מאמר שיטה

שיטה מבוססת מיצוי אפופלסט לשיפור הטוהר של חלבון רקומביננטי המיוצר על ידי צמחים

DOI:

10.3791/66852

⸱

5 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור חלבונים רקומביננטיים ממערכות צמחיות מאותגר בדרך כלל על ידי חלבונים צמחיים. עבודה זו מספקת שיטה למיצוי וטיהור יעיל של חלבון רקומביננטי מופרש מהאפופלסט של ניקוטיאנה בנתמיאנה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים הם מערכת ביטוי אאוקריוטית חדשה שמתפתחת ונחקרת כדי לייצר חלבונים טיפוליים. טיהור חלבונים רקומביננטיים מצמחים הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בתהליך הייצור. בדרך כלל, חלבונים טוהרו מחלבונים מסיסים כוללים (TSP), ונוכחותם של חלבונים תוך-תאיים וציטוכרומים שונים מציבה אתגרים לשלבי טיהור החלבונים הבאים. יתר על כן, רוב החלבונים הטיפוליים כמו אנטיגנים ונוגדנים מופרשים כדי להשיג גליקוזילציה נכונה, ונוכחות של חלבונים שהשתנו באופן לא מלא מובילה לאנטיגן או מבני נוגדנים לא עקביים. עבודה זו מציגה שיטה יעילה יותר להשגת חלבונים רקומביננטיים מטוהרים מאוד מהחלל האפופלסטי של הצמח. החלבון הפלואורסצנטי הירוק הרקומביננטי (GFP) מהונדס להיות מופרש לתוך אפופלסט של ניקוטיאנה בנטמיאנה ולאחר מכן מופק בשיטת חדירה-צנטריפוגה. ה-GFP-His מהאפופלסט המופק מטוהר לאחר מכן על ידי כרומטוגרפיית זיקה לניקל. בניגוד לשיטות המסורתיות של TSP, טיהור מהאפופלסט מייצר חלבונים רקומביננטיים מטוהרים מאוד. מדובר בשיפור טכנולוגי חשוב למערכות הייצור במפעלים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיום, חלבונים טיפוליים רקומביננטיים שונים המיוצרים על ידי צמחים נחקרים, כולל נוגדנים, חיסונים, חלבונים ביו-אקטיביים, אנזימים ופוליפפטידים קטנים 1,2,3,4,5,6. צמחים הופכים לפלטפורמה מנוצלת יותר ויותר לייצור חלבונים טיפוליים בשל בטיחותם, עלותם הנמוכה ויכולתם להגדיל במהירות את הייצור 7,8. ביטוי ושינוי חלבונים במערכות צמחיות, יחד עם טיהור חלבונים, הם גורמים קריטיים הקובעים את התפוקה של ביוריאקטורים צמחיים 9,10. שיפור הפרודוקטיביות של הצמח והשגת חלבוני מטרה בעלי טוהר גבוה הם אתגרי הליבה העומדים בפני מערכות ייצור צמחיות11,12.

הלוקליזציה התת-תאית והשינוי של חלבונים רקומביננטיים תלויים בפפטיד האות הספציפי המקודד ב-N-terminus, אשר מכוון את החלבון ליעדו הסופי במהלך ביטוי הגנים. חלבונים רקומביננטיים מתוכננים למקם את האפופלסט, הרשתית האנדופלסמית (ER), הכלורופלסט, הוואקול או הציטופלסמה, בהתבסס על תכונותיהם הייחודיות13. עבור אנטיגנים ונוגדנים, חלבונים מופרשים עדיפים. לפני ההפרשה, חלבונים מתקדמים דרך ER ו Golgi עבור קיפול נכון ושינויים לאחר תרגום 14,15,16.

