מאמר שיטה

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66866

⸱

14 ביוני 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

במאמר זה

סיכום

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

תקציר

במהלך העשור האחרון, גישות חד-תאיות הפכו לתקן הזהב לחקר דינמיקה של ביטוי גנים, הטרוגניות של תאים ומצבי תאים בתוך דגימות. לפני התקדמות התא הבודד, ההיתכנות של לכידת הנוף התאי הדינמי ומעברי תאים מהירים במהלך ההתפתחות המוקדמת הייתה מוגבלת. במאמר זה, צינור חזק תוכנן לבצע אנליזה של תאים בודדים וגרעינים על עוברי עכברים מהיום העוברי E6.5 עד E8, המתאים לתחילת והשלמת הגסטרולציה. גסטרולציה היא תהליך בסיסי במהלך הפיתוח הקובע את שלוש שכבות הנבט: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם, החיוניים לאורגנוגנזה. קיימת ספרות נרחבת על אומיקה חד-תאית המיושמת על עוברי פריגסטרולציה מסוג פראי. עם זאת, ניתוח חד-תאי של עוברים מוטנטיים עדיין נדיר ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FACS. זאת, בין היתר, בשל האילוצים הטכניים הקשורים לצורך בגנוטיפ, הריונות מתוזמנים, ספירת עוברים עם גנוטיפים רצויים להריון ומספר התאים לעובר בשלבים אלה. כאן מוצגת מתודולוגיה שנועדה להתגבר על מגבלות אלה. שיטה זו קובעת הנחיות רבייה והריון מתוזמן כדי להשיג סיכוי גבוה יותר להריונות מסונכרנים עם גנוטיפים רצויים. שלבי אופטימיזציה בתהליך בידוד העובר יחד עם פרוטוקול גנוטיפ באותו יום (3 שעות) מאפשרים לבצע תא בודד מבוסס מיקרו-טיפות באותו יום, מה שמבטיח את הכדאיות הגבוהה של התאים ותוצאות חזקות. שיטה זו כוללת גם הנחיות לבידודים אופטימליים של גרעינים מעוברים. לפיכך, גישות אלה מגדילות את ההיתכנות של גישות חד-תאיות של עוברים מוטנטיים בשלב הגסטרולציה. אנו צופים כי שיטה זו תקל על ניתוח האופן שבו מוטציות מעצבות את הנוף התאי של הגסטרולה.

מבוא

גסטרולציה היא תהליך בסיסי הנדרש להתפתחות תקינה. תהליך מהיר ודינמי זה מתרחש כאשר תאים פלוריפוטנטיים עוברים למבשרים ספציפיים לשושלת המגדירים כיצד נוצרים איברים. במשך שנים, גסטרולציה הוגדרה זמן רב כהיווצרות של שלוש אוכלוסיות הומוגניות ברובן: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם. עם זאת, טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה ומספר מתפתח של מודלים של תאי גזע עובריים 1,2 חושפים הטרוגניות חסרת תקדים בין שכבות הנבט המוקדמות 3,4. זה מצביע על כך שנותר עוד הרבה מה לגלות על המנגנונים המווסתים את אוכלוסיות התאים השונות של הגסטרולה. התפתחות עוברית של עכבר הייתה אחד המודלים הטובים ביותר לחקר החלטות מוקדמות לגבי גורל התא במהלך גסטרולציה 3,5. הגסטרולציה בעכברים היא מהירה, שכן כל תהליך הגסטרולציה מתרחש תוך 48 שעות, מהיום העוברי E6.5 עד E85.

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות של תא בודד אפשרה מיפוי מפורט של התפתחות עוברי עכבר מסוג פרא, וסיפקה סקירה מקיפה של הנוף התאי והמולקולרי של עוברים במהלך גסטרולציה 3,4,6,7,8. עם זאת, ניתוח עוברים מוטנטיים בשלבים אלה הוא פחות נפוץ ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FAC 9,10. הספרות המועטה משקפת את האתגרים הטכניים הקשורים למניפולציה והכנה חד-תאית של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ. לכידת התהליך הדינמי של גסטרולציה יכולה להציב אתגרים בשל טבעו המהיר, במיוחד להבנת עוברים מוטנטיים. העיתוי והסנכרון של הריונות הם חיוניים, שכן אפילו הבדלים קלים בין הריונות מתוזמנים יכולים להתפרש בטעות כפנוטיפ התפתחותי הנובע מהגן המוטנטי. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר הגן המוטנטי משפיע על תהליך הגסטרולציה13,14. במחקר זה, נקבעו קווים מנחים להשגת הריונות מסונכרנים באמצעות הדמיה של פקקים בנרתיק (כלומר, מסת נוזל הזרע הקרוש שנוצר בנרתיק הנקבה לאחר ההזדווגות). בנוסף, אסטרטגיה נועדה להשיג נתונים חד-תאיים חזקים מעוברים מוטנטיים מ-E6.5 עד E8. אסטרטגיה זו פותחה כדי להתגבר על אילוצים הקשורים למספר הנמוך של עוברים עם הגנוטיפ הרצוי להריון ולירידה בכדאיות הנגרמת על ידי הקפאה-הפשרה של עוברים או תאים.

מאמר זה מתאר מתודולוגיה אופטימלית החל מקביעת הריונות מתוזמנים דרך פקקים וגינליים ועד לריצוף הסופי של תאים/גרעינים בודדים. שיטה זו מסבירה כיצד להגדיל את מספר ההריונות המסונכרנים כדי להשיג מספר גבוה יותר של עוברים עם גנוטיפ רצוי, בידודי תאים/גרעינים כדי לשפר את יכולת הקיום של התאים, ופרוטוקול גנוטיפ באותו יום. כתב יד זה מתאר גם את תהליך בידוד העוברים בנקודות זמן שונות של גסטרולציה. המתודולוגיה מסייעת להגדיל את מספר תאי העובר/גרעינים הסופיים ברי קיימא לריצוף, ומבטיחה נתוני ריצוף באיכות גבוהה. לכן, שיטה זו תפתח את הדלתות למחקרים חד-תאיים של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ.

פרוטוקול

פרוטוקול זה וכל הניסויים המתוארים בבעלי חיים אושרו באופן רשמי ובהתאם להנחיות מוסדיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טמפל, העוקבת אחר ההנחיות הבינלאומיות של האגודה להערכה והסמכה לטיפול בחיות מעבדה. כל העכברים שתוארו היו על זן הרקע C57/BL6N. במחקרים אלה לא נצפו בעיות בריאותיות של בעלי חיים.

