מאמר שיטה

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

4.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66831

⸱

3 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

תקציר

מוות תאי הוא תהליך בסיסי בכל האורגניזמים החיים. הפרוטוקול מבסס מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA)-תצהיר שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. LPS בשילוב עם ATP היא שיטת השראת דלקת קלאסית, המשמשת לעתים קרובות לחקר פירופטוזיס, אך אפופטוזיס ונקרופטוזיס מגיבים גם לגירוי על ידי LPS/ATP. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, קרום התא נשאר שלם וחשוף לפוספטידיל-סרין, ובשלבים מאוחרים יותר, קרום התא מאבד את שלמותו. כאן, ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח צביעה כפולה של Annexin V ו- 7-Aminoactinomycin D (AAD) כדי לזהות את מוות התאים מכל התאים. התוצאות מראות כי תאים משמעותיים מתו לאחר גירוי עם LPS/ATP. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אנו צופים בצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים. התוצאות מצביעות על כך שתאים עשויים לעבור פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס לאחר גירוי עם LPS/ATP. פרוטוקול זה מתמקד בצפייה במוות של מקרופאגים לאחר גירוי באמצעות LPS/ATP. התוצאות הראו כי מוות תאי לאחר גירוי LPS ו-ATP אינו מוגבל לפירופטוזיס, וכי אפופטוזיס ואפופטוזיס נמק יכולים להתרחש גם כן, מה שעוזר לחוקרים להבין טוב יותר את מוות התאים לאחר גירוי LPS ו-ATP ולבחור שיטה ניסיונית טובה יותר.

מבוא

מוות תאי הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי בכל האורגניזמים החיים. בשנים האחרונות, מחקרים משמעותיים הראו כי מוות תאי מעורב בחסינות ובאיזון בתוך האורגניזם. חקר מוות תאי עוזר לנו להבין טוב יותר את הופעתן והתפתחותן של מחלות. תוארו מספר צורות של מוות תאי מתוכנת, וכמה מטרות מפתח בתהליכים אלה זוהו. פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס הם שלושת מסלולי המוות התאיים המתוכנתים המוגדרים גנטית המעורבים באיזון פנימי ובמחלות1.

Pyroptosis מאופיין על ידי היווצרות של נקבוביות הממברנה ואת שחרורו של תוכן התא. קספזות או גראנזימים פעילים מנתקים גזדרמינים כדי להפריד את תחומי N-terminal שלהם, אשר לאחר מכן אוליגומריים, נקשרים לקרום ויוצרים נקבוביות 2,3,4. נקבובית הגסדרמין מספקת תעלת הפרשה לא טיפוסית על פני קרומי התאים, וכתוצאה מכך תגובות תאים במורד הזרם, כולל שחרור תוכן וזרימת יונים 2,3,4. בסופו של דבר, התאים חווים בסופו של דבר קרע בקרום הפלזמה וליזה פירופטוטית בסיוע נינג'ורין-15. באפופטוזיס, Bax ו-Bak מופעלים יוצרים אוליגומרים על הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה ומשחררים ציטוכרום C, המווסת על ידי איזון בין חלבונים פרואפופטוטיים ואנטי-אפופטוטיים ממשפחת BCL-2, קספזות יוזמות (קספאז-8, -9 ו-10-) וקספזות אפקטור (קספאז-3, -6 ו-7)1,6,7. השינויים המורפולוגיים של אפופטוזיס כוללים דימום ממברנה, התכווצות תאים, פיצול גרעיני, עיבוי כרומטין והיווצרות גוף אפופטוטי 6,8. הקולטן סרין/תראונין-פרוטאין קינאז 1 (RIPK3) וקינאז דמוי שושלת מעורבת (MLKL) הם שני מרכיבי ליבה במורד הזרם של מנגנון נקרופטוטי1. RIPK3 מגייס ופוספורילטים MLKL, p-MLKL אוליגומריזציה, מתקשר לקרום התא, יוזם נקבים בממברנה, גורם לזרם יונים, מגביר אוסמולריות תוך תאית, ובסופו של דבר קרע תאים 6,9. Gasdermins ו- MLKL נקשרים לקרום הפלזמה ומתווכים פירופטוזיס ונקרופטוזיס, בהתאמה, בעוד BAX/BAK מתווך אפופטוזיס על ידי קשירה לקרום החיצוני של מיטוכונדריה6.

