פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.
מאמר שיטה
זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפטוציטים ראשוניים הם כלי נפוץ למחקרים הקשורים לכבד חוץ גופי . עם זאת, תחזוקת תאים אלה תמיד הייתה אתגר בשל האובדן המהיר של מורפולוגיה, כדאיות ופונקציונליות בתרבית. גישה עדכנית לתרבות ארוכת טווח היא יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), כלי במבחנה שיכול לשחזר רקמות בצלוחית בהתבסס על היכולת המופלאה של הכבד לחדש את עצמו. פרוטוקולים שפורסמו תוכננו להשיג אורגנואידים תלת-ממדיים פונקציונליים ארוכי טווח מהפטוציטים בוגרים ראשוניים (Hep-Orgs). הכלי החדשני של אורגנואיד תלת-ממדי דורש את היכולת לבודד תאים מרקמה בוגרת, ושלב ראשוני זה חיוני לתוצאה סופית באיכות גבוהה. זילוח collagenase דו-שלבי, שהוצג בשנות השבעים, הוא עדיין הליך תקף להשגת hepatocytes יחיד. המאמר הנוכחי נועד לתאר את כל השלבים המכריעים של ההליך הכירורגי, ובכך לייעל את הליך בידוד הפטוציטים הראשוני במודל החולדות. יתר על כן, תשומת לב מיוחדת מוקדשת להנחיות PREPARE כדי להגדיל את הסבירות להליכים מוצלחים ולהבטיח תוצאות באיכות גבוהה. פרוטוקול מפורט מאפשר לחוקרים להאיץ ולייעל את העבודה במורד הזרם כדי לבסס אורגנואידים תלת-ממדיים מהפטוציטים הראשוניים של חולדות בוגרות. בהשוואה להפטוציטים דו-ממדיים, Hep-Orgs עדיין היו בני קיימא ובהתפשטות פעילה ביום ה-15, והפגינו פוטנציאל ארוך טווח.
מבוא
הפטוציטים ראשוניים הם כלי חשוב ונפוץ למחקרים הקשורים לכבד חוץ גופי . עם זאת, הרחבתם ותחזוקתם היו מאתגרים מבחינה היסטורית, מכיוון שהם מאבדים מורפולוגיה ופונקציונליות לאחר מספר ימים בתרבות1. תרבית דו-ממדית היא תנאי מגביל, בפרט, עבור הפטוציטים בעלי צורה מצולעת ומבנה מקוטב עם קרומים אפיים ובזולטרליים מובחנים. למעשה, הידבקות הפטוציטים לצלחת מפריעה לפעילות הרגילה שלהם מכיוון שהיא מובילה לשלד ציטוציטי שטוח עם אינטראקציה מוגבלת בין תאים ובין תאים ומטריקס חוץ-תאי (ECM), מה שמפחית את הקיטוב ואת מסלולי האיתות המעורבים2.
כדי לעקוף את המגבלות של שיטה זו, דאן ועמיתיו3 השתמשו תחילה בשכבה הכפולה של קולגן. שיטת תרבית זו, המכונה "שיטת תרבית הסנדוויץ'", מבוססת על זריעת הפטוציטים ראשוניים בין שתי שכבות המטריצה. לשיטה זו יתרונות רבים, כולל תרבית ארוכת טווח, שמירה על מורפולוגיה מצולעת ופעילויות שעתוק דומות לאלה של הפטוציטים4 שבודדו זה עתה. שיטה דומה, המבוססת על אותו עיקרון, שבה השכבה התחתונה מורכבת ממטריג'ל בעוד שכבת העל של קולגן, הוכיחה את נוכחותה של רשת תעלה מבוססת היטב5.
למרות האמינות של שיטת תרבית הסנדוויץ' לגידול הפטוציטים, העבודה הנוכחית מצפה להקים תרבית אורגנואידים תלת-ממדית, כלי במבחנה המשמש לשחזור רקמות בצלחת ויצירת גשר פוטנציאלי לקראת רפואה מותאמת אישית, המאפשר יצירת תובנות ביולוגיות ספציפיות למחלה, זיהוי מטרות מולקולריות, בדיקת תרופות, הקמת ביובנקים ופתיחת אופקים חדשים לטכנולוגיות חדשניות כמו איבר על שבב6. הפטוציטים הראשוניים הוטמעו בטיפות מטריצה חצי ספריות הידועות בשם "כיפות" כדי לאפשר צמיחה חזקה של אורגנואידים בתוך הכיפות ולהבטיח את זרימת הגורמים המסיסים, כולל גורם גדילה הפטוציטים (HGF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF), ממדיום התרבית. גורמי גדילה אלה מפעילים ישירות מסלולי איתות כדי להבטיח את הישרדותם של הפטוציטים7. אורגנואידים של הכבד מתקבלים בדרך כלל מתאי גזע/אב שבודדו משלבים עובריים או מחולדות בוגרות, עכברים, כבד אנושי (וגם כלבים וחתולים)8. גם אם הקונפורמציה התלת-ממדית משפרת את התמיינות תאי הגזע להפטוציטים בוגרים, כלי זה עדיין חסר את הבשלות של הרקמה הראשונית המקורית9. כדי להתגבר על בעיה זו, בשנת 2018, שתי קבוצות שונות 9,10 פרסמו בו זמנית פרוטוקול להשגת תרבית ארוכת טווח של אורגנואידי כבד תלת-ממדיים החל מהפטוציטים הראשוניים של עכברים בוגרים (המכונים Hep-Orgs). הפרוטוקולים שלהם משחזרים את תגובת הנזק השגשוגית של התחדשות הכבד, גידול הפטוציטים עם רמה גבוהה של ציטוקינים דלקתיים כפי שהיא מתרחשת לאחר כריתת כבד חלקית. ואכן, המחקרים הנ"ל מראים כי הפטוציטים יכולים לעבור למצב דוקטלי לאחר פציעה12 או כאשר התפשטות כולנגיוציטים מדוכאת13. היכולת הדו-פוטנטית שלהם מאפשרת גמישות תאית, החשובה למבנים מורכבים כגון אורגנואידים. לכן, פרוטוקולים אלה להתגבר על הבעיה של חוסר היכולת להרחיב hepatocytes ראשוני במבחנה.