לאחר הייצור בצמחים, חלבונים רקומביננטיים חייבים להיות מטוהרים מתמציות צמחים. בדרך כלל, חלבונים מטוהרים מתמציות צמחים מסיסות, המכילות שפע של חלבונים תוך-תאיים, מוצרים שלא קופלו כהלכה ולא שונו, וציטוכרומים17. כדי להסיר זיהומים, תמציות צמחים עוברות שבירה נרחבת, כולל כרומטוגרפיית זיקה ספציפית לריבולוז-1,5-ביספוספט קרבוקסילאז/אוקסיגנאז (RuBisCO), משקעים פיטאטים, משקעים מפוליאתילן גליקול והתאמת טמפרטורה ו- pH18,19. שלבים כאלה של הסרת זיהומים הם מייגעים ועלולים לפגוע באיכות החלבון.

תא התא הצמחי מעבר לקרום הפלזמה מוגדר כאפופלסט, וכולל את דופן התא, חללים בין-תאיים וקסילם20. הפאזה המימית נקראת בדרך כלל נוזל כביסה אפופלסט (AWF). AWF מכיל מולקולות המופרשות על ידי תאים כדי לווסת התקדמות ביולוגית רבה כמו תחבורה, מטבוליזם של דופן התא ותגובות לחץ21,22. בניגוד ל-TSP, המרכיבים המולקולריים של AWF פחות מורכבים. חילוץ חלבונים רקומביננטיים מ-AWF עשוי למנוע זיהום על ידי חלבונים תוך-תאיים, מוצרים שאינם מקופלים כהלכה ושאריות ציטופלזמיות. בקצרה, שומני מיצוי נכנסים לעלים דרך הפיוניות בלחץ שלילי, וה- AWF נאסף על ידי צנטריפוגה עדינה23. בעוד בידוד של AWF נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את ההתקדמות הביולוגית בתוך אפופלסט 24,25,26,27, הוא לא נוצל במערכות ייצור צמחיות.

שיפור התפוקה של המפעל והשגת חלבוני מטרה בעלי טוהר גבוה הם אתגרים מרכזיים עבור מערכות ייצור צמחים28. בדרך כלל, חלבונים מטוהרים מתמציות צמחים מסיסים הכוללים כמויות גדולות של חלבונים תוך-תאיים, מוצרים שאינם מקופלים כהלכה וללא שינוי, וציטוכרומים29, הדורשים עלויות גדולות לטיהור הבא30. השימוש בשיטות מיצוי חלבוני AWF למיצוי חלבונים רקומביננטיים אקסוגניים המופרשים לאפופלסט יכול לשפר ביעילות את ההומוגניות של חלבונים רקומביננטיים ולהפחית את עלות טיהור החלבונים. כאן, אנו משתמשים בפפטיד אות PR1a כדי לאפשר הפרשת חלבון אקסוגני לתוך חלל אפופלסט ומציגים שיטה מפורטת לטיהור חלבון רקומביננטי מה- AWF של N. benthamiana.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת צמחי N. benthamiana

  1. מניחים את קוביות השתיל במגש, מוסיפים ליטר מים ומשרים כשעתיים עד לרוויה מלאה.
  2. מפזרים באופן שווה זרעי בר מסוג N. benthamiana על אבני השתיל, מכסים במכסה ונובטים במשך שבוע אחד. לגדל N. benthamiana בחממה עם 18 שעות photoperiod, 24 ° C, 45% לחות יחסית, ולהפרות כל שבועיים.
  3. לאחר שהזרעים נבטו, השתמשו בפינצטה כדי להסיר שתיל בעדינות, תוך הקפדה שלא לגרום נזק לשורשיו. חופרים בור קטן במרכזו של מגש חדש, מניחים בו את השתיל ומכסים קלות את השורשים באדמה. מכסים במכסה וממשיכים לגדול.
  4. לגדול עד שתילים יש שלושה עלים, עם המכסה על. יש להסיר את המכסה כאשר העלההאמיתי ה-4 מגיח.
  5. לאפשר לצמחים להמשיך לגדול במשך שבועיים נוספים לפני חלחול חקלאי.

