מאמר שיטה

שימוש במתן תרופות מונחות מיקרופיפטה כשיטה חלופית לגבאג' אוראלי במודלים של מכרסמים

4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66836

⸱

26 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים מתן תרופות מונחות מיקרופיפטה (MDA) כשיטה חלופית לאכילה אוראלית המתמרצת את חיית המחקר לבלוע טיפולים בקלות עם מינימום מתח ואי נוחות.

תקציר

גאוות אוראלית (OG) עם שימוש בצינורית המחוברת למזרק היא אחת השיטות הנפוצות ביותר המשמשות להעברת מינון מדויק של תרכובות לקיבתן של חיות מחקר. למרבה הצער, שיטה זו מגיעה עם קשיים הן עבור המפעיל והן עבור חיית המחקר. מחקרים הראו כי OG עלול להוביל לסיבוכים, כולל דלקת הוושט, ניקוב של הוושט, ומתן תרופות קנה הנשימה בשוגג. בנוסף, OG קשור לעלייה ברמות פלסמה וקורטיקוסטרון צואה (עקב מתח), לחץ דם משתנה וקצב לב מוגבר, מה שעלול להשפיע לרעה או להטות את תוצאות המחקר. שיטה חלופית שפותחה בעבר בשם MDA (ראשי תיבות של micropipette-guided drug administration) מתמרצת את בעל החיים לצרוך טיפולים בקלות באופן זעיר פולשני. להלן נציג דוגמאות לשימוש בטכניקת מד"א עם טיפולים המשוחזרים בכלי רכב שונים ונדגים העברה יעילה של הטיפולים המגוונים לזני עכברים שונים. עוד אנו מראים כי מד"א היא טכניקה המפחיתה את העיתוי והפולשניות של מתן תרופות ואינה משפיעה על הרכב מיקרוביום המעי כפי שהוערך על ידי ניתוח כמותי של מיני חיידקי מעיים מרכזיים. בסך הכל, מד"א עשוי להציע חלופה פחות מלחיצה ויעילה ל-OG.

מבוא

מתן תרופות למודלים של מכרסמים מושג בדרך כלל באמצעות gavage אוראלי (OG), המורכב ממתן תכשיר נוזלי ישירות לקיבה באמצעות צינורית המחוברת למזרק המכיל את התמיסה. טכניקה זו מביאה למינון עקבי ומדויק של הטיפול בבעל החיים, אך טומנת בחובה גם חסרונות רבים. OG נבדק על כך שאינו מודל כראוי של חשיפות תזונתיות אנושיות 1,2. כמו כן, OG מעלה את הסיכון לפגיעות לא מכוונות במערכת העיכול העליונה (ניקוב הוושט והקיבה), שאיפת הטיפול הניתן ונגעים בדרכי הנשימה3. OG קשורה גם עם אי נוחות4, לחץ דם מוגבר וקצב לב5, כמו גם מתח 6,7, ולפעמים מוות8 עקב ירידה סובלנות gavage על ידי החיה. שינויים פיזיולוגיים אלה עלולים להפריע או לבלבל את תוצאות הניסוי; לכן, נהלים חדשים נחקרו כדי למנוע תופעות לוואי אלה. מחקרים השתמשו בפרוצדורות חלופיות ל-OG, כגון שימוש בג'לטין ככלי סם9, רצועות המסה דרך הפה (ODS)10, מחטי gavage מצופות סוכרוז11, צינורות הזנה גמישים, עוגיות חיטה12, דבש13 וכדורי חמאת בוטנים14. למרבה הצער, ישנן מגבלות בשינויים אלה בטכניקת OG, כולל חוסר התאמה לתרופות בלתי מסיסות במים, זמן הכנה ארוך יותר לטיפול15, טעם התרופה ויציבות15, והכרת החיה עם המזון. יתר על כן, קיים פוטנציאל למינון פחות מדויק כאשר בעלי חיים מאכילים אד ליב.