הכלי החדשני של אורגנואיד תלת-ממדי דורש את היכולת לבודד תאים מרקמה בוגרת, ושלב ראשוני זה חיוני לתוצאה סופית באיכות גבוהה. בעוד שתכשיר אורגנואיד תלת-ממדי יכול להיחשב כטכניקה חדשה ומתפתחת (מכיוון שהגדרת האורגנואיד נטבעה על ידי לנקסטר14 והוך15 רק לפני עשר שנים), זילוח הקולגנאז הדו-שלבי הוא הליך ישן שהוצג על ידי סגלן בשנות השבעים16. אם נתמקד בפרסומים האחרונים בתחום, הפרוטוקולים של Ng17 ו-Shen18 יכולים להיחשב לתקן הזהב לביצוע ההליך בחולדות, בעוד שהפרוטוקולים של Cabral19 ו-Charni-Natan20 עבור עכברים. אין זה יוצא דופן שחוקרים מתמקדים בבחירת המטריצה החוץ-תאית (ECM) וגורמי הגדילה הטובים ביותר לפיתוח אורגנואידים תלת-ממדיים, אך נתקלים בכשלים כגון הליך כירורגי לא תקין, כדאיות ותשואה נמוכה של הפטוציטים, או רמות גבוהות של זיהום חיידקי. בעיות אלה מאריכות את הניסויים במורד הזרם ומגדילות את מספר בעלי החיים הדרושים לניסויים הבאים. לעומת זאת, אם הליכי הניתוח והבידוד מוגדרים היטב, המספר הגבוה של הפטוציטים קיימא המתקבלים מאפשר להכין מספר עצום של אורגנואידים, ובכך להגביל את השימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מטפל בעיקר בבעיות אלה באמצעות פתרונות מסחריים ועל ידי אופטימיזציה של קנולציה מדויקת של ורידים פורטליים המבטיחה שלבי זילוח ועיכול אופטימליים עם הכבד באתרו.
על מנת לשפר את האיכות, השחזור ויכולת התרגום של המחקר שלנו בבעלי חיים, שקלנו בקפידה את הנחיות PREPARE : תכנון הליכי מחקר וניסוי בבעלי חיים: המלצות למצוינות21. הנחיות דיווח אלה מנסות להגדיל את הסיכוי להצלחה באמצעות תכנון ומייצגות צעד חשוב ביישום 3Rs של ראסל וברץ' (החלפה, הפחתה ועידון). הנחיות PREPARE מכסות 15 נושאים עיקריים שיש להתייחס אליהם בהתאם לכל פרויקט מחקר בנפרד. נתאר את הנושאים בהם התמקדנו במהלך תכנון והכנת הפרויקט.
העבודה הנוכחית שואפת לתאר, בפרוטוקול מקצה, מפורט ותוצאתי, את השלבים המכריעים של הניתוח במודל החולדות כדי לאפשר לחוקרים להאיץ ולייעל את העבודה במורד הזרם. כאשר ניגשנו לפרוטוקולים אלה בהתחלה, חווינו בעיות של זיהום חיידקי, יעילות עיכול נמוכה בכבד, תפוקת כבד ראשונית נמוכה וכדאיות נמוכה של הפטוציטים שיכולים להשפיע בקלות על הצלחת הטכניקה. פרוטוקול זה, שהראה כיצד לטפל בתכונות קריטיות ולפתור אותן, ביצע אופטימיזציה של ההליך לבידוד ראשוני של הפטוציטים בחולדות. זילוח כבד החולדה ובידוד הפטוציטים הראשוני הראשוני של הפטוציטים הבוגרים לאחר מכן הם השלבים המקדימים העיקריים ליישומים שונים. בפרט, פרוטוקול זה מתאים לכל ההליכים הדורשים תשואה טובה של hepatocytes מבוגרים באיכות גבוהה קיימא גבוהה. תוצאות הפרוטוקול מתאימות לביסוס מודלים במבחנה לחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הכבד.
פרוטוקול
כל ההליכים והמגורים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות החוק האיטלקי ודירקטיבת הקהילה האירופית. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (היתר מס' 321/2022-PR) בהתאם לסעיף 31 של צו 26/2014.
1. הכנה להליך בעלי החיים
הערה: עיין בטבלה 1 עבור הרכב המדיום והחיץ ובטבלת החומרים לקבלת פרטים מסחריים.
- חממו את אמבט המים בטמפרטורה של 42°C ולאחר מכן הניחו את חיץ הזילוח ואת 1x PBS באמבט המים למשך כ-20 דקות.