1. מושבת רבייה והריונות מתוזמנים

  1. הזמן את ההריונות על ידי הדמיה של פקק בנרתיק. צהריים ביום התקע נחשב E0.5.
  2. עכברי בית בכלובים עם חומר מצע המכיל מצעי עץ סדוקים וחומר קינון נייר.
    1. כל כלוב מכיל צ'או עכבר, מים מתוקים ופריט העשרה (למשל, מנהרה וחומר קינון). עקוב אחר מידע המושבה ואסוף אותו מדי יום במהלך הרבייה המתוזמנת.
    2. רשמו את כל המידע כגון גיל העכבר, מספר ההריונות שהיו לעכברה נקבה, מספר התקעים שהונחו על-ידי עכבר זכר ושלב הייחום (איור 2) עבור נקבות עכברים.
      הערה: נקבות שכבר המליטו 1-2 פעמים יספקו המלטה גדולה יותר בהריונות עתידיים.
  3. לפני תחילת הריונות מתוזמנים, לשכן את העכבר הזכר לבד בכלוב 1 שבוע לפני הרבייה. במהלך השבוע של תחילת הרבייה, להציג לפחות נקבה אחת לכל זכר בכלוב.
    הערה: בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר, הוספת 2-3 נקבות לכלוב רבייה עשויה להיות מותרת ומועדפת להגדיל את ייצור התקע.
  4. הגדר לפחות 4 שלישיות רבייה (2 עכברים נקבות עד זכר אחד) כדי להגדיל את הסיכויים להריונות מסונכרנים על פני הכלובים (כלומר, תקעים מרובים באותו יום). זה יגדיל את מספר העוברים שבודדו באותו שלב התפתחותי.
  5. ארגנו הזדווגות אידיאלית בשעות אחר הצהריים או הערב לפני השעה 17:00, והנקבות יוכנסו לכלוב של הזכר או להיפך. אם הרבייה אינה מתרחשת תוך 4-5 ימים, שקול להחליף שותפים להזדווגות כל יומיים.
    הערה: אם לא ניתן לבדוק אם יש פקק בנרתיק למחרת בבוקר, יש להפריד בין זוג הרבייה בלילה הקודם (כלומר, סופי שבוע/חגים).
  6. בדוק אם יש תקעים בנרתיק כל יום בשעות הבוקר המוקדמות; לפני 9 בבוקר עדיף.
    1. כדי לבדוק אם קיימים פקקים בנרתיק, הרימו בעדינות את נקבות העכברים בבסיס הזנב והתבוננו בפתח הנרתיק. חפשו מסה ג'לטינית בצבע לבן או קרם. לעתים קרובות, פקק הנרתיק יכול להיות ברור, אבל אם לא ברור, לקחת פינצטה ולבדוק בעדינות את פתח הנרתיק. שקול רק את התקעים הנראים יותר לבידוד. עיין באיור 2C.
      הערה: זה קריטי לבדוק תקעים בנרתיק מוקדם ככל האפשר בבוקר כדי למנוע פספוס הריון פוטנציאלי. תקעים יכולים ליפול או להתמוסס לאחר 12 שעות.
      הערה: גם אם נצפה תקע, זה לא מבטיח כי העכבר נקבה תהיה בהריון. אם נצפה פקק חלקי או ללא תקע אך יש אדמומיות ליד פתח הנרתיק של נקבות העכברים, אל תשקלו נקבות אלה לבידוד מכיוון שיש סיכוי קטן יותר שהתקע יידבק. הסבירות להריון לאחר הזדווגות משתנה בין זני עכברים ותלויה בשלב מחזור הייחום במהלך ההזדווגות (איור 2).
  7. לאחר שנצפה פקק בנרתיק, רשום את היום. הצהריים של אותו יום שבו נצפה תקע הנרתיק נחשב E0.5. הפרידו את נקבות העכברים מכלוב הרבייה ובודדו את העוברים בהתאם לשלב הגסטרולציה הרצוי.
    הערה: שיטה זו אינה מספקת תזמון מדויק להזדווגות. באופן קונבנציונלי, ההנחה היא שההזדווגות מתרחשת בסביבות חצות בלילה הקודם. כתוצאה מכך, עוברים נחשבים בני חצי יום (E0.5) עד הצהריים ביום שבו נצפה פקק הנרתיק.