2. בניית GFP רקומביננטי-שלו

  1. לבצע אופטימיזציה של N . benthamiana codon וסינתזה של GFP ו- PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) בהתבסס על רצפי הגנים.
  2. בצע עיכול כפול של וקטור pCAMBIA1300 באמצעות אנזימים Xba I ו- Sac I (ראה טבלת חומרים).
  3. ביצוע הגברה של PR1a באמצעות פריימרים במעלה הזרם (TTGGAGAGAACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) ופריימרים במורד הזרם (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), הגברה של GFP באמצעות פריימרים במעלה הזרם (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) ופריימרים במורד הזרם (GGGGAAATTCGAGCTCAGTGGTGATGGTGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. שימוש ברקומבינציה הומולוגית, שיבוט PR1a ו-GFP לווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1300. לאחר המעבר ל - E. coli, בחר שיבוטים בודדים ושלח אותם לחברה לריצוף. השוואה בין תוצאות הריצוף לבין הפלסמיד הימני הוא פלסמיד רקומביננטי pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, המכונה p35s-PR1a-GFP-His.

3. ייצור GFP-שלו ב N. benthamiana

  1. הוסף 1 μL של פלסמיד GFP לתוך 50 μL של תאים קולטן Agrobacterium GV3101, לערבב בעדינות ולהוסיף לכוס אלקטרודה, להסיר לאחר electrocution על electroshocker.
  2. התפשטות Agrobacterium tumefaciens מותמרת על צלחת בינונית מוצקה LB המכילה 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין (Kan) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ריפמפיצין (Rif). דגירה הפוכה ב 28 ° C במשך 48 שעות. וקטור pCAMBIA1300 עמיד בפני קאן, ואגרובקטריום עמיד בפני ריף; רק אגרובקטריום נכון יכול לגדול על צלחות עם קאן וריף. השיבוטים החד-שבטיים היו הטרנספורמנטים החיוביים, שנקראו A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. השתמש קיסם מעוקר כדי להרים כמות מתאימה של AtGPG ולחסן אותו לתוך 4 מ"ל של LB נוזלי עם Kan ו Rif. תרבות ב 28 ° C, 220-300 סל"ד במשך 24 שעות.
  4. תת-תרבית חיידקים 1:50 לתוך LB טרי (50 מיקרוגרם / מ"ל Kan, 10 mM 2-(N-Morpholino) חומצה ethanesulfonic (MES), 20 מיקרומטר אצטוסירינגון (AS)) ולדגור ב 28 ° C, 220-300 סל"ד במשך 10-12 שעות.
  5. קצור חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 1500 x גרם במשך 10 דקות והשהה מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 100 μM AS).
  6. מדוד וכוונן את הצפיפות האופטית (OD) של AtGPG ל- OD600=0.8 באמצעות MMA. דוגרים על החיידקים עוד 2-4 שעות בטמפרטורת החדר. ציירו את התמיסה החיידקית עם מזרק ללא מחט, לחצו אותו קלות על גב העלים, ותנו לחץ לחדור את התמיסה לעלים. מזריקים רק את 3-4 העלים האמצעיים לכל צמח.
  7. ממשיכים לגדל N. benthamiana בחממה במשך 3-4 ימים לפני קציר עלים למיצוי חלבון.

4. התבוננות בלוקליזציה תת-תאית של GFP

  1. לאחר 48 שעות של חדירה חקלאית, בחר עלה שטוח והשתמש בניקוב חור 6 מ"מ כדי להדק את הלהב לניקוב.
  2. טפטפו תמיסת 30% סוכרוז על מגלשת זכוכית, הניחו את דוגמת העלה כשהגב פונה כלפי מעלה וכסו אותה בכוס כיסוי.
  3. הגדר את אורך גל העירור ל 488 ננומטר וזהה את הפלואורסצנטיות הירוקה ב 490-550 ננומטר לאחר הגדלה של 400x. צלם את התמונה הראשונה לאחר הכנת השקופית ותמונה נוספת 10 דקות לאחר מכן.