הערה: בשל רגישות לאנזים, מאגר העיכול מחומם רק כאשר הליך הזילוח החל בהצלחה. במהלך הליך הזילוח, לשמור על התמיסות באמבט המים. - הניחו את המדיום המלא של ויליאם ואת PBS + מכפיל רווח של 3% על הקרח.
- הכינו את המשאבה הפריסטלטית וחברו את הצינור לבקבוק הזכוכית ולמלכודת הבועות, שניהם מלאים בחיץ זילוח.
- בעת הפעלת המשאבה, מלאו את הצינורית בחיץ זילוח חם על מנת להוציא אוויר ולשטוף שאריות אתנול (מהירות משאבה נמוכה). שלב זה חשוב גם כדי לבדוק את פעולת המשאבה הנכונה ואת דליפת הצינור האפשרית.
2. הכנה לבידוד הפטוציטים
- במהלך ההליך בבעלי חיים, לחשוף את המכשירים הבאים לאור UV: צלחת פטרי 100 מ"מ, מסננת תאים 100 מיקרומטר, גודל מגרד M, פינצטה גדולה, לקרח, מגש לקרח.
3. הליך ראשוני בבעלי חיים והרדמה
- מרדימים את החולדה הבוגרת (250-350 גרם משקל גוף; בת 10-12 שבועות) על ידי הזרקה תוך צפקית של תערובת חומרי הרדמה (ריכוז סופי עבור xylazine: 22.5 מ"ג / ק"ג; עבור קטמין: 112.5 מ"ג / ק"ג; כ. נפח סופי: 0.8-1.0 מ"ל).
- עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן עד שהחולדה כבר לא מגיבה לגירויים מזיקים. זה בדרך כלל לוקח 5 דקות. מנת ההרדמה מבטיחה הרדמה כירורגית עמוקה הממזערת את הסיכון לסבל או מצוקה במהלך ההליך
הערה: המתת חסד היא השיטה המשנית להמתת חסד של חולדות המשמשת בניסוי זה, והיא מבטיחה כי בעל החיים עבר המתת חסד יעילה. - יש לגלח את הבטן ולנקות אותה עם 70% אתנול כדי להפחית זיהום חיידקי במהלך הניתוח.
הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי, ולכן אספסיס מלא אינו נשמר. - הניחו את החולדה במרכז מגש הדיסקציה ואבטחו את הגפיים באמצעות מחטים.
- בצעו חתך בצורת U דרך העור והשריר ממרכז הבטן התחתונה לכלוב הצלעות, הדקו את העור וקפלו אותו לראש, תוך חשיפת המעיים.
- בזהירות להעביר את המעי לצד שמאל של החיה, מתוך חלל הבטן, ולחשוף את וריד פורטל הכבד ואת vena cava.
- בעזרת צבת מעבירים חוט כותנה מתחת לווריד הפורטל ומכינים 2 קשרים, 1 ס"מ אחד מהשני, המקיפים את הווריד עצמו.
הערה: קל יותר להציג חוט שחור. - הזריקו 100-150 IU של הפרין מומס ב-1x PBS (נפח כולל 300 μL) לתוך הווריד הנבוב כדי למנוע קרישת דם.
4. קנולציה וזילוח כבד
- הפעל את המשאבה בקצב נמוך (זרימה של פחות מ-1 מ"ל/דקה).
- הכנס את האנגיוקאת 18 G לווריד הפורטל ברמת החוט בזווית שטוחה ביחס לווריד.
- הסר ידנית את המחט הפנימית כדי להשאיר את הצינורית בווריד. הדם יזרום בתוכו, ימלא את התקע וימנע בועות אוויר לכודות בשלב הבא.
- בזמן שחיץ הזילוח זורם בצינורית, חבר את הצינורית על ידי לחיצה על כפתור C לקצה השקע באמצעות מחבר Luer lock.
- בשלב זה, קשרו את הקשרים, אחד סביב הצנתר בתוך הווריד ואחד סביב הצנתר, לפני הכניסה לווריד כדי לייצב את הצינור במיקום הנכון.
- חותכים את הווריד קאווה כדי לתת לדם לצאת. ודא שהכבד מתחיל להתנפח ולהלבין במהירות (שניות) תוך 2-3 שניות. זה מאשר כי חיץ זילוח זורם כראוי דרך הכבד.
הערה: אם חלק מהאונות נשארות אדומות, האנגיוקטטר ממוקם עמוק מדי. אם יש רק כתמים אדומים, הקשה קלה על הכבד יכולה לעזור זילוח בנקודות ספציפיות. שפכו 1x PBS על הבטן הפתוחה כדי לעזור להזיז את הדם ולבדוק דליפות. - הגדילו באיטיות את זרימת המשאבה ל-10 מ"ל/דקה ושמרו עליה למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר ניקוי של הכבד מהדם.
- במהלך הזילוח, הפעילו לחץ על הווריד קאווה עם ניצן צמר גפן למשך 10 שניות: ודאו שהכבד מתנפח עם ההידוק ונרגע עם שחרורו. חזור על הלחץ מעת לעת (5-10 פעמים) ובדוק נפיחות בכבד והרפיה.
הערה: שלב זה משמש כנקודת ביקורת חיונית לאימות גלוי לעין של זילוח. זה היה חיוני כדי להבטיח חיוניות גבוהה hepatocyte ולמקסם את התשואה הסופית. על ידי אימות פעיל של תהליך זה, החיץ יכול להגיע ביעילות לכל חלקי כלי הדם בכבד, אשר ניקוי דם פסיבי לבדו לא ישיג.