2. בידוד עוברי עכברים במהלך גסטרולציה

  1. לפני תחילת בידוד העוברים, הכינו את כל הריאגנטים והציוד הנדרשים.
    1. נקו את האזור ביסודיות עם 70% אתנול. יש לוודא שכל כלי הדיסקציה (מלקחיים ומספריים) נשטפים ומעוקרים. יש להשיג 5 מ"ל סטריליים של מדיום הנשר המעובד (DMEM)/10% נסיוב בקר עוברי (FBS) של דולבקו ו-20 מ"ל DPBS-/- ולהניח על קרח.
    2. בצע את כל הבידודים באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם במת אור משודרת ומצלמה כדי לסייע בפנוטיפ התפתחותי גס.
  2. הרדימו את סכר העכבר ההרה והתחילו את הבידוד מיד.
    1. הניחו את הסכר ההרה בתא CO2 כאשר קצב זרימתCO2 מותאם לעקירת 20% מנפח הכלוב לדקה. עקוב אחר העכבר מקרוב ואשר את המוות על ידי התבוננות בהיעדר תנועות נשימה.
    2. שמור על זרימת CO2 למשך 2 דקות נוספות לאחר היעדר תנועות נשימה. לאשר המתת חסד על ידי ביצוע נקע צוואר הרחם.
    3. מקמו את העכברים במצב עמידה רגיל על משטח יציב ושטוח. לאחר מכן, עם האגודל והאצבע הראשונה של יד אחת כנגד העורף בבסיס הגולגולת, דחפו קדימה ולמטה תוך משיכה לאחור כשהיד השנייה אוחזת בבסיס הזנב.
    4. ודא את יעילות הנקע על ידי הרגשת ההפרדה של חוליות צוואר הרחם. כאשר חוט השדרה נקטע, יהיה חלל של 2-4 מ"מ מוחשי בין הקונדילים העורפיים לחוליה הצווארית הראשונה.
      הערה: אין להרדים מספר סכרים בהריון בבת אחת, מכיוון שיכולת הקיום של התאים תושפע. איזופלואורן יכול לשמש כחומר הרדמה חלופי אם אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) או גוף מקביל.
  3. מניחים את סכר ההריון על גבו ומעקרים את האזור הסמוך לפתח הנרתיק באתנול.
    1. בעזרת מספריים ופינצטה לדיסקציה, הרימו את קפל העור ליד פתח הנרתיק ובצעו חתך קטן בצורת V, החושף לאט לאט את הרחם של הסכר ההריוני (איור 3 [חץ צהוב]).
    2. נתחו את קרן הרחם של הסכר ההריוני על ידי החזקת קצה אחד שלו בפינצטה וחיתוך לאורכו, תוך הקפדה להסיר את צוואר הרחם. הניחו את קרן הרחם בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה DPBS-/- על קרח (איור 3).
      הערה: בהתאם לשלב בידוד העוברים, הרחם יהיה דומה לאתרי השרשה קטנים או גדולים יותר (כלומר, 'פנינים' על חוט).
  4. בעזרת מספריים ופינצטה לדיסקציה, חתכו כל אתר השתלה ("פנינים") המכיל את הנפיחות הנשירים בפנים והכניסו ל-DPBS טרי -/- בצלוחית פטרי בקוטר 6 ס"מ על קרח (איור 3).
    הערה: בסכר הריון ממוצע יהיו כ-6-8 עוברים מושתלים.
  5. קח אתר השתלה אחד והנח אותו על צלחת פטרי חדשה בקוטר 6 ס"מ על גבי שלב הסטריאומיקרוסקופ והוסף עליו 500 מיקרוליטר DPBS-/- מעליו. התאימו את מוקד המיקרוסקופ ואת מקור האור (איור 3).
    הערה: בהתאם לגודל אתר ההשתלה, כמות DPBS עשויה להשתנות; המטרה היא שיהיה מספיק DPBS כדי שאתר ההשתלה יהיה שקוע.
  6. באמצעות פינצטה דיסקציה עדינה, להסיר את שריר הרחם מאתר ההשתלה. החזיקו את אתר ההשתלה עם סט אחד של פינצטה ביד אחת והכניסו באיטיות זוג מלקחיים נוסף ביד השנייה לקצה אתר ההשתלה שנחתך מקרן הרחם, מה שחושף לאט את הנפיחות (איור 3).
    הערה: אין למשוך או למשוך חזק מדי על פני הרחם, כפי שהוא יכול להוביל לקרע של נפיחות נשירים או אפילו lysis של העובר.
  7. לאחר שהנפיחות הנשירים מבודדת, המשיכו לחשוף את העובר.
    1. החזיקו את הקצה האנטי-מזומטריאלי של הנפיחות העשרונית עם זוג מלקחיים אחד, ועם הזוג השני, בצעו לאט חתך אופקי בערך 1/4 מגודל הנפיחות הנשירים מהקצה המזומטריאלי (כלומר, לעתים קרובות הקצה המחודד יותר של הנפיחות הנשירית).
    2. כעת, בעזרת שתי המלקחיים, דחפו באיטיות מהקצה האנטי-מזומטריאלי של הנפיחות הנשירית, והעובר ייצא מהקצה המזומטרי שזה עתה נחתך (איור 3).
      הערה: אין לקרוע לתוך נפיחות עשרונית, כמו זה ישבור את העובר. במידת הצורך, בצע חתכים קטנים יותר לאורך הקצה המזומטריאלי של הנפיחות הנשירה.
  8. ברגע שהעובר נחשף, הסר את כל הרקמות החוץ-עובריות המצורפות.
    1. השק האנדודרמלי הקודקודי והחרוט האקטושלייתי עשויים לרדת באופן ספונטני מהעובר במהלך תהליך החשיפה, אך אם לא, השתמשו בזוג מלקחיים והוציאו אותם יחד עם כל דם אימהי נלווה. לאחר מכן, באמצעות שתי מלקחיות, החזיקו את העובר עם זוג אחד וקילפו לאט את שק החלמון הקרבי מהעובר באמצעות הקבוצה השנייה.
    2. באמצעות פיפטה P20, הניחו את שק החלמון עם לא יותר מ -10 μL של DPBS-/- מהצלחת לתוך צינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בן 8 רצועות על קרח, מכיוון שזה ישמש לגנוטיפ באותו יום.
      הערה: קריטי שדגימת שק החלמון לא תהיה מזוהמת ברקמה מהסכר ההרה. זיהום עלול להוביל להקצאה גנוטיפית שגויה של העובר.
  9. צלמו תמונות שדה בהירות של עוברים שזה עתה בודדו כדי להבטיח שההיערכות של ההמלטות דומה. עם פיפטה P200, פיפטה איטית למעלה את העובר עם 50 μL של DMEM / 10% FBS ומניחים אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל על קרח. תנו לעוברים להישאר על קרח עד שהגנוטיפים יאושרו.
    הערה: העוברים נשמרו על קרח במשך 3-4 שעות ללא השפלה ברורה, אך אינם עולים על הפעם, מכיוון שתתרחש ירידה בכדאיות התא. תייגו את העוברים ואת צינורות הגנוטיפ בהתאם. מומלץ לצלם תמונות שדה בהירות כדי לזהות ולהוסיף ביאורים להבדלים פנוטיפיים גסים בין עוברים.
  10. חזור על שלבים אלה עבור כל הנפיחויות הנשירים הנותרות. נקו את כל כלי הדיסקציה והשתמשו בפלסטיק חדש לכל בידוד כדי להבטיח שלא יהיה זיהום מבידודים קודמים.
    הערה: יש לוודא כי הליכי הדיסקציה מוגבלים לשעה אחת מרגע איסוף אתר ההשתלה מהסכר ההרה.
  11. המשך לבודד עוברים מסכר ההריון הבא (אם זוהו הריונות מסונכרנים מרובים) לפני המעבר לשלב הגנוטיפ באותו יום.

3. גנוטיפ באותו יום (איור 4)

