Method Article

שיטות להפעלת תעתיק מרחבי של רקמות עצם

DOI:

10.3791/66850

⸱

May 3rd, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Periodontics and Preventive Dentistry, University of Pittsburgh School of Dental Medicine, 2Center for Craniofacial Regeneration, University of Pittsburgh School of Dental Medicine, 3UPMC Presbyterian, 4UPMC Shadyside, 5Musculoskeletal Oncology Laboratory, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6UPMC Hillman Cancer Center, 7Departments of Anatomic Pathology and General Surgical Oncology, University of Pittsburgh, 8Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 9University of Pittsburgh UPMC Hillman Cancer Center, 10McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת decalcification של רקמות עצם שהושגו טרי ושימור של RNA באיכות גבוהה. שיטה מודגמת גם לחיתוך דגימות פורמלין קבוע פרפין משובץ (FFPE) של עצמות לא demineralized כדי להשיג תוצאות באיכות טובה אם רקמות טריות אינן זמינות או לא ניתן לאסוף.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת הקשר בין התאים ומיקומם בתוך כל רקמה היא קריטית כדי לחשוף את התהליכים הביולוגיים הקשורים להתפתחות תקינה ולפתולוגיה של מחלות. שעתוק מרחבי היא שיטה רבת עוצמה המאפשרת ניתוח של כל התעתיק בתוך דגימות רקמה, ובכך מספקת מידע על ביטוי הגן התאי ועל ההקשר ההיסטולוגי שבו שוכנים התאים. בעוד שיטה זו כבר בשימוש נרחב עבור רקמות רכות רבות, היישום שלה עבור ניתוח של רקמות קשות כגון עצם היה מאתגר. האתגר העיקרי טמון בחוסר היכולת לשמר RNA ומורפולוגיה של רקמות באיכות טובה בעת עיבוד דגימות הרקמה הקשה לחיתוך. לכן, מתוארת כאן שיטה לעיבוד דגימות רקמת עצם טריות שהושגו כדי ליצור ביעילות נתוני שעתוק מרחבי. השיטה מאפשרת דה-הסתיידות של הדגימות, תוך הענקת קטעי רקמה מוצלחים עם פרטים מורפולוגיים שהשתמרו תוך הימנעות מפירוק RNA. בנוסף, ניתנות הנחיות מפורטות לדגימות שהיו בעבר מוטמעות פרפין, ללא דה-מינרליזציה, כגון דגימות שנאספו מבנקי רקמות. באמצעות הנחיות אלה, מוצגים נתוני שעתוק מרחבי באיכות גבוהה המופקים מדגימות בנק רקמות של גידול ראשוני וגרורות ריאה של אוסטאוסרקומה בעצם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצם היא רקמת חיבור מיוחדת המורכבת בעיקר מסיבים של קולגן מסוג 1 ומלחים אנאורגניים1. כתוצאה מכך, העצם חזקה ונוקשה להפליא ובו בזמן קלה ועמידה בפני טראומה. כוחה הגדול של העצם נובע מתכולת המינרלים שלה. למעשה, עבור כל עלייה נתונה באחוז תכולת המינרלים, הנוקשות עולה פי חמישה2. כתוצאה מכך, חוקרים נתקלים בבעיות משמעותיות כאשר הם מנתחים, באמצעות חתך היסטולוגי, את הביולוגיה של דגימת עצם.

היסטולוגיה של עצם לא מסוידת היא אפשרית ולפעמים נדרשת, בהתאם לסוג החקירה (למשל, כדי לחקור את המיקרו-ארכיטקטורה של העצם); עם זאת, זה מאתגר מאוד, במיוחד אם הדגימות גדולות. במקרים אלה, עיבוד רקמות למטרות היסטולוגיות דורש מספר שינויים של פרוטוקולים סטנדרטיים וטכניקות3. באופן כללי, כדי לבצע הערכות היסטולוגיות נפוצות, רקמות העצם מסוידות מיד לאחר הקיבוע, תהליך שעשוי להימשך מספר ימים עד מספר שבועות, תלוי בגודל הרקמה ובחומר ההסתיידות המשמש4. חלקים מסוידים משמשים לעתים קרובות לבדיקת מח עצם, אבחון גידולים וכו '. ישנם שלושה סוגים עיקריים של חומרי הסתיידות: חומצות חזקות (למשל, חומצה חנקתית, חומצה הידרוכלורית), חומצות חלשות (למשל, חומצה פורמית), וחומרים כלאטיים (למשל, חומצה אתילאנדיאמיןטטרצטית או EDTA)5. חומצות חזקות יכולות לפרק את העצם במהירות רבה, אך הן עלולות לפגוע ברקמות; חומצות חלשות נפוצות מאוד ומתאימות להליכי אבחון; סוכני כלציה הם ללא ספק הנפוצים ביותר והמתאימים ביותר ליישום מחקרי, שכן במקרה זה, תהליך הדה-מינרליזציה הוא איטי ועדין, ומאפשר שמירה על מורפולוגיה באיכות גבוהה ושימור מידע על גנים וחלבונים, כפי שנדרש על ידי הליכים רבים (למשל, הכלאה באתר , immunostaining). עם זאת, כאשר כל התעתיק צריך להישמר, כגון עבור ניתוח ביטוי גנים, אפילו דה-מינרליזציה איטית ועדינה עלולה להזיק. לכן, יש צורך בגישות ושיטות טובות יותר כאשר הניתוח המורפולוגי של הרקמות צריך להיות משולב עם ניתוחי ביטוי גנים של התאים.