5. עיכול הכבד
- לאחר הזילוח, עברו למאגר העיכול שחומם מראש מבלי להפריע לזרימה ולהימנע מבועות אוויר בצינורית.
הערה: הפחתה זמנית של הזרימה יכולה לסייע בביצוע קטע זה. מאגר העיכול כולל פנול אדום, המאפשר הדמיה של מעבר ממאגר הזילוח למאגר העיכול. - הגדל את מהירות המשאבה ל -20 מ"ל / דקה ולחץ מעת לעת עם המקלון לנפיחות בכבד והרפיה.
- לאחר שלב זה (שנמשך כ -15 דקות), ודא כי הכבד הופך להיות יותר ויותר עבש. בשלב זה, המחט ניתן להסיר, ואת המשאבה מפסיק.
- מכיוון שכמוסת הכבד שברירית לאחר העיכול, נתחו בעדינות ובזהירות את הכבד: תפסו את רקמת החיבור המרכזית בין האונות בעזרת מלקחיים. לחתוך את כל החיבורים לאיברים אחרים ולהרים את הכבד.
- שטפו את הכבד, טבלו אותו בתמיסת PBS + 3% P/S מקוררת מראש למשך מספר שניות. לאחר מכן, הניחו אותו בצינור המכיל את המדיום המלא של ויליאם המצונן מראש.
הערה: גירוש ומוות מבטיחים זילוח דרך הווריד הנבוב. האישור למותו של בעל החיים מגיע מדלקת ריאות הנגרמת ברגע שהכבד מושתל, הסרעפת מנותחת במלואה, ובבדיקה, הנשימה והדופק כבר אינם מתפקדים.
6. טיהור הפטוציטים
- מתחת למכסה המנוע הביולוגי, מעבירים את הכבד לצלחת פטרי 100 מ"מ עם 15 מ"ל של התווך הקר של ויליאם על מגש מלא קרח.
- לחץ על האיבר במרץ עם המגרד כדי לשחרר את התאים בתווך.
הערה: אם שלב העיכול מבוצע כראוי, שחרור התאים צריך להיות קל ולא דורש לחץ רב על הכבד. אין לחתוך את הכבד לחתיכות; השאר אותו שלם. שמירה על הכבד שקוע בתווך משפרת את שחרור התא. - אספו את התאים המכילים בינוני וסננו אותם עם מסנן 100 מיקרומטר תוך העברתם לצינור חרוטי סטרילי. הסינון מאפשר הסרת רקמות חיבור ושברי רקמות לא מעוכלות.
- שפכו כ-15 מ"ל של תווך קר על הכבד המרוסק בצלוחית הפטרי כדי לעזור לשחרר תאים נוספים. חזור על שלבים 6.2 ו- 6.3.
- חזור על נקודה 6.4 לפחות פעם אחת, עד שכל התאים משתחררים. במידת הצורך, חלקו את המדיום לצינורות חרוטיים יותר והשתמשו במסננים מרובים של 100 מיקרומטר.
הערה: לאחר שחרור הפטוציטים ולפני הסינון, המדיום אמור להיראות אטום בגלל נוכחות הפטוציטים. הכבד הנותר צריך להיראות סיבי וישליך. - צנטריפוגה המדיום המסונן המכיל תאי כבד ב 50 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C עם בלם במהירות נמוכה.
הערה: הפטוציטים צפופים יותר מתאי כבד אחרים. בשל כוח צנטריפוגה נמוך, רק hepatocytes יהיה בכדור, בעוד תאים אחרים יישארו supernatant. - יש להשליך את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הוסיפו בעדינות כ-40 מ"ל של התווך המלא של ויליאם קר כקרח בצינור והוסיפו פיפטה איטית למעלה ולמטה 2 עד 3 פעמים כדי להשהות מחדש את כדורית התא.
הערה: יש להשהות מחדש את כדורית התא בזהירות כדי למנוע נזק לתאים. - צנטריפוגה ב 50 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
הערה: עבור הניסיונות הראשונים, ספור את התאים הקיימים עם בדיקת טריפאן כחול ביחס 1:10 לאחר הצנטריפוגה השנייה לפני שתמשיך לשלבים הבאים. זה יכול למנוע בזבוז מדיה וזמן אם כל התאים מתים. - השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-25 מ"ל של התווך המלא של ויליאם הקר כקרח.
- הוסף 25 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות 90% לתוך הצינור וערבב בעדינות.
הערה: תמיסת שיפוע צפיפות מפרידה הפטוציטים ברי קיימא מהפטוציטים מתים ומפסולת תאים בהתבסס על צפיפותם. - צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. יש להשיג גלולה גלויה בתחתית הצינור, המתאימה להפטוציטים קיימא, ושכבה ברורה בחלק העליון של השיפוע המורכב מהפטוציטים מתים.
הערה: אם אין גלולה כלל, נסה לערבב את התמיסה שוב על ידי ערבול וחזור על הצנטריפוגה. - שואפים את שכבת התא המת מראש השיפוע ומשאירים 1-2 מ"ל של המדיום עם הכדורית.
- להשהות את הגלולה ב 30-40 מ"ל של המדיום המלא של ויליאם.