  1. יש לעכל כל שק חלמון בטני בצינור PCR בעל 8 פסים. באמצעות פיפטה P20, הוסף 19.3 μL של מאגר DNA lysis תבנית PCR ו- 0.7 μL של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל פרוטאינאז K לכל דגימת שק חלמון.
  2. מערבלים את הדגימה במשך 10 שניות ומסתובבים כלפי מטה כדי למקם את הדגימות בתחתית הצינור באמצעות מיני צנטריפוגה עם מתאם רצועה ב 1,000 x גרם במשך 10 שניות. הניחו את צינור ה-PCR בעל 8 הפסים בבלוק חום של 85°C למשך 45 דקות ואת המערבולת למשך 5 שניות כל 5 דקות.
    הערה: חשוב לערבל דגימות בזמן העיכול כדי למקסם את הליזה התאית תוך 45 דקות.
  3. לאחר 45 דקות, סובבו את רצועת הצינור כלפי מטה באמצעות מיני צנטריפוגה עם מתאם רצועה במהירות של 1,000 x גרם למשך 10 שניות, והמשיכו עם PCR לזיהוי גנטי רצוי. לשם השוואה, פרוטוקול לדוגמה עבור מערכת Cre-lox מסופק. להלן דוגמה לתנאי PCR עבור Cre genotyping. עצבו פריימרים כדי להגביר את אזורי 5' ו-3' של אתר Cre הממוקד.
  4. כדי לבצע את תגובת ה-PCR עבור Cre genotyping, הכינו תערובת מאסטר PCR לכל צינור PCR בן 8 רצועות עבור כל שק חלמון המכיל 10 μL של תערובת Taq DNA פולימראז, 0.5 μL של פריימר Cre קדמי של 0.5 מיקרומטר, 0.5 μL של פריימר Cre הפוך של 0.5 מיקרומטר, 5 μL של מים מאושרי PCR, ו-4 μL של DNA גנומי של שק חלמון.
    הערה: אם אתה משתמש בפרוטוקול שעבר אופטימיזציה לגנוטיפ זנב עכבר, הוסף כמות כפולה של DNA המשמשת בדרך כלל לתוצאות נקיות יותר.
  5. לאחר ביצוע תערובת האב של PCR, הפעל את תוכנית הגברת המחזור התרמי של PCR. עבור גנוטיפ Cre, המחזור הוא כדלקמן: (1) 95 ° C במשך 3 דקות, (2) 95 ° C עבור 30 שניות, (3) 55 ° C עבור 30 שניות, (4) 72 ° C עבור 30 שניות, שלב חוזר 2-4 עבור 34 מחזורים, (5) 72 ° C במשך 10 דקות, (6) 4 ° C להחזיק. הפעל את מוצרי ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% כדי להסיק מסקנות גנוטיפיות.
    הערה: אם יש צורך ביותר מ-PCR אחד לזיהוי גנטי, הפעל את תגובות ה-PCR בו-זמנית כדי למטב את התזמון. כדי לזרז את התהליך, הכינו את ג'ל האגרוז יום מראש ביום הניסוי ואחסנו אותו ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אין לשקול דגימות ללא גנוטיפים ברורים. קחו בחשבון הן את שלב הגנוטיפ והן את שלב ההתפתחות עבור דגימות, שכן המלטות יכולות להיות בשלבים שונים של גסטרולציה ועלולות להטות את התוצאות. בעת ביצוע הגנוטיפ של אללי LoxP, רצועות ה- PCR הצפויות בג'ל עשויות להשתנות בהתאם למנהל התקן Cre בשימוש. לדוגמה, אם דרייבר Cre מבוטא בשק החלמון הקרבי, רצועת Loxp תופיע מוזזה בעוברים Cre-positive (Cre+), בהשוואה ל-Cre-negative (Cre-). עם זאת, אם ה-Cre אינו מבוטא בשק החלמון הקרבי, גודל רצועת ה-Loxp יהיה זהה בעוברי Cre+ ו-Cre-comryos (כלומר, האללים של Loxp לא יהיו floxed בשושלת שק החלמון). עובר הנושא אלל Cre+ אחד ושני אללי Loxp נחשב לעובר KO מותנה. עם זאת, כדי לאשר את המחיקה של הגן floxed, מומלץ לבצע אישור של הנוקאאוט של הגן על התאים המבטאים את דרייבר Cre, או על ידי חזרה על פרוטוקול הגנוטיפ או על ידי ניתוח qPCR של רמות mRNA של הגן floxed (איור 4D, E).
  6. אחסנו את שאריות דגימות שק החלמון המעוכל במקפיא בטמפרטורה של -20°C לאחסון לטווח ארוך.

4. דיסוציאציה תאית של עוברים ויכולת קיום התא

  1. לאחר אישור הגנוטיפים, קח פיפטה P200 ופיפטה 50 μL של DMEM/10% FBS. אסוף עוברים עם אותו גנוטיפ לתוך צינור חדש של 1.5 מ"ל והנח את הצינור על קרח.
    הערה: אין להמשיך בניסוי אם אין לפחות 5 עוברים בקבוצה (E7-E7.5) או 3 (E7.75-E8), מכיוון שספירת התאים והכדאיות שלהם יפחתו מאוד.
  2. לאחר איגום העוברים על בסיס גנוטיפים, אפשרו להם להתיישב בתחתית הצינור. שטפו את העוברים המאוגמים על ידי הוספת 50 μL של DPBS-/-, ואז המתינו עד שהעוברים יתיישבו לפני שתוציאו כמה שיותר DPBS-/- מבלי להסיר את העוברים מהצינור. חזור על שלב זה פעמיים.
    הערה: החזקת הצינור בנפח 1.5 מ"ל עד למקור אור או לכיוון חלון תקל על ראיית העוברים שוקעים בתחתית הצינור.
  3. הוסיפו 100 מיקרוליטר טריפסין לעוברים המצטברים ודגרו בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום למשך 5 דקות. העבר בעדינות את צינורות 1.5 מ"ל כל 30 שניות כדי לעזור לתאים להתנתק.
    הערה: אין להשתמש במערבולת או פיפטה במהלך תהליך הטריפסיניזציה, מכיוון שהיא פוגעת בתאים. אם מאגדים יותר מ-5 עוברים (E7-E7.5) או 3 עוברים (E7.75-E8), יש לבצע עיכול טריפסין בצינור אחר עם כמות שווה ערך של טריפסין (~20 מיקרוליטר לעובר אחד). השתמש ~ 20 μL של טריפסין לכל עובר (E6.5-E7.5), 35 μL לכל עובר (E7.75), ו 40 μL עבור עובר (E8).
  4. לאחר 5 דקות, נטרל את הטריפסין עם 300 μL של DMEM/10% FBS. צנטריפוגה את העוברים המאוגמים ב 100 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר הצנטריפוגה, גלולה קטנה תופיע עבור כל הדגימות. השהה מחדש את הכדוריות ב 40 μL של DMEM / 10% FBS והנח אותם על קרח.
    הערה: גודל הגלולה ישתנה בהתאם למספר העוברים המאוגמים. ייתכן כי הגלולה אינה נראית לעין אלא להמשיך לשלב הבא. כמות DMEM/10% FBS הנדרשת לנטרול טריפסין תהיה תלויה בכמות הטריפסין שנוספה. הוסף פי 3 מכמות DMEM/10% לכמות הטריפסין.
  5. קבע את ריכוז התאים המרחפים מחדש (40 μL) באמצעות מונה תאים אוטומטי. מערבבים 5 μL של תאים עם 5 μL של כחול טריפאן בצינור חדש של 1.5 מ"ל. פיפטה מערבבים היטב פיפטה על שקופית כדי לקבוע את מספר התא ואת כדאיות התא. הריכוז האופטימלי של תאים הוא 700-1200 תאים/μL, ויכולת הקיום של התא היא 90% ומעלה.
    הערה: אם הריכוז נמוך מ-200 תאים/מיקרוליטר והכדאיות נמוכה מ-50%, אין להמשיך בניסוי. אם ריכוז התאים גבוה מדי, דללו את תרחיף התא וספרו שוב תאים. אם נצפים גושי תאים, השתמש במסננת תאים כדי להבטיח השעיה של תא יחיד.
  6. המשך לחלוקה של תא בודד באמצעות שבב מיקרופלואידי ופעל לפי הפרוטוקול של יצרני השבבים המיקרופלואידים11.