הודות לשיפורים האחרונים בריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) ובשעתוק מרחבי, ניתן כעת לחקור את ביטוי הגנים של דגימת רקמה גם כאשר נעשה שימוש בהטבעה של פרפין קיבוע פורמלין (FFPE) לאחסון דגימות הרקמה 6,7,8. הזדמנות זו פתחה גישה למספר גדול יותר של דגימות, כגון אלה המאוחסנות בבנקי רקמות ברחבי העולם. אם רוצים להשתמש ב-scRNA-seq, שלמות ה-RNA היא הדרישה החשובה ביותר; עם זאת, במקרה של תעתיק מרחבי של דגימות FFPE, הן קטעי רקמה באיכות גבוהה והן RNA באיכות גבוהה נחוצים כדי לדמיין את ביטוי הגן בהקשר ההיסטולוגי של כל קטע רקמה. אמנם זה הושג בקלות עם רקמות רכות, אותו הדבר לא ניתן לומר עבור רקמות קשות כמו עצם. למעשה, למיטב ידיעתנו, מעולם לא בוצע מחקר באמצעות תעתיק מרחבי על דגימות עצם מסוג FFPE. הסיבה לכך היא היעדר פרוטוקולים שיכולים לעבד ביעילות רקמות עצם FFPE תוך שמירה על תכולת ה- RNA שלהם. כאן, שיטה לעבד ו decalcize דגימות רקמת עצם שהושגו טרי תוך הימנעות השפלה RNA מסופק הראשון. לאחר מכן, מתוך הכרה בצורך בניתוח תמלול של דגימות FFPE שנאספו בבנקי רקמות ברחבי העולם, מוצגות גם הנחיות שפותחו לטיפול נכון בדגימות FFPE של עצמות לא דה-מינרליות.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המתוארים להלן בבעלי חיים אושרו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה בבית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת פיטסבורג.