למרות שלכל מסלול יש מנגנונים ותוצאות ספציפיים, הם מובילים לשינויים דומים על קרום התא. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין (PS) ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, PS ייחשף, מחוץ לקרום הפלזמה. Caspase-3/caspase-7 מפעיל משפחות TMEM16 ו-XKR, מה שמוביל לקרום תא אסימטרי ומחצין PS במהלך אפופטוזיס10. זרם Ca2+ בתיווך D של Gasdermin ו- MLKL מוביל לאובדן הסימטריה של דו-שכבת הפוספוליפידים על קרום התא ולחשיפה של PS. החשיפה מתרחשת לפני אובדן שלמות קרום התא11,12. בהתבסס על השינויים הדומים בממברנה של שלושת הסוגים האלה של מוות תאי מתוכנת, אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) כדי לזהות מוות תאי. Annexin V, חלבון קושר פוספוליפידים תלוי סידן, יש זיקה גבוהה PS, אשר יכול לשמש בדיקה רגישה כדי לזהות PS חשוף על פני השטח של קרום פלזמה13. 7-AAD הוא כתם חומצת גרעין שאינו יכול לעבור דרך כל קרום התא. הוא דומה לפרופידיום יודיד (PI), צבע נפוץ של חומצות גרעין. יש להם מאפיינים פלואורסצנטיים דומים, אך ל-7-AAD יש ספקטרום פליטה צר יותר ופחות הפרעות לערוצי גילוי אחרים. בשל קווי דמיון אלה, אין זה מספיק להבחין בין פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס. השתמשנו בציטומטריית זרימה כדי לזהות מוות תאי מתאים שלמים. שיטה שנייה משמשת ללכידת קרום התא באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לבחון את הצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים.

הקמנו מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA) - שיקוע שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. פרוטוקול זה מתמקד בהתבוננות במוות תאי ולא בחקירת מנגנונים.

פרוטוקול

1. קו תאים ותרבית תאים

  1. לגדל את קו התאים המונוציטיים האנושיים THP-1 בתווך תרבית שלם RPMI-1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.05 מילימטר β-מרקפטואתנול. תרבית את התאים ב 37 ° C ב 5% CO2 אוויר לח. תאי תרבית כל 2-3 ימים.
    הערה: THP-1 הוא תא תרחיף, בחר לשנות מחצית מהמדיום עבור תת-תרבית. כאשר מתבוננים בשברי תאים רבים תחת מיקרוסקופ האור, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשהות מחדש את התאים במדיום תרבית התאים המלא הטרי שחומם מראש.
  2. השתמש בתאים (במעברים 4-10) בשלב הגידול הלוגריתמי עבור כל הניסויים. כאשר התאים במצב טוב ובשלב הצמיחה הלוגריתמי, הם עגולים, בהירים, צפופים וללא גושים ושברי תאים תחת מיקרוסקופ האור ברזולוציה של 100x.

2. התמיינות של תאי THP-1

  1. הכן תמיסת מלאי של PMA בריכוז של 1 mM (להמיס 1 מ"ג של PMA ב 1.62 מ"ל של dimethyl sulfoxide). לדלל את תמיסת מלאי PMA עם מדיום תרבית תאים מלאה לריכוז עבודה סופי של 100 ננומטר.
  2. אספו את התאים בצלחת התרבית לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית של 10 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, להשהות תאים עם 3 מ"ל של מדיום תרבית מלאה המכיל PMA.
  3. פתח את מונה התאים ואת תוכנת הספירה. פיפטה 20 μL של תרחיף התא ללוח מונה התא ולהכניס אותו לתוך לוח מונה התא. לחץ על תצוגה מקדימה B1, סובב את הידית בפינה השמאלית התחתונה של המכשיר וכוונן את מרחק המוקד כדי ליצור את התאים עם מרכז בהיר עם קווי מתאר ברורים בתוכנה. לחץ על ספירה כדי להתחיל לספור.
  4. בהתבסס על תוצאות הספירה, השתמש במדיום תרבית שלם המכיל PMA כדי להתאים את צפיפות התא ל- 1 x 106 תאים/מ"ל. תאי זרעים בצלחת 6 באר, לדגור על הצלחת במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2 לפני תחילת טיפול נוסף.