הערה: עבור ההליך כולו, השתמש רק 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות. פיפטות קטנות יותר עשויות להפחית את יכולת הקיום של הפטוציטים. כל השלבים צריכים להתבצע על קרח כדי לשמור על +4 מעלות צלזיוס. - צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ואז לשאוף את supernatant.
7. תרבית הפטוציטים ואיסוף RNA
- הוסף כמות מתאימה של מדיום לספירת תאים. ספור את יכולת הקיום של התא עם 1:10 Trypan כחול.
- תרבית הפטוציטים דו-ממדית
- תאי צלחת בריכוז של 500,000 תאים/באר של צלחת 6 בארות על צלחת תאים מצופה קולגן עם התווך המלא של ויליאם שחומם מראש.
- מקם את תרבית התאים באינקובטור לח עם 95% אוויר, 5% CO2 ב 37 ° C.
- לאחר 4 שעות, שנו את התווך לתווך המלא החדש של ויליאם שחומם מראש.
- שמור תאים באינקובטור. שנה את המדיום מדי יום.
- לאסוף hepatocytes ראשוני מגיב עבור מיצוי RNA לפני ציפוי (יום 0) ובימים 1 עד 3 של תרבית.
- לחלץ RNA על פי פרוטוקול היצרן ולתעתק אותו לאחור ל- cDNA להערכת גנים של סמן כבד על ידי RT-qPCR. רשימת הפריימר מוצגת בטבלה 2.
- לתרבית הפטוציטים תלת-ממדית לטווח ארוך:
- להשהות מחדש את התאים במטריצה טהורה קרה בריכוז של 1,000-10,000 תאים ב 20 μL.
הערה: נסה להימנע מיצירת בועות מטריצה . - בעזרת קצות פיפטה מקוררים מראש, מחברים טיפות תאים המכילות מטריצת צלחת לצלחת תרבית תאים שחוממה מראש.
- הופכים את הצלחת ומשאירים אותה באינקובטור תרבית התאים למשך 20-30 דקות.
- הפוך אותו והוסף את מדיום הפטוציטים לטווח ארוך המחומם מראש ומדיום תרבית ספציפי על פי עבודתו של פנג22. שמור תאים באינקובטור.
- שנה את מדיום הפטוציטים לטווח ארוך 3D כל 2-3 ימים.
- לפחות לאחר 14 ימים של תרבות, Hep-Orgsare מופרדים מהמטריצה ו-Hep-Orgs בני קיימא מוערכים על ידי בדיקת התפשטות Trypan blue ו-EdU ועוברים בהתאם לעבודתו של פנג.
- להשהות מחדש את התאים במטריצה טהורה קרה בריכוז של 1,000-10,000 תאים ב 20 μL.
תוצאות
בסוף הליכי ההקמה (שלב 6.13), קיבלנו תפוקת תאים של עד 1 x 108 תאים לכל בידוד מהכבד של כ -300 גרם של חולדה. יכולת הקיום של תאים בין 78% ל-97% נקבעה על ידי ספירה כחולה של טריפאן.
כפי שכבר תואר במחקרים קודמים 1,18,19, הפטוציטים הראשוניים בתרבית מאבדים את המורפולוגיה שלהם, תפקודים ספציפיים לכבד, ומתים תוך מספר ימים.
ידוע בספרות23,24 כי הפטוציטים בוגרים ראשוניים מאבדים במהירות את המורפולוגיה הקובואידית-משושה, הופכים לצורה "דמוית פיברובלסט" תוך מספר ימים, ומתים. איור 1 מתאר את השלבים השונים: 4 שעות לאחר ציפוי על צלחת מצופה קולגן, הפטוציטים נצמדים לפני השטח ומתפשטים בשכבה אחת טיפוסית שמראה מורפולוגיה קובואידית, קצוות התאים מוגדרים, הצמתים בין התאים ליניאריים ופני השטח של התאים נראים חלקים (איור 1A). ביום 1, הפטוציטים הראשוניים מקבלים את צורתם המשושה הטיפוסית, וטיפות שומנים נעשות גלויות (איור 1B). בימים 2-3 טיפות השומנים גדלות (איור 1C-1D), ואילו בימים 4-5 התאים צוברים סיבי עקה של אקטין (איור 1E-F). הערכנו גם את אחוז התאים בני קיימא בתרבית דו-ממדית ראשונית מיום 1 עד יום 5 והשווינו אותו לכדאיות לפני הציפוי ביום 0 (איור 2). ניתן לראות ירידה דרסטית בכדאיות כבר בימים הראשונים של התרבות, ולהגיע ל-49.5% (SD 12.7) ביום הראשון, אשר יורד ל-45.2% (SD 18.2) ביום השני ול-33.5% (SD 0.77) ביום השלישי. אחוז התאים הקיימים ביום 4 הוא כבר 16.9% (SD 5.4), ואילו ביום 5 מגיע ל-9.1% (SD 0.38). לכן, ברור כי אובדן המורפולוגיה מלווה מוות תאי מתקדם מהיר של הפטוציטים בוגרים בתרבית דו-ממדית.
הפטוציטים מבודדים, לפני ציפוי (יום 0), הראו ביטוי mRNA גבוה של גנים של סמן כבד (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) שהוערכו על-ידי RT-qPCR (איור 3). כל הגנים שנותחו מראים ירידה תלוית זמן בתרבית של ביטוי כבר ביום הראשון בתרבית. רמות ביטוי ה-mRNA מדגישות את אובדן התפקוד והכדאיות של הפטוציטים הראשוניים במהלך הזמן.