1. שיטה להכנת בלוקים FFPE של דגימות רקמת עצם הדורשים דה-מינרליזציה

  1. הכנת ריאגנטים וחומרים
    1. הכינו EDTA 20% pH 8.0. עבור 1 L, להמיס 200 גרם של EDTA ב 800 מ"ל של מים טהורים במיוחד, להתאים pH ל 8.0 עם hydroxide נתרן 10 N ולבסוף להביא את נפח 1L עם מים טהורים במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להשתמש תמיד ב-EDTA טרי 20% pH 8.0. נתרן הידרוקסידי (NaOH) 10 N מוכן על ידי המסת 400 גרם של NaOH ב 1 L של מים טהורים במיוחד.
    2. הכינו פרפורמלדהיד (PFA) 4% במכסה אדים תוך שימוש ב-PBS אחד ללא סידן ומגנזיום.
      הערה: הקצו אזור במכסה אדים לעבודה עם תמיסות פרפורמלדהיד מרוכזות, או מוצקי פרפורמלדהיד, ותייגו אותו ככזה. כדי למנוע חשיפה, יש לשמור על המכולות סגורות ככל האפשר. השתמש בכמויות המעשיות הקטנות ביותר הדרושות לניסוי המבוצע. אם לא ניתן להשתמש באבקת פרפורמלדהיד ובסולם השקילה במכסה אדים, יש ליטול תחילה מיכל, ולאחר מכן להוסיף אבקת PFA למכסה המנוע ולכסות לפני שתחזור למשקל האבקה. יש להשתמש תמיד ב-4% PFA טרי שהוכן.
    3. השתמש במיכל מתאים לכל דגימה.
      הערה: לדוגמה, עבור 1 מ"ג של רקמת עצם, השתמש במיכל המאפשר לפחות 1 מ"ל של כל תמיסה להיות במגע עם העצם.
    4. לעקר את כל ציוד הניתוח הדרוש לנתיחה.
    5. נקה את כל האזורים עם פתרון טיהור כדי להסיר RNases.
    6. אספו את שאר חומרי הניסוי, כולל מיכלי קרח, תרסיס אתנול 70%, וקבלו גישה לשייקר מסלולי.
  2. בידוד דגימות רקמת עצם מעכברים
    1. הרדימו את העכבר על ידי חשיפהל-CO2 , ולאחר מכן בצעו נקע צוואר הרחם והשכיבו אותו על גבו. רססו את עור העכבר באתנול 70%.
    2. בעזרת מספריים סטריליים לניתוח, פותחים את העור וחושפים את שריר הרגל. חתכו את השריר לצד הרגל כדי לקבל תמונה ברורה של מיקום העצם, ופרקו בעדינות את העצם כדי להסיר אותה ללא נזק.
      הערה: אין צורך להסיר לחלוטין את כל השריר המחובר לעצם. נסו להיות מהירים ככל האפשר כדי להגביל את פירוק הרנ"א.
    3. הניחו מיד את דגימת העצם בצינור המכיל 4% PFA והניחו את הצינור על קרח.
    4. חזור על ההליך כדי לאסוף דגימות עצם אחרות לפי הצורך.
    5. שים דגימות עם 4% PFA בסערה על שייקר מסלול ב 140 סל"ד ב 4 ° C במשך 24 שעות לפחות כדי לאפשר קיבוע נכון.
  3. הסתיידות של דגימות רקמת עצם
    1. אחזר את רקמת העצם מן המנער האורביטלי לאחר קיבוע.
    2. שטפו את רקמת העצם פעמיים עם 1x PBS במשך 3 דקות על שייקר אורביטלי ב-140 סל"ד כדי להסיר כל PFA שנותר.
    3. בעזרת מספריים סטריליים לניתוח, הסירו את השרירים שנותרו מחוברים לעצם.
    4. שטפו את רקמת העצם פעם נוספת עם 1x PBS למשך 3 דקות.
    5. הניחו את רקמת העצם במיכל חדש עם 20% EDTA pH 8.0. לאחר מכן, הניחו את המיכל על שייקר מסלול במהירות 140 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. השליכו את התמיסה, הוסיפו 20% EDTA pH 8.0 טרי למיכל, והניחו אותו על שייקר מסלולי במהירות 140 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.
    7. חזור על שלב 1.3.6 10 פעמים.
    8. השליכו את התמיסה, הוסיפו 20% EDTA pH 8.0 טרי במיכל, והניחו אותו בטמפרטורה של 4°C בחדר קר על שייקר מסלולי, ב-140 סל"ד למשך הלילה.
  4. התייבשות דגימות רקמת עצם
    1. אחזר את דגימת רקמת העצם מהמיכל.
    2. בדוק את הרקמה ווידא את יעילות ההסתיידות על ידי סיבוב וסיבוב עדין של העצם. לחילופין, בצעו צילום רנטגן של העצם באמצעות מכונת רנטגן.
      הערה: אם הדגימה מתגמשת בקלות, הושגה דרגה טובה של הסתיידות. אם לא, יש להגדיל את פרמטרי ההסתיידות (זמן, מהירות התסיסה, נפח של 20% EDTA pH 8.0. בשימוש וכו ').
    3. שטפו את רקמת העצם פעמיים עם 1x PBS למשך 3 דקות כדי להסיר שאריות של EDTA.
    4. מניחים את רקמת העצם במיכל חדש ומתחילים התייבשות עם 70% אתנול. דוגרים במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
    5. השליכו את תמיסת האתנול 70%, הכניסו את הדגימה לתמיסת אתנול 90% ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
    6. השליכו את תמיסת האתנול 90%, הכניסו את הדגימה ל-100% אתנול ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
    7. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
    8. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
    9. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 30 דקות ב-140 סל"ד.
    10. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 45 דקות ב-140 סל"ד.
      הערה: ניתן לבצע התייבשות גם באמצעות מעבד אוטומטי. במקרה זה, הגדר את התוכנית עם אותם תנאים שדווחו עבור התייבשות ידנית. התנאים המדווחים הם עבור דגימות בעובי שאינו עולה על 4 מ"מ (כלומר, דגימות רקמת עצם שהתקבלו מעכברים). עבור דגימות בעובי של יותר מ-4 מ"מ, יש לקבוע את תזמון ההתייבשות באופן ניסיוני.
  5. ניקוי דגימות רקמת עצם
    1. הניחו את דגימת רקמת העצם במיכל חדש והתחילו את תהליך הניקוי באמצעות קסילן. דגירה במשך 20 דקות ב-140 סל"ד.
    2. השליכו את הקסילן המשומש, הוסיפו קסילן חדש ודגרו במשך 20 דקות נוספות ב-140 סל"ד.
    3. השליכו את הקסילן המשומש, הוסיפו קסילן חדש ודגרו במשך 45 דקות ב-140 סל"ד.
      הערה: ניתן לבצע ניקוי גם באמצעות מעבד אוטומטי. במקרה זה, הגדר את התוכנית עם אותם תנאים שדווחו עבור הניקוי הידני. התנאים המדווחים הם עבור דגימות בעובי שאינו עולה על 4 מ"מ (כלומר, דגימות רקמת עצם שהתקבלו מעכברים). עבור דגימות בעובי של יותר מ-4 מ"מ, יש לקבוע את העיתוי באופן ניסיוני.
  6. חדירה והטבעה של דגימות רקמת עצם
    1. אחזר את דגימת רקמת העצם מהשייקר האורביטלי / מעבד אוטומטי לאחר ניקוי.
    2. מניחים את דגימת רקמת העצם בקלטת הטבעה ומתחילים חדירה עם שעווה (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 60°C.
    3. יש להשליך את השעווה המשומשת, להוסיף שעווה חדשה ולדגור במשך 30 דקות בחום של 60°C.
    4. יש להשליך את השעווה המשומשת, להוסיף שעווה חדשה ולדגור במשך 45 דקות בטמפרטורה של 60°C.
    5. מניחים בזהירות את דגימת רקמת העצם בתבנית עם הכיוון הרצוי.
    6. אפשרו לגוש הדגימה להתמצק על משטח קר.
    7. אחסן את ה- FFPE המתקבל ב- 4 ° C עד מוכן להתחיל בחתך.
      הערה: ניתן לאחסן בלוק FFPE במשך שנים רבות לפני ביצוע החיתוך.