סקרבורו ועמיתיו פיתחו בעבר שיטת טיפול אוראלית אלטרנטיבית בעכברים, אותה כינו MDA (ראשי תיבות של micropipette-guided drug administration). שיטת מתן זו מבוססת על תמיסת חלב מרוכז ממותק ככלי לחומרים פרמקולוגיים, המניעה את חיות המחקר לצרוך את הרכב המוכן ו/או תמיסות תרופתיות בקלות באמצעות ניפוק התמיסה עם פיפטה וקצה פיפטה חד תעלות. כדי ליישם טכניקה זו, מכרסמים עוברים אימון (מינימום יומיים) כדי לקצר את זמני הטיפול ולאפשר לחיית המחקר להכיר את השתייה מקצה פיפטה4. מחקרי תיקוף ראשוניים של Scarborough et al.7 ו- Schalbetter et al.16 מצביעים על כך שההליך של MDA קל ליישום, חסכוני, זעיר פולשני ופחות מלחיץ עבור בעלי החיים מאשר שיטות אוראליות קונבנציונליות. סקרבורו ועמיתיו הציגו את השימוש בטכניקת MDA במודל עכברי של הפעלה חיסונית אימהית (MIA) של הפרעות נוירו-התפתחותיות7. מחקר זה הראה כי הפרופילים הפרמקוקינטיים של עכברים שטופלו בתרופה האנטי פסיכוטית ריספרידון באמצעות מד"א היו דומים לשימוש ב- OG. יתר על כן, מד"א לא גרם לעלייה ברמות הקורטיקוסטרון (הורמון הלחץ) בעכברים, וטיפול כרוני בריספרידון בטכניקת מד"א הוביל לירידה תלוית מינון בליקויים באינטראקציה חברתית הנגרמת על ידי MIA וברגישות יתר לאמפטמין7. מחקרים נוספים בדקו את היעילות של MDA לעומת OG הן במודלים של עכבר17 והן במודל של חולדה18 . מד"א הושווה גם להזרקה תוך צפקית והוכח כיעיל באותה מידה במתן קלוזאפין-N-אוקסיד לעכברים16. לאור ההצלחה המדווחת של מד"א בהפחתת הלחץ על בעלי החיים והיעילות הטיפולית, אנו שואפים כעת להמשיך ולחקור את טכניקת מד"א כשיטה יעילה להעברת תרופות תוך שימוש במודלים נוספים של מורין. במאמר זה אנו מתארים את יישום שיטת מד"א לטיפול בזני עכברים שונים, כולל זני FVB/NJ ו-C57BL/6J בעלי יכולת חיסונית וזני NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) מדוכאי חיסון עם טיפולים פומיים שונים, כולל חיידקים חיים, תרכובות ניסיוניות המועברות בתמיסות בלתי מסיסות במים (שמן תירס) ובקרות רכב. הערכנו את הפעילות והנוכחות של הטיפולים השונים בסרום ובצואה, והערכנו שינויים במיקרוביוטת הליבה של המעי ביחס לשיטת מד"א.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ותחת פרוטוקולים מוסדיים של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (IACUC) M021M197 ו-M023M195. זני עכברים המשמשים (עכברים זכרים, בני 7 שבועות) מתוארים בטבלת החומרים. השימוש בעכברים זכרים נבע מהשימוש בהם במחקרים המתמשכים של סרטן הערמונית. שיטת מד"א הוכחה בעבר כיעילה גם בנקבות עכברים 7,17. עכברים חולקו באקראי לכלובים / קבוצות הטיפול שלהם. העכברים טופלו בכלובים וללא סדר מסוים. הנסיין שנתן את הטיפולים היה עיוור לקבוצת הטיפול. המספר שהוקצה לעכבר התייחס לתעודת הזהות שלו ולא לסדר הטיפול בו. הנתונים נאספו לאורך ציר הזמן של המחקר ונותחו בסיומו כדי למנוע הטיה. מבחני הניסוי היו עיוורים לקבוצת הטיפול עד שכל הנתונים נאספו.

הערה: פרוטוקול זה שונה מ- Scarborough et al.7.

1. הכנת טיפולים

  1. הכינו תמיסה של חלב מרוכז ממותק (מרכיבים: חלב וסוכר) ומים בדרגת ביולוגיה מולקולרית ביחס של 3:10 חלב למים. למדוד את חלב מרוכז ממותק באמצעות צינור חרוטי 15 מ"ל בשל צמיגות החלב.
  2. באמצעות צינור חרוטי של 50 מ"ל, מערבבים מים ברמה של ביולוגיה מולקולרית עם חלב מרוכז ממותק על ידי ערבוב איטי של 5 מ"ל מים בכל פעם עם החלב.
    הערה: שלב זה מתבצע בתנאים סטריליים באמצעות ארון בטיחות ביולוגית.
  3. הכינו aliquots של תמיסת חלב (מאוחסן כמו 500 μL aliquots) ולאחסן את aliquots ב 4 °C עד בשילוב עם הטיפול של עניין.
  4. יש להשהות את הטיפולים בכלי הרכב שלהם בריכוז הנכון בהתבסס על משקל הגוף של בעל החיים לפני שילובם עם תמיסת החלב/מים המרוכזים הממותקים.

2. מפגש הדרכה של מד"א

הערה: סעיף זה מתאר מודלים של עכברים; עם זאת, ניתן להרחיב את טכניקת מד"א לפי הצורך עם נפחים גדולים יותר / קצוות פיפטה עבור דגמי מכרסמים גדולים יותר.