הפטוציטים המבודדים צופו בטיפות מטריצה תלת-ממדיות ומבני תאים אורגנואידים תלת-ממדיים עקבו אחריהם לאורך זמן. ביום הראשון של התרבית, הפטוציטים בודדים מרחפים בטיפות המטריקס (איור 4A). ריכוז התאים נשמר נמוך בכוונה כדי לספק hepatocytes עם מספיק מקום לגדול. כמו כן, זה מאפשר לנו לעקוב חזותית אחר הצמיחה אורגנואידים. הפטוציטים ראשוניים הראו חלוקה תאית בימים הראשונים של התרבית (איור 4C). יתר על כן, בעוד שביום 0, Hep-Orgs נמדדו 30 מיקרומטר, ביום 2 Hep-Orgs כמעט הכפילו את ממדיהם, מה שהדגיש את צמיחת הגודל שנשמרה עד יום 15 (33.08 מיקרומטר ביום 1; 64.86 מיקרומטר ביום 2; 45.06 מיקרומטר ביום 5; 55.19 מיקרומטר ביום 7; 51.93 מיקרומטר ביום 10; 62.90 מיקרומטר ביום פיי 15). לגבי צורת הפ-ארגונים, בעוד שביום הראשון הם היו עגולים, הם הגיעו ל"צורת חבורת ענבים" (אופיינית לאורגנואידים בכבד) בימים שלאחר מכן.
הפטוציטים המצופים במטריצה תלת-ממדית נשארים בחיים בתרבית במשך שבועות, ומראים כדאיות של 23% ±10% לאחר 15 יום באמצעות בדיקת Trypan blue (איור 4B, שורה ראשונה). כדי לאמת את ההתפשטות של Hep-Orgs של חולדות, בוצעה בדיקת EdU ביום ה-15 (איור 4D). אף על פי כן, צביעת Hoechst הראתה מספר גבוה של תאים בודדים ולא Hep-Orgs, פעילות שגשוג של הפטוציטים (תאים ירוקים) הייתה נוכחת, גם אם שילוב EdU היה נמוך (9% ± 7%) (איור 4B, שורה שנייה).
איור 1: תרבית דו-ממדית של הפטוציטים ראשוניים על לוחות מצופים קולגן לאורך זמן. התמונות צולמו בהגדלה של פי 20 עם (A) מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ב-4 שעות לאחר הציפוי, (B) יום 1, (C) יום 2, (D) יום 3, (E) יום 4, (F) יום 5. בכל תמונה מדווח סרגל קשקשים המתאים ל-50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תאים ראשוניים בני קיימא בתרבית דו-ממדית על לוחות מצופים קולגן. הגרף מציג את אחוז התאים בני הקיימא מיום 1 עד יום 5, בהשוואה לתאים בני קיימא המצופים ביום 0, הנחשבים ל-100%. התוצאות מדווחות כמשכפלים בודדים, ממוצע ו-SD של 3 ניסויים שונים (* ערך p ≤ 0.05; ** ערך p ≤ 0.005). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי mRNA של סמני כבד שנמדד על-ידי RT-qPCR בהפטוציטים ראשוניים. התוצאות נורמלו על β-Actin ו / או GAPDH (גנים משק בית) והן מבוטאות ביחס להפטוציטים ראשוניים שנאספו לפני ציפוי ביום 0, נחשב 1. התוצאות מדווחות כממוצע ± SD של, לפחות, 3 ניסויים שונים (**+ ערך p ≤ 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תרבית הפטוציטים תלת-ממדית בטיפות מטריצה לאורך זמן. (A) הפטוציטים מבודדים המצופים בטיפות מטריצה עבור Hep-Orgs ארוכי טווח: בתמונה, טיפות המטריצה נראות על פני השטח של הבאר (עיגול אדום = טיפה אחת). (B) אחוז התאים בני קיימא על ידי Trypan blue ותאים מתרבים על ידי EdU ביום 15 לפני המעבר. כימות תאים חיוביים EdU בוצע על ידי תוכנת ImageJ2. התוצאות מדווחות באחוזים כ±SD ממוצע של, לפחות, 3 ניסויים שונים. (C) תמונות ניגודיות פאזה של תרבית תלת-ממדית של חולדות Hep-Orgs בימים שונים של צמיחה בתרבות תלת-ממדית: יום 1, 2, 5, 7, 10, 15. הגדלת תמונה פי 20. בכל תמונה מדווח סרגל קשקשים המתאים ל-50 מיקרומטר. (D) בדיקת התאגדות EdU של חולדות Hep-Orgs ביום ה-15. הגדלת תמונה פי 20. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מאגרים והרכב מדיה. הטבלה מדווחת על השם והרכיבים (עם הריכוז הסופי שלהם) של כל המאגרים והמדיה התאית המשמשת בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: רשימת פריימרים לחולדות. הטבלה מדווחת על רשימת הפריימרים המשמשים לניסויי RT-qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
דיון
אורגנואידים תלת-ממדיים הם חזית לרפואה מותאמת אישית ומאפשרים תרבית הפטוציטים לטווח ארוך. האיכות של טכניקה חדשנית זו דורשת תשואה טובה של hepatocytes ראשוני קיימא זילוח כבד מבוצע היטב בידוד hepatocytes. הליך ישן זה עדיין נמצא בשימוש נרחב; עם זאת, הוא כולל שלבים שונים שיכולים להיות מאתגרים. כשהתקרבנו להליך, חווינו בעיות קריטיות כגון זיהום חיידקי, יעילות עיכול נמוכה בכבד, תפוקת כבד ראשונית נמוכה וכדאיות נמוכה של הפטוציטים, כל אלה יכולים להשפיע בקלות על הצלחת הטכניקה. החל מפרוטוקולי תקן הזהב17,18, כאן אנו מדגישים כיצד להתגבר על בעיות נפוצות, מבהירים את השלבים הקריטיים ביותר בבידוד הפטוציטים הראשוני של חולדות ומסכמים את הטיפים המפוזרים שיכולים להשפיע בקלות על הצלחת הטכניקה במודל החולדה. למרות שההליך של זילוח כבד הוא מאתגר למדי ודורש מומחיות מדויקת מהמפעיל, הוא מבטיח תוצאות באיכות גבוהה במונחים של תשואה, שלמות, כדאיות ופונקציונליות של הפטוציטים הראשוניים. תכונות אלה חיוניות לשלבים הבאים.