5. עוברי עכבר מבודדים גרעינים (אפשרות לנקודות זמן עובריות גדולות יותר מ-E8 ואילך)

  1. הכינו ליזה טרייה ושטפו את מאגרי המתאר בטבלה 1, והניחו אותם על קרח.
    הערה: בידוד גרעינים יכול להתבצע על דגימות טריות או קפואות. אם הדגימות קפואות, אפשרו להן להפשיר במשך 2-5 דקות על קרח.
  2. לפני תחילת הניסוי, לאשר את כל הגנוטיפים ולצרף רק עוברים עם גנוטיפים ברורים.
  3. באמצעות פיפטה P200, הוסף 50 μL של חיץ גרעיני ליזה לעוברים מאוגמים בצינור של 1.5 מ"ל, במטרה למינימום של 3 עוברים לכל קבוצה מוטנטית. אפשר לדגימות לשבת על קרח עם חיץ ליזיס למשך 5 דקות ומערבולת כל 30 שניות.
  4. לאחר 5 דקות של דגירה, צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. באמצעות פיפטה P200, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את הגלולה ב 50 μL של חיץ שטיפה. לאחר השעיה מחדש, צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant ו resuspend ב 40 μL של DPBS-/-. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. מערבבים 5 μL של גרעינים עם 5 μL של כחול טריפאן בצינור חדש של 1.5 מ"ל. פיפטה את התערובת ביסודיות ולטעון אותו על שקופית כדי לקבוע את מספר התא ואת הכדאיות.
    הערה: קרום הגרעין חדיר לכחול טריפאן; לכן, כתם הגרעינים המבודדים חיובי לכחול טריפאן. במונה תאים אוטומטי, אחוז התאים המתים משמש להערכת אחוז הגרעינים המבודדים (איור 5A).
  6. אם אחוז הגרעינים השלמים גדול מ-90% (כלומר, לפחות 90% מהגרעינים מוכתמים בכחול טריפאן ומציגים צורה מעוגלת והיבט טורגידי; עיין באיור 5B, C), המשך להשתמש בשבב מיקרופלואידי ופעל לפי פרוטוקול מיצרני השבבים המיקרופלואידים11.

6. חלוקה חד-תאית (כולל הגברה cDNA ובניית ספרייה)

  1. המשך באופן מיידי עם פרוטוקול ריצוף RNA חד-תאי בהתאם לפרוטוקול11 של יצרן השבבים המיקרופלואידים לקבלת התוצאות האופטימליות ביותר. הגדר את שחזור תאי היעד ל- 6000 תאים ומעלה.

7. רצף

  1. לאחר בניית הספריות, מדדו את התפלגות גודל המקטע ואת ריכוזי הדגימות באמצעות מנתח אלקטרופורזה אוטומטי.
    הערה: התפלגות גודל המקטע האופטימלית היא בין 300-1000 bp.
  2. הדגימות מוכנות לטעינה לתוך הרצף. ספריות בריכה מדוגמאות שונות יחד. ריכוז הטעינה הסופי של ספריות מאוגמות הוא 750 pM בנפח כולל של 24 μL. טען את הספריות המאוגדות למחסנית המגיב, בהתאם לפרוטוקול יצרן הרצף12.
  3. רצף את הספריות הטעונות לתוך תא הזרימה והמחסנית שהורכבו מראש בהתאם לעומק הרצף הרצוי עם אינדקס כפול. קריאות הריצוף הנצמדות לפרוטוקול שהותוו על ידי יצרני שבבים מיקרופלואידים הוא כדלקמן:11: קרא 1: 28 מחזורים, מדד i7: 10 מחזורים, מדד i5: 10 מחזורים, וקרא 2: 90 מחזורים. לאחר השלמת הריצוף, הנתונים עוברים ניתוח ביואינפורמטיקה.
  4. השתמש בשיטות ביואינפורמטיקה כדי לבצע בקרות איכות. זה כולל הערכת מספר התאים המרוצפים, קריאות לכל תא ומספר הגנים שמופו לכל תא.
    הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, מספר התאים המרוצפים הוא לפחות 80% מתאי היעד. מומלץ שמספר הקריאות בכל תא יהיה לפחות 30,000, ומספר הגנים שזוהו גבוה מ-3000 (עבור דגימות עכברים).

תוצאות

המתודולוגיה שתוכננה במאמר זה נועדה במיוחד לשפר את הכנת דגימות העוברים עבור אומיקה חד-תאית מ-E6.5 עד E8. הצינור החזק הזה מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הריונות מתוזמנים מסונכרנים, בידודים של עוברים, גנוטיפ באותו יום, דיסוציאציה של תאים והערכת כדאיות התא (איור 1A). בעוד שהנתונים המוצגים מתמקדים בנקודות זמן מ-E7 עד E7.5, ניתן ליישם אותם על עוברים עד E8 (איור 1B) עם שינויים קטנים בהליך (המתייחסים להערות לאורך הפרוטוקול). הריונות מתוזמנים מסונכרנים הושגו על ידי הכנסת שתי עכברות נקבות לכלוב עם עכבר זכר. פקקים וגינליים נבדקו כל בוקר לפני 10 בבוקר, ואם נצפה תקע, הוא נחשב E0.5 בצהרי אותו יום (איור 2A). במחקר הזה, התנאים האופטימליים לתקעים דרשו מנקבת עכבר בשלב הייחום או הפרואסטרוס להיות מזווגת, עם זכר עם היסטוריה של הצבת כמה תקעים בהצלחה במהלך רבייה קודמת (איור 2B). רק תקעים ברורים נלקחו בחשבון עבור בידוד עוברים (איור 2C).

העיתוי ההתפתחותי הוערך בהתאם ללוח הזמנים באיור 2A. עבור E7.5, דיסקציה של עוברים החלה בשעה 12:00 ביוםהשביעי שלאחר יום גילוי התקע. איור 3 מדגים בידוד עובר מוצלח ב-E7.5. לאחר שהסכר ההריוני עבר המתת חסד, קרן הרחם נותחה, הנפיחות הנשירים נחתכה בנפרד וחשפה את העובר, ושק החלמון בודד לצורך גנוטיפ (איור 3).

גנוטיפ באותו יום בוצע תוך 3 שעות מבידוד העובר בעקבות השלבים באיור 4A. העוברים נשמרו על קרח בתהליך הגנוטיפ כדי לשמור על שלמותם. אין להקפיא את העוברים, שכן זה יקטין את מספר התאים קיימא לכל עובר. איור 4B,C מראה את שק החלמון הקרבי, את השק האנדודרמלי הקודקודי ואת חרוט השליה האקטושליה עם הדם האימהי הקשורים. שק החלמון הקרבי שימש לגנוטיפ (איור 4C). לאחר עיכול שק החלמון, תערובת ה-PCR הוכנה, ותגובת ה-PCR הופעלה. מוצר ה- PCR שהתקבל הופרד לאחר מכן על ג'ל אגרוז. איור 4D מראה את גודל המקטעים הצפוי עבור אללי LoxP ואללים מסוג בר (597 bp ו-498 bp, בהתאמה) ואלל Cre (650 bp). באיור 4E מוצגת דוגמה לגנוטיפ של שק חלמון מ-6 עוברים שהתקבלו מזוגות רבייה הנושאים אללים מסוג Cre ו-LoxP (flox). הג'לים מתארים את תוצרי ה-PCR של אללי Cre ו-LoxP ב-6 העוברים שנותחו. עוברים מספר 2 ומספר 5 נושאים 2 אללי פלוקס ואלל 1 קר; לכן, הם נחשבים עוברי KO מותנים (איור 4E, נקודות אדומות). לעוברים 1 ו-3 יש 2 אללים פלוקס אך הם שליליים ל-Cre; לכן, הם נחשבים בקרות FLOX. לעובר 4 יש 2 אללי פלוקס ורצועה חלשה לאלל Cre, וכתוצאה מכך גנוטיפ "לא ברור". עובר זה לא עבר עיבוד נוסף (לחלופין, הנסיין עשוי לשקול לחזור על הגנוטיפ או לבצע אימות משני של KO המותנה באמצעות תאים המבטאים Cre). חשוב לציין כי דרייבר Cre המשמש בניסוי זה אינו בא לידי ביטוי בשק החלמון הקרבי15; לפיכך, האללים של LoxP אינם נראים מוזזים על הג'ל של עוברים Cre-positive בהשוואה לעוברים Cre-negative.

