פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפטוציטים ראשוניים הם כלי נפוץ למחקרים הקשורים לכבד חוץ גופי . עם זאת, תחזוקת תאים אלה תמיד הייתה אתגר בשל האובדן המהיר של מורפולוגיה, כדאיות ופונקציונליות בתרבית. גישה עדכנית לתרבות ארוכת טווח היא יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), כלי במבחנה שיכול לשחזר רקמות בצלוחית בהתבסס על היכולת המופלאה של הכבד לחדש את עצמו. פרוטוקולים שפורסמו תוכננו להשיג אורגנואידים תלת-ממדיים פונקציונליים ארוכי טווח מהפטוציטים בוגרים ראשוניים (Hep-Orgs). הכלי החדשני של אורגנואיד תלת-ממדי דורש את היכולת לבודד תאים מרקמה בוגרת, ושלב ראשוני זה חיוני לתוצאה סופית באיכות גבוהה. זילוח collagenase דו-שלבי, שהוצג בשנות השבעים, הוא עדיין הליך תקף להשגת hepatocytes יחיד. המאמר הנוכחי נועד לתאר את כל השלבים המכריעים של ההליך הכירורגי, ובכך לייעל את הליך בידוד הפטוציטים הראשוני במודל החולדות. יתר על כן, תשומת לב מיוחדת מוקדשת להנחיות PREPARE כדי להגדיל את הסבירות להליכים מוצלחים ולהבטיח תוצאות באיכות גבוהה. פרוטוקול מפורט מאפשר לחוקרים להאיץ ולייעל את העבודה במורד הזרם כדי לבסס אורגנואידים תלת-ממדיים מהפטוציטים הראשוניים של חולדות בוגרות. בהשוואה להפטוציטים דו-ממדיים, Hep-Orgs עדיין היו בני קיימא ובהתפשטות פעילה ביום ה-15, והפגינו פוטנציאל ארוך טווח.
מבוא
הפטוציטים ראשוניים הם כלי חשוב ונפוץ למחקרים הקשורים לכבד חוץ גופי . עם זאת, הרחבתם ותחזוקתם היו מאתגרים מבחינה היסטורית, מכיוון שהם מאבדים מורפולוגיה ופונקציונליות לאחר מספר ימים בתרבות1. תרבית דו-ממדית היא תנאי מגביל, בפרט, עבור הפטוציטים בעלי צורה מצולעת ומבנה מקוטב עם קרומים אפיים ובזולטרליים מובחנים. למעשה, הידבקות הפטוציטים לצלחת מפריעה לפעילות הרגילה שלהם מכיוון שהיא מובילה לשלד ציטוציטי שטוח עם אינטראקציה מוגבלת בין תאים ובין תאים ומטריקס חוץ-תאי (ECM), מה שמפחית את הקיטוב ואת מסלולי האיתות המעורבים2.
כדי לעקוף את המגבלות של שיטה זו, דאן ועמיתיו3 השתמשו תחילה בשכבה הכפולה של קולגן. שיטת תרבית זו, המכונה "שיטת תרבית הסנדוויץ'", מבוססת על זריעת הפטוציטים ראשוניים בין שתי שכבות המטריצה. לשיטה זו יתרונות רבים, כולל תרבית ארוכת טווח, שמירה על מורפולוגיה מצולעת ופעילויות שעתוק דומות לאלה של הפטוציטים4 שבודדו זה עתה. שיטה דומה, המבוססת על אותו עיקרון, שבה השכבה התחתונה מורכבת ממטריג'ל בעוד שכבת העל של קולגן, הוכיחה את נוכחותה של רשת תעלה מבוססת היטב5.