במהלך תכנון הפרויקט, לקחנו בחשבון בקפידה את רשימת התיוג של הנחיות PREPARE21. תשומת לב מיוחדת הוקדשה לספרות העבר, השוואת עבודות קודמות שונות וכניסה במגע עם חלק מהמחברים (רשימת הנחיות הכנה _topic A1). הכלי האורגנואידי עצמו הוא דרך חשובה להפחית את מספר בעלי החיים מכיוון שניתן להפיץ את התאים בתרבית עד 7 חודשים (רשימת הנחיות הכנה _topic A3). באמצעות דיאלוג עם אנשי המתקן לבעלי חיים, בחרנו טכנאי מנוסה שסייע בהליך ותרם למניעת שימוש בעודפי חיות ניסוי (רשימת הנחיות PREPARE _topic B5). התקבלה משאבה פריסטלטית מתאימה הדרושה לביצוע זילוח כבד (רשימת הנחיות PREPARE _topic B6).
הפרסומים של נג17 ושן18 הם האחרונים המתארים את התהליך בחולדות. השאלות העיקריות אליהן מתייחס הפרוטוקול הנוכחי, שלא טופלו על ידי קודמיו, נוגעות לשימוש בפתרונות מסחריים ואופטימיזציה של קנולציה מדויקת של ורידים פורטליים המבטיחה שלבי זילוח ועיכול אופטימליים השומרים על הכבד באתרו. בעוד שהפרוטוקולים של Shen18 ו-Ng17 השתמשו בפתרונות תוצרת בית, הפרוטוקול שלנו מבוסס על פתרונות זילוח ועיכול מסחריים כדי להפחית את השונות בהכנת החיץ. עודף של ריכוז אנזים העיכול עלול להיות אגרסיבי כלפי הפטוציטים ולהשפיע על איכותם ועל כדאיותםשל התאים 25. השימוש בפתרונות מסחריים הוא קריטי לשיפור יכולת השחזור של הפרוטוקול, ומבטיח סטנדרטיזציה. יתר על כן, הפרוטוקול המבוצע על ידי Ng17 עשוי להיות מאתגר בשל הצורך להסיר את הכבד לפני שלב העיכול. הפרוטוקול שלנו מבוסס על זילוח ועיכול של הכבד מבלי להסיר אותו עד שני השלבים בוצעו, זה מפשט את ההליך. במונחים של תפוקת תאים וכדאיות התא, תוצאות הפרוטוקול שלנו דומות לעבודות קודמות.
ניקוי וחיטוי צינורות זילוח, לפני ואחרי ההליך, יחד עם חיטוי העור לפני תחילת הניתוח, חשובים מאוד כדי להגביל את הזיהום החיידקי. יתר על כן, ייבוש מלא של הצינורית לאחר ניקוי אתנול ושטיפה לאחר מכן עם המדיום הוא חיוני כדי להגדיל את כדאיות התא. למעשה, אפילו זריקה אחת של אתנול המוזרק לכבד תגרום למוות תאי במהלך ההליך.
הטמפרטורה של התמיסה המוזרקת חשובה, אך יש לקחת בחשבון גם את רגישות אנזים הקולגנאז לטמפרטורה. מסיבה זו, חיממנו מראש את חיץ הזילוח ב 42 מעלות צלזיוס לפני תחילת ההליך הכירורגי, בעוד שמנו את חיץ העיכול באמבט החימום רק בשלב הזילוח. הוספת מלכודת בועות לצינור במעלה הזרם מונעת מבועות שנמלטו להגיע לצנתר וכן מכניסת אוויר לכבד כאשר נגמרת תמיסת הזילוח17.
הרכב החיץ, לחץ הזילוח וקצב הזרימה צריכים להיות בטווח המתאים17. חווינו שלחץ נמוך וקצב זרימה נמוך גורמים לתנובה נמוכה ומשפיעים לרעה על יכולת הקיום של התא מכיוון שהמאגר לא יכול היה להגיע לכלי הדם הקטנים. מצד שני, קצב הזרימה לא צריך להיות גבוה מדי כדי לשמור על הקפסולה של גליסון שלמה. מאחר ששלמות היצמדות התאים דורשת Ca2+ 18, חיץ הזילוח הוא תמיסה נטולת Ca2+ המכילה EDTA כדי לתקוף את הגשרים המכילים סידן בין התאים, ולכן היא חיונית לסילוק סידן ולשטיפת הדם מהכבד. זמן הזילוח של 8-15 דקות עם קצב זרימה של 10 מ"ל/דקה הוא קריטי כדי לאפשר לכל התאים להגיע לתמיסה נטולת EDTA, Ca2+. זילוח לא אופטימלי עלול להוביל לעיכול מופחת.