ספירת תאים וכדאיות טובה נדרשות לניסוי מוצלח של תא בודד. מתלים עם כדאיות תאים נמוכה, אחוז גבוה של תאים מתים, גושים או פסולת משמעותית אינם מתאימים לעיבוד נוסף. התנאים האופטימליים הם עבור 700-1200 תאים חיים למיקרוליטר ו >90% כדאיות. איור 5A מציג פאנל שממחיש גם יכולת קיום טובה וגם תת-אופטימלית של תאים. ניתן ליישם את אותם קריטריונים גם עבור בידוד גרעינים, כפי שמוצג באיור 5B. עם זאת, חשוב לציין כי ההערכה של כחול טריפאן שונה מתאים וגרעינים: תאים קיימא אינם משלבים כחול טריפאן, בעוד גרעינים קיימא כן. אם תרחיף תאים/גרעינים הוא אופטימלי (>90% כדאיות), המשך בחלוקה של תא בודד באמצעות שבב מיקרופלואידי בהתאם לנוהלי היצרן11. אפשרויות פתרון בעיות מסופקות עבור מתלים שבהם הכדאיות של התא/גרעינים היא בין 60% ל-89%, כפי שמתואר באיור 5C. אם הכדאיות, ללא קשר למספר התאים הכולל, יורדת מתחת ל-60%, שקול להפסיק את הניסוי.

כל הצינור מסגירת הסכר ההרה לבניית הספרייה אורך בסך הכל 8 שעות באותו יום (כלומר, שלבי פרוטוקול 2 עד 6 חייבים להתבצע באותו יום). בהתאם לנהלים שהותוו על ידי נהלי11 של יצרני התא הבודד, הוכנו מבני ספריות לריצוף רנ"א חד-תאי באמצעות תאים שהתקבלו מעוברי E7, כאשר כדאיות התא נעה בין תנאים תת-אופטימליים לאופטימליים, במטרה להתאוששות יעד משוערת של 2000 תאים (איור 6). איור 6A מתאר התפלגות מייצגת של גודל מקטע של ספריות scRNAseq עבור תנאים תת-אופטימליים ואופטימליים, מה שמצביע על כך שיכולת הקיום של התא אינה משפיעה באופן משמעותי על כל תהליך החלוקה של תא יחיד. התפלגות גודל השבר נעה בין 400-500 bp. הדבר מצביע על כך שתנאים תת-אופטימליים אינם משפיעים על תהליך הכנת הספרייה. איור 6B מראה את התוצאות של ניסויי RNAseq חד-תאיים מוצלחים ותת-אופטימליים. לאחר הריצוף נערכו בדיקות בקרת איכות על הדגימות והבחינו כי במקרים בהם כדאיות התא הייתה תת-אופטימלית, רק 10% מהתאים רוצפו בהצלחה. לעומת זאת, דגימות אופטימליות הציגו אחוז גבוה יותר, כאשר 91% מכלל התאים רוצפו. הדבר מוכח עוד יותר על ידי תרשימי ברקוד, המצביעים על כך שלתנאים התת-אופטימליים יש רעשי רקע גדולים יותר בהשוואה לתנאים אופטימליים. ניתוח אשכולות בוצע בשני הניסויים וגילה 9 אשכולות בתנאים האופטימליים ו-4 בתנאים התת-אופטימליים. ביאור הצבירים באמצעות סמנים ידועים3 חשף סוגי תאים צפויים בעוברי E7, כולל אפיבלסט ופס פרימיטיבי (איור 6B). ביאורי אשכולות בניסוי התת-אופטימלי לא התאפשרו בשל היעדר העשרה בסמנים ידועים לכל אשכול. זה מדגיש את החשיבות של תאים באיכות גבוהה הדרושים לייצוג נכון של נתונים בשלבי התפתחות אלה.