  1. אופציונלי: יש לרסן בעדינות את חיית המחקר על ידי החזקת קשקוש הצוואר ביד אחת.
  2. הציעו לחיית המחקר 100 מיקרוליטר של תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים בלבד (ללא תוספת הטיפול הניסיוני) באמצעות פיפטה חד-ערוצית וקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר המודרך לפה.
  3. יש לפזר את תמיסת החלב/מים באיטיות כדי למנוע החמצת הפה של החיה. ודא שהחיה צורכת בקלות את תמיסת החלב בין 5-15 שניות.
    הערה: אימון זה מתרחש במשך יומיים רצופים לפחות (אימון אחד ביום), ללא שינויים בנפח המנוהל. ריסון עדין על ידי קשקוש נדרש לאימוני מד"א. סקרבורו ועמיתיו ממליצים על ריסון מלא של בעל החיים ביום הראשון לאימון מד"א ולאחר מכן ריסון על ידי הזנב ביום השני. שיטת הריסון עשויה להיות שונה עבור דגמי מכרסמים גדולים יותר. לעומת זאת, Vanhecke et al.17 החזיקו את העכברים רק מעט בזנב במהלך האימונים.

3. טיפולים בעכברים בשיטת מד"א

  1. שלבו את הטיפול במחקר עם תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים (ראו דוגמאות עם ניסויי תיקוף [סעיף 4 וסעיף 5] להלן).
  2. אופציונלי: יש לרסן בעדינות את חיית המחקר על ידי החזקת קשקוש הצוואר ביד אחת.
    הערה: Scarborough et al.7 מדווחים כי עכברים כבר לא דורשים ריסון מעבר לתקופת האימון והם ישתו בקלות מקצה פיפטה. לעומת זאת, Vanhecke et al.17 מדווחים כי עבור טיפולים מסוימים (למשל, טמוקסיפן) שעשויים להיות בעלי סלידה קלה מטעם, MDA מבוצע בצורה הטובה ביותר על ידי ריסון עדין של העכברים באמצעות קשקוש במהלך כל הטיפולים. מחקר זה גם קבע כי מיקום בעל החיים על גבו עם קשקוש עדין משפר את הזמן והיעילות של צריכת הטיפול.
  3. יש לבצע טיפול של 100 מיקרוליטר באמצעות פיפטה חד-ערוצית וקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר המודרך לפיו של בעל החיים, כפי שמבוצע במהלך האימון.
  4. טפלו בבעל חיים אחד בכל פעם.
  5. החזירו כל בעל חיים לכלוב המתאים לו לאחר הטיפול.
    הערה: טיפולים בשיטת מד"א ניתנים למסירה מדי יום או באופן חוזר 7,17.

4. ניסוי תיקוף #1 - העברה פומית של חיידקי מעיים לעכברים באמצעות מד"א

הערה: חלק זה מתאר את השימוש בשיטת מד"א להעברת חיידקים חיים דרך הפה למחקרי נשאות מעיים בעכברים. בניסוי פיילוט מייצג זה, החיידק הגראם חיובי Clostridium scindens מועבר לעכברי C57BL/6J. העכברים טופלו באנטיביוטיקה (צפוקסיטין) במשך יומיים רצופים במי השתייה לפני חיסון חיידקי במד"א.

  1. תרבית חיידקים
    1. תרבית C. scindens זן ATCC 35704 במרק קלוסטרידיאלי מחוזק (RCB) באמצעות מלאי גליצרול קפוא כדי לחסן 500 μL של חיידקים לתוך צינור RCB 7 מ"ל. לגדול אנאירובית בן לילה ב 37 °C (77 °F).
    2. השתמש 500 μL של תרבית חיידקים לילה כדי לחסן צינור RCB חדש לדגור אנאירובית במשך 24 שעות. הוציאו את הצינורית מהחדר האנאירובי והשתמשו בה להכנת הטיפול החיידקי למד"א. השתמש באותו צינור כדי לחשב את היחידות יוצרות המושבה למיליליטר (CFU/mL).
  2. חישוב C. scindens CFU/מ"ל
    1. צור דילול 1:3 של תרבית C. scindens באמצעות 3.5 מ"ל של התרבית המחוסנת ל -7 מ"ל של מדיה RCB. השתמש במדגם של דילול זה כדי ליצור מלאי גליצרול של 20% 1 מ"ל (1:1) המאוחסן ב -80 ° C.
    2. צלחת 100 μL של דילול 1:3 על לוחות אגר קלוסטרידיאלי מחוזק (RCA). השתמש בדילול הראשון כדי לבצע דילולים סדרתיים וצלחת בסך הכל שלוש פעמים נוספות.
    3. לאחר הדגירה של לוחות RCA, לספור את המושבות ולחשב את CFU. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את ריכוז תאי החיידקים בדגימות המדוללות והמקוריות:
      CFU במדגם מדולל (תאים/מ"ל) = (מספר המושבות שנספרו על צלחת RCA)/(כמות הדגימה המדוללת שנוספה ללוחית RCA במ"ל)
      CFU במדגם המקורי (תאים/מ"ל) = (CFU במדגם מדולל)/(דילול צלחת RCA)
  3. הכנת טיפול C. scindens עבור מד"א
    1. שלב תמיסה של 50 μL (1.265 x 10,6 CFU/mL בדוגמה זו) של C. scindens + 50 μL של תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים.
      הערה: אם יש צורך ב-CFU ספציפי, ניתן להשתמש בשיטה חלופית לכימות תאי חיידקים, כגון יצירת עקומה סטנדרטית עם מדידות צפיפות אופטית (OD) ב-600 ננומטר.
  4. טיפול אוראלי בעכברים עם C. scindens באמצעות מד"א
    1. בימים 1-3 יש להכיר לעכברים את תמיסת החלב כמתואר בסעיף 2 (הדרכת מד"א).
    2. ביום הרביעי, יש לתת 100 מיקרוליטר של C. scindens + תמיסת חלב או PBS (בקרה) + תמיסת חלב באמצעות MDA לעכברי C57BL/6J. טפלו בעכברים פעם אחת למשך המחקר.
  5. אוסף דגימות צואה
    1. החזיקו את העכבר על ידי קשקוש עדין וחכו שהם ישחררו כדור צואה. לאסוף כדורי צואה ישירות מן פי הטבעת לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל microcentrifuge. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
  6. C. scindens PCR כמותי (qPCR)
    1. בצע מיצוי DNA צואתי באמצעות פרוטוקולשפורסם בעבר 19,20.
    2. קבע את ריכוז ה- DNA באמצעות פלואורומטר DNA לזיהוי רגישות גבוהה. נרמלו דגימות DNA ל-10 ננוגרם/מיקרוליטר ואחסנו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
    3. השתמש ב- qPCR כדי לחקור את השפע של: (i) C. scindens חיידקים המשתמשים בפריימרים משומרים כנגד הגן desA של זן C. scindens ATCC 35704, (ii) סך החיידקים המשתמשים בפריימרים שתוכננו כנגד האזור ההיפר-משתנה V6 של הגן rRNA 16S החיידקי כפי שתואר קודם לכן20,21.
      הערה: תנאי qPCR והפריימרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 1. עקומה סטנדרטית באמצעות DNA מסוג C. scindens זן ATCC 35704 שימשה להערכת עותקים של חיידקי desA+.