2. הנחיות לחלוקה של דגימות FFPE לא מינרליות

הערה: ההנחיות הבאות מספקות עצות והוראות חשובות שימושיות לשיפור משמעותי של איכות חלקי הרקמה תוך הימנעות מפירוק RNA, במיוחד במקרים של דגימות עצם קטנות ללא הסתיידות. הנחיות אלה עשויות להיות מיושמות גם על דגימות עצם מסוידות כאשר הן זמינות. עבור דגימות רקמת עצם גדולות יותר, demineralization צריך להתבצע כדי להשיג חלקים באיכות טובה יותר; במקרים כאלה, יש לעקוב אחר השיטה שדווחה לעיל, ולהתאים פרמטרים (תזמון, נפחי פתרונות וכו ') בהתאם. ההנחיות הבאות מתאימות כאשר רקמות עצם FFPE כבר עובדו (למשל, בלוק FFPE שנאסף מבנקי רקמות או מעבדות אחרות) או כאשר החלקים שנאספו ישמשו לביצוע כל סוג של ניתוח הדורש RNA באיכות טובה, קטעי רקמות באיכות גבוהה, או שניהם.

  1. הכנת ציוד
    1. רססו את כל משטחי העבודה והמכשירים בתמיסות טיהור כדי להסיר RNases.
    2. הכינו אמבט מים עם מים מזוקקים כפול וקבעו את הטמפרטורה ל 42 מעלות צלזיוס.
    3. קח להב microtome, לרסס אותו עם 70% אתנול כדי להסיר שאריות שמן, ולאחר מכן לרסס אותו עם פתרונות טיהור כדי להסיר RNases.
    4. אבטחו את הלהב על המיקרוטום. ודא שזווית המרווח מוגדרת ל- 10°.
      הערה: השתמש תמיד בלהבים חדשים לחלוקה למקטעים.
    5. הכינו שני דליי קרח.
    6. קחו פינצטה, מברשות ובדיקות, רססו אותן בתמיסות טיהור כדי להסיר RNases, והניחו אותן באחד משני דליי הקרח.
    7. הכינו אמבט קרח על ידי הוספת מים מזוקקים פעמיים לדלי הקרח השני.
      הערה: בלוק FFPE לא צריך לצוף במים הנוספים; לכן, כמות המים המוספים לדלי הקרח חייבת להספיק כדי לאפשר לדגימה להיות רטובה מבלי לצוף.
  2. חלוקה למקטעים
    1. אחזר את בלוק ה- FFPE מהאחסון ב- 4 ° C והנח אותו על המיקרוטום. הגדר את הפקודה לחיתוך או לעובי גלילה של 14 מיקרומטר, והתחל לחתוך את הדגימה עד לחשיפת הרקמה.
      הערה: אם בלוק FFPE כבר נחתך והרקמה כבר חשופה, דלג על שלב 2.2.1. ודא שהבלוק נקי מחורים וסדקים. אם כן, המשך ישירות לשלב 2.2.2. אם לא, לחתוך כמה חלקים כדי לשטח את פני השטח ולמנוע את החורים והסדקים, ולאחר מכן להמשיך לשלב 2.2.2.
    2. הניחו את בלוק ה-FFPE על אמבט הקרח כדי ללחלח את הדגימה. זמן ההידרציה חייב להיקבע באופן ניסיוני.
      1. התחל עם 2 דקות והגדל את הזמן אם הידרציה אינה מספיקה. אין לחרוג מ-10 דקות. ההידרציה תרחיב את הרקמה ותפחית את היווצרותם של "תריסים וקווים" ונציאניים. זמני הידרציה ארוכים יותר עלולים לגרום לסדקים בבלוק הפרפין ואולי גם להיפרדות רקמות.
      2. אם 10 דקות אינן מספיקות כדי לייבש את הדגימה, בצעו מחזורי הידרציה לא יותר מ-10 דקות ונסו שוב לחתוך.
      3. אם פני השטח של הבלוק אינם חלקים ונקיים עקב סדקים או חתכים, שקול להטביע מחדש את הדגימה. איכות ה-RNA לא תושפע מתהליך ההטבעה מחדש.
    3. שים את הדגימה במהדק הדגימה של המיקרוטום, יישר אותו עם הלהב, והתחל לחתך. הגדר את עובי הגלילה ל- 5 מיקרומטר.
    4. אספו את החלק והניחו אותו באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס באמצעות פינצטה קרה ומברשות.
      הערה: לחלופין, אם יבוצע בידוד RNA של חלקי רקמות, יש לאסוף את המקטעים בצינור צנטריפוגה ולעקוב אחר מפרט הייצור להכנת RNA (ראה טבלת חומרים).
    5. לדגור את החלק באמבט המים כדי למתוח את הרקמה ולחסל כל קמטים שיורית וקפלים.
      הערה: זמן הציפה באמבט המים עבור כל קטע חייב להיקבע באופן ניסיוני. שקול להשאיר את חלקי העצם דקה נוספת אם מתרחשות בעיות ניתוק רקמות. אל תשאירו את החלק צף זמן רב מדי מכיוון שזמני ציפה ארוכים עלולים לפגוע ברקמה.
    6. מניחים את החלק על מגלשת זכוכית, ולאחר מכן לדגור אותו במשך 3 שעות ב 42 מעלות צלזיוס.
    7. הניחו את מגלשת הזכוכית במייבש או בתנור למשך הלילה ב-RT לייבוש מתאים.
    8. אחסן את שקופית הזכוכית עם המקטע המצורף ב- RT בתיבת שקופיות.
      הערה: ניתן לאחסן שקופיות במשך שנים רבות ב- RT. אם יבוצע שעתוק מרחבי, במקום שקופית זכוכית, מקם את המקטע בשקופית ביטוי הגן המרחבי שסופקה על ידי היצרן ופעל לפי ההמלצות המדווחות (ראה טבלת חומרים).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת כאן מתארת כיצד לעבד עצמות מבודדות טריות כדי לקבל דגימות FFPE נטולות מינרלים שניתן לחתוך בקלות באמצעות מיקרוטום תוך שמירה על שלמות הרנ"א (איור 1). השיטה יושמה בהצלחה על עצם הירך אך ניתן לעקוב אחריה עבור דגימות רקמת עצם אחרות בממדים דומים, או שניתן להתאים אותה לדגימות עצם גדולות יותר (למשל, דגימות אנושיות) על ידי הגדלת כל הפרמטרים (תזמון, נפחי תמיסות וכו ').