3. טיפול בתאי THP-1

  1. הכינו תמיסת מלאי של LPS בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (יש להמיס 1 מ"ג LPS ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS)). יש לדלל את תמיסת מלאי LPS בתווך נטול סרום עד לריכוז עבודה סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל. הכן תמיסת מלאי של Na2ATP בריכוז של 500 mM (להמיס 0.3026 גרם ATP ב 1 מ"ל של PBS).
  2. שאפו את המדיום המכיל PMA מבארות ושטפו עם PBS 1x. הוסף מדיום ללא סרום לקבוצת הביקורת ומדיום ללא סרום המכיל LPS לקבוצת הדגמים. לדגור על הצלחת במשך 6 שעות ב 37 ° C + 5% CO2 לפני שתמשיך עם טיפול נוסף.
  3. לאחר 6 שעות, הוסף את פתרון מלאי ATP לקבוצת המודל לריכוז עבודה סופי של 500 ננומטר. לדגור על הצלחת במשך 45 דקות ב 37 ° C + 5% CO2 לפני שתמשיך.

4. ניתוח ציטומטריית זרימה (שיטה 1)

  1. הכנת דגימות ניסוי
    1. זרעו ודגרו על תאים בצלחות 6 בארות לפי שלב 2. הקימו ארבע קבוצות ביקורת ללא טיפול: בקרה אחת ללא צביעה, שתי בקרות צביעה בודדות (אחת לכל כתם) ובקרת צביעה כפולה אחת. להקים קבוצת טיפול אחת ולטפל לפי שלב 3.
    2. לאחר הטיפול, לשאוף את כל supernatant מן הבארות ולשטוף עם PBS 2x. מוסיפים 500 μL של 0.05% טריפסין (לא EDTA) לכל באר, ודגרים באינקובטור במשך 30 שניות.
    3. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית שלם RPMI-1640 לכל באר כדי לעצור את ניתוק התאים ולאסוף את התאים לתוך צינור 5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הוסף 1 מ"ל של PBS כדי להשעות תאים. מניחים צינורות עם תאים באמבט מים ב 37 ° C למשך 3 דקות. צנטריפוגה כל הדגימות ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לדלל 200 μL של 5x חיץ מחייב עם 800 μL של מים מזוקקים ל 1x חיץ קשירה. הוסף 100 μL של 1x binding buffer כדי להשהות מחדש תאים ולהעביר את התאים לתוך צינור 5 מ"ל.
    6. הוסף 5 μL של תמיסת V-PE Annexin לצינור אחד של תאי קבוצת ביקורת למשך 10 דקות ו- 5 μL של תמיסת 7-AAD לצינור אחר של תאי קבוצת ביקורת למשך 5 דקות (כפקדי צביעה בודדים בנפרד). מערבלים בעדינות כל צינור כדי לערבב צבע ולדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר המוגנות מפני אור. הוסף 400 μL של PBS לכל צינור ומערבול בעדינות כדי לסיים את הדגירה.
    7. הוסף 5 μL של תמיסת Annexin V-PE לצינורות הנותרים ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מערבלים בעדינות כל צינור כדי לערבב צבע ולדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר המוגנות מפני אור. לאחר 5 דקות, הוסיפו 5 מיקרוליטר של תמיסת 7-AAD למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 400 μL של PBS לכל צינור ומערבולת בעדינות כדי לסיים את הדגירה.
    8. סנן את מתלה התא באמצעות רשת ניילון 35 מיקרומטר שהם חלק מצינורות פוליסטירן עגולים 5 מ"ל. מניחים את הצינור על קרח ומחכים לבדיקה. ערבבו בעדינות לפני הבדיקה ולאחר מכן הכניסו אותו למכשיר.
  2. ציטומטריית זרימה
    1. השתמש בציטומטר זרימת מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות לבדיקה. פתח את תוכנת ניתוח נתוני ציטומטר הזרימה ואשר את ביצועי הגלאי והלייזר. לחץ על Cytometer ובחר אתחול Fluidics, המתן עד שהמערכת תהיה מוכנה. אל תכלול בועות תא זרימה על ידי לחיצה על Cytometer > Clean Modes > De-gas Flow cell.
    2. לחץ על ניסוי, בחר ברצף תיקיה חדשה, ניסוי, דגימה, צינור וערוך שם. חץ בצורת מחומש לפני הצינור, הופך לירוק כאשר הוא נדלק.
    3. לחץ על הסמל של Cytometer FACSCelesta (סמל מקש קיצור), בחר פרמטר, ולאחר מכן בחר FSC, SSC ואות PE . לחץ על הסמל של Global Worksheet (סמל מקש קיצור) כדי ליצור היסטוגרמה PE. עבור ציטומטר הזרימה המשמש במחקר זה, השתמש PE עבור נספח V ב 586 ננומטר ותרשים על ציר X; PerCP-Cy5.5 עבור 7-AAD ב-700 ננומטר והתוויית ציר Y.
    4. הכנס תחילה דגימת בקרה לא מוכתמת למכשיר. לחץ על הסמל של Acquisition Dashboard (סמל מפתח קיצור), רכוש מינימום של 10,000 אירועים מהאוכלוסייה הרצויה. אל תכלול פסולת באמצעות שער (P1) בתרשים נקודות FSC-A ו- SSC-A. התאם את קצב הזרימה למהירות בינונית והקלט נתונים. כוונן את המתח כדי למקם את אוכלוסיית התא באלכסון של היסטוגרמה FSC/SSC ולחץ על הפעל מחדש. התאם את קצב הזרימה למהירות בינונית והקלט נתונים.
    5. לחץ על הצינור הבא, הפעל פקדי צביעה בודדים של Annexin V ו- 7-AAD כדי להתאים את הפיצוי. הפעל את הצינורות הנותרים ואסוף נתונים.