5. ניסוי וולידציה #2 - העברת תרופות ניסיונית לעכברים באמצעות מד"א

הערה: סעיף זה מתאר את השימוש בשיטת מד"א להעברת תרכובת ניסוי לעכברים. בניסוי פיילוט מייצג זה, אקוול מטבוליט סויה (S-equol) מועבר לעכברי NSG ו- FVB/NJ.

  1. הכנת טיפול S-equol
    הערה: הן S-equol והן dimethyl sulfoxide (DMSO) הם aliquoted ומאוחסנים ב -20 °C עד לשימוש.
    1. הרכיבו מחדש את S-equol ב-DMSO בשילוב עם שמן תירס (90%). יש לערבב S-אקוול בשמן תירס (220 μL) עם 480 μL של תמיסת חלב/מים מרוכזת ממותקת. ערבבו וערבבו תמיסה זו בחדר החי כדי למנוע את הפרדת השמן מהחלב.
      הערה: אם נצפתה הפרדה של התמיסה, ערבבו את התמיסה לפני הטיפול. המינון של S-equol מנוהל הוא 25 מ"ג / ק"ג / יום. העכברים ששימשו במחקר זה היו דומים במשקלם, ולכן הם קיבלו את אותו המינון. ייתכן שיהיה צורך להתאים את מינון הטיפול ולהפוך אותו לתכשירים מרובים בהתבסס על משקלי חיות המחקר.
    2. שלבו רכב DMSO עם שמן תירס (90%). מערבבים DMSO עם שמן תירס (220 μL) עם 480 μL של תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים. ערבבו וערבבו תמיסה זו בחדר החי כדי למנוע את הפרדת השמן מהחלב.
      הערה: אם נצפתה הפרדה של התמיסה, ערבבו את התמיסה לפני הטיפול.
  2. טיפול פומי בעכברים עם S-equol באמצעות מד"א
    1. בימים 1 ו-2 יש להכיר לעכברים את תמיסת החלב כמתואר בסעיף 2 (הדרכת מד"א).
      הערה: עבור ניסוי אימות #1, זמן האימון המתואר בסקארבורו ואחרים היה אחריו, אשר הציע זמן התאקלמות של 3 ימים. בניסוי זה נבדק זמן אימון קצר יותר (יומיים) ונמצא כי הוא אינו משנה את מתן הטיפולים המעניינים.
    2. בימים 3-43, טפלו בעכברים עם (i) בקרת PBS, (ii) רכב DMSO, או (iii) S-equol, כולם בשילוב עם תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים. צור תמהיל אב של הפתרון כדי לספק פתרון הומוגני של הטיפולים לכל חיות המחקר. לתת נפח כולל של 100 μL לכל עכבר פעם ביום, 5 ימים בשבוע, במשך סך של 43 ימים.
  3. איסוף דם
    1. לאסוף דם לאחר המתת חסד (מנת יתר של פחמן דו חמצני) באמצעות ניקוב לב. מעבירים דם לצינור מפריד סרום מיקרוטיינר, מערבבים ומאחסנים בטמפרטורת החדר (RT) עד לעיבוד נוסף.
    2. דגימת דם צנטריפוגה כדי להשלים את ההפרדה ב 254 x גרם במשך 5 דקות. יש לאסוף את הסרום (שכבת ההפרדה העליונה) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  4. בדיקת כרומטוגרפיה נוזלית S-equol עם בדיקת ספקטרומטריית מסות טנדם (LC/MS/MS)
    1. עיין בקובץ טבלת החומרים עבור הכימיקלים והריאגנטים ששימשו לניסוי זה.
    2. תקני כיול ובקרת איכות: הכינו תמיסות מלאי של S-equol ותקן פנימי (racemic equol-d4) ב-DMSO בריכוזים של 1 מ"ג/מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
    3. יש לדלל את התמיסות הסטנדרטיות עם אצטוניטריל:מים (50:50) להכנת תמיסת עבודה מעורבת בריכוזים שונים. הכינו תקן פנימי באתיל אצטט כתמיסת מיצוי בריכוז של 100 ננוגרם/מ"ל. יש לאחסן מלאי ופתרונות עבודה בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש מדי יום, בדילול או ישירות.
    4. חילוץ דגימה
      1. הכינו את הדגימה באמצעות משקעים חלבוניים על ידי תמיסת מיצוי (אתיל אצטט בתוספת תקן פנימי, ראה סעיף 5.4.3), ולאחר מכן צנטריפוגה ואידוי של supernatant תחת חנקן יבש (50 ° C).
      2. הרכיבו מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל והעבירו לבקבוקוני דוגמה אוטומטית לצורך ניתוח LC/MS/MS.
    5. הפרדת דגימה
      1. השג הפרדה עם עמוד C18, 2.1x50 מ"מ, 1.7 מיקרומטר. יש להשתמש ב-0.1% חומצה פורמית כשלב A נייד ו-0.1% חומצה פורמית בשלב B הנייד אצטוניטריל.
      2. השתמש בשיפוע והחזק את שלב B הנייד ב- 40% עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה למשך 0.5 דקות. לאחר מכן, הגדל את קצב הזרימה ל -100% במשך דקה אחת, החזק שם במשך 2 דקות, ולאחר מכן חזור ל 40% B למשך דקה אחת.
      3. נטר את שפכי העמוד באמצעות גלאי ספקטרומטרי מסה באמצעות יינון אלקטרוספריי, הפועל במצב שלילי. תכנת את הספקטרומטר לניטור המעברים הבאים לניטור תגובות מרובות (MRM): 241 → 119.1 עבור S-equol ו- 245 → 123 עבור התקן הפנימי, equol-d4.
      4. חשב את עקומת הכיול עבור S-equol באמצעות שיא יחס השטח של הניתוח לתקן הפנימי באמצעות משוואה ריבועית עם פונקציית שקלול 1/x 2 באמצעות טווחי כיול של 5-500 ננוגרם/מ"ל.