figure-results-1
איור 1: אופטימיזציה של עוברי עכבר שלמים עבור ריצוף רנ"א חד-תאי. (A) סכימת זרימת עבודה להשגת תאים ו/או גרעינים באיכות גבוהה מעוברים מתגבשים. (B) תמונות שדה בהירות מייצגות וסכמהמותאמת 3 של עוברי עכברים במהלך הגסטרולציה מ-E7 עד E8. סרגל קנה מידה: 125 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אסטרטגיה להריונות מתוזמנים מסונכרנים יעילים עבור בידודי עוברים במהלך גסטרולציה. (A) תרשים סכמטי המציין את הצינור להריונות מתוזמנים ולוח זמנים המתאר את הזמנים מגילוי תקע לבידוד עוברים לניתוח שלבי גסטרולציה ספציפיים. (B) תמונות מייצגות של שלבי מחזור הייחום עבור נקבות עכברים. השלבים הפתוחים ביותר לרבייה מסומנים. (C) תרשים סכמטי הממחיש כיצד לבדוק אם קיימים פקקים בנרתיק ודוגמאות לפתחי נרתיק ללא תקע, תקע חלקי או תקע טוב שיש לקחת בחשבון עבור בידוד עוברים. פתחי הנרתיק מוגדלים מתחת לכל תמונה. הפקק (זרע קרוש בפתח הנרתיק) מודגש בחץ אדום המצביע עליו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דיסקציה וגנוטיפ של עוברי E7.5 לצורך ריצוף רנ"א חד-תאי. דיאגרמות סכמטיות ותמונות של תהליך בידוד עוברי E7.5 וניתוח שק החלמון הקרבי. החץ הצהוב מציין את הרחם של הסכר ההרה, והעיגול המקווקו הצהוב מתאר את מיקום העובר. קווים מקווקווים מייצגים את האזורים שנחתכו במהלך הנתיחה. "M" מציין את הסוף המזום, ואילו "AM" מציין את הסוף האנטי-מזומטרי. פסי קנה מידה בתמונות סטריאוסקופ הם 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: גנוטיפ באותו יום של שקי חלמון מעוברי עכברים מגרדים. (A) סכמת זרימת עבודה לגנוטיפ באותו יום של שקי חלמון. (B) תמונה מייצגת של השק האנדודרמלי הקודקודי וחרוט השליה האקטושליה עם הדם האימהי המשויך. (C) שק חלמון בטני בעוברי E7.5 המודגשים בקו מקווקו. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (D) ג'לים מייצגים מסוג פראי (+/+), הטרוזיגוטי (Flox/+), והומוזיגוטי flox (Flox/Flox), וגנוטיפ Cre (Mesp1cre15) עם גדלים נצפים של מקטעי DNA. (E) תוצאות גנוטיפ באותו יום עבור אללים Cre ו-flox משקים חלמוניים של 6 עוברים (1-6) מסופקות. שני העוברים עם גנוטיפ flox/flox ו-Cre שלילי (-) הם פקדי flox (נקודות כחולות), ואילו אלה עם גנוטיפ flox/flox ו-Cre חיובי (+) הם KOs מותנים (נקודות אדומות). עובר 4 אינו אופטימלי עקב רצועת Cre חלשה (flox/flox ו- Cre-unclear) ולכן אינו נכלל בעיבוד נוסף. עוברים עם אותו גנוטיפ מאוגמים ומעובדים לריצוף RNA של תא יחיד. שימו לב שנוכחות אלל Cre בשק החלמון אינה משפיעה על גודל רצועות הפלוקס , שכן ה- Cre המשמש (Mesp1cre) אינו מתבטא בשק החלמון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הערכת איכות התא וכדאיות הגרעינים. (A) תמונות מייצגות של תנאי קיום תאים אופטימליים ותת-אופטימליים מעוברי E7.5. (B) תמונות מייצגות של תנאי קיום גרעינים אופטימליים ותת-אופטימליים מעוברי E8 (C) סכימת פתרון בעיות המציינת פתרונות אפשריים שיעזרו להגדיל את הכדאיות של תאים לפני תחילת חלוקה של תא יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ריצוף רנ"א חד-תאי של עוברי עכבר E7. (A) מעקב מייצג של התפלגות גודל המקטע עבור ספריות ריצוף רנ"א חד-תאי מעוברי עכברי E7 עבור תנאים תת-אופטימליים ואופטימליים של קיום התא, כאשר השיא העיקרי קרוב ל-400-500 bp. שים לב שהעקבות דומות בין תנאים אלה, דבר המצביע על כך שיכולת הקיום של התא אינה משפיעה על בקרות האיכות של הספריה. (B) ניתוח תוצאות ריצוף RNA חד-תאי עבור עוברי עכברי E7 בתנאים תת-אופטימליים ואופטימליים כאחד, המציג שחזור מטרה נצפה, דירוג ברקוד והתקבצות של סוגי תאים באמצעות התפלגות סעפת אחידה של קירוב והקרנה (UMAP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חיץ ליזיס
שם מגיבריכוז מלאיריכוז סופינפח כולל 1 מ"ל
Tris-HCL (Ph7)1 מטר10 מ"מ10 מיקרוליטר
NaCl5 מטר10 מ"מ2 μL
MgCl20.1 מטר3 מ"מ3 מיקרוליטר
טווין-2020%0.10%5 מיקרוליטר
Nondiedt P4010%0.10%10 מיקרוליטר
דיגיטונין5%0.01%2 μL
DTT1 מטר1 מ"מ1 μL
מעכב RNase40 U/μL1 U/μL25 מיקרוליטר
מים ללא Nuclease----924 מיקרוליטר
חיץ כביסה
שם מגיבריכוז מלאיריכוז סופינפח כולל 1 מ"ל
BSA ב PBS10%1%100 מיקרוליטר
PBS----900 מיקרוליטר

טבלה 1: חיץ ליזיס בידוד גרעינים והרכב חיץ שטיפה.

דיון

במאמר זה מוצג צינור איתן להשגת תרחיפים חד-תאיים וגרעינים באיכות גבוהה מעוברי עכברים מגזימים, שתוכננו במיוחד כדי להקל על מחקרים על מנגנונים של אפיון גורל התא בהתפתחות מוקדמת. שיטה זו מטפלת בפער מכריע בתחום הגסטרולציה על ידי אופטימיזציה של ניתוח עוברים הדורשים גנוטיפים, כגון מין או גנים סומטיים. על ידי שימוש במודלים של מוטציות גנטיות בעכברים ושימוש בריצוף חד-תאי ברזולוציה גבוהה על עוברי עכברים שלמים, צינור זה יכול לשפר עוד יותר את ההבנה של פרופילי ביטוי הגנים של גסטרולת העכבר המוקדמת. שיטה זו מדגימה את ההיתכנות של שימוש במודל עכבר מוטציה גנטית על ידי מערכת Cre recombinase כדי להשיג תאים וגרעינים באיכות גבוהה בנקודות זמן התפתחותיות מוקדמות עבור אומיקה חד-תאית. שיטה זו התפתחה באמצעות ניסיונות רבים, שבמהלכם הדגימות לא עמדו בתקני האיכות הנדרשים להכנת הספרייה ולריצוףה. המתודולוגיה המוסברת מייצרת מספיק תאים/גרעינים מעוברים צעירים מ-E8 באמצעות אופטימיזציה של שלושה שלבים קריטיים: (1) הריונות מתוזמנים מסונכרנים כדי להגדיל את מספר העוברים, (2) גנוטיפ באותו יום כדי למנוע הקפאה/הפשרה, ו-(3) הערכת כדאיות התא/גרעינים כדי למנוע ריצוף של תאים גוססים. פרוטוקול זה מספק תוצאות מוצלחות עם RNASeq חד-תאי, אך ניתן לעבד את מתלי התא או הגרעינים המתקבלים בפרוטוקול זה בפלטפורמות ריצוף אחרות, שבהן כדאיות התא היא הגורם המגביל, כגון smart-seq, drop-seq ו-cel-seq16.

בעובר E7, מספר התאים יכול להשתנות בהתאם לזן ולגנוטיפ המוטנטי. בדרך כלל, עובר E7 יכול לנוע בין מאות לכמה אלפי תאים, והשגת עוברים עם הגנוטיפ הרצוי היא מאתגרת, כאשר רק עובר אחד או שניים לכל סכר בהריון עומדים בקריטריונים. פרוטוקול זה מאפשר לכידה של כ-300 תאים בני קיימא לכל עובר E7 לצורך אנליזה של תא יחיד. ניסיונות להגדיל את מאגר העוברים על ידי הקפאת עוברים מהירה מסכרים בהריון בימים שונים לא צלחו, שכן כדאיות התאים נפגעה קשות לאחר ההפשרה, אפילו עם תוספת של חומרים משמרים בהקפאה. כדי להתמודד עם אתגר זה, אסטרטגיית הרבייה והסנכרון של סכרים בהריון היו אופטימליים. כדי להגדיל את הסיכוי לבידודים מרובים, מומלץ להשתמש בנקבות עכברים שילדו 1-2 פעמים לפני הרבייה לבידוד, מכיוון שיש להן סיכוי גבוה יותר להיות בעלות גודל המלטה גדול יותר. ניטור מחזור הייחום של הנקבה הוא חיוני; סביר יותר שההזדווגות תתרחש במהלך שלבי הפרואסטרוס והייחום. אם מתעוררים קשיי רבייה, החלפת השותפים לרבייה לאחר ארבעה ימים תעזור גם אם לא נוצר תקע.