5. מיצוי GFP מהצמח

  1. מיצוי AWF
    1. יש לאסוף את עלי N. benthamiana הטריים השלמים המבטאים GFP רקומביננטי לאחר 3 ימים לאחר ההסתננות. יש לטפל בעלה בעדינות ולשמור על שלמות העלה כדי למנוע פליטת חלבון תוך-תאית. השתמשו בעלים שנאספו לשלב הבא באופן מיידי כדי למנוע פירוק חלבון.
    2. יש לשטוף את להב העלה ב-ddH2O מעוקר מראש כדי להסיר לכלוך.
    3. שוקלים עלים טריים וטובלים 20 גרם עלים (הצד האבקסי כלפי מטה) ב-100 מ"ל של חיץ פוספט מקורר מראש של 100 מילימטר (PB 100 mM Na2HPO4 ו-100 mM NaH2PO4 הוגדרו בנפרד ועורבבו ביחס של 2.2:1 pH 7.0) בכד רחב פה של 200 מ"ל. מכסים את העלים בחוט רשת דק מניילון 100 רשת (ראו טבלת חומרים) ובצלחת פלסטיק.
      הערה: קירור מקדים מונע פירוק חלבונים. ניתן לכוונן נפחי מאגר בהתבסס על קנה המידה הניסיוני. ודא שכל העלים שקועים.
    4. הכניסו את הכד למשאבת ואקום. החל שואב אבק 0.8 MPa למשך דקה אחת, ולאחר מכן שחזר במהירות ללחץ אטמוספרי.
    5. מוציאים את העלים מהמאגר ומייבשים בעדינות עם נייר סופג. לגלגל עלים, לעטוף עם חוט רשת, ומניחים 5 גרם של עלים לתוך כל צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. כדי לאסוף AWF, מקם עלים מגולגלים בקצה הצד בצינורות עם חוט רשת המהודק על ידי מכסי הצינורות.
    6. צנטריפוגה ב-4°C, 500 x גרם למשך 5 דקות. מוציאים עלים ואוספים את ה-AWF בתחתית הצינור באמצעות פיפטה. ניתן לקבל כ -5 מ"ל של AWF מכל צינור.
      הערה: על מנת למזער הפרעות מחלבונים תוך-תאיים ולמצות את הכמות המרבית של חלבוני AWF, ניתן לחזור על המיצוי 2x-3x, אך לא יותר מ-3x.
  2. מיצוי חלבון מסיס כולל
    1. טוחנים 20 גר' עלים לאבקה דקה בחנקן נוזלי. הוסף מאגר מיצוי (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 10% גליצרול, 1% Triton X-100, 0.034% β-מרקפטואתנול (ראה טבלת חומרים)) ביחס של 1:2.
    2. נערו הומוגנט במיקסר אנכי במשך 30 דקות ב-4°C. צנטריפוגה הומוגנית ב 13,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
    3. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש וחוזרים על הצנטריפוגה למשך 15 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור אחר.
    4. סננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לקבלת תמצית חלבון מסיס לחלוטין.

  

6. טיהור GFP-His עם כרומטוגרפיית זיקה ניקל (Ni)

הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורה של 4°C.

  1. הוסף Ni sepharose excel resin (ראה טבלת חומרים) לצינור ביחס של 1:1000 ביחס לנפח תמצית החלבון משלב 5.1.6. נפח השרף שווהל-1 /1000 מנפח תמצית החלבון.
  2. שטפו את שרף Ni 3x עם נפח שרף פי 10 של ddH2O ו-PB (pH 7.0) בנפרד בתורו והסירו את הסופרנטנט.
  3. יש לדגור על תמצית חלבון עם שרף Ni למשך שעתיים כדי לאפשר קשירה מלאה. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר חלבונים לא קשורים בסופרנטנט. יש לשטוף פי 3 עם נפח שרף פי 20 של PB. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  4. Elute GFP-His על ידי הוספת נפח שרף 10x של 250 mM imidazole (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 250 mM imidazole) ולאסוף את supernatant.