6. מדידת השפעת הטיפול במד"א על ליבת המיקרוביוטה של המעי

הערה: סעיף זה מתאר שימוש ב-qPCR למדידת רמות הליבה של מיקרוביוטת המעיים לאחר טיפול ב-MDA.

  1. בצע איסוף דגימות צואה ומיצוי DNA כמתואר בשלבים 4.5.1 ו- 4.6.1.
  2. קבע את ריכוז ה- DNA באמצעות פלואורומטר DNA לזיהוי רגישות גבוהה. נרמלו דגימות DNA ל-10 ננוגרם/מיקרוליטר ואחסנו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  3. השתמשו ב-qPCR כדי לחקור את השפע של חברי המיקרוביוטה של המעי: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp., ו-(v) סך כל החיידקים המשתמשים בפריימרים שתוכננו כנגד האזור ההיפר-משתנה V6 של הגן rRNA 16S של החיידק כפי שתואר קודם לכן 20,21,22.
    הערה: תנאי qPCR והפריימרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 2.

תוצאות

ניתן להשתמש במד"א בהעברה אוראלית של זני חיידקים במודלים של עכברים. עכברי C57BL/6J טופלו באנטיביוטיקה (צפוקסטין במי השתייה) במשך יומיים כדי לפנות קהילות מיקרוביאליות לפני תחילת ההכשרה של מד"א. תמיסת החלב/מים המרוכזים הממותקת ניתנה פעם ביום ברציפות במשך 3 ימים לפני מתן הטיפול. עכברים רוסנו לזמן קצר על ידי קשקוש עדין במהלך מתן הטיפול במד"א. ביום הרביעי, עכברים טופלו פעם אחת ב-PBS (בקרה שלילית, n = 4) או בתרבית אנאירובית של C. scindens (חיידקי desA+, n = 4) שקודם לכן הושעתה מחדש בתמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים. כל העכברים בדרך כלל לקחו את הטיפולים תוך שניות ושתו את כל המינון (100 μL). כדי לאמת את ההעברה והנוכחות של החיידקים האנאירוביים, השווינו דגימות צואה שנאספו לאחר טיפול אנטיביוטי לדגימות צואה שנאספו 24 שעות לאחר טיפול PBS או C. scindens (איור 1). דנ"א צואתי בודד, כומת ונורמל ל-10 ננוגרם/μL כדי לבצע qPCR באמצעות C. scindens ATCC 35704 desA פריימרים ספציפיים לגן (טבלה 1). ראינו שלעכברים שטופלו באנטיביוטיקה היו חיידקי desA+ מינימליים או ללא חיידקים. כצפוי, ראינו כמות גבוהה משמעותית של חיידקי desA+ בעכברים שטופלו ב-C. scindens, שהייתה שונה באופן משמעותי מאלה שבקבוצת הביקורת של PBS (p = 0.0286, איור 1).