חשוב לציין שלשיטה זו יש מגבלה: היא מסתמכת על תקעים נצפים, וגם אם נצפה תקע, היא אינה מבטיחה הריון אלא רק מעידה על פעילות מינית. לכן, הגדלת מספר התקעים הנצפים ביום תגדיל את ההסתברות ליותר מסכר הריון אחד ביום ויותר גנוטיפים חיוביים. פרוטוקול זה הדגים את ההיתכנות של שימוש בשלבים עובריים החל מ-E7 ועד E7.75 כהוכחת היתכנות במהלך הגסטרולציה. עם זאת, צינור זה יכול להיות מיושם מ E6.5 ל E8 עוברים. עבור עוברי E6.5, מומלץ להגדיל את מספר ההריונות המסונכרנים כדי להשיג לפחות 7 עוברים עם הגנוטיפ הרצוי לאיגום. במקום זאת, עבור עוברי E8, להגדיל את כמות טריפסין המשמש לנתק כל עובר ~ 40 μL במקום 20 μL. המטרה היא להשיג תרחיף תא/גרעינים בטווח ריכוז של 700-1200 תאים למיקרוליטר לפני שממשיכים בחלוקה.

קיום תאים טוב חיוני להצלחת ריצוף תא יחיד. בתכנון השבב המיקרופלואידי המסופק על ידי היצרנים, תאים בודדים מחולקים לחרוזי ג'ל בתחליב (GEMs) בתוך שבב המכיל חרוזי ג'ל ידועים ברקודים11. עם זאת, מגבלה בולטת של תהליך זה היא כי הן תאים בודדים באיכות גבוהה באיכות ירודה ניתן לחלוקה. אפילו עם מספר מספיק של תאים חיים (כלומר, 1000 תאים/μL), אם הכדאיות של ההשעיה נמוכה (כלומר, 1000 תאים חיים ו -1000 תאים מתים, וכתוצאה מכך 50% כדאיות), ניסוי הריצוף צפוי להיכשל. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ לשאוף לכדאיות של כ-90%. אם כדאיות התא נעה בין 60%-89%, ניתן לנקוט באמצעים ספציפיים כדי לשפר את כדאיות הניסוי. עם זאת, אם כדאיות התא נמוכה מ-60%, מומלץ מאוד לא להמשיך בניסוי. הסיבה לכך היא שהתאים הגוססים "יילכדו" בג'ל המחיצה, והכנת הספרייה ובקרת האיכות הבאות יעברו ללא בעיות מורגשות. עם זאת, ניסוי הריצוף בפועל עלול להיכשל לחלוטין, מכיוון שרוב קריאות הריצוף ימפו גנים מיטוכונדריאליים, ריבוזומליים או אפופטוזיס, מה שמצביע על סימנים של יכולת קיום תאים ירודה מלכתחילה. הנתונים המוצגים במאמר זה ממחישים צינור לריצוף חד-תאי של עוברי עכברים בעלי תאים באיכות גבוהה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת להבנה של מודלים רבים ושונים של מוטציות גנטיות בעכברים במהלך הפיתוח.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לליבת הגנומיקה במרכז הסרטן פוקס צ'ייס ולד"ר ג'ונתן ווטסטין ולחברי המעבדה זאק גריי, מדיסון הונר ובנג'מין פרמן על התמיכה הטכנית בניסויי הריצוף. אנו מודים לחברי המעבדה של ד"ר אסטרס ואלכס מוריס, סטודנט לתואר שני ברוטציה שתרמו לניתוח הראשוני של המחקרים החד-תאיים. עבודה זו ממומנת על ידי מענקי NIH R01HD106969 R56HL163146 לקונצ'י אסטראס. בנוסף, אליזבת אברהם נתמכה על ידי מענק הכשרה T32 5T32HL091804-12.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטרי 10 ס"מGenesee Scientific25-202
1000 ומיקרו; L להגיע לקצה מחסוםGenesee Scientific23-430
20 µ L להגיע לקצה מחסוםGenesee Scientific24-404
300 µ L להגיע לקצה מחסוםGenesee Scientific24-415
37 µ m מסננת הפיכה,תאי גזע27215
צלחת פטרי 6 ס"מGenesee Scientific25-260
צינורות PCR 8 רצועותGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock מיני אמבט יבשGenesee31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle מיקרוצנטריפוגה מקוררתGenesee33-759R
אלבומין סרום בקר בקר (BSA)Sigma-AldrichA2153
בקר כרום10XPN-1000127
כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכות ריאגנט v3.110XPN-1000269
רוזנת 3 אוטומטי מונה תאיםInvitrogen
שקופיות תא שיתוף תאים של רוזנתInvitrogenC10283
D1000 ריאגנטיםAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
שק חלמון DirectPCRViagen201-Y
Dithiothreitol ( DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 מ"לEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
PBS GenClone של Dulbecco25-508
Dumont #5 מלקחייםעדינים כלים מדעייםעדינים 11254-20
Dumont #5SF מלקחייםFine Science Tools11252-00
אתנולKoptecV1401
EVOS M7000 מערכת הדמיהInvitrogenAMF7000
מספריים עדינים -Sharp Fine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Graefe FineScience Tools11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
הבאSeq 1000/2000 P2 ריאגנטים (100 מחזורים) v3Illumina20046811
הבאSeq2000Illumina
ניקון SMZ 1000 מיקרוסקופ סטריאוניקון
Nondiedt P40סיגמא-אולדריץ'74385
מים ללא נוקלאזGenClone25-511
צינור אופטי 8x רצועה (401428)Agilent401428
כובע צינור אופטי 8x רצועה (401425)Agilent401425
פוסידון 31-511, מיקרוצנטריפוגה HS24, עם רוטור 24 x 1.5/2.0 מ"ל, 1 צנטריפוגה/יחידהGenesee31-511
Proteinase KSigma-AldrichP6556
ערכות בדיקת כימות dsDNA של קיוביטInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
Fisher Scientific12-141-368
מלקחיים דפוס סטנדרטיכלי מדע עדינים11000-12
טיפים לטעינת תחנת קלטתAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)איכות ביולוגית351-007-101
כתם כחול טריפן 0.4%Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
מערבולת מערבולת IKA MS3 עם מתאם צלחת דגימה 96 בארותIKA3617000
קטנים AMQAX2000 מעכב RNase

מקורות

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
  3. Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
  4. Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).
  5. Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617(2020).
  6. Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
  7. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  8. Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
  9. Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
  10. Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
  11. Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024).
  12. NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024).
  13. Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
  14. Li, Q., et al. editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).
  15. Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.