7. כתמים כחולים של חלבונים

  1. הוסף 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS ל 40 μL של דגימות חלבון, להרתיח במשך 10 דקות, ולאחר מכן לרוץ על 15% SDS-PAGE ב 110 V במשך 60 דקות.
  2. ג'ל חלבון מכתים עם תמיסה כחולה קומאסי (0.1% R-250, 25% איזופרופנול, 10% חומצה אצטית קרחונית) למשך שעתיים.
  3. יוצקים את התמיסה ושוטפים בתמיסת הסרת צבע למשך שעתיים. שימו לב לג'ל; חלבונים על הג'ל יהיו בצבע כחול.

8. כתם מערבי של חלבונים

  1. הוסף 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS ל 40 μL של דגימות חלבון, להרתיח במשך 10 דקות, ולאחר מכן לרוץ על 15% SDS-PAGE ב 110 V במשך 60 דקות.
  2. העברת חלבונים לקרום ניטרוצלולוז של 0.45 מיקרומטר ב-280 mA. לחסום את הממברנה עם חלב דל שומן 5% במשך 1 שעות.
  3. לדלל את הנוגדנים anti-His-tag ב 1:5000 ולדגור את הממברנה עם הנוגדנים במשך 1 שעות. השתמשו במי מלח חוצצים בתלת-מלח וב-tween 20 (TBST) כדי לשטוף את הממברנה 4x למשך 5 דקות.
  4. לדלל את הנוגדנים נגד עכבר ב 1:10000 ולדגור את הממברנה עם הנוגדנים במשך 1 שעות. השתמשו ב-TBST כדי לשטוף את הממברנה 4x במשך 5 דקות.
  5. ערבבו את המפתח (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1. הוסף 400 μL לממברנה ולאפשר להגיב במשך 1 דקה. צלם תמונות לאחר חשיפה של דקה אחת באמצעות חומר הדמיה.

9. בדיקת ריכוז חלבון

  1. הוסף 5 μL של חלבון ל 1 מ"ל של Bradford 1x מגיב צבע ולהגיב במשך 5 דקות.
  2. קבע את ערך OD595 לאחר אפס וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית.

10. כימות חלבונים 31

  1. ביצוע הדבקה מערבית של דגימות חלבון יחד עם תקנים.
  2. בצע כימות של GFP לפי יחס לתקנים באמצעות ניתוח גווני אפור של ImageJ 1.5.0.

  

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP-His מיועד להפרשה לחלל האפופלסטי של N. benthamiana
GFP שובט לתוך פלסמיד pCAMBIA1300 עם פפטיד אות N-terminal PR1a להפרשה ותג His-terminal C לטיהור, ויצר p35s-PR1a-GFP-His (איור 1A). החלבון הרקומביננטי בוטא באופן ארעי ב-N. benthamiana ורצועה של 30 kDa זוהתה על-ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-שלו 3 ימים לאחר חדירה חקלאית (איור 1B). פלסמוליזה היא טיפול בעלים באמצעות תמיסה היפרטונית להפרדת דופן התאמקרום התא 32. כדי לקבוע אם GFP ממוקם אפופלסט, השתמשנו 30% סוכרוז כדי להפוך את פלסמוליזה עלים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדגים את נוכחותו של GFP-His בתוך האפופלסט (איור 1C). חלבוני AWF שחולצו על-ידי חדירת ואקום-צנטריפוגה הכילו גם GFP-His (איור 1D). תוצאות אלה מדגימות את הפרשת GFP-His לתוך AWF של עלי N. benthamiana , שממנו ניתן להפיק אותו לטיהור במורד הזרם.

טיהור חלבונים מ-AWF
היעילות של מיצוי AWF משפיעה מאוד על תפוקת ה-GFP הסופית. בהתבסס על פרוטוקולי מיצוי AWFשפורסמו 24,25,26,27, בדקנו פתרונות שונים כדי לייעל את ההתאוששות של GFP-His מופרש. כאן נבדקו שמונה פתרונות מיצוי: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4.5), 50 mM NaCl (pH 7.1), 40 mM KCl (pH 7.0), 20 mM CaCl2 (pH 5.7), 100 mM PB (pH 7.0), 10 mM MES (pH 5.6) ו- ddH2O (pH 7.0). PB חילץ את הכמות הגדולה ביותר של AWF ו-GFP-His, יותר מפי 4 מפתרונות אחרים (איור 2A,B). השוואת PB ב- pH משתנה גילתה שיפור ב- AWF וב- GFP-מיצוי שלו בתנאים ניטרליים עד בסיסיים קלים (pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ו- 8.0; איור 2C,D). בנוסף, PB עם ריכוזים של 50 mM, 100 mM, ו 150 mM הושוו עבור יעילות המיצוי. התוצאות הצביעו על כך ש-PB של 100 מילימטר הראה יעילות מרבית להתאוששות הן מ-AWF והן מ-GFP-His (איור 2E,F).