העברת תרכובת ניסויית (S-equol) בשיטת מד"א. עכברי NSG (n = 15) ו- FVB/NJ (n = 18) עברו הכשרה עם תמיסת חלב/מים מרוכזת ממותקת יומיים לפני מתן הטיפול. עכברי NSG עברו טיפול אנטיביוטי (צפוקסטין במי השתייה) כדי לחסל חיידקי מעיים מייצרי אקוול, ומכאן ייצור אקוול אנדוגני. עכברי FVB/NJ קיבלו תזונה נטולת סויה כדי לחסל את ייצור האקוול האנדוגני. כל העכברים רוסנו לזמן קצר על ידי קשקוש עדין על מנת לתת את הטיפולים. קבוצת הביקורת קיבלה את תמיסת החלב/מים המרוכזים הממותקים בשילוב עם שמן תירס, קבוצת DMSO (בקרת רכב עבור S-equol) קיבלה את תמיסת החלב/מים המרוכזים הממותקים ואת DMSO בשמן תירס, וקבוצת האקוול קיבלה תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים ואקוול בשמן תירס. עכברים טופלו חמישה ימים בשבוע בטכניקת מד"א במשך 43 ימים בסך הכל. עכברים בדרך כלל לקחו את הטיפולים תוך שניות ושתו את כל המינון (100 μL). בסך הכל, כל העכברים צרכו לפחות מחצית מהמינון ביום מסוים (מנה חלקית ביום מסוים, אך מנה מלאה יום קודם או למחרת). אף אחד מהעכברים לא דחה את הטיפול לחלוטין במהלך המחקר. ראינו כי לאחר קשקוש, מיקום העכברים על גבם שיפר את זמן צריכת הטיפול והבטיח כי החיה לקחה את כל המינון.

רמות אקוול במחזור מדגימות אספקת תרופות יעילה של מד"א. דגימות דם נלקחו מעכברי NSG לאחר המתת חסד בסוף המחקר כדי לאמת כי העברת השוויון במד"א הובילה לרמות שוויון במחזור בחיות המחקר. לא החזרנו מספיק דם מאחד העכברים שטופלו בקו שוויון כדי לבצע את בדיקת LC/MS/MS. רמות השוויון בסרום נמדדו על ידי LC/MS/MS במשאב המשותף לפרמקולוגיה אנליטית בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. לא ראינו אקוול במחזור בקבוצות הבקרה וה-DMSO (רכב משווה), בעוד שלעכברים שטופלו בקו המשווה היה משוואה מחזורית ניתנת לזיהוי (איור 2). חשוב לציין, אנו מצפים לשונות מסוימת ברמות השוויון במחזור בעכברים שטופלו בקו השוויון עקב תאריכים וזמנים שונים של הקרבת בעלי חיים בניסוי זה.

אוכלוסיית חיידקי המעי נותרת ללא שינוי לאחר הטיפול במד"א. ההשפעה של תמיסת חלב MDA (עם ובלי אקוול) על מיקרוביוטת המעיים הוערכה באמצעות עכברי FVB/NJ. כימתנו את ההרכב המיקרוביאלי של דגימות שנלקחו בתחילת הטיפול (ללא טיפולים/ללא מד"א) ודגימות שנלקחו 7 ימים לאחר תחילת הטיפול (9 ימים לאחר התחלת מד"א, כולל ימי הדרכה). לא ראינו שינויים משמעותיים בעומס החיידקים הכולל או בהרכב המיקרוביאלי הכולל של מיקרוביוטת הליבה של המעי (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) כפי שהוערך על-ידי ניתוח qPCR ספציפי למין (איור 3) כפי שתואר קודם לכן21,22. כלוב אחד הראה הבדל משמעותי בלקטובצילוס בין נקודת ההתחלה לאחרי טיפול במד"א; עם זאת, ממצא זה נצפה בבקרת הרכב של DMSO ולא היה עקבי בכל הכלובים.