figure-results-1
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. תרשים סכמטי של השיטה להשגת בלוקים FFPE של רקמות עצם decalcified עם שלמות RNA שמורה (נקודות 1 ו -2). דיאגרמה סכמטית של ההנחיות לסעיף בלוקים FFPE (נקודה 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לאמת את העיתוי הנכון של הסתיידות, בוצע מסלול זמן שבו הושוו עצם הירך שלא הסתיידה, עצם הירך שהסתיידה במשך 3 שעות (שעבורה EDTA הוחלף כל 30 דקות ובסך הכל 6 פעמים), ועצם הירך שהסתיידה במשך 24 שעות (שעבורה EDTA הוחלף כל 30 דקות ובסך הכל 10 פעמים ואז הושאר ב-EDTA למשך הלילה) (איור 2). בלוקי ה- FFPE שהתקבלו חולקו לאחר מכן על פי ההנחיות לעיל, והאיכות ההיסטולוגית ושלמות ה- RNA של החלקים שהתקבלו אומתו. כדי לעשות זאת, השלמות המבנית והמורפולוגיה של חלקי רקמות הוערכו באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) ולאחר מכן בדיקה מיקרוסקופית (איור 2A,C,E), בעוד שאיכות הרנ"א הוערכה על-ידי הערכת ערך התפלגות מקטע הרנ"א בגודל גבוה מ-200 נוקלאוטידים (200 nt) (הידוע כציון DV200)4 (איור 2B, ד,ו). תמונות H&E הראו שמקטעי עצם הירך שלא הסתיידו ו-3 שעות הסתיידו הציגו כמה שברים, חורים ונזקים (איור 2A,C,), בעוד שחלקים של עצם הירך שהסתיידו במשך 24 שעות הציגו איכות היסטולוגית טובה (איור 2E). כל הדגימות הציגו ציוני DV200 גבוהים מ- 50%, הנחשבים לערך המינימלי לביצוע ניתוח scRNA-seq או שעתוק מרחבי4. זמני דגירה ארוכים יותר עם שינויים יומיים של EDTA, ב-4°C, עם תסיסה קלה יותר במיכלים קטנים יותר, נבדקו גם הם ואינם מומלצים מאחר שבתנאים אלה, שלמות הרנ"א של הדגימות יורדת באופן דרמטי (איור 2H). לכן, זמן הדגירה הופחת ל -24 שעות בעוד התדירות, התסיסה ונפחי ההסתיידות הוגדלו כדי להגביר את ההסתיידות.