בהתבסס על ניסויי אופטימיזציה אלה, 100 mM PB, pH 7.0, נבחר עבור מיצוי AWF בקנה מידה גדול מ N. benthamiana. באמצעות החיץ הזה, 495 מיקרוגרם של חלבוני AWF לכל גרם של חומר עלים טריים נמצאו מהאפופלסט (איור 2G). ה-AWF שחולץ הכיל 10 מיקרוגרם של GFP-His (איור 2H), אשר התאימו לכ-18% מכלל ה-GFP-His ב-TSP (איור 2I). לאחר כרומטוגרפיית Ni-affinity, טוהר GFP-His הגיע ל-84.3% ממיצוי AWF, גבוה משמעותית מהטוהר של 44.9% שהושג באמצעות מיצוי חלבון מסיס כולל (איור 2J).

figure-results-1
איור 1: GFP-His מיועד להפרשה לתוך אפופלסט של N. benthamiana. (A) סכמטי של PR1a-GFP-המבנה שלו בווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1300. (B) כתם מערבי המזהה GFP-ייצורו ב-N. benthamiana. כאן, 10 μL של דגימות חלבון הועמסו וזוהו. עלי N. benthamiana שהוזרקו בו זמנית עם MMA שימשו כבקרה שלילית. אותו נפח של דגימות נבדק והוצבע באמצעות תת-יחידות צמחיות גדולות כמו בקרת העמסה (C) מיקרוסקופ קונפוקלי המראה לוקליזציה תת-תאית של GFP-His (ירוק). עלי N. benthamiana היו plasmolyzed עם 30% סוכרוז. קווים מקווקווים לבנים מציינים את קרום הפלזמה. חיצים אדומים מציינים GFP - הצטברות שלו באפופלסט. (D) כתם מערבי המדגים נוכחות של GFP-His בנוזל האפופלסטי המופק. כאן, 10 μL של דגימות חלבון הועמסו וזוהו. עלי N. benthamiana שהוזרקו בו זמנית עם MMA שימשו כבקרה שלילית. קיצורים: 35s = 2x וירוס פסיפס כרובית 35s מקדם; PR1a = חלבון הקשור לפתוגנזה של טבק 1a פפטיד אות; שלו = 6x התג שלו; Nos = Nopaline synthase terminator. BS = לפני פלסמוליזה; PS = פוסט-פלסמוליזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אופטימיזציה של שיטת מיצוי החלבונים מ-AWF. (A-B) מיצוי חלבונים מ-AWF באמצעות מאגרים שונים. שמונה תמיסות נבדקו למיצוי חלבונים מ-AWF: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4.5), 50 mM NaCl (pH 7.0), 40 mM KCl (pH 7.0), 20 mM CaCl2 (pH 5.7), 100 mM PB (pH 7.0), 10 mM MES (pH 5.6) ו-ddH2O (pH 7.0). יעילות החילוץ נותחה על ידי SDS-PAGE (A), ו-GFP-His זוהתה על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-שלו (B). (ג-ד) חילוץ באמצעות PB בערכי pH שונים. PB עם pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ו-8.0 שימש לחילוץ מ-AWF. יעילות החילוץ זוהתה על ידי SDS-PAGE (C), ו-GFP-His זוהתה על ידי כתם מערבי עם נוגדן אנטי-שלו (D). (ה-ו) מיצוי באמצעות PB בריכוזים שונים. PB ב 50 mM, 100 mM, ו 150 mM שימשו לחילוץ מ AWF. יעילות החילוץ נותחה על ידי SDS-PAGE (E), ו-GFP-His זוהתה על ידי כתם מערבי עם נוגדן אנטי-שלו (F). (ז-ח) ניתוח כמותי של חלבונים שחולצו. החלבונים הופקו באמצעות PB של 100 מילימטר (pH 7.0). סך כל החלבון המסיס (G) וה-GFP-His (H) כומתו לצורך ניתוח סטטיסטי. (I) ניתוח סטטיסטי של היחס בין AWF GFP לסך GFP. (J) טיהור GFP-His מחלבונים מסיסים כוללים של N. benthamiana או AWF. חלבונים הופקו באמצעות 100 mM PB (pH 7.0), ו-GFP-His טוהר על ידי כרומטוגרפיית זיקה Ni. טיהור נותח על ידי SDS-PAGE. הנתיב הימני ביותר הוא תקן BSA של 1 מיקרוגרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בצמחים לייצור חלבונים טיפוליים התרחב במהירות בשנים האחרונות 1,2,3,4,5,6. גנים מקודדי חלבונים משובטים לווקטורי ביטוי ומועברים לרקמות הצמח באמצעות חדירה חקלאית. לאחר הייצור על ידי תאי צמחים, חלבונים מטוהרים עבור יישומים במורד הזרם. בדרך כלל, חלבונים רקומביננטיים מטוהרים מתמציות TSP. עם זאת, שפע של חלבונים צמחיים וציטוכרומים המשתחררים מתאי הצמח במהלך המיצוי עלולים לעכב את הטיהור33. מצד אחד, ציטוכרומים צמחיים יכולים לסתום עמודי הפרדה, ולהאט את העיבוד17; מצד שני, חלבונים בשפע רב כמו RuBisCO קשים להסרה, הפחתת טוהר18,19. נושאים אלה הופכים בעייתיים יותר כאשר חלבוני המטרה באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. טיהור מ-AWF עוקף את הבעיות האלה, ומאפשר טוהר גבוה יותר (איור 2J).

בעוד מיצוי AWF נמצא בשימוש נרחב בביולוגיה של צמחים 24,25,26,27, הוא מנוצל רק לעתים רחוקות בצנרת חקלאות מולקולרית. כאן, אנו משתמשים במודל GFP צמחי כדי להדגים טיהור חלבונים מבוסס AWF. חילוץ GFP מה-AWF בוצע על ידי הוספת פפטיד אות כדי לאפשר הפרשת GFP לחלל האפופלסט. שיטה זו מחלצת חלבונים בעלי הומוגניות גבוהה יותר ומפחיתה את עלויות עיבוד החלבונים במורד הזרם. מספר שיקולים מצדיקים חקירה עתידית ליישום טיהור AWF בביוריאקטורים של צמחים. ראשית, הפרשה יעילה דורשת היתוך של פפטידים ספציפיים של אות N-terminal. שנית, כדי לשמור על איכות AWF, עלים שלמים חייבים להיות מעובדים במהירות לאחר הקציר ללא הקפאה, מה שמשחרר תוכן תוך-תאי. שלישית, PB מחלץ ביעילות חלבוני AWF34 אולם יש להתאים את רמת החומציות וריכוז המלח לחלבונים רקומביננטיים בודדים (איור 2C-D). רביעית, השגנו חלבון מטוהר מ -200 גרם של N. benthamiana פעמים רבות בתנאי מעבדה עם טוהר ותנובה יציבים. כדי להתרחב לשימוש במפעל, מתבקשים כלי שיט גדולים יותר ומשאבות ואקום ושיטת טיהור יעילה יותר, וייתכן שיהיה צורך לייעל תנאים כגון משך ואקום, מספר שחזורים וכו '.