figure-results-1
איור 1: מד"א מעביר חיידקים אנאירוביים למעי העכבר שניתן לכמת באמצעות qPCR צואתי. עכברי C57BL/6J טופלו באנטיביוטיקה במשך יומיים רצופים במי השתייה. לאחר מכן טופלו עכברים בחיידק האנאירובי C. scindens בשיטת מד"א. עומס חיידקי צואה C. scindens (desA+) נמדד על ידי qPCR עבור הגן desA הן לאחר טיפול אנטיביוטי והן 24 שעות לאחר טיפול MDA (PBS או C. scindens). (A) C . scindens-specific desA כימות גנים מוצג בין עכברים שטופלו ב-PBS ו-C. scindens לאחר טיפול אנטיביוטי ו-24 שעות לאחר טיפול ב-MDA. (B) אותם נתונים המוצגים במשך 24 שעות לאחר מד"א ב-(A) מוצגים כגרף עמודה. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן מאן-ויטני לא פרמטרי. (*) p = 0.0286, קווי שגיאה = SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח רמות המשוואה במחזור הדם בעכברי NSG שטופלו באקוול באמצעות טכניקת מד "א. רמות אקוול בסרום כומתו באמצעות LC/MS/MS בקבוצת ביקורת (n = 5), DMSO (רכב, n = 5) ו- equol (n = 4) עכברים שטופלו. לא נמצא מספיק דם מאחד העכברים שטופלו באקוול כדי לבצע LC/MS/MS. טיפולים אלה ניתנו בשיטת מד"א. ניתן היה לזהות אקוול בסרום רק בקבוצה שטופלה במשווה. מגבלת הכימות < 5 ננוגרם/מ"ל. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני לא פרמטרי עם השוואות מרובות (תיקון דאן). (**) p = 0.0053, קווי שגיאה = SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: חיידקי הליבה במעיים ורמות עומס החיידקים הכולל נותרו ללא שינוי בעכברי FVB/NJ לאחר טיפול במד"א. לא נצפו שינויים משמעותיים בערכי qPCR Cq עבור קהילות החיידקים הממוקדות לפני ואחרי מתן הטיפול בשיטת מד"א. לקטובצילוס הראה הבדל משמעותי (*, p = 0.0321) רק בכלוב 3 בין נקודת ההתחלה לטיפול במד"א. ממצא זה לא היה עקבי בין הכלובים. מספרי הכלוב מסומנים כ-C1-C4. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות (תיקון Tukey). קווי שגיאה = SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם פריימררצפי פריימרתנאי PCR
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93°C 3 דקות, 34 מחזורים (95°C 30 שניות, 54°C 30 שניות)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

טבלה 1: פריימרים ותנאי qPCR עבור חיידקי desA+ (C. scindens).

שם פריימררצפי פריימרתנאי PCR
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95°C, 3 דקות
36 מחזורים
95 °C, 30 שניות
53°C, 30 שניות
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50°C, 5 דקות
95°C, 10 דקות
40 מחזורים
95°C, 15 שניות
60 °C, 1 דקות
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95°C, 3 דקות
36 מחזורים
95 °C, 30 שניות
53°C, 30 שניות
ס. salivarius_F
ס. salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95°C, 10 דקות
44 מחזורים
95°C, 15 שניות
60 °C, 1 דקות
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 דקות
95°C, 10 דקות
40 מחזורים
95°C, 15 שניות
62°C, 1 דקות

טבלה 2: פריימרים ותנאי qPCR המשמשים למדידת ההשפעה של MDA על מיקרוביוטת הליבה של המעי.

דיון

OG יכול להיות מקור משמעותי של מתח בחיות מחקר שעלול ליצור משתנה מבלבל כפי שהוערך בעבר במחקרים מרובים 7,9,11,12,13,14,15,23. בשל הפולשנות של OG, טכניקות חלופיות שימשו כדי למזער את האתגרים הקשורים OG 9,10,12,13,14,15. ניהול תרופות מונחה מיקרופיפטה (MDA) היא טכניקה חדשנית המאפשרת העברת תרופות באופן פחות פולשני באמצעות פיפטה חד-ערוצית ושילוב של התרופה המעניינת עם תמיסת חלב מרוכז ממותק7. שלב קריטי בטכניקה זו הוא אימון (מינימום יומיים) המאפשר לבעל החיים להכיר טוב יותר את קצה הפיפטה ואת טעם החלב המרוכז הממותק, ובאופן כללי מקצר את זמני הטיפול ואת המצוקה. אימון זה גם מאפשר לעכברים לצרוך בקלות את התרופות המשולבות בתמיסת חלב מרוכז ממותק הרבה יותר מהר מאשר טכניקות אחרות ובמינון מדויק.