מאגר העיכול מכיל Ca2+, שכן collagenase אשר מעכל את מטריצת הקולגן הוא Ca2+ תלוי. קצב הזרימה של חיץ העיכול צריך להישמר לפחות 20 מ"ל / דקה והזמן תלוי בקיבולת collagenase. במקרה של מאגר העיכול הספציפי שבו אנו משתמשים, עלינו לנקב 15 דקות לקבלת נפח סופי של תמיסה של 300 מ"ל. אם העיכול אינו שלם, צמתים בין תאים נשמרים, ולחץ מכני עוקב יפגע בתאים ויפחית את הכדאיות. הגדלה איטית של קצב הזרימה תורמת להפחתת ההשפעה המלחיצה של הזלוף על התאים. במהלך הניתוח התמקדנו בהידוק הווריד הנבוב התחתון החולף ובנפיחות הכבד שבאה בעקבותיו: מעבר זה שיפר משמעותית הן את יעילות העיכול והן את התאוששות התא. בסוף העיכול, הכבד צריך להיראות חום בהיר ורך. עם השלמת כריתת הכבד, שטיפת הכבד המבודד ב- PBS +3% P/S מפחיתה את כותרת החיידק ומסייעת למנוע זיהום בחלק הבא של ההליך.
עבור שלבי בידוד הפטוציטים מתחת למכסה המנוע הביולוגי, השימוש בפיפטות סרולוגיות של 25 מ"ל מונע את הפחתת הכדאיות של הפטוציטים על ידי פיפטות קטנות יותר. הוספנו צעד אופציונלי להגדלת תפוקת הפטוציטים הראשונית, שהיא שפיכת התווך המלא של ויליאם על הכבד המרוסק כדי לחזור על שלב הגירוד מתחת למכסה המנוע. שלב זה נעשה לאחר סינון של התווך ששוחרר מהכבד המבודד, והוא מסייע לנקות את הפטרי ולשחזר תאים נוספים מכמוסת הכבד. אם יש צורך להפעיל לחץ גבוה כדי להעביר את hepatocytes דרך המסננים, הכדאיות התא יהיה נמוך19.
חוסר היכולת של hepatocytes להיות בתרבית כמו 2D במשך יותר מ 2 ימים הוביל אותנו למצוא מודל חלופי לטווח ארוך תרבית. מודל מתאים לתרבית הפטוציטים למשך זמן רב יותר הוא Hep-Org למבוגרים. בהשוואה להפטוציטים דו-ממדיים, Hep-Orgs היו עדיין בני קיימא ובהתפשטות פעילה ביום ה-15, והפגינו פוטנציאל ארוך טווח.
זילוח כבד החולדה ובידוד הפטוציטים הראשוני הראשוני של הפטוציטים הבוגרים לאחר מכן הם השלבים המקדימים העיקריים ליישומים שונים. למרות שיכולת השחזור יכולה להיות מגבלה של הטכניקה מכיוון שההליך כרוך בשלבים ומשתנים רבים, תשומת לב לתיאור החזותי של ההליך מסייעת לשכפל את השיטה עם שיעור הצלחה גבוה. פרוטוקול זה, המצביע על השלבים הקריטיים ומראה כיצד לטפל בהם, מייעל את ההליך לבידוד ראשוני של הפטוציטים בחולדות ואת התוצאות המתאימות לביסוס מודלים במבחנה , כמו דור Hep-Orgs, על מנת לחקור פיזיולוגיה ופתולוגיה של הכבד.
גילויים
כל המחברים חשפו כל ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו מודים לד"ר דווידה סלווסטרל ולפרופ' ג'ובאני סורנטינו מ-SorrentinoLab באוניברסיטת טריאסטה על שעזרו לנו לבצע את בדיקת התפשטות EdU. העבודה נתמכה על ידי מענק אד-הוק של Banca d'Italia ומענקי FIF פנימיים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| A83-01- מעכב ALK5 IV | סליל תאומים | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect מערכת זיהוי PCR בזמן אמת | Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 ערכת הדמיה | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| קולגן, סוג I, תמיסה מזנב עכברוש | Merck | C3867-1VL | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| הפרין נתרן 25000 יחב"ל/5 מ"ל | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| תמיסת אינסולין-טרנספרין-סלניום 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| תמיסת L-גלוטמין | Euroclone | ECB3000D | |
| Liver Digest Medium | תרמופישר סיינטיפיק | 17703-034 | |
| Liver Perfusion Medium | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| תוסף N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A9165 | |
| Nicotinamide | Merck | N-0636 | |
| חומצות אמינו לא חיוניות | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| PBS buffer 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| משאבה פריסטלטית | איסמטק וסחר; | MS-4/12 משאבה דיגיטלית Reglo TNFa | |
| Peprotech | 300-01A | ||
| TRI ריאגנט | Merck | T9424 | |
| צינורות | איסמטק וסחר; | ID.2,79 מ"מ | |
| וויליאמס E בינוני, ללא גלוטמין | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
מקורות
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
- Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
- Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
- Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
- Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
- Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
- Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
- Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
- Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
- Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
- Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
- Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
- Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