שיטה זו מוגבלת על-ידי העובדה שחלבונים אקסוגניים מופרשים לתוך ה-AWF, וחלבונים בתוך קרום הפלזמה נטושים (איור 2H-I). זה מביא את היתרון של קבלת חלבונים מטוהרים גבוה יותר עם שינוי נכון אבל במחיר גבוה יותר של התשואה. צוואר הבקבוק הטכני העיקרי לטיהור מבוסס AWF הוא שיפור רמת חלבון היעד בתוך AWF. צימוד עם מקדמים חזקים ומערכות הפרשה אופטימליות ישפר את פלטפורמות ביטוי הצמחים הן לטוהר גבוה והן לתפוקה גדולה יותר. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, מערכת ייצור גבוהה יותר ומערכת הפרשה יעילה יותר מתבקשים בעבודה עתידית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה לקידום חדשנות לנוער CAS (2021084) וקרן התמיכה בפרויקט פריסת המפתח של תוכנית הפעולה התלת-שנתית של המכון למיקרוביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 רשת ניילון חוט רשת עדיןגואנגג'ואו Huayu מסחר בע"מ חברהhy-230724-2למיצוי חלבון AWF
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהVazymeTCF00150לצנטריפוגה
ClonExpress II ערכת שיבוט שלב אחדVazymeC112-02לשיבוט
FastDigest Sac1NEBR3156Sלשיבוט
FastDigest XbaINEBFD0685לשיבוט
ImageJ 1.5.0/לניתוח בגווני אפור
מסנן גדולThermo FisherNESTלסינון
סריקת לייזר מיקרוסקופיה קונפוקליתLeica SP8ללוקליזציה תת-תאית
Ni sepharose excelCytiva10339806לטיהור חלבונים
חלבון Precast בתוספת ג'לYEASEN36246ES10עבור SDS-PAGE
מסנן קטןNalgene1660045לסינון
SuperSignal West Femto מצע ערכת ניסויThermo Fisher34076עבור ספיגה מערבית
Triton X-100SCR30188928כדי להגדיר את מאגר החילוץ
סוג משאבת ואקום סיבוביתZhejiang taizhouqiujing משאבתואקום חברה מוגבלת2XZ-2לחדירת ואקום
מערבל אנכיHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing חברה בע"מBE-1200לערבוב
ובטא;-מרקפטואתנולSIGMABCBK8223Vלהגדרת מאגר החילוץ
/

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
  2. PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).
  3. Ma, J. K. C., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).
  4. Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro. Front Plant Sci. 11, 589995(2020).
  5. Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).
  6. Ward, B. J., Séguin, A., Couillard, J., Trépanier, S., Landry, N. Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age. Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).
  7. Siriwattananon, K., et al. Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates. Front Plant Sci. 12, 682953(2021).
  8. Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. Plant-based vaccines: The way ahead. Viruses. 13 (1), 5(2020).
  9. Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. Engineering of plants for efficient production of therapeutics. Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).
  10. Webster, D. E., Thomas, M. C. Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond. Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).
  11. Streatfield, S. J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  12. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  13. Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. Means to optimize protein expression in transgenic plants. Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).
  14. Su, H., et al. Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals. Front Plant Sci. 14, 1170815(2023).
  15. Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins. Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).
  16. Kim, T., Gondré-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. Dense-core secretory granule biogenesis. Physiology. 21, 124-133 (2006).
  17. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  18. Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).
  19. Xi, J., et al. Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome. Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).
  20. Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
  21. Delaunois, B., et al. Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies. Front Plant Sci. 5, 249(2014).
  22. Andreasson, E., Abreha, K. B., Resjö, S. Isolation of apoplast. Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).
  23. Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).
  24. Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).
  25. Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro. Plants. 12 (23), 4048(2023).
  26. Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy. Sci Rep. 12 (1), 18363(2022).
  27. Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example. J Vis Exp. (94), e52113(2014).
  28. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  29. Menkhaus, T., et al. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  30. Streatfield, S. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  31. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).
  32. Zhao, J., et al. Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina. Front Plant Sci. 12, 771806(2021).
  33. Venkataraman, S., et al. Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines. Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).
  34. Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves. Plant Meth. 7, 48(2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Nicotiana benthamianaWestern Blot

מאמרים קשורים