המחקרים שלנו עקבו מקרוב אחר ההכנות והאספקה של תמיסת חלב/מים מרוכזים ממותקים שהוצגה ב-Scarborough et al.7. במהלך המחקר לא נמנעו מהעכברים מים או מזון לפני מתן המינון. הם הוחזקו בכלוב הדיור שלהם, ועיתוי הטיפולים היה פחות מדקה. הבדל מרכזי אחד במחקרים שלנו היה שאולי בגלל הפוטנציאל לליקוי ראייה בזני עכברים לבקנים שבהם השתמשנו והפוטנציאל לסלידה קלה מטעם עם טיפול תרופתי, כל העכברים נזקקו לריסון קצר על ידי קשקוש עדין כחלק מפרוטוקול האימון והטיפול. שינוי זה לטיפולי מד"א מומלץ על ידי Vanhecke et al.16. הקשקוש העדין, יחד עם מיקום העכברים על גבם, עודדו את העכברים לצרוך בשקיקה את תמיסת החלב. אנו מסיקים כי הצורך בקרשוף עדין כחלק משלבי האימון והטיפול הוא אופציונלי ויהיה תלוי מחקר. מתן הטיפולים (שתוקנו למשקל הגוף של החיה, לפי העניין) ניתן בנפח סטנדרטי, והעכברים לא הראו שינויים בהתנהגות. שינויים קלים נוספים במחקר הראשוני7 כללו ירידה במספר האימונים ובנפחים שניתנו בכל מפגש. חלק מהמגבלות שנתקלנו בהן במחקר זה כוללות את ההתנגדות של חלק מהעכברים לשתות את כל המינון (100 מיקרוליטר) של תמיסת החלב ביום הראשון לאימון ובנקודות זמן במהלך המחקר. התגברו על כך על ידי הצבת העכברים על גבם בזמן שהיו מרוסנים. מחקר זה לא העריך את האינטראקציה של התרופה עם תמיסת חלב מרוכז ממותק, הבדלים בצריכה בין מיני עכברים (אם כי MDA הוכח בעבר כיעיל גם בעכברות נקבות 7,17), או עלייה של סמני לחץ, כגון רמות קורטיקוסטרון 7,11,14, הקשורים ל- OG.

במחקר זה התמקדנו ביכולתה של טכניקת מד"א לספק מינון מדויק של טיפול ניסיוני ולאחר מכן הערכנו את רמות הצואה ו/או המחזור של הטיפולים המעניינים את חיות המחקר. כמו כן, הערכנו אם הטיפול במד"א משנה את המיקרוביוטה של המעי, וראינו שינויים מזעריים עד אפסיים במיקרוביוטה של ליבת הצואה או בעומס החיידקי הצואתי הכולל של חיות המחקר. כמו כן, לא ראינו נפגעים בבעלי החיים כתוצאה מטיפול מד"א. לסיכום, מד"א יכול לשמש כשיטה אלטרנטיבית למתן טיפול קצר מועד וארוך במודלים של מכרסמים. בסך הכל, למד"א יש השפעה חיובית על רווחת בעלי החיים על ידי הפחתת הסיכון לפציעות הקשורות ל- OG. מד"א מתגבר על חלק מהמגבלות של טכניקות אחרות ואנו מציעים שניתן יהיה להשתמש בו באופן נרחב במחקר תרגומי במודלים רבים ושונים של מכרסמים24.

תודות

ברצוננו להודות על תמיכת המחקר של משרד ההגנה האמריקאי פרס התוכנית לחקר סרטן הערמונית W81XWH-20-1-0274 ופרס אתגר הקרן לסרטן הערמונית 16CHAL13. ברצוננו להודות ולהכיר לד"ר מישל רודק, ד"ר נושין רסטקרי, ד"ר ניקול אנדרס ולינפינג שו מהמשאב המשותף לפרמקולוגיה אנליטית בג'ונס הופקינס על הסיוע ב- equol LC/MS/MS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
200 ומיקרו; קצות פיפטה Lמטלר טולדו17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 גלאי ספקטרומטרימסה SciexN/A
Akkermansia muciniphila זן muc גנומי DNAאמריקאי אוסף תרביותמסוג BAA-835D-5
אמוניום אצטטסיגמא– אולדריץ'5.43834
C57BL/6J עכברימעבדות ג'קסוןזן # 000664
C. scindens זן 35704אוסף תרבות הסוג האמריקאי35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
שמן תירסMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
אתנולפישר סיינטיפיקAC611050040
חומצה פורמיתסיגמא– אולדריץ'5.33002
עכברי FVB/NJג'קסוןזן # 001800
גליצרולסיגמא– אולדריץ'G5516
הקסאןפישר סיינטיפיק02-002-996
מים בדרגת LC-MSפישר סיינטיפיק14-650-357
מתנולפישר סיינטיפיק02-003-340
צינור מפריד סרום מיקרוטיינרבקטון דיקינסון02-675-185
ביולוגיה מולקולרית כיתהמים קורנינג46-000-CI
עכברי NSGJackson LaboratoriesStrain# 005557
PBSCorning21-031-CV
ערכת Qubit DNA HSInvitrogenQ32851
Racemic  equol-d4סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-219827
אגר קלוסטרידיאלי מחוזקAnaerobe SystemsAS-6061
מרק קלוסטרידיאלי מחוזקAnaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
תקן ייחוס S-equol עבור LC-MSCayman Chemical10010173
יחיד פיפטת ערוץRainin17008652
Streptococcus salivarius DNA גנומיאוסף תרבות מסוג אמריקאיBAA-1024D-5
חלב מרוכז ממותקקליפורניהB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3 VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatiaSigma– אולדריץ'G7017
מעבדות חוות

מקורות

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים