוכימי
      1. צור מקטעים בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום. החל מקטע רקמות על שקופיות טעונות.
      2. מוציאים פרפין על ידי דגירה על המגלשות ב->75% קסילן למשך 10 דקות. העבר שקופיות למכל שני עם קסילן למשך 10 דקות נוספות.
      3. הסר קסילן על ידי טבילת המגלשות ב-100% EtOH למשך 10 דקות, ולאחר מכן ב-95% EtOH למשך 5 דקות ו-70% EtOH למשך 5 דקות.
      4. שטפו את המגלשות עם H2O נטול יונים, במשך 5 דקות.
      5. יש לטבול את השקופיות במאגר אחזור האנטיגן למשך 25 דקות בטמפרטורה של 90-95 מעלות צלזיוס.
      6. אפשר למיכל להתקרר ל- RT למשך שעה אחת עם תסיסה.
      7. יש לטבול את המגלשות במאגר השריה (0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100) למשך 30 דקות ב-4°C.
      8. הקיפו את הרקמה בעט PAP. הוסף PBS לכל שקופית והנח אותה בתא לח כדי למנוע התייבשות.
      9. שטפו שקופיות עם PBS ב- RT עם תסיסה במשך 5 דקות.
      10. חסום עם חיץ חוסם (0.01 mol/L PBS + 10% סרום חמור + 0.1% TX-100) למשך שעה אחת עם תסיסה.
      11. יש לדגור עם נוגדן ראשוני המדולל בחיץ חוסם למשך הלילה ב-4°C.
      12. למחרת, אפשר לשקופיות להתחמם ל- RT למשך 15 דקות.
      13. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS 0.01mol/L + 0.2% TritonX-100 למשך 5 דקות.
      14. לדגור עם נוגדן משני מדולל בחיץ חוסם במשך 1 שעה ב RT עם תסיסה.
      15. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS 0.01mol/L + 0.2% TritonX-100 למשך 5 דקות.
      16. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS 0.01mol/L למשך 5 דקות.
      17. יש להניח טיפה אחת של RIMS עם טפטפת ולמרוח כיסוי.
      18. יש למרוח לק מסביב למכסה כדי ליצור את האטם.
      19. כבקרה שלילית, הפעל דגימה ללא הנוגדן העיקרי כדי להדגים היעדר כתמים ספציפיים.
    3. הדמיה של שקופיות מוכתמות חיסון
      1. צלם את השקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם עדשות אובייקטיביות 10x, 20x ו- 40x.
      2. תמונה ברזולוציה של 1024 x 1024 באמצעות קווי לייזר המתאימים לספקטרום הפליטה של הנוגדנים המשניים המשמשים.
      3. צור איורים באמצעות תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) של ערימות Z עבור ערוצים בודדים וערוצים ממוזגים (איור 3).

2. בדיקת מזו-סולם

  1. דיסקציה סטריאוסקופית
    1. בצע דיסקציות עדינות המתמקדות במבנים זעירים או דקים, כגון צומת אטריובנטריקולרי, עורק קשריות אטריובנטריקולרי ומקלעת עצב הלב (תת-מילימטר עד מילימטר בקנה מידה) באמצעות מנורת שולחן מגדלת עם מהדק, טלסקופים כירורגיים או סטריאומיקרוסקופ.
  2. סריקת Micro-CT
    הערה: הדמיית CT מבוצעת לאחר זילוח וקיבוע לחץ ובכל שלבי הדיסקציה באמצעות טומוגרפיית פליטת מיקרו-פוזיטרונים (PET)/סורק CT (איור 4).
    1. חממו את מקור הרנטגן של CT למשך 25 דקות לפני הדמיית הדגימה.
    2. הניחו את דגימת הלב על מיטת הסורק.
    3. הזז את מיטת הסורק למצב אופקי של 544 מ"מ ולמיקום אנכי של 14 מ"מ כדי למרכז את הלב בשדה הראייה של CT (FOV).
    4. קבל תמונת CT ב- 80 kVp, 150 μA, עם 720 הקרנות בזמן סריקה של דקה אחת ברזולוציה מרחבית של 200 מיקרומטר.
    5. שחזר את נתוני ה- CT עם שדה ראייה של 12 ס"מ x 12 ס"מ x 10 ס"מ ומטריצה של 600 x 600 x 500 ווקסלים, ושמור כקובץ DICOM.