למרות האמינות של שיטת תרבית הסנדוויץ' לגידול הפטוציטים, העבודה הנוכחית מצפה להקים תרבית אורגנואידים תלת-ממדית, כלי במבחנה המשמש לשחזור רקמות בצלחת ויצירת גשר פוטנציאלי לקראת רפואה מותאמת אישית, המאפשר יצירת תובנות ביולוגיות ספציפיות למחלה, זיהוי מטרות מולקולריות, בדיקת תרופות, הקמת ביובנקים ופתיחת אופקים חדשים לטכנולוגיות חדשניות כמו איבר על שבב6. הפטוציטים הראשוניים הוטמעו בטיפות מטריצה חצי ספריות הידועות בשם "כיפות" כדי לאפשר צמיחה חזקה של אורגנואידים בתוך הכיפות ולהבטיח את זרימת הגורמים המסיסים, כולל גורם גדילה הפטוציטים (HGF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF), ממדיום התרבית. גורמי גדילה אלה מפעילים ישירות מסלולי איתות כדי להבטיח את הישרדותם של הפטוציטים7. אורגנואידים של הכבד מתקבלים בדרך כלל מתאי גזע/אב שבודדו משלבים עובריים או מחולדות בוגרות, עכברים, כבד אנושי (וגם כלבים וחתולים)8. גם אם הקונפורמציה התלת-ממדית משפרת את התמיינות תאי הגזע להפטוציטים בוגרים, כלי זה עדיין חסר את הבשלות של הרקמה הראשונית המקורית9. כדי להתגבר על בעיה זו, בשנת 2018, שתי קבוצות שונות 9,10 פרסמו בו זמנית פרוטוקול להשגת תרבית ארוכת טווח של אורגנואידי כבד תלת-ממדיים החל מהפטוציטים הראשוניים של עכברים בוגרים (המכונים Hep-Orgs). הפרוטוקולים שלהם משחזרים את תגובת הנזק השגשוגית של התחדשות הכבד, גידול הפטוציטים עם רמה גבוהה של ציטוקינים דלקתיים כפי שהיא מתרחשת לאחר כריתת כבד חלקית. ואכן, המחקרים הנ"ל מראים כי הפטוציטים יכולים לעבור למצב דוקטלי לאחר פציעה12 או כאשר התפשטות כולנגיוציטים מדוכאת13. היכולת הדו-פוטנטית שלהם מאפשרת גמישות תאית, החשובה למבנים מורכבים כגון אורגנואידים. לכן, פרוטוקולים אלה להתגבר על הבעיה של חוסר היכולת להרחיב hepatocytes ראשוני במבחנה.
הכלי החדשני של אורגנואיד תלת-ממדי דורש את היכולת לבודד תאים מרקמה בוגרת, ושלב ראשוני זה חיוני לתוצאה סופית באיכות גבוהה. בעוד שתכשיר אורגנואיד תלת-ממדי יכול להיחשב כטכניקה חדשה ומתפתחת (מכיוון שהגדרת האורגנואיד נטבעה על ידי לנקסטר14 והוך15 רק לפני עשר שנים), זילוח הקולגנאז הדו-שלבי הוא הליך ישן שהוצג על ידי סגלן בשנות השבעים16. אם נתמקד בפרסומים האחרונים בתחום, הפרוטוקולים של Ng17 ו-Shen18 יכולים להיחשב לתקן הזהב לביצוע ההליך בחולדות, בעוד שהפרוטוקולים של Cabral19 ו-Charni-Natan20 עבור עכברים. אין זה יוצא דופן שחוקרים מתמקדים בבחירת המטריצה החוץ-תאית (ECM) וגורמי הגדילה הטובים ביותר לפיתוח אורגנואידים תלת-ממדיים, אך נתקלים בכשלים כגון הליך כירורגי לא תקין, כדאיות ותשואה נמוכה של הפטוציטים, או רמות גבוהות של זיהום חיידקי. בעיות אלה מאריכות את הניסויים במורד הזרם ומגדילות את מספר בעלי החיים הדרושים לניסויים הבאים. לעומת זאת, אם הליכי הניתוח והבידוד מוגדרים היטב, המספר הגבוה של הפטוציטים קיימא המתקבלים מאפשר להכין מספר עצום של אורגנואידים, ובכך להגביל את השימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מטפל בעיקר בבעיות אלה באמצעות פתרונות מסחריים ועל ידי אופטימיזציה של קנולציה מדויקת של ורידים פורטליים המבטיחה שלבי זילוח ועיכול אופטימליים עם הכבד באתרו.
על מנת לשפר את האיכות, השחזור ויכולת התרגום של המחקר שלנו בבעלי חיים, שקלנו בקפידה את הנחיות PREPARE : תכנון הליכי מחקר וניסוי בבעלי חיים: המלצות למצוינות21. הנחיות דיווח אלה מנסות להגדיל את הסיכוי להצלחה באמצעות תכנון ומייצגות צעד חשוב ביישום 3Rs של ראסל וברץ' (החלפה, הפחתה ועידון). הנחיות PREPARE מכסות 15 נושאים עיקריים שיש להתייחס אליהם בהתאם לכל פרויקט מחקר בנפרד. נתאר את הנושאים בהם התמקדנו במהלך תכנון והכנת הפרויקט.
העבודה הנוכחית שואפת לתאר, בפרוטוקול מקצה, מפורט ותוצאתי, את השלבים המכריעים של הניתוח במודל החולדות כדי לאפשר לחוקרים להאיץ ולייעל את העבודה במורד הזרם. כאשר ניגשנו לפרוטוקולים אלה בהתחלה, חווינו בעיות של זיהום חיידקי, יעילות עיכול נמוכה בכבד, תפוקת כבד ראשונית נמוכה וכדאיות נמוכה של הפטוציטים שיכולים להשפיע בקלות על הצלחת הטכניקה. פרוטוקול זה, שהראה כיצד לטפל בתכונות קריטיות ולפתור אותן, ביצע אופטימיזציה של ההליך לבידוד ראשוני של הפטוציטים בחולדות. זילוח כבד החולדה ובידוד הפטוציטים הראשוני הראשוני של הפטוציטים הבוגרים לאחר מכן הם השלבים המקדימים העיקריים ליישומים שונים. בפרט, פרוטוקול זה מתאים לכל ההליכים הדורשים תשואה טובה של hepatocytes מבוגרים באיכות גבוהה קיימא גבוהה. תוצאות הפרוטוקול מתאימות לביסוס מודלים במבחנה לחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הכבד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים והמגורים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות החוק האיטלקי ודירקטיבת הקהילה האירופית. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (היתר מס' 321/2022-PR) בהתאם לסעיף 31 של צו 26/2014.
1. הכנה להליך בעלי החיים
הערה: עיין בטבלה 1 עבור הרכב המדיום והחיץ ובטבלת החומרים לקבלת פרטים מסחריים.
- חממו את אמבט המים בטמפרטורה של 42°C ולאחר מכן הניחו את חיץ הזילוח ואת 1x PBS באמבט המים למשך כ-20 דקות.
הערה: בשל רגישות לאנזים, מאגר העיכול מחומם רק כאשר הליך הזילוח החל בהצלחה. במהלך הליך הזילוח, לשמור על התמיסות באמבט המים. - הניחו את המדיום המלא של ויליאם ואת PBS + מכפיל רווח של 3% על הקרח.
- הכינו את המשאבה הפריסטלטית וחברו את הצינור לבקבוק הזכוכית ולמלכודת הבועות, שניהם מלאים בחיץ זילוח.
- בעת הפעלת המשאבה, מלאו את הצינורית בחיץ זילוח חם על מנת להוציא אוויר ולשטוף שאריות אתנול (מהירות משאבה נמוכה). שלב זה חשוב גם כדי לבדוק את פעולת המשאבה הנכונה ואת דליפת הצינור האפשרית.
2. הכנה לבידוד הפטוציטים
- במהלך ההליך בבעלי חיים, לחשוף את המכשירים הבאים לאור UV: צלחת פטרי 100 מ"מ, מסננת תאים 100 מיקרומטר, גודל מגרד M, פינצטה גדולה, לקרח, מגש לקרח.
3. הליך ראשוני בבעלי חיים והרדמה
- מרדימים את החולדה הבוגרת (250-350 גרם משקל גוף; בת 10-12 שבועות) על ידי הזרקה תוך צפקית של תערובת חומרי הרדמה (ריכוז סופי עבור xylazine: 22.5 מ"ג / ק"ג; עבור קטמין: 112.5 מ"ג / ק"ג; כ. נפח סופי: 0.8-1.0 מ"ל).
- עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן עד שהחולדה כבר לא מגיבה לגירויים מזיקים. זה בדרך כלל לוקח 5 דקות. מנת ההרדמה מבטיחה הרדמה כירורגית עמוקה הממזערת את הסיכון לסבל או מצוקה במהלך ההליך
הערה: המתת חסד היא השיטה המשנית להמתת חסד של חולדות המשמשת בניסוי זה, והיא מבטיחה כי בעל החיים עבר המתת חסד יעילה. - יש לגלח את הבטן ולנקות אותה עם 70% אתנול כדי להפחית זיהום חיידקי במהלך הניתוח.
הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי, ולכן אספסיס מלא אינו נשמר. - הניחו את החולדה במרכז מגש הדיסקציה ואבטחו את הגפיים באמצעות מחטים.
- בצעו חתך בצורת U דרך העור והשריר ממרכז הבטן התחתונה לכלוב הצלעות, הדקו את העור וקפלו אותו לראש, תוך חשיפת המעיים.
- בזהירות להעביר את המעי לצד שמאל של החיה, מתוך חלל הבטן, ולחשוף את וריד פורטל הכבד ואת vena cava.
- בעזרת צבת מעבירים חוט כותנה מתחת לווריד הפורטל ומכינים 2 קשרים, 1 ס"מ אחד מהשני, המקיפים את הווריד עצמו.
הערה: קל יותר להציג חוט שחור. - הזריקו 100-150 IU של הפרין מומס ב-1x PBS (נפח כולל 300 μL) לתוך הווריד הנבוב כדי למנוע קרישת דם.
4. קנולציה וזילוח כבד
- הפעל את המשאבה בקצב נמוך (זרימה של פחות מ-1 מ"ל/דקה).
- הכנס את האנגיוקאת 18 G לווריד הפורטל ברמת החוט בזווית שטוחה ביחס לווריד.
- הסר ידנית את המחט הפנימית כדי להשאיר את הצינורית בווריד. הדם יזרום בתוכו, ימלא את התקע וימנע בועות אוויר לכודות בשלב הבא.
- בזמן שחיץ הזילוח זורם בצינורית, חבר את הצינורית על ידי לחיצה על כפתור C לקצה השקע באמצעות מחבר Luer lock.
- בשלב זה, קשרו את הקשרים, אחד סביב הצנתר בתוך הווריד ואחד סביב הצנתר, לפני הכניסה לווריד כדי לייצב את הצינור במיקום הנכון.
- חותכים את הווריד קאווה כדי לתת לדם לצאת. ודא שהכבד מתחיל להתנפח ולהלבין במהירות (שניות) תוך 2-3 שניות. זה מאשר כי חיץ זילוח זורם כראוי דרך הכבד.
הערה: אם חלק מהאונות נשארות אדומות, האנגיוקטטר ממוקם עמוק מדי. אם יש רק כתמים אדומים, הקשה קלה על הכבד יכולה לעזור זילוח בנקודות ספציפיות. שפכו 1x PBS על הבטן הפתוחה כדי לעזור להזיז את הדם ולבדוק דליפות. - הגדילו באיטיות את זרימת המשאבה ל-10 מ"ל/דקה ושמרו עליה למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר ניקוי של הכבד מהדם.
- במהלך הזילוח, הפעילו לחץ על הווריד קאווה עם ניצן צמר גפן למשך 10 שניות: ודאו שהכבד מתנפח עם ההידוק ונרגע עם שחרורו. חזור על הלחץ מעת לעת (5-10 פעמים) ובדוק נפיחות בכבד והרפיה.
הערה: שלב זה משמש כנקודת ביקורת חיונית לאימות גלוי לעין של זילוח. זה היה חיוני כדי להבטיח חיוניות גבוהה hepatocyte ולמקסם את התשואה הסופית. על ידי אימות פעיל של תהליך זה, החיץ יכול להגיע ביעילות לכל חלקי כלי הדם בכבד, אשר ניקוי דם פסיבי לבדו לא ישיג.
5. עיכול הכבד
- לאחר הזילוח, עברו למאגר העיכול שחומם מראש מבלי להפריע לזרימה ולהימנע מבועות אוויר בצינורית.
הערה: הפחתה זמנית של הזרימה יכולה לסייע בביצוע קטע זה. מאגר העיכול כולל פנול אדום, המאפשר הדמיה של מעבר ממאגר הזילוח למאגר העיכול. - הגדל את מהירות המשאבה ל -20 מ"ל / דקה ולחץ מעת לעת עם המקלון לנפיחות בכבד והרפיה.
- לאחר שלב זה (שנמשך כ -15 דקות), ודא כי הכבד הופך להיות יותר ויותר עבש. בשלב זה, המחט ניתן להסיר, ואת המשאבה מפסיק.
- מכיוון שכמוסת הכבד שברירית לאחר העיכול, נתחו בעדינות ובזהירות את הכבד: תפסו את רקמת החיבור המרכזית בין האונות בעזרת מלקחיים. לחתוך את כל החיבורים לאיברים אחרים ולהרים את הכבד.
- שטפו את הכבד, טבלו אותו בתמיסת PBS + 3% P/S מקוררת מראש למשך מספר שניות. לאחר מכן, הניחו אותו בצינור המכיל את המדיום המלא של ויליאם המצונן מראש.
הערה: גירוש ומוות מבטיחים זילוח דרך הווריד הנבוב. האישור למותו של בעל החיים מגיע מדלקת ריאות הנגרמת ברגע שהכבד מושתל, הסרעפת מנותחת במלואה, ובבדיקה, הנשימה והדופק כבר אינם מתפקדים.
6. טיהור הפטוציטים
- מתחת למכסה המנוע הביולוגי, מעבירים את הכבד לצלחת פטרי 100 מ"מ עם 15 מ"ל של התווך הקר של ויליאם על מגש מלא קרח.
- לחץ על האיבר במרץ עם המגרד כדי לשחרר את התאים בתווך.
הערה: אם שלב העיכול מבוצע כראוי, שחרור התאים צריך להיות קל ולא דורש לחץ רב על הכבד. אין לחתוך את הכבד לחתיכות; השאר אותו שלם. שמירה על הכבד שקוע בתווך משפרת את שחרור התא. - אספו את התאים המכילים בינוני וסננו אותם עם מסנן 100 מיקרומטר תוך העברתם לצינור חרוטי סטרילי. הסינון מאפשר הסרת רקמות חיבור ושברי רקמות לא מעוכלות.
- שפכו כ-15 מ"ל של תווך קר על הכבד המרוסק בצלוחית הפטרי כדי לעזור לשחרר תאים נוספים. חזור על שלבים 6.2 ו- 6.3.
- חזור על נקודה 6.4 לפחות פעם אחת, עד שכל התאים משתחררים. במידת הצורך, חלקו את המדיום לצינורות חרוטיים יותר והשתמשו במסננים מרובים של 100 מיקרומטר.
הערה: לאחר שחרור הפטוציטים ולפני הסינון, המדיום אמור להיראות אטום בגלל נוכחות הפטוציטים. הכבד הנותר צריך להיראות סיבי וישליך. - צנטריפוגה המדיום המסונן המכיל תאי כבד ב 50 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C עם בלם במהירות נמוכה.
הערה: הפטוציטים צפופים יותר מתאי כבד אחרים. בשל כוח צנטריפוגה נמוך, רק hepatocytes יהיה בכדור, בעוד תאים אחרים יישארו supernatant. - יש להשליך את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הוסיפו בעדינות כ-40 מ"ל של התווך המלא של ויליאם קר כקרח בצינור והוסיפו פיפטה איטית למעלה ולמטה 2 עד 3 פעמים כדי להשהות מחדש את כדורית התא.
הערה: יש להשהות מחדש את כדורית התא בזהירות כדי למנוע נזק לתאים. - צנטריפוגה ב 50 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
הערה: עבור הניסיונות הראשונים, ספור את התאים הקיימים עם בדיקת טריפאן כחול ביחס 1:10 לאחר הצנטריפוגה השנייה לפני שתמשיך לשלבים הבאים. זה יכול למנוע בזבוז מדיה וזמן אם כל התאים מתים. - השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-25 מ"ל של התווך המלא של ויליאם הקר כקרח.
- הוסף 25 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות 90% לתוך הצינור וערבב בעדינות.
הערה: תמיסת שיפוע צפיפות מפרידה הפטוציטים ברי קיימא מהפטוציטים מתים ומפסולת תאים בהתבסס על צפיפותם. - צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. יש להשיג גלולה גלויה בתחתית הצינור, המתאימה להפטוציטים קיימא, ושכבה ברורה בחלק העליון של השיפוע המורכב מהפטוציטים מתים.
הערה: אם אין גלולה כלל, נסה לערבב את התמיסה שוב על ידי ערבול וחזור על הצנטריפוגה. - שואפים את שכבת התא המת מראש השיפוע ומשאירים 1-2 מ"ל של המדיום עם הכדורית.
- להשהות את הגלולה ב 30-40 מ"ל של המדיום המלא של ויליאם.
הערה: עבור ההליך כולו, השתמש רק 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות. פיפטות קטנות יותר עשויות להפחית את יכולת הקיום של הפטוציטים. כל השלבים צריכים להתבצע על קרח כדי לשמור על +4 מעלות צלזיוס. - צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ואז לשאוף את supernatant.
7. תרבית הפטוציטים ואיסוף RNA
- הוסף כמות מתאימה של מדיום לספירת תאים. ספור את יכולת הקיום של התא עם 1:10 Trypan כחול.
- תרבית הפטוציטים דו-ממדית
- תאי צלחת בריכוז של 500,000 תאים/באר של צלחת 6 בארות על צלחת תאים מצופה קולגן עם התווך המלא של ויליאם שחומם מראש.
- מקם את תרבית התאים באינקובטור לח עם 95% אוויר, 5% CO2 ב 37 ° C.
- לאחר 4 שעות, שנו את התווך לתווך המלא החדש של ויליאם שחומם מראש.
- שמור תאים באינקובטור. שנה את המדיום מדי יום.
- לאסוף hepatocytes ראשוני מגיב עבור מיצוי RNA לפני ציפוי (יום 0) ובימים 1 עד 3 של תרבית.
- לחלץ RNA על פי פרוטוקול היצרן ולתעתק אותו לאחור ל- cDNA להערכת גנים של סמן כבד על ידי RT-qPCR. רשימת הפריימר מוצגת בטבלה 2.
- לתרבית הפטוציטים תלת-ממדית לטווח ארוך:
- להשהות מחדש את התאים במטריצה טהורה קרה בריכוז של 1,000-10,000 תאים ב 20 μL.
הערה: נסה להימנע מיצירת בועות מטריצה . - בעזרת קצות פיפטה מקוררים מראש, מחברים טיפות תאים המכילות מטריצת צלחת לצלחת תרבית תאים שחוממה מראש.
- הופכים את הצלחת ומשאירים אותה באינקובטור תרבית התאים למשך 20-30 דקות.
- הפוך אותו והוסף את מדיום הפטוציטים לטווח ארוך המחומם מראש ומדיום תרבית ספציפי על פי עבודתו של פנג22. שמור תאים באינקובטור.
- שנה את מדיום הפטוציטים לטווח ארוך 3D כל 2-3 ימים.
- לפחות לאחר 14 ימים של תרבות, Hep-Orgsare מופרדים מהמטריצה ו-Hep-Orgs בני קיימא מוערכים על ידי בדיקת התפשטות Trypan blue ו-EdU ועוברים בהתאם לעבודתו של פנג.
- להשהות מחדש את התאים במטריצה טהורה קרה בריכוז של 1,000-10,000 תאים ב 20 μL.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בסוף הליכי ההקמה (שלב 6.13), קיבלנו תפוקת תאים של עד 1 x 108 תאים לכל בידוד מהכבד של כ -300 גרם של חולדה. יכולת הקיום של תאים בין 78% ל-97% נקבעה על ידי ספירה כחולה של טריפאן.
כפי שכבר תואר במחקרים קודמים 1,18,19, הפטוציטים הראשוניים בתרבית מאבדים את המורפולוגיה שלהם, תפקודים ספציפיים לכבד, ומתים תוך מספר ימים.
ידוע בספרות23,24<...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אורגנואידים תלת-ממדיים הם חזית לרפואה מותאמת אישית ומאפשרים תרבית הפטוציטים לטווח ארוך. האיכות של טכניקה חדשנית זו דורשת תשואה טובה של hepatocytes ראשוני קיימא זילוח כבד מבוצע היטב בידוד hepatocytes. הליך ישן זה עדיין נמצא בשימוש נרחב; עם זאת, הוא כולל שלבים שונים שיכולים להיות מאתגרים. כשהתקרבנו להליך, חווינו בעיות קריטיות כגון זיהום חיידקי, יעילות עיכול נמוכה בכבד, תפוקת כבד ראשונית נמוכה וכדאיות נמוכה של הפטוציטים, כל אלה יכולים להשפיע בקלות על הצלחת הטכניקה. החל מפרוטוקולי תקן הזהב
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים חשפו כל ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו מודים לד"ר דווידה סלווסטרל ולפרופ' ג'ובאני סורנטינו מ-SorrentinoLab באוניברסיטת טריאסטה על שעזרו לנו לבצע את בדיקת התפשטות EdU. העבודה נתמכה על ידי מענק אד-הוק של Banca d'Italia ומענקי FIF פנימיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| A83-01- מעכב ALK5 IV | סליל תאומים | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect מערכת זיהוי PCR בזמן אמת | Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 ערכת הדמיה | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| קולגן, סוג I, תמיסה מזנב עכברוש | Merck | C3867-1VL | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| הפרין נתרן 25000 יחב"ל/5 מ"ל | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| תמיסת אינסולין-טרנספרין-סלניום 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| תמיסת L-גלוטמין | Euroclone | ECB3000D | |
| Liver Digest Medium | תרמופישר סיינטיפיק | 17703-034 | |
| Liver Perfusion Medium | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| תוסף N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A9165 | |
| Nicotinamide | Merck | N-0636 | |
| חומצות אמינו לא חיוניות | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| PBS buffer 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| משאבה פריסטלטית | איסמטק וסחר; | MS-4/12 משאבה דיגיטלית Reglo TNFa | |
| Peprotech | 300-01A | ||
| TRI ריאגנט | Merck | T9424 | |
| צינורות | איסמטק וסחר; | ID.2,79 מ"מ | |
| וויליאמס E בינוני, ללא גלוטמין | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
מקורות
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
- Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
- Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
- Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
- Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
- Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
- Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
- Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
- Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
- Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
- Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
- Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
- Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