figure-results-2
איור 2. מקטעים ובקרת איכות תקינות RNA (QC) של עצם הירך של עכבר בן 8 שבועות לאחר הסתיידות. עצם הירך של עכברים בני 8 שבועות נותחה טרייה, תוקנה והוסרה עם 20% EDTA pH 8.0. בנקודות זמן שונות, מוטמעות בפרפין בשיטה המתוארת, ומחולקות בהתאם להנחיות המדווחות. QC היסטולוגי של מקטעים שהתקבלו בוצע לאחר מכן באמצעות צביעת H&E, בעוד שלמות RNA הוערכה על ידי הערכת ערך התפלגות מקטע RNA בגודל גדול מ -200 נוקלאוטידים (200 nt) (DV200). (A) צביעת H&E המציגה 8 קטעי עצם הירך של עכבר בן שבוע לאחר ללא הסתיידות. התמונה הימנית מציגה הגדלה גבוהה יותר של האזור הארוז. (B) RNA QC של מקטעי עצם הירך של עכבר בן 8 שבועות לאחר ללא הסתיידות. (C) צביעת H&E המראה 8 קטעי עצם הירך של עכבר בן שבוע לאחר 3 שעות של הסתיידות. התמונה הימנית מציגה הגדלה גבוהה יותר של האזור הארוז. (D) RNA QC של מקטעי עצם הירך של עכבר בן 8 שבועות לאחר 3 שעות של הסתיידות. (E) צביעת H&E המראה 8 קטעי עצם הירך של עכבר בן שבוע לאחר 24 שעות של הסתיידות. התמונה הימנית מציגה הגדלה גבוהה יותר של האזור הארוז. (F) RNA QC של מקטעי עצם הירך של עכבר בן 8 שבועות לאחר 24 שעות של הסתיידות. (G) צביעת H&E המראה קטעי עצם הירך של עכבר בן 8 שבועות לאחר 72 שעות של הסתיידות. התמונה הימנית מציגה הגדלה גבוהה יותר של האזור הארוז. (H) RNA QC של מקטעי עצם הירך של עכבר בן 8 שבועות לאחר 72 שעות של הסתיידות. קיצורים: H&E = hematoxylin ו eosin; DV200 (%) = % מערך התפלגות המקטע > 200 nt; NT = נוקלאוטידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לבחון את היעילות של ההנחיות המדווחות לטיפול בדגימות FFPE שאינן נטולות מינרלים, נאספו בלוקים מסוג FFPE של אוסטאוסרקומה ראשונית אנושית שאינה עוברת דה-מינרליזציה וגרורות של אוסטאוסרקומה של אוסטאוסרקומה ריאתית שהתקבלו מרישום גידולי השלד והשרירים ובנק הרקמות (MOTOR) שלנו, ובוצע ניתוח שעתוק מרחבי (איור 3). לפני שנמשיך בניתוח תעתיק מרחבי, בלוקים של FFPE הוטמעו מחדש בפרפין כדי לקבל משטח התחלה חלק. לאחר מכן, הוערכו הרנ"א והאיכות ההיסטולוגית של המקטעים (הנתונים לא מוצגים). שלבי ההידרציה היו מכריעים מכיוון שלא ניתן היה לחתוך דגימות אוסטאוסרקומה ראשוניות ללא הידרציה נאותה. לעומת זאת, גרורות ריאה לא דרשו כל שלבי הידרציה. לאחר החיתוך, רקמות הונחו על שקופית שעתוק מרחבי (איור 3A), מוכתמת ב-H&E (איור 3D), וניתוח שעתוק מרחבי בוצע בהתאם למפרטי היצרן (ראו טבלת חומרים). ספריות cDNA שהתקבלו רוצפו, ונתונים מעובדים הודגמו באמצעות Space Ranger לבקרת איכות5 (איור 3B). פלט ספייס ריינג'ר הראה ציונים גבוהים מאוד (כמעט 100%) עבור ברקודים תקפים, מזהים מולקולריים ייחודיים תקפים (UMIs), בסיסי Q30 וחציון של גנים שזוהו לכל נקודה (בין 1700 ל-5000), מה שמדגים חוסן ומוצקות של הנתונים שהתקבלו (איור 3B). באמצעות ניתוח אשכולות מבוסס גרפים בלתי מוטה, זוהו 12 צבירים עיקריים, כולל צבירים של תאים אוסטאוגניים, חיסוניים, אפיתליאליים ואנדותליים, כמו גם אדיפוציטים (איור 3E). שימו לב שגבולות הצבירים חפפו לקצוות האזורים ההיסטולוגיים שזוהו על-ידי הפתולוג (איור 3D). חלקים נוספים של אותן דגימות הוכתמו גם הם בטריכרום של גולדנר כדי להמחיש אזורים שעברו מינרליזציה (איור 3C).

figure-results-3
איור 3. ניתוח שעתוק מרחבי של שני זוגות של אוסטאוסרקומה ראשונית (OS) לא מסוידת וגרורות ריאה. בלוקים FFPE של שני זוגות תואמים של אוסטאוסרקומה ראשונית אנושית לא demineralized וגרורות ריאות נאספו מבנק רקמות MOTOR שלנו. הדגימות חולקו באמצעות ההנחיות המדווחות והוכנסו לשקופית Visium Spatial Gene Expression עבור דגימות FFPE לביצוע ניתוח שעתוק מרחבי. (A) שקופית Visium Spatial Gene Expression עבור דגימות FFPE עם המקטעים המצורפים. (B) פלט ספייס ריינג'ר המציג פרמטרים משותפים המשמשים להערכת איכות הנתונים המתקבלים עבור כל הדגימות. (C) כתם טריכרום של גולדנר המראה לוקליזציה של רקמות עצם מינרליות ואוסטאואיד. (D) כתם H&E המציג את ביאור הפתולוג. (E) ניתוח אשכולות המראה לוקליזציה של אוכלוסיות התאים השוכנות ברקמה. קיצורים: FFPE = פורמלין-קבוע ופרפין מוטבע; MOCs = תאים אוסטאוגניים ממאירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, ניתנת שיטה מפורטת להכנת בלוקים FFPE של עצמות מסוידות ושמירה על שלמות RNA לריצוף (כלומר, ריצוף הדור הבא (NGS)) או לטכניקות אחרות הקשורות ל- RNA (כלומר, הכלאה באתר , תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (qRT-PCR) וכו ').

השיטה משתמשת ב- EDTA כדי להסיר דגימות רקמת עצם; הדגירה של EDTA מאפשרת דה-מינרליזציה איטית אך עדינה של הדגימות, ובכך שומרת על התכונות ההיסטולוגיות של הרקמה במיטבן. בדרך כלל, הסתיידות עצם מתבצעת באמצעות 10% EDTA pH 7.0 במשך שבועיים לפחות על ידי רענון התמיסה כל יומיים4. זמנים ארוכים של הסתיידות, לעומת זאת, תורמים באופן משמעותי לפירוק RNA 6,7,8. כדי להתגבר על בעיה זו, ריכוז EDTA הועלה ל -20%, ה- pH הועלה ל -8.0, ותדירות החלפת התמיסה הועלתה לכל 30 דקות. תנאים אלה, בשילוב עם כמות התמיסה הגדולה אליה נחשפת הרקמה, התסיסה הנמרצת והיחס הגבוה בין מיכל לנפח רקמה, ממקסמים את ההסתיידות וקיצור זמני הטיפול, ומאפשרים דה-מינרליזציה עדינה אך מהירה. חשוב לציין כי כאשר דגימות רקמת עצם ישמשו לריצוף שעתוק, ייתכן שלא יהיה צורך לבטל אותן לחלוטין. במקרה זה, ניתן למצוא את היחס האופטימלי בין דה-מינרליזציה מספקת לבין שימור RNA טוב. דבר נוסף שחשוב להזכיר הוא שלא משנה איך מטפלים בדגימות אם הן תוקנו, הרנ"א שלהן יהיה מקוטע. השיטה המדווחת כאן מאפשרת שימור של מקטעי רנ"א בגודל גבוה מ-200 נוקלאוטידים (%DV200) (איור 2F), מה שמצביע על איכות רנ"א גבוהה 9,11.

שיטה זו מציגה מגבלות מסוימות. ראשית, מכיוון שעכברים היו המקור היחיד לדגימות רקמת עצם, השיטה אומתה רק על עצמות מורין, שהן קטנות יחסית. יתר על כן, לא ידוע אם שיטה זו יכולה לשמש עבור עכברים מעל גיל 8 שבועות או מתחת לגיל 8 שבועות מאז זה נבדק על עכברים בני 8 שבועות בלבד. בחרנו עכברים בני 8 שבועות מכיוון שהם בוגרים בשלד. מכיוון שההזדקנות משנה את תכולת המינרלים בעצמות, ייתכן שיהיה צורך ליישם שינויים בגישה זו.

בנוסף, הנחיות מדווחות כדי לעזור לשפר את האיכות של קטעי הרקמה כאשר דגימות FFPE של דגימות עצם קטנות undecalcified משמשים, כמו, למשל, כאשר הם נאספים ישירות מבנקי רקמות. במצבים אלה, לא ניתן לעשות דבר אם RNA הוא התפרק, אבל איכות סעיף ניתן לשפר. מצד שני, עבור דגימות עם תוכן RNA טוב, כגון אלה המוצגות כאן, ניתוח שעתוק מרחבי אפשרי אם ההנחיות שסופקו הם אחריו. יש לציין כי בדגימות אוסטאוסרקומה ראשוניות, ניתן לשנות את מבנה העצם על ידי נוכחות מסת הגידול, מה שהופך את הדגימות בפועל לחלשות ושבריריות, מה שעשוי להקל על החתך. לכן, נעשה שימוש בצביעת טריכרום של גולדנר כדי להעריך אם זה היה המקרה, מאחר שניתן לזהות אזורים שעברו מינרליזציה ואזורים לא מינרליים באמצעות טכניקת הצביעה הזו (איור 3C).

לסיכום, השיטה המדווחת מייצגת שיטה קלה ליישום להסרת דגימות רקמת עצם ולהשגת קטעי FFPE שעשויים לשמש ביעילות עבור NGS או טכניקות אחרות הדורשות שלמות RNA. בנוסף, ניתנות הנחיות לחיתוך דגימות שייתכן שלא עברו דה-מינרליזציה לפני הטמעת פרפין, כמו דגימות שהתקבלו מבנקי רקמות. בהתחשב בהתפתחות המהירה של ניתוחי תעתיק מרחבי, השיטה וההנחיות המוצעות עשויות להיות מועילות מאוד במחקר העצם בכלל וגם בחקר סרטן העצם.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מפיטסבורג קיור סרקומה (PCS) ומכון אוסטאוסרקומה (OSI).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שייקר אורביטלי מתקדםVWR76683-470השתמש כדי לשמור על רקמות תחת תסיסה במהלך הדגירה כפי שדווח בהוראות השיטה.
מברשות שיער גמלטד פלה11859השתמש לטיפול בקטעי FFPE כפי שדווח בהנחיות.
ערכת אינדקס כפול TS סט A 96 rxns10X גנומיקהPN-1000251השתמש לביצוע טרנסקריפטומיקה מרחבית.
אתנול 200 הוכחהDecon Labs Inc2701השתמש לביצוע התייבשות רקמות כפי שדווח בהוראות השיטה.
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, מלח דיסודיום דיהידראט (EDTA)Thermo Fisher ScientificS312-500השתמש להכנת EDTA 20% pH 8.0. 
Fisherbrand Curved Medium Point מלקחיים לשימוש כלליFisher Scientific16-100-110השתמש לטיפול בקטעי FFPE כפי שדווח בהנחיות.
Fisherbrand Fine Precision ProbeFisher Scientific12-000-153השתמש לטיפול בקטעי FFPE כפי שדווח בהנחיות.
פישרברנד  Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15השתמש כדי לצרף מגילות חתוכות כפי שדווח בהנחיות.
להבי מיקרוטום יהלום בפרופיל גבוהCL SturkeyD554DDהשתמש כדי לחתוך בלוקים FFPE כפי שדווח בהנחיות.
Novaseq 150PENovogeneN/ASequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% תמיסה מימית EM GradeElectron Microscopy Sciences15714-Sיש לדלל לריכוז סופי של 4% עם 1x PBS  לביצוע קיבוע רקמות.
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-049מוכן לשימוש. השתמש כדי לדלל PFA ולבצע שטיפות כפי שדווח בהוראות השיטה.
אמבט טישו פרמייר צף פישר סיינטיפיקA84600061השתמש להסרת קמטים מקטעי FFPE כפי שדווח בהנחיות.
RNase AWAY מטהר משטחThermo Fisher Scientific7002השתמש לניקוי כל המשטחים כפי שדווח בהוראות השיטה.
ערכת RNeasy DSP FFPEQiagen73604השתמש כדי לבודד RNA מקטעי FFPE לאחר שנוצרו כפי שדווח בהנחיות.
מיקרוטום סיבובי חצי אוטומטיLeica BiosystemsRM2245השתמש בחתך בלוקים של FFPE כפי שדווח בהנחיות.
נתרן הידרוקסידMillipore SigmaS8045-500הכן תמיסה של 10 N על ידי המסה איטית של 400 גרם בליטר מים Milli-Q.
Space Ranger10X Genomics2.0.1השתמש לעיבוד פלט נתוני ריצוף.
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006להשתמש לביצוע אינפלציה והטמעה של רקמות כפי שדווח בהוראות השיטה.
ערכת אביזרי Visium10X GenomicsPN-1000194השתמש לביצוע ניסויים טרנסקריפטומיים מרחביים.
ערכת בדיקה טרנסקריפטום אנושי של Visium קטנה 10X GenomicsPN-1000363השתמש לביצוע ניסויים טרנסקריפטומיים מרחביים.
ערכת שקופיות ביטוי גנים מרחבית של Visium 4 rxns 10X GenomicsPN-1000188השתמש כדי למקם את החלקים אם מבצעים ניסויים טרנסקריפטומיים מרחביים.
XyleneLeica Biosystems3803665להשתמש לביצוע ניקוי רקמות כפי שדווח בהוראות השיטה.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baig, M. A., Bacha, D. Histology. Bone. , StatPearls Publishing. (2024).
  2. Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
  3. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707(2010).
  4. Wallington, E. A. Histological Methods for Bone. , Butterworths. London. (1972).
  5. Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
  6. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304(2017).
  7. Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
  8. Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734(2023).
  9. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
  10. 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
  11. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsBone TissueDecalcification ProtocolRNA PreservationFFPE SectioningOsteosarcoma MetastasisTissue MorphologyH E StainingRNA IntegrityMicrotome Sectioning

Related Articles