3. בחינה בקנה מידה מאקרו

  1. זילוח לחץ וקיבוע
    הערה: המחברים משנים טכניקות זילוח וקיבוע לחץ שתוארו קודם לכן ומיישמים אותן על לבבות אנושיים שאינם נכשלים שנדחו להשתלה 14,19,20,21.
    1. השתמש משאבות זרימה גבוהה עבור קיבוע זילוח. השתמש 100% אתנול14, 4% PFA, או 10% פורמלין עבור קיבוע.
      הערה: הלב מתאושש עם אבי העורקים העולה, תא המטען הריאתי, וגם הוורידים הוורידים הריאתיים שנכרתו בצורה דיסטלית ככל האפשר ונמסרו בתמיסה23 של אוניברסיטת ויסקונסין.
    2. השתמש בשתי צינוריות כירורגיות 20-24 Fr לזילוח לב ימין ושמאל. לזילוח הלב הימני, יש לערבב את הווריד הנבוב העליון, ולהניח פתח אוורור בתא המטען הריאתי או בעורק הריאה עם מזרקי פלסטיק בגודל 12-30 מ"ל חתוכים למחצה עם קצוות Luer-Lock המחוברים לסטופקוקים תלת-כיווניים.
    3. הסתירו את הווריד הנבוב התחתון ואת עורק הריאה השני עם חוט לאחר הנחת מזרק פלסטיק נעול חצי חתוך בגודל המתאים או צינור צנטריפוגה 1.5-5.0 מ"ל.
      1. לזילוח מקדים של הלב השמאלי, יש להצמיד את אחד הוורידים הריאתיים ולהניח פתח אוורור בקצה החתוך הדיסטלי של אבי העורקים עם מזרקי פלסטיק בגודל 12-30 מ"ל חתוכים למחצה עם קצוות Luer-Lock המחוברים לסטופקוקים תלת-כיווניים.
      2. לזילוח מדרדר של הלב השמאלי, יש לקנח את אחד מענפי קשת אבי העורקים ולהניח פתח אוורור בענף אחר של קשת אבי העורקים. מניחים את קצות הצינוריות בשני החדרים.
    4. הסתר פתחי כלי אחרים עם חוט לאחר החדרת מזרק פלסטיק נעול חצי חתוך בגודל המתאים או צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5-5.0 מ"ל. השתמש בגזה דקה כדי לכסות את החלק המחדיר של המזרקים/ צינורות/ צינוריות כדי למנוע דליפה והחלקה. תקן דליפות גדולות באמצעות תפר, פסים או גושים. דליפות קטנות מותרות.
    5. להשעות את הלב במיכל פלסטיק.
    6. חברו צינורות פלסטיק רכים 22-24 Fr לכל צינורית והכניסו את הקצה השני של הצינור למיכל המלא בקיבוע.
    7. יש להזרים קיבוע דרך מעגלי הלב הימני והשמאלי באמצעות משאבה בעלת זרימה גבוהה המוגדרת בכ-100-300 מ"ל/דקה עבור לב ימין ו-200-400 מ"ל/דקה עבור לב שמאל כדי להשיג כ-20 מ"מ כספית בחדר הימני ו-80 מ"מ כספית בחדר השמאלי, בהתאמה.
    8. יש לשמור על זילוח בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות.
    9. שטפו את הלב עם PBS 0.01 mol/L במשך 30 דקות עם תסיסה ארבע פעמים.
    10. יש לאחסן את הלב ב-0.01 mol/L PBS/0.02% נתרן אזיד ב-4°C.
      הערה: קיבוע זילוח לחץ יעיל רק ללב רענן, לא ללב שהחלים מגופה חנוטה.
  2. דיסקציה גסה
    1. בצע דיסקציה פרוגרסיבית עם הקלטות מצולמות בכל שלב של הדיסקציה.
    2. כדי לשמור על רלוונטיות קלינית, הקדישו תשומת לב מיוחדת כדי למנוע עיוות/עיוות של מבנים כלשהם כדי לשמור על המורפולוגיה הפיזיולוגית של הלב.
    3. מבני יעד תמונה באמצעות אוריינטציה רלוונטית קלינית, כגון כיוון אלכסוני קדמי ימני.
  3. צילום
    1. הניחו את הלב המחורר בלחץ וקבוע על חצובה עם פלטפורמה המורכבת על שיניים מרובות ויכולת סיבוב של 360o.
    2. צלם את הלב באמצעות מצלמת רפלקס דיגיטלית בעלת עדשה יחידה (איור 5)24 תוך שימוש במספר לוחות אור של דיודות פולטות אור המוצבים על מעמדי C ובד רקע שחור רחב של שמיכת פוך.
    3. צלם באמצעות עדשה עם אורך מוקד ארוך (200 מ"מ) למרחק עבודה של 4-6 רגל כדי למזער עיוות של נושא הצילום14.
  4. אנאגליפים
    1. להצגת תמונות אנאגליפיות, בנו מחדש זוג תצלומים או תמונות שעובדו בנפח מערכות נתונים של CT עם הפרש של 10° בזווית הסיבוב במישור האופקי.
    2. המר קבוצה של תמונות דו-ממדיות (דו-ממדיות) אלה, המכונות סטריאוגרמה, לאנגליפים באמצעות תוכנה חופשית16.
    3. כדי להציג אנאגליף, השתמש במשקפיים אדומים/ציאן.
  5. פוטוגרמטריה
    הערה: פוטוגרמטריה היא המדע היישומי של יצירת שחזור תלת-ממדי של פני השטח מתצלומים דו-ממדיים מרובים שצולמו בזוויות משתנות17.
    1. השהה את הדגימה במעמד C או הנח אותה על שולחן הסיבוב כדי לקבל מאות תמונות רב-כיווניות באמצעות טלפון חכם.
    2. צור את מודל התלת-ממד בפורמט FBX באמצעות תוכנה זמינה מסחרית.
  6. סריקת CT
    הערה: ניתן לבצע סריקת CT לאחר זילוח וקיבוע לחץ ובכל שלב של דיסקציה.
    1. השהה את דגימת הלב ממוט הממוקם על פני החלק העליון של המיכל. כדי למנוע מהלב להתנדנד במהלך הסריקה, תמכו בבסיס הלב עם שיניים מפלסטיק קבועות בתחתית המיכל. לפיכך, האוויר ישמש ניגוד שלילי.
    2. בצע את סריקת ה- CT באמצעות סורק CT מרובה גלאים זמין מסחרית עם הפרמטרים הבאים: מתח צינור של 120 קילו וולט, זרם צינור של 800-900 mA וסיבוב גנטרי של 280 מילישניות. אורך המינון הוא בדרך כלל 500-1200 mGy.cm.
    3. בנייה מחדש של נתוני תמונה צירית באמצעות הפרמטרים הבאים: עובי חתך, 0.6 מ"מ; מרווח מצטבר, 0.3 מ"מ; שדה ראייה, קטן ככל האפשר (בדרך כלל 100-200 מ"מ); ומטריצה, 512 × 512.
  7. דיסקציה וירטואלית
    1. נתח את תמונות סריקת ה- CT באמצעות תוכנה זמינה מסחרית ליצירת תמונות דיסקציה וירטואליות.
      הערה: דיסקציה וירטואלית היא שינוי של תהליך עיבוד נפח שבו המוקד מועבר לדפנות חדרי הלב וכלי הדם18. בתהליך זה, הסף הידני מסיר למעשה את התא המשופר מערכות הנתונים המקוריות.
    2. דמיינו את הקירות, הספטה והשסתומים שאינם משופרים באמצעות דיסקציה וירטואלית כדי להפיק תמונות הדומות לדיסקציה גסה. שלא כמו דיסקציה גסה של דגימות הלב, המישורים החתוכים במהלך דיסקציה וירטואלית הם כמעט בלתי מוגבלים. כמעט כל תצוגה ניתן לשחזר כדי לדמיין את המבנים של עניין לפי הצורך.
  8. הדפסה תלת מימדית
    1. פתח את הקובץ התואם של דגימת הלב בתוכנת מדפסת תלת-ממד.
    2. השתמש בפרופיל של 0.10 מ"מ פירוט מהיר עבור הגדרות ההדפסה במדפסת התלת-ממד והפחת את מהירות ההדפסה ל- 20 מ"מ לשנייה. אפשר צור חומר תמיכה.
    3. השתמש בפרופיל של נימה TPU עבור "הגדרות נימה" במדפסת 3D.
    4. השתמש בפרופיל של זרבובית Prusa MK4 Input Shaper 0.4 המקורית עבור "הגדרות מדפסת" במדפסת.
    5. לאחר השלמת החיתוך, שמור את קובץ BGCODE בכונן הבזק מסוג USB להדפסה תלת-ממדית.
    6. השתמש בחוט הלהט TPU בקוטר 1.75 מ"מ להדפסה תלת-ממדית של דגימת הלב האנושי. לפני הדפסה תלת-ממדית, יבש את חוט הלהט TPU למשך 6 שעות באמצעות מייבש נימה.
    7. כדי להפחית את מתח הנימה במהלך הדפסה תלת-ממדית, הנח את סליל הנימה על מחזיק סליל עם מיסב מובנה כדי להקל על סיבוב סליל החוט. בצע הדפסה בתלת-ממד באמצעות מדפסת תלת-ממד מסחרית עם יריעת פלדה בציפוי אבקה.
    8. הסר בזהירות חומרי תמיכה עם השלמת ההדפסה בתלת-ממד.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקות מיקרוסקליות
יישום ניקוי רקמות מאפשר הדמיה של נפחים גדולים יותר של רקמה בתלת מימד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בלב, ניתן לדמיין גרעינים המכילים תאי עצב לבביים ואת התבנית העצבית של עצבוב שריר הלב (איור 2). איור 3 מראה תמונה קונפוקלית של שריר הלב של החדר השמאלי האנושי שעבר מערכת חיסון עבור עצבים ותאי שריר חלקים. כלי הדם מצוינים כחוצים את שריר הלב, וסיבי עצב רבים מזוהים, הן בקשר לכלי הדם והן ללא תלות בהם.

בדיקות מזו-מקרו
בעת שימוש באתנול מוחלט עבור זילוח לחץ וקיבוע של 24 שעות, הצבע הטבעי של המדגם מולבן, הרקמה מיובשת25, והגמישות מופחתת באופן משמעותי. מצד שני, עם קיבוע עם PFA ופורמלין, צבע טבעי ואלסטיות נשמרים להפליא. מסיבות אלה, PFA או פורמלין משמש בעיקר כקיבוע המועדף.

איור 6 מציג תמונות מייצגות של דיסקציה גסה, דיסקציה וירטואלית, מודל מצולע STL והדפסה תלת-ממדית. איור 7 מציג תמונות מייצגות של האנאגליפים שנוצרו מתמונות דיסקציה גסות ווירטואליות. תפיסת עומק ניתן להשיג עם משקפיים anaglyphi. המודל הפוטוגרמטרי היחיד שצולם ניתן לצפייה כמעט מכל הכיוונים באמצעות תוכנה מסחרית זמינה ומדגים תכונות אנטומיות מורכבות הרלוונטיות לפרוצדורות לב שגרתיות של טרנסקטטר. על ידי יישום טכניקות אלה על הלב מוכן עם זילוח לחץ וקיבוע, מידע תלת מימדי על הלב יכול להישמר כמעט לנצח באופן דיגיטלי או פיזי ומשותף ללא גבולות. איור 8 מראה את הדפסות התלת-ממד בקנה מידה של 50% ששוכפלו מהלבבות המנותחים שנדחו להשתלה.

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מקטע מנוקה רקמות של אטריום ימין האדם. (A) מבט אלכסוני אחורי ימני של אטריום ימני אנושי עם מקלעת גנגליון פרוזדורים ימנית (RAGP) שנחתכה לצורך ניקוי רקמות. (B) דגימת RAGP לפני ואחרי ניקוי רקמות. (C) הקרנה בעוצמה מרבית של חלק מנוקה iDISCO+ של RAGP אנושי המדגים גרעינים (ראשי חץ) המוכתמים במערכת החיסון עם תוצר גן חלבון סמן פאן-עצבי 9.5 (PGP9.5). פסי קנה המידה הם 1 ס"מ (A), 5 מ"מ (B) ו- 500 מיקרומטר (C). נתון זה נלקח מתוך חנה ואחרים 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שקופיות מוכתמות חיסון של החדר השמאלי האנושי. תמונה קונפוקלית מפרוסת שריר הלב של החדר השמאלי האנושי מוכתמת חיסון עם סמן פאן-עצבי תוצר גן חלבון 9.5 (PGP9.5) וסמן תאי שריר חלק α אקטין שריר חלק (αSMA). אוטופלואורסצנטיות שרירים נראית באמצעות קו לייזר 488 ננומטר (ירוק). סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הדמיה טומוגרפית מיקרו-ממוחשבת של דגימות לב. (A) מערך טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להדמיית דגימת לב. (B) ממשק משתמש להדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: צילום סטודיו במרכז להפרעות קצב לב באוניברסיטת UCLA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: דיסקציה גסה (למעלה משמאל), דיסקציה וירטואלית (למעלה מימין), מודל מצולע STL (למטה משמאל) והדפסה תלת ממדית (למטה מימין) תמונות של קומפלקס אבי העורקים והמסתם המיטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: אנאגליפים של דיסקציה גסה (משמאל) ודיסקציה וירטואלית (מימין) של קומפלקס אבי העורקים והמסתם המיטרלי. משקפיים אנאגליפים (אדום / ציאן) נחוצים כדי לקבל תפיסת עומק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: הדפסה תלת-ממדית של דגימות לב. (A) הגדרת מדפסת תלת-ממדית (תלת-ממדית) להדפסה תלת-ממדית של דגימות לב עם חוט להט TPU. (B) הדפסות תלת-ממד מייצגות של לב שהופקו בשיטות המתוארות במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מדגים את הצינור המקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים שלמים. תוצאות מייצגות מראות בדיקות אנטומיות בקנה מידה זעיר עד מאקרו המבוצעות באופן שגרתי עבור לב יחיד. מכיוון שדגימת לב אנושית היא יקרה ביותר, גישה רב-ממדית היא אידיאלית ויעילה כדי לא לבזבז חלקים מהדגימה על ידי יישום פרוטוקולים מרובים למטרות שונות, כולל גילוי במחקר מדעי, שיפור הליכים קליניים וחינוך אנטומי עם שמירה על מתאם אנטומי בהקשר של הלב כולו.

לגבי בדיקה בקנה מידה מיקרוסקולרי, ניתן ליישם אימונוסטיין ומיקרוסקופ כדי להבין את הציטוארכיטקטורה של דגימות לב אנושיות. כאן, היישום של ניקוי רקמות ואימונוהיסטוכימיה לחקר נוירואנטומיה של הלב בקנה מידה תאי מודגם. השימוש בטכניקות אלו מסייע באפיון מערכת העצבים הלבבית ודפוסי עצבוב שריר הלב ביחס למבנים מעניינים, כגון מערכת ההולכה הלבבית וחדרי הלב. למרות שמושגת רזולוציה מרחבית מצוינת, השימוש במיקרוסקופ קונפוקלי, במיוחד עבור דגימות שעברו ניקוי רקמות, גוזל זמן. ניתן להשתמש במיקרוסקופ Lightsheet כדי לקצר את זמן רכישת התמונה על חשבון רזולוציה מרחבית.

באשר לבדיקת מזו-מקרו, הרזולוציה המרחבית של סורקי מיקרו-CT במוסד המחברים נעה בין 10-200 מיקרומטר. גודל הדגימה מוגבל ל-20 מ"מ לסריקה של 10 מיקרומטר, ול-120 מ"מ לסריקה של 100-200 מיקרומטר. סורקי מיקרו-CT במוסד המחברים אינם יכולים להכיל את כל הלב. כך, במכון המחברים, סריקת לב שלם דורשת שימוש בסורק CT קליני ברזולוציה מרחבית של 600 מיקרומטר, אם כי ההתקדמות אפשרה פיתוח סורקי מיקרו-CT שיכולים לצלם את הלב כולו2. פיתוח טכנולוגי, כגון CT ספירת פוטונים, בוודאי ירחיב אפשרויות נוספות. שיפור הרזולוציה המרחבית של קובץ STL צריך להיות הצעד הראשון לשיפור נוסף של איכות ההדפסה בתלת-ממד. העלות הגבוהה יותר של הדפסה תלת ממדית מגבילה את יישום הטכניקה לפרקטיקה קלינית שגרתית. תמונות פוטוגרמטריה המופקות מכל יישום סמארטפון קלות לפיתוח ובאיכות מקובלת, אך ידרשו מערכות מתוחכמות נוספות אך יקרות וגוזלות זמן רב כדי לשפר את רזולוציה26. כדי להמחיש בתלת-ממד, מציאות מורחבת עם ציוד ראש ייעודי27,28 וצגים הולוגרפיים29 הם כלים נוספים, אך גם הם מוגבלים בעלות גבוהה יותר.