5. דימות SEM (שיטה 2)

  1. הכנת דגימות ניסוי
    1. לזרוע ולדגור תאים בצלחות 6 בארות לפי שלב 2 ולטפל לפי שלב 3.
    2. לאחר הטיפול, לשאוף את כל supernatant מן הבארות ולשטוף 2x עם PBS. מוסיפים 500 μL של 0.05% טריפסין (לא EDTA) לכל באר, ודגרים באינקובטור במשך 30 שניות.
    3. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית שלם RPMI-1640 לכל באר כדי לעצור את ניתוק התאים ולאסוף את התאים לתוך צינור 5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. תקן תאים עם 500 μL של מיקרוסקופ אלקטרונים קיבוע (2.5% דיאלדהיד גלוטרי, 100 mM מלחי זרחן) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לילה ב 4 ° C.
    5. הכינו תמיסת אלום כרום: הוסיפו 1.0 גרם ג'לטין ל-100 מ"ל מים טהורים במיוחד, חימום מים-אמבטיה בטמפרטורה של 70°C וערבבו באופן שווה. מוסיפים 0.05 גרם אלום כרום, מערבבים באופן שווה ומסננים עם נייר מסנן. טובלים את זכוכית הכיסוי הנקייה בתמיסת אלום כרום למשך שעתיים ב-37°C ומייבשים אותה בתנור ב-37°C לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: המטרה היא למנוע ניתוק תאים במהלך הניסוי.
    6. אסוף תאים מתמיסה קבועה. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של PBS ולנשוף בעדינות את התאים. זרוק את מתלה התא על זכוכית הכיסוי, לאפשר לעמוד במשך 5 דקות. שאפו את כל הסופרנאטנט ושטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: יש לבצע את הפעולה בעדינות כדי למנוע ניתוק תאים. אין לנער במרץ, לנוע לאט, ולהוסיף נוזלים לאט לאורך הקיר.
    7. הוסף 500 μL של קיבוע חומצה אוסמית 1% למשך שעה אחת. שאפו את כל הסופרנאטנט ושטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
    8. יש לייבש את הדגימות ברצף בסדרה של ריכוזי אתנול (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) למשך 15 דקות לכל תמיסת EtOH.
      הערה: ניתן לשמור את משקפי הכיסוי ב-100% EtOH למשך מספר ימים בטמפרטורה של 4°C, אך עליהם להתייבש בהקדם האפשרי כדי למנוע התייבשות מוגזמת.
    9. הפעילו את מייבש הנקודות הקריטיות, פתחו את מיכל ה-CO2 , קררו את התא ל-10°C. עטוף במהירות את המדגם בנייר סינון כאשר לחץ התא הוא 0 psi והכנס אותו לתא.
    10. פתח את שסתום הכניסה, התבונן דרך חלון תצפית CO2 , העלה את רמת CO2 הנוזלי בין שני הקווים האדומים (אין לחרוג מהגבול העליון), סגור את שסתום הכניסה. משרים את הדגימה למשך 10 דקות. פתח את שסתומי הכניסה והפליטה בו-זמנית כדי להשוות את ה-CO2 למשך דקה אחת (CO2 נוזלי מחליף את EtOH). סגור את שסתום הפליטה כדי להעלות את רמת CO2 הנוזלי למיקום שצוין, סגור את שסתום הכניסה.
    11. הגדר את הטמפרטורה ל 35 ° C ולחץ על 1250 psi. ברגע שהטמפרטורה והלחץ מתייצבים, יש להוריד את הלחץ על 100 psi/min. הוציאו את הדגימה כאשר לחץ התא הוא אפס וכבו את המכשיר.
    12. הרכבה של דגימות על מחזיקי דגימות אלומיניום SEM באמצעות סרט מוליך. השתמשו במעיל מרזב כדי לכסות את הדגימות בשכבה (2-5 ננומטר) של זהב.
  2. דימות
    1. השתמש ב- SEM של פליטת שדה קר ברזולוציה גבוהה להדמיה. הגדר את מתח ההאצה של SEM ל- 3 kV. הגדר את מרחק העבודה ל -10 מ"מ. הגדר את ההגדלה ל- 1,000x כדי לצפות בפנורמה. הגדר את ההגדלה ל- 5,000x ו- 20,000x כדי לאתר את קרום הפלזמה ולצלם את הדגימה.
      הערה: תהליך ההדמיה של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA באמצעות SEM דומה לסוגים אחרים של תאים ורקמות ותלוי במכשירים שבהם נעשה שימוש. הפניה14 מספקת פרוטוקול SEM מפורט עם סרטונים נלווים.

תוצאות

דגימות התאים טופלו כמתואר בפרוטוקול ונעשה זיהוי ציטומטריית זרימה. לא ניתן להכתים תאים רגילים בנספח V וב-7-AAD (נספח V-/7-AAD-). בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, PS נחשף ונקשר לנספחין V, אך קרום התא עדיין היה שלם ולא כלל 7-AAD מהחלל החוץ-תאי (Annexin V+/7-AAD-). בשלבים מאוחרים יותר, קרום התא מאבד את שלמותו, התאים מוכתמים בו זמנית על ידי Annexin V ו- 7-AAD, ומראים תוצאות חיוביות כפולות (Annexin V+/7-AAD+). התאים הנמקיים הוכתמו רק ב-7-AAD (נספח V-/7-AAD+). איור 1 מראה שאחרי גירוי LPS/ATP, התאים באזור Q2 גדלו באופן משמעותי, מה שמצביע על מוות תאי.

אנו משתמשים ב- SEM כדי ללכוד את פני השטח של קרום הפלזמה, תוך התבוננות ישירה במאפייני הממברנה מתא יחיד. איור 2A מראה את תאי הבקרה, איור 2B-D מראה את התאים אחרי גירוי LPS/ATP. התבוננו בתאים עם מאפיינים של פירופטוזיס, כולל דימום קרום וקרע בקרום (איור 2B), תאים עם מאפיינים אפופטוטיים, כולל דימום ממברנה והתכווצות תאים (איור 2C), ותאים עם מאפייני נקרופטוזיס, כולל התנפחות תאים וקרע בקרום (איור 2D).

figure-results-1
איור 1: זיהוי צביעה כפולה של Annexin V/7-AAD באמצעות ציטומטריית זרימה. (A) צביעה שלילית של נספח V וצביעה שלילית של 7-AAD (Q4), צביעה כפולה חיובית של נספח V וצביעה כפולה שלילית של 7-AAD (Q3), צביעה חיובית של נספח V וצביעה חיובית של 7-AAD (Q2), וצביעה שלילית של נספח V וצביעה חיובית של 7-AAD (Q1). (ב) נתונים כמותיים עבור (א). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3), מבחן t לא מזווג, **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סריקת תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. (A) קבוצת ביקורת, הגדלה פי 5,000/20,000x. (ב, ג, ד) קבוצת LPS/ATP הראתה דימום של הממברנה, קרע של הממברנה (Bembrane): ↑), נפיחות תאים (Cell נפיחות): ↑) והתכווצות תאים (Cell התכווצות): ↑) בהגדלה של פי 5,000/20,000x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בכתב יד זה, שתי שיטות שימשו לזיהוי LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. נעשה שימוש בצביעה כפולה של Annexin V/7-AAD, והתוצאות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה מהצביעה הכוללת. כמו באנליזה ציטומטרית זרימה אחרת, קבוצה של תאים לא מוכתמים ושתי קבוצות של תאים מוכתמים בודדים הוקמו כדי לא לכלול תוצאות חיוביות כוזבות ושליליות כוזבות. התוצאות מראות כי לאחר גירוי LPS/ATP, מספר תאים איבדו את שלמות הממברנה, מה שמצביע על כך שייתכן שהתרחש מוות תאי. שיטת זיהוי זו מאפשרת לנו להעריך את מוות התאים מתאים שלמים. ראוי לציין כי הצביעה הכפולה של Annexin V/7-AAD אינה מספיקה כדי להבחין בין פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס. בשלבים המוקדמים של שלוש צורות אלה, PS ייחשף מחוץ לקרום הפלזמה, וצביעת Annexin V תהיה חיובית. שלמות הממברנה אובדת בשלב המאוחר של שלוש צורות אלה, ותוצאות הצביעה מראות צביעה חיובית כפולה. לכן, השתמשנו ב-SEM כדי להמשיך ולבחון את הצורות האפשריות של מוות תאי שעלולות להתרחש.

באפופטוזיס, היווצרות נקבוביות BAX/BAK על הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, התכווצות התאים לאחר מכן והופעת קרום התא. נקרופטוזיס משתמש ב-MLKL כדי לפתוח נקבוביות בקרום התא, בעוד שאות פירופטוזיס מפעיל את הגסדרמין ליצירת נקבוביות בקרום התא. ראוי לציין כי הן pyroptosis ו necroptosis מלווים קרע קרום התא בשלב הסופי. עם זאת, נקבוביות גסדרמין גדולות בהרבה מנקבוביות MLKL, כך שלנקבוביות גסדרמין אין סלקטיביות יונים. תאים נקרופטוטיים מפגינים נפיחות משמעותית במורפולוגיה15. בסופו של דבר הם מסתיימים בקרע בממברנה. ללא קשר למסלול האיתות במעלה הזרם של הפעלת חדירות קרום התא, שינויים בקרום התא מלווים את שלוש צורות המוות התא הללו. השתמשנו ב-SEM כדי להמשיך ולהתבונן בקרום התא, מה שמספק דרך אינטואיטיבית לבחון מוות תאי. ראינו את המאפיינים של פירופטוזיס, כולל דימום הממברנה וקרום הקרע, ונקרופטוזיס, כולל התנפחות תאים וקרום הקרע, בהתאם למאפיינים שנחקרו על ידי חוקרים קודמים15. נצפו דימום קרום והתכווצות תאים, בהתאם למאפייני אפופטוזיס שנחקרו על ידי חוקרים קודמים16.

במחקרים קודמים, השילוב של LPS ו- ATP שימש לעתים קרובות כדי לגרום פירופטוזיס. באופן מעניין, ראינו תכונות של אפופטוזיס ונקרופטוזיס. למרות שכל שלוש הצורות עשויות להתרחש במוות תאי הנגרם על ידי LPS/ATP, מחקרים קודמים הראו כי פירופטוזיס נותר מצב המוות הדומיננטי. LPS הוא אחד הדפוסים המולקולריים המאופיינים ביותר הקשורים לפתוגן. ATP שוחרר מתאים גוססים, יש ריכוז גבוה בתוך התא. ATP חוץ-תאי הוא אחד הדפוסים המולקולריים הקשורים לסכנה17. LPS/ATP היא שיטת גירוי דו-שלבית קלאסית לגרימת פירופטוזיס. מחקרים הראו כי תוספת של ATP לתאים מעוררי LPS יכולה להפעיל במהירות קספאז-118 בעוד השתקת הגן קספאז-1 יכולה להפוך באופן משמעותי את מוות התאים הנגרם על ידי LPS/ATP19. במחקרים קודמים, מצאנו גם הפעלה הנגרמת על ידי LPS/ATP של חלבוני מטרה אפופטוטיים ונקרופטוטיים20,21. למרות LPS/ATP הוא גורם פירופטוזיס קלאסי, הוא עשוי גם לגרום לאפופטוזיס ונקרופטוזיס.

למעשה, שלוש צורות אלה לעתים קרובות אינן קיימות באופן עצמאי, והצלבה בין שלבי אותות. לדוגמה, חלבוני גסדרמין מכוונים למיטוכונדריה כדי לקדם שחרור ציטוכרום C כדי לשפר את מסלול אפופטוטי המיטוכונדריה22. הפעלה של קספאז-3 יכולה לבקע gasdermin E ולאחר מכן להפעיל pyroptosis23. מחקר מצביע על כך שאיתות MLKL/PIPK3 מעורב בהפעלה של NLRP3 inflammasomes24. שיחה צולבת מורכבת זו הובילה לרעיון של PANoptosis, המוגדר כמסלול מוות תאי מתוכנת דלקתי המווסת על ידי קומפלקס PANoptosome עם תכונות מפתח של פירופטוזיס, אפופטוזיס, ו / או נקרופטוזיס שלא ניתן להסביר על ידי אף אחד ממסלולי המוות התא המתוכנתים האלה לבד25. כאשר הרעיון של PANoptosis הוצע, מדענים תיארו את ההתרחשות של מוות תאי מתוכנת באופן מקיף יותר, זה גם מדגיש את המורכבות של מוות תאי מתוכנת. בינתיים, זה גם מצביע על המגבלות של שיטת מחקר זו. למרות שפירופטוזיס נחשב דומיננטי במוות תאי הנגרם על ידי LPS/ATP, לא ניתן לקבוע את חלקן של צורות מוות אלה או אם כולן קיימות, אפילו בצורות אחרות של מוות מתוכנת. זה יכול להיות תחום לחקור בעתיד.

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים. תיארנו שיטה של בדיקה מן השלם אל הפרט, אשר ישים גם מודלים ותאים אחרים. התוצאות מצביעות על כך שתאים עברו פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס, שאינו מוגבל לפירופטוזיס, מה שעוזר לחוקרים להבין טוב יותר את מוות התאים לאחר גירוי LPS ו-ATP ולבחור שיטה ניסיונית טובה יותר. במחקרים קודמים, Annexin V/7-AAD או Annexin V/PI צביעה כפולה שימש בדרך כלל כדי להצביע על התרחשות של אפופטוזיס26,27, כמה חוקרים השתמשו בו גם כדי לחקור אפופטוזיס28. למעשה, איננו יכולים להבחין בין שלושת סוגי המוות התאי באמצעות כתמים כפולים אלה. פרוטוקול זה מזכיר לחוקרים, במיוחד למתחילים, כי צביעה כפולה של Annexin V/7-AAD או Annexin V/PI אינה יכולה להתאים את סוג המוות הסלולרי. זה יכול רק להראות נזק לתא ומוות בכללותו או להצביע על כך שהתא אולי עבר צורה כלשהי של מוות. במחקר ממוקד יותר, יש צורך להציג קבוצת ביקורת המעכבת מקרי מוות אחרים כדי להראות כי מוות מתכנת באופן חד משמעי הוא בהישג יד. באופן דומה, מחקר מכניסטי נוסף יחקור את המטרות הקריטיות של מקרי מוות מתוכנתים שונים.