לסיכום, באמצעות ניתוחים מבניים מקיפים על פני קני מידה מיקרוסקופיים ומקרוסקופיים, ניתן להבין את האנטומיה המיקרוסקופית של כל מבנה ואת תרומתו התפקודית בהקשר של הלב כולו. יחד עם הפיתוח של הדמיה ברזולוציה גבוהה, המרחק בין האנטומיה המיקרו והמקרו מתרחב באופן דרמטי. מומחים באנליזה מיקרוסקופית אלקטרונית של קרדיומיוציטים עשויים שלא להכיר את מספר העלונים המיטרליים ולהיפך. כדי להקל על ההבנה המקיפה של מורפולוגיה לבבית, מדענים חייבים להמשיך לחקור פרטים נוספים של כל עץ, תוך שמירה על מבט ממעוף הציפור של היער כולו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לאנשים שתרמו מגופם לקידום החינוך והמחקר. אנו אסירי תודה לקרן OneLegacy, שהיוותה את הבסיס להשגת לבבות תורמים למחקר. אנו אסירי תודה גם לאנתוני א. סמיתסון וארווין רוק-ורדפלור ממרכז הדימות התרגומי של UCLA (המחלקה לרדיולוגיה) על תמיכתם ברכישת נתוני CT. פרויקט זה נתמך על ידי פרויקט אמארה יד באוניברסיטת UCLA. אנו מודים לד"ר Kalyanam Shivkumar ו- Olujimi A. Ajijola על הקמה ותחזוקה של צינור לב אנושי למחקר. אנו מעריכים את מנהלת תפעול המחקר שלנו, עמיקשה ס. גנדי על מסירותה לתמיכה בפרויקטים שלנו. עבודה זו התאפשרה הודות לתמיכה של מענקי NIH OT2OD023848 & P01 HL164311 ומענק Leducq 23CVD04 לקליאנם שיבקומר, פרס פיתוח הקריירה של איגוד הלב האמריקאי 23CDA1039446 ל-PH, ופרויקט אמארה-יד של UCLA (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). סורק המיקרו-PET/CT GNEXT ששימש במחקר זה מומן על ידי מענק מכשור משותף של NIH למחקר בבעלי חיים (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x פוספט חוצץ מלחSigma-AldrichP3813
מציג תלת מימדMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 מ"מ f/4D IF-ED LENSניקון
אנטי-אקטין, &אלפא;-שריר חלק - נוגדן Cy3סיגמא-אולדריץ'C6198
מאגר אחזור אנטיגן (100x EDTA Buffer, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (תוצר גן חלבון 9.5)Abcamab108986
אנטי-TH (טירוזין הידרוקס ילאז)Abcamab1542
Anti-VAChT (טרנספורטר אצטילכולין שלפוחית)מערכות סינפטיות139 103
בנזיל אתרסיגמא-אולדריץ'108014
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A4503-10G
נימה של מדפסת תלת מימד צ'יטה (95A), 1.75 מ"מNinjaTek
Coverslip, 22 מ"מ x 30 מ"מ, מס' 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
דיכלורומתאןסיגמא-אולדריץ'270997-100 מ"ל
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'D8418-500 מ"ל
אתנול, 100%מעבדות דקון2701
גליציןסיגמא-אולדריץ'G7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE BIOSCIENCES
מלח נתרן הפרין מרירית מעי חזירSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
תמיסת מי חמצןSigma-AldrichH1009-500ML
תוכנת הדמיהZeissZEN (מהדורה שחורה)
תוכנת הדמיהOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3 מ"מ
מנוע KIRIחדשנות KIRI סריקת
לייזר מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM 880
LEAD-2 - אנכי & משאבה פריסטלטית רב ערוציתLONGER
Lightview XL Brightech
מתנול (מוסמך ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
סרום חמור רגילJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
מדפסת תלת מימד מקורית Prusa MK4Prusa Research
עט PAPAbcamab2601
Paraformaldehyde, 32%Electron Microscopy Sciences15714-S
PolycamPolycam
נוגדן
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
נוגדן
SlowFade זהב נוגד תושבתInvitrogenS36936
נתרן אזיד, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field כירורגי טלסקופים,  עיצובים למערכת
SZ61OLYMPUS
StereoPhoto Makerתוכנה חופשית שפותחה על ידי Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, PrecleanFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
קסילןסיגמא-אולדריץ'534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN
ראשונימשני סטריאומיקרוסקופ ראייה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart AnatomyThree Dimensional ImagingTissue ClearingConfocal MicroscopyMicro CT ScanningPressure Perfusion FixationImmunohistochemical StainingGross DissectionCardiac Innervation3D Heart Model

Related Articles