בנוסף, במהלך הכנת הניסוי מצאנו כי קיימים כיום הליכי ניסוי מפורטים רבים עבור SEM של תאים דבקים, עם תיאור מועט של תאים מרחפים. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט יותר של שיטת הכנת הדגימה עבור תאים מרחפים. שלב 5.5 הוא צעד הכרחי כדי לסייע בהשתקת תאים מרחפים לשקופיות תאים. הפעולות הבאות חייבות להתבצע בעדינות כדי למנוע ניתוק תאים. בנוסף לתמיסת אלום כרום, פולי-L-ליזין יכול גם לשתק תאים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מביעים את הערכתנו הרבה לג'יה-יי סון וללו יאנג במכון החדשני לרפואה סינית ורוקחות, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, על הסיוע בציטומטריית זרימה, קויפינג צ'ן במעבדת המפתח הממלכתית של משאבי הרפואה הסינית הדרום-מערבית, על העזרה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [82104491], הקרן למדעי הטבע של סצ'ואן [2023NSFSC0674], והקרן למדע פוסט-דוקטורט של סין [2021M693789].

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת אנזימי לבלב 0.25% (לא כולל EDTA)BOSTER co.ltd טכנולוגיה ביולוגיתPYG0068
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגולCORNING352235
5 מ"ל צינור צנטריפוגהLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
צלחת 6 בארות Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Annexin V-PE/7-AAD ערכת ניתוח אפופטוזיסאבסין (שנחאי) טכנולוגיה ביולוגית co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5× מאגר מחייב, פתרון בקרה חיובי לאפופטוזיס
חממת סלקולטור CO2 אסקו(שנחאי) פיתוח ארגוני ושות 'בע"מ.N/A
, 100 מ"מSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell CounterNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 Counting ChambersNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
מכונת צנטריפוגהHunan Xiangyi מעבדה Instrument Development Co., LtdL530
אלום כרום גואנגדונג Wengjiang מגיב כימי ושות', בע"מ
משקפי כיסוי PA04354, 9 מ"מLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
מייבש נקודה קריטיתQuorum TechnologiesK850
דימתיל סולפוקסידBOSTER טכנולוגיה ביולוגית co.ltdPYG0040
מיקרוסקופ אלקטרונים מקבעServicebio Technology co.ltd G11022.5% דיאלדהיד גלוטארי, 100 מ"מ מלחי זרחן
איזון אלקטרוניSHIMADZUATX124
אתנול מוחלטצ'נגדו קלונג כימיקלים ושות', בע"מ2021033102
ציטומטר זרימהBecton, Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימהBecton, Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM תוכנה
ג'לטיןגואנגדונג Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה קר ברזולוציה גבוההTITACHIRegulus 8100
קו תאים מונוציטים אנושיים THP-1Procell Life Science& טכנולוגיה ושות', בע"ממיקרוסקופ הפוך CL0233
 Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR מערבולת מערבולת מיקסרVELP Scientifica SrlZX4
ליפופוליסכריד בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ L8880LPS נגזר מ- Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & טכנולוגיה ושות', בע"מ A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ P6741
מי מלח חוצץ פוספטServicebio Technology Co.Ltd G4202
פיפטהEppendorf AG/A
קצות פיפטה, 10 μ Lסרוויסביו טכנולוגיה ושות', בע"מ T-10PL
, 1 מ"ל סרוויסביו טכנולוגיה ושות', בע"מ T-1250L
, 200 μ Lסרוויסביו טכנולוגיה ושות', בע"מ T-200L
RPMI-1640 מדיית תרבית מלאהProcell Life Science& טכנולוגיה ושות', בע"מCM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05 מ"מ & בטא;-מרקפטואתנול + 1% P/S
RPMI-1640 מדיית תרבית שנחאי  בזלמדיה  טכנולוגיות ושות', בע"מ
נוזל נדןK211104 בקמן קולטר8546733
מקרטעציפוי קרסינגטון מכשירים מדעיים בע"מ108
אמבט מים תרמוסטטיGUOHUA מכשיר חשמלי ושות', בע"מ HH-1
צלחת תרבית תאים Nקצות פיפטה קצות פיפטה

מקורות

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גירוי LPS ATPגילוי PMAמוות תאיפירופטוזיסאפופטוזיסנקרופטוזיסציטומטריה זרימהמיקרוסקופיית אלקטרונים סורקתצביעת Annexin V
LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.